CN111334528B - 水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用 - Google Patents

水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111334528B
CN111334528B CN202010203738.3A CN202010203738A CN111334528B CN 111334528 B CN111334528 B CN 111334528B CN 202010203738 A CN202010203738 A CN 202010203738A CN 111334528 B CN111334528 B CN 111334528B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mev
genome
mink enteritis
cells
enzyme digestion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010203738.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111334528A (zh
Inventor
谢之景
朱倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Priority to CN202010203738.3A priority Critical patent/CN111334528B/zh
Publication of CN111334528A publication Critical patent/CN111334528A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111334528B publication Critical patent/CN111334528B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用。该方法是将MEV复制形式的完整基因组进行酶切，以分段的形式依次定向克隆到基于载体pUC18‑M，获得重组质粒。将重组质粒与转染试剂混合后转染CRFK细胞，可获得拯救病毒。本发明利用反向遗传技术构建的水貂肠炎细小病毒感染性克隆在体外转染CRFK细胞，能够诱导细胞产生与亲本病毒相同的细胞病变和生长趋势。该方法简单、快速、省时省力，与传统PCR方法相比具有更高的准确性，应用该克隆***能够快速便捷地在MEV基因组任意位置进行碱基突变，从而为后续研发MEV的分子生物学研究和疫苗的研制提供了有效的途径和手段。

Description

水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用反向遗传操作技术的水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用。
背景技术
水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis parvovirus,MEV)可引起水貂病毒性肠炎，以胃肠黏膜出血和剧烈下痢为特征的高度接触性传染病，具有较高的发病率和死亡率，其中幼貂更易感。该病于上个世纪八十年代开始在我国暴发流行，给我国水貂养殖业造成了巨大的经济损失，也是世界公认的危害水貂养殖业的三大疾病之一。目前虽有疫苗用于水貂病毒性肠炎的预防，但在生产实践中该病仍较为多发，严重危害水貂健康。
反向遗传技术是开展病毒学研究有效的分子生物学手段，在阐明病毒致病机制和疫苗的研制中发挥着重要的作用。利用反向遗传技术构建水貂肠炎细小病毒感染性克隆，使得在病毒的任意位点引入突变成为可能，方便对病毒的致病机制进行更加精细、准确的研究，从而在基因层面上对该病毒有更为深入的研究和了解，同时也是研制水貂肠炎病毒疫苗的一个有效途径，具有重大的兽医公共卫生学意义。
根据GenBank报道的MEV全基因组序列，3’-端的发夹结构长205nt，成Y型结构，而5’-端发夹结构长为62nt，成U型结构。这种特殊结构的存在严重影响了细小病毒全基因组的克隆和反向遗传学操作平台的建立。现有技术构建水貂肠炎细小病毒感染性克隆主要是采用PCR方法，然而该PCR方法扩增病毒序列时会出现错配问题。同时由于采用常规质粒，还存在容量小、难承受长片段序列的问题。
目前，对整个细小病毒家族复制过程的研究还很少，尤其是对水貂肠炎细小病毒分子方面的研究。尽管GenBank已报道MEV全基因组序列，但是全长克隆的例子很少有人研究，特别是全长的感染性克隆。由于自主复制性细小病毒的基因组结构特殊，很难克隆出其全长基因组，严重影响了其反向遗传学操作平台的建立。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种新的水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis parvovirus,MEV)感染性克隆质粒的构建方法，并建立了反向遗传学操作***，为今后进行该病毒毒力研究和新型疫苗的研制提供了技术保障。
为实现上述发明目的，本发明一方面提供一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆，所述克隆通过将水貂肠炎细小病毒完整基因组酶切后，以分段的形式依次定向克隆到载体pUC18-M得到。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明另一方面，还提供一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆的构建方法，所述方法主要包括如下步骤：将水貂肠炎细小病毒复制形式的完整基因组进行酶切；将酶切后得到的两段基因片段，以分段的形式依次定向克隆到载体pUC18-M，获得重组质粒。
所述载体pUC18-M由载体pUC18经酶切改造而成；改造过程是：首先使用Hind Ⅲ酶切将环状质粒线性化，然后使用Blunting平端化酶处理将质粒DNA两端的粘性末端变为平末端，命名为载体pUC18-M。
水貂肠炎细小病毒复制形式的完整基因组通过如下方式获得：将水貂肠炎细小病毒接种CRFK细胞，当细胞生长旺盛且大部分肿胀变圆时收取细胞进行基因组提取，获得水貂肠炎细小病毒复制形式的完整基因组；用PstⅠ酶切基因组产生两个DNA片段。
具体地，本发明水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆的构建方法，步骤如下，
(1)载体pUC18改造
首先使用Hind Ⅲ将pUC18线性化，然后使用Blunting平端化酶处理使载体片段两端由黏性末端变为平末端，命名为pUC18-M；将pUC18-M载体进行PstⅠ酶切使载体片段的一端变为黏性末端；
(2)MEV复制形式基因组提取
将MEV病毒接种于CRFK细胞，当细胞密度约为106个/mL、MEV滴度为107TCID50时进行接种，将0.5mL MEV病毒液接种于10mLCRFK细胞，感染36h左右细胞生长旺盛且大部分肿胀变圆时收取细胞进行基因组提取获得MEV复制形式的完整基因组，长度约5.1kb。
(3)MEV复制形式基因组分段克隆
使用PstⅠ对步骤(2)得到的MEV复制形式双链基因组进行酶切，切下两个DNA片段MEV-5'(约3.1kb)和MEV-3'(约2kb)，序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；将pUC18-M、MEV-3'进行连接转化，得到pM-MEV-3'重组质粒；然后将pM-MEV-3'重组质粒先进行PstⅠ酶切，再进行SmaI酶切；酶切后的pM-MEV-3'、MEV-5'连接转化后得到pM-MEV重组质粒。
本发明再一方面提供一种水貂细小病毒的反向遗传学操作***，所述的***包括上述的水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆以及宿主细胞。所述宿主细胞为CRFK细胞。
本发明反向遗传学操作***在水貂细小病毒拯救、水貂细小病毒的致病机理和致病力研究以及水貂细小病毒疫苗研制中的应用。
本发明再一方面，提供一种拯救水貂细小病毒的方法：离心管内加入Lipofectamine2000转染试剂，再加入Opti-DMEM培养液混匀，静置；加入pM-MEV重组质粒混匀，室温静置20min得到转染混合物；将长满单层的CRFK细胞去掉培养基，用PBS或无血清培养基清洗2-3次，加入所述转染混合物，将细胞放入37℃ 5％CO2培养箱中培养1h，然后加入血清含量7％的完全培养基继续培养24-48h，进行细胞传代；收集出现疑似细胞病变的细胞上清液，得到拯救病毒。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
(1)本发明所构建的水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆，首次覆盖水貂肠炎细小病毒全长基因组。由于采用复制形式的DNA，避免了PCR方法扩增病毒序列时的错配问题，同时也克服了常规质粒容量小、难承受长片段序列的问题，为后续MEV全基因的改造和研究不同氨基酸位点对生物学特性的影响提供了重要的分子工具。
(2)本发明采用质粒的氨苄抗性及酶切验证的方法，筛选出水貂肠炎细小病毒感染性克隆，方便快捷。
(3)本发明建立的水貂细小病毒的反向遗传学操作***，将水貂肠炎细小病毒感染性克隆在体外转染CRFK细胞，能够诱导细胞产生与亲本病毒相同的细胞病变和生长趋势。该方法简单、快速、省时省力，与传统PCR方法相比具有更高的准确性，应用该克隆***能够快速便捷地在MEV基因组任意位置进行碱基突变，从而为今后MEV的分子生物学研究和疫苗的研制提供了有效的途径和手段。
附图说明
图1.MEVSD1株基因组DNA提取的琼脂糖凝胶电泳。M：DNA Marker DL5000；1：5kb左右的MEV复制形式双链DNA分子。
图2.pM-MEV-3'质粒酶切鉴定。M：DNA Marker DL5000；1：经PstⅠ酶切产生的大小为4748bp的DNA片段；2：经PvuⅡ酶切产生的大小为2355bp、1575bp和727bp的DNA片段；3：经SspⅠ酶切产生的大小为2568bp、1549bp、444bp和187bp的DNA片段。
图3.MEV株感染性克隆pM-MEV的构建策略。
图4.pM-MEV质粒酶切鉴定。M：DNA Marker DL5000；1：经PstⅠ酶切产生的大小为7823bp的DNA片段；2：经EcoRⅠ酶切产生的大小为6384bp和1439bp的DNA片段；3：经Hind Ⅲ酶切产生的大小为7161bp和662bp的DNA片段；4：经PvuⅡ酶切产生的大小为3893bp、2355bp和1575bp的DNA片段；5：经SspⅠ酶切产生的大小为5824bp、1368bp、444bp和187bp的DNA片段。
图5.验证pM-MEV质粒成功转染的琼脂糖凝胶电泳。M：DNA Marker DL2000；1：DNA酶酶切pM-MEV转染后的上清液并进行PCR扩增得到的大小为1755bp的VP2基因片段。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下结合具体生物材料及参数对本发明进一步说明，但不是对本发明的进一步限定。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所涉及到的试剂均可从商业途径得到。
1.载体pUC18改造
首先使用Hind Ⅲ将pUC18线性化，37℃作用1h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，把目的条带的DNA切下回收纯化；然后使用Blunting平端化酶处理纯化后的载体，37℃作用10min、70℃作用5min后进行1％琼脂糖凝胶电泳，把目的条带的DNA切下回收纯化，该步骤使载体片段两端由黏性末端变为平末端，命名为pUC18-M；最后对上一步纯化后的载体进行PstⅠ酶切，37℃作用1h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，把目的条带的DNA切下回收纯化，该步骤使载体片段的一端变为黏性末端，方便后续克隆。
2.MEV复制型基因组提取
将MEV病毒接种于CRFK细胞，根据病毒效价摸索接毒剂量和病毒接种时间。当细胞密度约为106个/mL、MEV滴度为107TCID50时进行接种，将0.5mL MEV病毒液接种于10mL CRFK细胞，感染36h左右细胞生长旺盛且大部分肿胀变圆时收取细胞进行基因组提取获得MEV复制形式的完整基因组。基因组提取具体方法如下：吸出细胞培养瓶中的营养液，用PBS清洗2-3次；倒出PBS，加入1mL裂解液，37℃作用1h；加入250μL 5M NaCl溶液，加的同时动摇细胞培养瓶，冰浴1h；将粘性溶解产物转移到1.5mL离心管中，4℃12000rpm离心30-45min；吸出上清液并转移到干净的离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿＝1:1，颠倒并静置一段时间，12000rpm离心15min，若离心分层后中间的蛋白部分过多，可重复此步骤；加入0.25M乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，作用10-15min，12000rpm离心15min后倒掉上清液；用70％乙醇洗脱，缓慢加入并吹干；加入25-50μL TE，再加入1-2μL RNase，37℃作用20-30min；最后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外切胶仪内切下5.1kb左右的目的条带回收纯化(见图1)。
3.MEV复制形式基因组分段克隆(见图3)
使用PstⅠ对纯化后的MEV复制形式双链基因组进行酶切，37℃作用1h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别切下两个DNA片段MEV-5'(3098bp)和MEV-3'(2064bp)，序列分别如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。分别回收纯化。将2μl pUC18-M、4μL MEV-3'和6μL Ligationsolution I吹打混匀后置于16℃过夜。将该连接产物加入DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2-3min，加入800μL无抗性LB液体培养基后放置于37℃摇床振荡45min；吸取200μL转化产物，均匀涂布在氨苄板上，37℃倒置8-12h；挑取氨苄板上的单菌落，将入具有氨苄抗性的LB液体培养基，置于37℃摇床振荡8-12h后进行质粒提取，通过酶切鉴定的方法筛选pM-MEV-3'重组质粒(见图2)。
对纯化后的pM-MEV-3'进行PstⅠ酶切，37℃作用1h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化得到的重组质粒再次进行SmaI酶切，30℃作用1h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，将2μL酶切纯化后的pM-MEV-3'、4μLMEV-5'和6μL Ligation solution I吹打混匀后置于16℃过夜，重复上述转化过程，挑取单菌落进行扩大培养，并通过酶切鉴定的方法筛选pM-MEV重组质粒(见图4)。
4.重组质粒转染CRFK细胞拯救
4.1.转染试剂的配制
转染混合物的配制参照Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen,Carlsbad,USA)说明书进行。载体和转染试剂按照1:2.5(μg:μL)进行。取16μg纯化的质粒溶液至1个灭菌的1.5mL离心管中，用DMEM培养液(Invitrogen)稀释至1mL，静置5min。另一个灭菌的1.5mL离心管内加入40μL Lipofectamine2000转染试剂，再加入960μL DMEM培养液混匀，静置5min。静置结束后，将稀释后的质粒和转染试剂轻轻混匀，室温静置20min后进行转染。
4.2.转染CRFK细胞
将长满单层的细胞去掉培养基，用PBS或无血清培养基清洗2-3次，加入上述配制好的转染试剂，将细胞放入37℃5％CO2培养箱中培养1h，然后加入血清含量7％的完全培养基继续培养24-48h，进行细胞传代，观察细胞是否出现病变，根据细胞状态决定是否需要二次转染。收集出现疑似细胞病变的细胞上清液，使用DNA酶把未转染进细胞的重组质粒随机切断后，对酶切后的上清液进行VP2片段的PCR扩增，引物序列：VP2-F:5'-CTTTGCCTCAATCTGAAGGAGT-3'、VP2-R:5'-GAATTGGATTCCAAGTATGAGAT-3'，反应条件为96℃预变性3min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸，140s；32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳出现1.8kb左右的目的条带证明转染成功(见图5)。
VP2基因PCR反应体系
Figure BDA0002420235580000051
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5162
<212> DNA
<213> Mink enteritis parvovirus
<400> 1
cgccaccttt tcccgcccaa gtttaaacac acaaaccgcc tatcattctt tagaaccaac 60
tgaccaagtt cacgtacgta tgacgtgatg acgcgcgctg cgcgcgctgc ctacggcagt 120
cacacgtcat acgtacgctc cttggtcagt tggttctaaa gaatgatagg cggtttgtgt 180
gtttaaactt gggcgggaaa aggtggcggg cattgtgggc gtggttaaag gtataaaaga 240
caaaccatag accgttactg acattcgctt cttgtctttg acagagtgaa cctctcttac 300
tttgactaac catgtctggc aaccagtata ctgaggaagt tatggaggga gtaaattggt 360
taaaaaaaca tgcagaaaat gaagcatttt cgtttgtttt taaatgtgac aacgtccaac 420
taaatggaaa ggatgttcgc tggaacaact ataccaaacc aattcaaaat gaagagctaa 480
catctttaat tagaggagca caaacagcaa tggatcaaac cgaagaagaa gaaatggact 540
gggaatcgga agttgatagt ctcgccaaaa agcaagtaca aacttttgat gcattaatta 600
aaaaatgtct ttttgaagtc tttgtttcta aaaatataga accaaatgaa tgtgtttggt 660
ttattcaaca tgaatgggga aaagatcaag gctggcattg tcatgtttta cttcatagta 720
agaacttaca acaagcaact ggtaaatggc tacgcagaca aatgaatatg tattggagta 780
gatggttggt gactctttgt tcggtaaatt taacaccaac tgaaaagatt aagctcagag 840
aaattgcaga agatagtgaa tgggtgacta tattaacata cagacataag caaacaaaaa 900
aagactatgt taaaatggtt cattttggaa atatgatagc atattacttt ttaacaaaga 960
aaaaaattgt ccacatgaca aaagaaagtg gctatttttt aagtactgat tctggttgga 1020
aatttaactt tatgaagtat caagacagac aaactgtcag cacactttac actgaacaaa 1080
tgaaaccaga aaccgttgaa accacagtga cgacagcaca ggaaacaaag cgcgggagaa 1140
ttcaaactaa aaaggaagtt tcaatcaaat gtactttgcg ggacttggtt agtaaaagag 1200
taacatcacc tgaagattgg atgatgttac aaccagatag ttatattgaa atgatggcac 1260
aaccaggagg tgaaaatctt ttaaaaaata cacttgaaat ttgtactttg actttagcaa 1320
gaacaaaaac agcatttgaa ttaatacttg aaaaagcaga taatactaaa ctaactaact 1380
ttgatcttgc aaattctaga acatgtcaaa tttttagaat gcacggatgg aattggatta 1440
aagtttgtca cgctatagca tgtgttttaa atagacaagg tggtaaaaga aatacagttc 1500
tttttcatgg accagcaagt acaggaaaat ctattattgc tcaagccata gcacaagctg 1560
tggggaatgt tggttgttat aatgcagcaa atgtaaattt tccatttaat gactgtacca 1620
ataaaaattt aatttggatt gaagaagctg gtaactttgg tcaacaagtt aatcaattta 1680
aagcaatttg ttctggacaa acaattagaa ttgatcaaaa aggtaaagga agtaagcaaa 1740
ttgaaccaac tccagtaatt atgacaacta atgaaaatat aacaattgta agaattggat 1800
gtgaagaaag acctgaacat acacaaccaa taagagacag aatgttgaac attaagttag 1860
tatgtaagct tccaggagac tttggtttgg ttgataaaga agaatggcct ttaatatgtg 1920
catggttagt taaacatggt tatgaaccaa ccatggctaa ctatacacat cattggggaa 1980
aagtaccaga atgggatgaa aactgggcgg agcctaaaat acaagaaggt ataaattcac 2040
caggttgcaa agacttagag acacaagcgg caagcaatcc tcagagtcaa gaccaagttc 2100
taactcctct gactccggac gtagtggacc ttgcactgga accgtggagt actccagata 2160
cgcctattgc agaaactgca aatcaacaat caaaccaact tggcgttact cacaaagacg 2220
tgcaagcgag tccgacgtgg tccgaaatag aggcagacct gagagccatc tttacttctg 2280
aacaattgga ggaagatttt cgagacgact tggattaagg tacgatggca cctccggcaa 2340
agagagccag gagaggtaag ggtgtgttag taaagtgggg ggaggggaaa gatttaataa 2400
cttaactaag tatgtgtttt cttataggac ttgtgcctcc aggttataaa tatcttgggc 2460
ctgggaacag tcttgaccaa ggagaaccaa ctaacccttc tgacgccgct gcaaaagaac 2520
acgacgaagc ttacgctgct tatcttcgct ctggtaaaaa cccatactta tatttctcgc 2580
cagcagatca acgctttata gatcaaacta aggacgctaa agattggggg gggaaaatag 2640
gacattattt ttttagagct aaaaaggcaa ttgctccagt attaactgat acaccagatc 2700
atccatcaac atcaagacca acaaaaccaa ctaaaagaag taaaccacca cctcatattt 2760
tcatcaatct tgcaaaaaaa aaaaaagccg gtgcaggaca agtaaaaaga gacaatcttg 2820
caccaatgag tgatggagca gttcaaccag acggtggtca acctgctgtc agaaatgaaa 2880
gagctacagg atctgggaac gggtctggag gcgggggtgg tggtggttct gggggtgtgg 2940
ggatttctac gggtactttc aataatcaga cggaatttaa atttttggaa aacggatggg 3000
tggaaatcac agcaaactca agcagacttg tacatttaaa tatgccagaa agtgaaaatt 3060
ataaaagagt agttgtaaat aatatggata aaactgcagt taaaggaaac atggctttag 3120
atgatactca tgtacaaatt gtaacacctt ggtcattggt tgatgcaaat gcttggggag 3180
tttggtttaa tccaggagat tggcaactaa ttgttaatac tatgagtgag ttgcatttag 3240
ttagttttga acaagaaatt tttaatgttg ttttaaagac tgtttcagaa tctgctactc 3300
aaccaccaac taaagtttat aataatgatt taactgcatc attgatggtt gcattagata 3360
gtaataatac tatgccattt actccagcag ctatgagatc tgagacattg ggtttttatc 3420
catggaaacc aaccatacca actccatgga gatattattt tcaatgggat agaacattaa 3480
taccatctca tactggaact agtggcacac caacaaatgt atattatggt acagatccag 3540
atgatgttca attttatact attgaaaatt ctgtgccagt acacttacta agaacaggtg 3600
atgaatttgc tacaggaaca tttttttttg attgtaaacc atgtagacta acacatacat 3660
ggcaaacaaa tagagcattg ggcttaccac catttctaaa ttctttgcct caatctgaag 3720
gagctactaa ctttggtgat ataggagttc aacaagataa aagacgtggt gtaactcaaa 3780
tgggaaatac agactatatt actgaagcta ctattatgag accagctgag gttggttata 3840
gtgcaccata ttattctttt gaagcatcta cacaagggcc atttaaaaca cctattgcag 3900
caggacgggg gggagcgcaa acagatgaaa atcaagcagc agatggtgat ccaagatatg 3960
catttggtag acaacatggt caaaaaacta ctacaacagg agaaacaccc gagagattta 4020
catatatagc acatcaagat acaggaagat atccagaagg agattggatt caaaatatta 4080
actttaacct tcctgtaaca aatgataatg tattgctacc aacagatcca attggaggta 4140
aaacaggaat taactatact aatatattta atacttatgg tcctttaact gcattaaata 4200
atgtaccacc agtttatcca aatggtcaaa tttgggataa agaatttgat actgacttaa 4260
aaccaagact tcatgtaaat gcaccatttg tttgtcaaaa taattgtcct ggtcaattat 4320
ttgtaaaagt tgcgcctaat ttaacaaatg aatatgatcc tgatgcatct gctaatatgt 4380
caagaattgt gacttactca gatttttggt ggaaaggtaa attagtattt aaagctaaac 4440
taagagcatc tcatacttgg aatccaattc aacaaataag tattaatgta gataaccaat 4500
ttaactatgt accaaataat attggagcta tgaaaattgt atatgaaaaa tctcaactag 4560
cacctagaaa attatattaa tatacttact atgtttttat gtttattaca tatcaactag 4620
cacctagaaa attatattaa tatacttact atgtttttat gtttattaca tattatttta 4680
agattaatta aattacagca tagaaatatt gtacttgtat ttgatatagg atttagaagg 4740
tttgttatat ggtatacaat aactgtaaga aatagaagaa catttagatc atagttagta 4800
gtttgtttta taaaatgtat tgtaaactat taatgtatgt tgttatggtg tgggtggttg 4860
gttggtttgc ccttagaata tgttaaggac caaaaaaatc aataaaagac atttaaaact 4920
aaatggtctc gtatactgtc tataaggtga actaacctta ccataagtat caatctgtct 4980
ttaagggggg ggtgggtggg agatacacaa catcagtaga ctgactggcc tggttggttg 5040
ctctgcttaa tcaaccagac cgcgtagcgg tctggttgat taagcgcaac caaccaggcc 5100
agtcagtcta ctgatgttgt gtatctccca cccacccccc ccttaaagac agattgatac 5160
tt 5162
<210> 2
<211> 3098
<212> DNA
<213> Mink enteritis parvovirus
<400> 2
cgccaccttt tcccgcccaa gtttaaacac acaaaccgcc tatcattctt tagaaccaac 60
tgaccaagtt cacgtacgta tgacgtgatg acgcgcgctg cgcgcgctgc ctacggcagt 120
cacacgtcat acgtacgctc cttggtcagt tggttctaaa gaatgatagg cggtttgtgt 180
gtttaaactt gggcgggaaa aggtggcggg cattgtgggc gtggttaaag gtataaaaga 240
caaaccatag accgttactg acattcgctt cttgtctttg acagagtgaa cctctcttac 300
tttgactaac catgtctggc aaccagtata ctgaggaagt tatggaggga gtaaattggt 360
taaaaaaaca tgcagaaaat gaagcatttt cgtttgtttt taaatgtgac aacgtccaac 420
taaatggaaa ggatgttcgc tggaacaact ataccaaacc aattcaaaat gaagagctaa 480
catctttaat tagaggagca caaacagcaa tggatcaaac cgaagaagaa gaaatggact 540
gggaatcgga agttgatagt ctcgccaaaa agcaagtaca aacttttgat gcattaatta 600
aaaaatgtct ttttgaagtc tttgtttcta aaaatataga accaaatgaa tgtgtttggt 660
ttattcaaca tgaatgggga aaagatcaag gctggcattg tcatgtttta cttcatagta 720
agaacttaca acaagcaact ggtaaatggc tacgcagaca aatgaatatg tattggagta 780
gatggttggt gactctttgt tcggtaaatt taacaccaac tgaaaagatt aagctcagag 840
aaattgcaga agatagtgaa tgggtgacta tattaacata cagacataag caaacaaaaa 900
aagactatgt taaaatggtt cattttggaa atatgatagc atattacttt ttaacaaaga 960
aaaaaattgt ccacatgaca aaagaaagtg gctatttttt aagtactgat tctggttgga 1020
aatttaactt tatgaagtat caagacagac aaactgtcag cacactttac actgaacaaa 1080
tgaaaccaga aaccgttgaa accacagtga cgacagcaca ggaaacaaag cgcgggagaa 1140
ttcaaactaa aaaggaagtt tcaatcaaat gtactttgcg ggacttggtt agtaaaagag 1200
taacatcacc tgaagattgg atgatgttac aaccagatag ttatattgaa atgatggcac 1260
aaccaggagg tgaaaatctt ttaaaaaata cacttgaaat ttgtactttg actttagcaa 1320
gaacaaaaac agcatttgaa ttaatacttg aaaaagcaga taatactaaa ctaactaact 1380
ttgatcttgc aaattctaga acatgtcaaa tttttagaat gcacggatgg aattggatta 1440
aagtttgtca cgctatagca tgtgttttaa atagacaagg tggtaaaaga aatacagttc 1500
tttttcatgg accagcaagt acaggaaaat ctattattgc tcaagccata gcacaagctg 1560
tggggaatgt tggttgttat aatgcagcaa atgtaaattt tccatttaat gactgtacca 1620
ataaaaattt aatttggatt gaagaagctg gtaactttgg tcaacaagtt aatcaattta 1680
aagcaatttg ttctggacaa acaattagaa ttgatcaaaa aggtaaagga agtaagcaaa 1740
ttgaaccaac tccagtaatt atgacaacta atgaaaatat aacaattgta agaattggat 1800
gtgaagaaag acctgaacat acacaaccaa taagagacag aatgttgaac attaagttag 1860
tatgtaagct tccaggagac tttggtttgg ttgataaaga agaatggcct ttaatatgtg 1920
catggttagt taaacatggt tatgaaccaa ccatggctaa ctatacacat cattggggaa 1980
aagtaccaga atgggatgaa aactgggcgg agcctaaaat acaagaaggt ataaattcac 2040
caggttgcaa agacttagag acacaagcgg caagcaatcc tcagagtcaa gaccaagttc 2100
taactcctct gactccggac gtagtggacc ttgcactgga accgtggagt actccagata 2160
cgcctattgc agaaactgca aatcaacaat caaaccaact tggcgttact cacaaagacg 2220
tgcaagcgag tccgacgtgg tccgaaatag aggcagacct gagagccatc tttacttctg 2280
aacaattgga ggaagatttt cgagacgact tggattaagg tacgatggca cctccggcaa 2340
agagagccag gagaggtaag ggtgtgttag taaagtgggg ggaggggaaa gatttaataa 2400
cttaactaag tatgtgtttt cttataggac ttgtgcctcc aggttataaa tatcttgggc 2460
ctgggaacag tcttgaccaa ggagaaccaa ctaacccttc tgacgccgct gcaaaagaac 2520
acgacgaagc ttacgctgct tatcttcgct ctggtaaaaa cccatactta tatttctcgc 2580
cagcagatca acgctttata gatcaaacta aggacgctaa agattggggg gggaaaatag 2640
gacattattt ttttagagct aaaaaggcaa ttgctccagt attaactgat acaccagatc 2700
atccatcaac atcaagacca acaaaaccaa ctaaaagaag taaaccacca cctcatattt 2760
tcatcaatct tgcaaaaaaa aaaaaagccg gtgcaggaca agtaaaaaga gacaatcttg 2820
caccaatgag tgatggagca gttcaaccag acggtggtca acctgctgtc agaaatgaaa 2880
gagctacagg atctgggaac gggtctggag gcgggggtgg tggtggttct gggggtgtgg 2940
ggatttctac gggtactttc aataatcaga cggaatttaa atttttggaa aacggatggg 3000
tggaaatcac agcaaactca agcagacttg tacatttaaa tatgccagaa agtgaaaatt 3060
ataaaagagt agttgtaaat aatatggata aaactgca 3098
<210> 3
<211> 2064
<212> DNA
<213> Mink enteritis parvovirus
<400> 3
gttaaaggaa acatggcttt agatgatact catgtacaaa ttgtaacacc ttggtcattg 60
gttgatgcaa atgcttgggg agtttggttt aatccaggag attggcaact aattgttaat 120
actatgagtg agttgcattt agttagtttt gaacaagaaa tttttaatgt tgttttaaag 180
actgtttcag aatctgctac tcaaccacca actaaagttt ataataatga tttaactgca 240
tcattgatgg ttgcattaga tagtaataat actatgccat ttactccagc agctatgaga 300
tctgagacat tgggttttta tccatggaaa ccaaccatac caactccatg gagatattat 360
tttcaatggg atagaacatt aataccatct catactggaa ctagtggcac accaacaaat 420
gtatattatg gtacagatcc agatgatgtt caattttata ctattgaaaa ttctgtgcca 480
gtacacttac taagaacagg tgatgaattt gctacaggaa catttttttt tgattgtaaa 540
ccatgtagac taacacatac atggcaaaca aatagagcat tgggcttacc accatttcta 600
aattctttgc ctcaatctga aggagctact aactttggtg atataggagt tcaacaagat 660
aaaagacgtg gtgtaactca aatgggaaat acagactata ttactgaagc tactattatg 720
agaccagctg aggttggtta tagtgcacca tattattctt ttgaagcatc tacacaaggg 780
ccatttaaaa cacctattgc agcaggacgg gggggagcgc aaacagatga aaatcaagca 840
gcagatggtg atccaagata tgcatttggt agacaacatg gtcaaaaaac tactacaaca 900
ggagaaacac ccgagagatt tacatatata gcacatcaag atacaggaag atatccagaa 960
ggagattgga ttcaaaatat taactttaac cttcctgtaa caaatgataa tgtattgcta 1020
ccaacagatc caattggagg taaaacagga attaactata ctaatatatt taatacttat 1080
ggtcctttaa ctgcattaaa taatgtacca ccagtttatc caaatggtca aatttgggat 1140
aaagaatttg atactgactt aaaaccaaga cttcatgtaa atgcaccatt tgtttgtcaa 1200
aataattgtc ctggtcaatt atttgtaaaa gttgcgccta atttaacaaa tgaatatgat 1260
cctgatgcat ctgctaatat gtcaagaatt gtgacttact cagatttttg gtggaaaggt 1320
aaattagtat ttaaagctaa actaagagca tctcatactt ggaatccaat tcaacaaata 1380
agtattaatg tagataacca atttaactat gtaccaaata atattggagc tatgaaaatt 1440
gtatatgaaa aatctcaact agcacctaga aaattatatt aatatactta ctatgttttt 1500
atgtttatta catatcaact agcacctaga aaattatatt aatatactta ctatgttttt 1560
atgtttatta catattattt taagattaat taaattacag catagaaata ttgtacttgt 1620
atttgatata ggatttagaa ggtttgttat atggtataca ataactgtaa gaaatagaag 1680
aacatttaga tcatagttag tagtttgttt tataaaatgt attgtaaact attaatgtat 1740
gttgttatgg tgtgggtggt tggttggttt gcccttagaa tatgttaagg accaaaaaaa 1800
tcaataaaag acatttaaaa ctaaatggtc tcgtatactg tctataaggt gaactaacct 1860
taccataagt atcaatctgt ctttaagggg ggggtgggtg ggagatacac aacatcagta 1920
gactgactgg cctggttggt tgctctgctt aatcaaccag accgcgtagc ggtctggttg 1980
attaagcgca accaaccagg ccagtcagtc tactgatgtt gtgtatctcc cacccacccc 2040
ccccttaaag acagattgat actt 2064
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ctttgcctca atctgaagga gt 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gaattggatt ccaagtatga gat 23

Claims (5)

1.一种水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆的构建方法，其特征在于， 所述方法主要包括如下步骤：将水貂肠炎细小病毒复制形式的完整基因组进行酶切；将酶切后得到的两段基因片段，以分段的形式依次定向克隆到载体pUC18-M，获得重组质粒；
所述载体pUC18-M由载体pUC18经酶切改造而成：首先使用Hind Ⅲ 酶切将环状质粒线性化，然后使用Blunting平端化酶处理将质粒DNA两端的粘性末端变为平末端；
所述两段基因片段获取方法如下：将水貂肠炎细小病毒接种CRFK细胞，当细胞生长旺盛且大部分肿胀变圆时收取细胞进行基因组提取，获得水貂肠炎细小病毒复制形式的完整基因组；用PstⅠ酶切基因组产生两个DNA片段。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下，
（1）载体pUC18改造
首先使用Hind Ⅲ 将pUC18线性化，然后使用Blunting平端化酶处理使载体片段两端由黏性末端变为平末端，命名为pUC18-M；将pUC18-M载体进行PstⅠ酶切使载体片段的一端变为黏性末端；
（2）MEV复制形式基因组提取
将MEV病毒接种于CRFK细胞，当细胞状态处于生长旺盛且大部分细胞肿胀变圆时，进行基因组提取；
（3）MEV复制形式基因组分段克隆
使用PstⅠ对步骤（2）得到的MEV复制形式双链基因组进行酶切，切下两个DNA片段MEV-5'和MEV-3'；先将pUC18-M、MEV-3'进行连接转化，得到pM-MEV-3'重组质粒；然后将pM-MEV-3'重组质粒先进行PstⅠ酶切，再进行Sma I酶切；酶切后的pM-MEV-3'、MEV-5'连接转化后得到pM-MEV重组质粒。
3.权利要求1或2所述的方法构建得到的水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆。
4.权利要求3所述的水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆在水貂肠炎细小病毒拯救、非疾病治疗目的的水貂肠炎细小病毒的致病机理和致病力研究以及制备水貂肠炎细小病毒疫苗中的应用。
5.一种拯救水貂肠炎细小病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：离心管内加入Lipofectamine 2000转染试剂，再加入DMEM培养液混匀，静置；加入权利要求2所述方法得到的pM-MEV重组质粒混匀，室温静置20min得到转染混合物；将长满单层的CRFK细胞去掉培养基，用PBS或无血清培养基清洗2-3次，加入所述转染混合物，将细胞放入37℃、 5% CO2培养箱中培养1h，然后加入血清含量7%的完全培养基继续培养24-48h，进行细胞传代；收集出现疑似细胞病变的细胞上清液，得到拯救病毒。
CN202010203738.3A 2020-03-20 2020-03-20 水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用 Active CN111334528B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010203738.3A CN111334528B (zh) 2020-03-20 2020-03-20 水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010203738.3A CN111334528B (zh) 2020-03-20 2020-03-20 水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111334528A CN111334528A (zh) 2020-06-26
CN111334528B true CN111334528B (zh) 2022-02-18

Family

ID=71180358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010203738.3A Active CN111334528B (zh) 2020-03-20 2020-03-20 水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111334528B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114921422B (zh) * 2022-05-25 2023-04-25 西南民族大学 一种犬源猫细小病毒分离株及其应用
CN115161291A (zh) * 2022-05-26 2022-10-11 西南民族大学 一株猫细小病毒毒株及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2266805A1 (en) * 1998-03-27 1999-09-27 An-Go-Gen Inc. Cell-based gene therapy in the treatment of pulmonary disorders
CN1314942A (zh) * 1998-06-19 2001-09-26 Id-莱利斯塔德动物育种及动物保健研究所公司 新城疫病毒感染性克隆、疫苗及诊断分析
CN103305534A (zh) * 2013-05-22 2013-09-18 中国农业大学 一种水貂肠炎病毒反向遗传学操作***及其应用
CN103952378A (zh) * 2014-04-29 2014-07-30 中国农业科学院特产研究所 自然无血凝性水貂肠炎病毒株mev-nh及其制备方法和应用
CN105907781A (zh) * 2015-04-22 2016-08-31 湖南人文科技学院 弱毒力cmv载体在表达抗虫基因增强植物抗虫性方面的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2032423C1 (ru) * 1991-08-19 1995-04-10 Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Вакцина против вирусного энтерита, ботулизма и псевдомоноза норок
WO2015157189A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-15 The Regents Of The University Of California Vaccines and uses thereof
CN105219735B (zh) * 2015-09-21 2018-04-03 山东农业大学 一种鸭细小病毒毒株及其灭活疫苗和制备方法
CN105154410B (zh) * 2015-09-21 2018-04-03 山东农业大学 一种鸭细小病毒毒株及其活疫苗
SG11202000764RA (en) * 2017-08-09 2020-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acid molecules and uses thereof
CN113227385A (zh) * 2018-08-09 2021-08-06 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 核酸分子及其用于非病毒基因疗法的用途
CN111961674B (zh) * 2020-08-31 2022-05-06 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草PVY预警基因Ntab0224260及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2266805A1 (en) * 1998-03-27 1999-09-27 An-Go-Gen Inc. Cell-based gene therapy in the treatment of pulmonary disorders
CN1314942A (zh) * 1998-06-19 2001-09-26 Id-莱利斯塔德动物育种及动物保健研究所公司 新城疫病毒感染性克隆、疫苗及诊断分析
CN103305534A (zh) * 2013-05-22 2013-09-18 中国农业大学 一种水貂肠炎病毒反向遗传学操作***及其应用
CN103952378A (zh) * 2014-04-29 2014-07-30 中国农业科学院特产研究所 自然无血凝性水貂肠炎病毒株mev-nh及其制备方法和应用
CN105907781A (zh) * 2015-04-22 2016-08-31 湖南人文科技学院 弱毒力cmv载体在表达抗虫基因增强植物抗虫性方面的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
两种水貂肠炎细小病毒的分子生物学特征比较研究;朱倩;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》;20201115;A006-79 *
反向遗传学技术在麻疹病毒属病毒中的研究进展;石晓玲等;《西北民族大学学报(自然科学版)》;20200315;第41卷(第117期) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111334528A (zh) 2020-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108531663B (zh) 鸭腺病毒DAdV-3和DAdV-A通用型检测引物及其应用
CN110079541B (zh) 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用
CN111849979B (zh) 一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA及RPSA基因敲除细胞系的构建方法
CN111334528B (zh) 水貂肠炎细小病毒全基因组感染性克隆及其构建方法和应用
CN104152416B (zh) 伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用
CN114058619B (zh) Riplet敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用
CN113470745A (zh) SARS-CoV2潜在突变位点的筛选方法及其应用
CN114774372A (zh) 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用
CN106939320A (zh) 一种伪狂犬病毒js‑2012株感染性克隆质粒、构建方法与应用
CN110205308A (zh) 一种表达ha基因的重组火鸡疱疹病毒及其应用
CN113755565A (zh) 一种用于鉴别非洲猪瘟野毒与疫苗毒株的四重定量荧光探针引物组合、试剂盒及鉴别方法
CN105713866A (zh) 人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用
CN116836244A (zh) 赤羽病毒akav/jl/2022的全基因组序列及其扩增引物
CN103305475B (zh) 肠道病毒71基因修饰***的建立及其应用
CN107201371B (zh) 一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒
CN112941240B (zh) 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法
CN106893732A (zh) 一种鹅细小病毒感染性克隆的拯救方法
CN108754019B (zh) 一种猪流行性腹泻病毒orf1基因全序列的扩增方法
CN113528568A (zh) 一种黄麻黄脉病毒侵染性克隆及其构建方法
CN109593761B (zh) 一种与布鲁氏菌毒力相关的small RNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用
CN113584080A (zh) 一种Nluc标记的重组猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建及其应用
CN114457042A (zh) 小反刍兽疫病毒强毒反向遗传***及动物感染模型
CN111635910A (zh) 大熊猫轮状病毒ch-1株vp7阳性质粒及其构建方法和应用
CN110468113A (zh) 重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒强毒株及其应用
CN114480378B (zh) 一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒sd株全长感染性克隆的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant