CN107475275B - 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 - Google Patents

嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107475275B
CN107475275B CN201710792918.8A CN201710792918A CN107475275B CN 107475275 B CN107475275 B CN 107475275B CN 201710792918 A CN201710792918 A CN 201710792918A CN 107475275 B CN107475275 B CN 107475275B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chimeric antigen
expression gene
antigen receptor
nucleotide sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710792918.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107475275A (zh
Inventor
黄彪
陈雪梅
刘韬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Huayun Biotechnology Co., Ltd.
Original Assignee
Shenzhen Huayun Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Huayun Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Huayun Biotechnology Co ltd
Priority to CN201710792918.8A priority Critical patent/CN107475275B/zh
Publication of CN107475275A publication Critical patent/CN107475275A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107475275B publication Critical patent/CN107475275B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。该嵌合抗原受体表达基因包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因。第一融合蛋白表达基因包括依次连接的粘蛋白‑1抗体表达基因、notch受体表达基因及Gal4‑VP64转录激活蛋白表达基因。第二融合蛋白表达基因包括依次连接的Gal4‑UAS启动子表达基因和间皮素抗体表达基因。这种创新设计的嵌合抗原受体表达基因能够成功导入T细胞中形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，在粘蛋白‑1和间皮素双抗原信号同时存在的条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。

Description

嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修 饰的T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是人工构建的融合基因编码的跨膜分子。一般包括胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。CAR-T，即嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞。CAR-T细胞应用于癌症治疗，显示了极佳疗效和巨大的潜力。如诺华于2015年12月5日在ASH会议上公布了其靶向CD19分子的CAR-T(CTL019)在治疗难治、复发急性淋巴性白血病(ALL)方面的2期临床数据，2期数据与2014年公布的1期数据相似，完全缓解率(CR)分布高达93％(55/59)和92％(36/39)。
传统的CARs主要可以分为三代，如图1，第一代CARs通常使用一条信号链，称为“信号1”(signal 1)。第一代CAR-T细胞在临床试验中表现出了有限的功效，这可能是由于移植T细胞激活诱导的细胞死亡(activation-induced cell death，AICD)，或者缺乏长期的T细胞扩增。第二代CARs利用第一代CARs作为一种支柱，增加了一个额外的共刺激信号域，称为“信号2”；因此，相同的受体需传递“信号1”和“信号2”以优化T细胞的激活。第二代CAR-T与第一代CAR-T相比，回输到非霍奇金淋巴瘤患者中的持久性和扩增性增强了。但是究竟哪一种是最佳的第二信号还有待确定。另一个需要解决的问题是，当比较不同的CAR-T细胞设计时，是否持久性和/或扩增性的阈值对产生有效临床结果是必须的。第三代CARs的信号域包两个共刺激域，临床前研究表明，第三代CAR-T细胞比第二代CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤效力。
然而，CAR-T细胞应用于癌症治疗，在显示出疗效的同时，伴随有毒性和风险，甚至导致病人死亡。2016年9月26日，Kite公布了KTE-C19的II期临床数据的中期分析结果。治疗的完全缓解率达到了47％。然而，此次参与试验的62名患者中，有1/3患者产生了严重的神经毒性，18％的患者受到了细胞因子释放综合征的影响，2人死于KTE-C19相关的不良反应。
其中，细胞因子释放综合症(cytokines release syndrome，CRS)是最显著的毒性，为头号安全风险。细胞因子释放综合症是基于T细胞的激活，是T细胞激活活性的一个反应，所以副作用是与CAR-T的治疗机制正相关的临床反应。高度增殖的T细胞能引起CRS，表现为高热和肌痛，不稳定的低血压和呼吸衰竭。这是一个意想不到的结果，因为在临床前动物模型中没有出现类似症状。从CRS观察中发现一个关键的点，除了预期的效应细胞因子INF-γ外，IL-6在CART治疗的细胞指数级增殖期间也会迅速提升。CRS可能直接与另一个毒性相关联，即巨噬细胞活化综合征。
除了CRS，还存在由工程改造的T细胞的抗原特异性导致的“靶向”毒性。例如溶瘤综合征，它直接是由肿瘤细胞的裂解而导致的。当CARs靶向于B细胞表面表达的靶点如CD19时，会引起B细胞发育不良，这就是一个“靶向”毒性，但却错误的攻击了正常组织细胞的结果。只要CD19CAR-T细胞长时间存在，B细胞发育不良的情况就不会改善。B细胞发育不良与CD20特异性单抗治疗一样会造成严重的低丙种球蛋白血症，需要静脉注射免疫球蛋白。最近报告了输注改造的T细胞引发致命毒性的2个案例，有一例患者接受了HER2-CAR治疗，两例患者接受了靶向MAGE-A3的TCR-T细胞治疗。在这2个案例中，均是因为正常组织表达这些靶点，导致急性不可逆的心肺毒性。所有的靶向毒性均是由于改造的T细胞无法区别表达靶向抗原的正常细胞和肿瘤细胞所致。
CAR-T治疗白血病会引起神经***症状，具有神经毒性。几个研究小组报道，这些症状具有多样性但可自行消退，如谵妄、语言障碍、运动障碍、缄默症和癫痫发作。虽然与全身CRS的发生有些时间上的关联，当然也与CAR-T存在于脑脊液中相关。这些症状的机制与靶组织仍有待确认。
另外，CAR-T细胞应用于癌症治疗还有潜在的风险，如输注活化的T细胞存在引起自身免疫性疾病的风险，输注同种异体T细胞存在抗宿主移植病的潜在风险。这可能会引起曾接受同种异体造血干细胞移植的患者的担心。
综上，传统的嵌合抗原受体存在治疗副作用多、特异性差等问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种治疗副作用少、特异性高的嵌合抗原受体及其表达基因和应用。
此外，还有必要提供一种双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。
一种嵌合抗原受体表达基因，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因；
所述第一融合蛋白表达基因包括依次连接的粘蛋白-1抗体表达基因、notch受体表达基因及Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因；
所述第二融合蛋白表达基因包括依次连接的Gal4-UAS启动子表达基因和间皮素抗体表达基因。
在一个实施方式中，所述粘蛋白-1抗体表达基因包括：(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述notch受体表达基因包括：(a)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，(b)、与SEQID No.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQID No.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述Gal4-UAS启动子表达基因包括：(a)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述间皮素抗体表达基因表达基因包括：(a)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述第二融合蛋白表达基因还包括终止子表达基因，所述终止子表达基因与所述间皮素抗体表达基因连接，所述终止子表达基因包括：(a)、SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
一种表达载体，所述表达载体中含有上述任一项所述的嵌合抗原受体表达基因。
一种嵌合抗原受体，包括第一融合蛋白和第二融合蛋白；
所述第一融合蛋白包括依次连接的粘蛋白-1抗体、notch受体及Gal4-VP64转录激活蛋白；
所述第二融合蛋白包括依次连接的Gal4-UAS启动子和间皮素抗体。
在一个实施方式中，所述粘蛋白-1抗体包括：(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽，或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述notch受体包括：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述Gal4-VP64转录激活蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，所述第二融合蛋白还包括终止子，所述终止子与所述间皮素抗体连接，所述第二融合蛋白中，
所述Gal4-UAS启动子包括：(a)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述间皮素抗体包括：(a)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述终止子包括：(a)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
一种双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述T细胞中导入了上述任一项所述的嵌合抗原受体表达基因，或者所述T细胞中转染了上述的表达载体，或者所述T细胞能够表达上述任一项所述的嵌合抗原受体。
上述任一项所述嵌合抗原受体表达基因、上述的表达载体、上述任一项所述的嵌合抗原受体或如权利要求9所述的双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤的药物中的应用。
上述嵌合抗原受体表达基因包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因。第一融合蛋白表达基因包括依次连接的粘蛋白-1抗体表达基因、notch受体表达基因及Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因。第二融合蛋白表达基因包括依次连接的Gal4-UAS启动子表达基因和间皮素抗体表达基因。这种创新设计的嵌合抗原受体表达基因能够成功导入T细胞中形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，用于肿瘤等的治疗。第一融合蛋白表达后能够识别肿瘤细胞表面的标记物粘蛋白-1(muc-1)从而将嵌合抗原受体特异性的靶向到相应的病灶位点。且第一融合蛋白与粘蛋白-1接触后，notch受体发生自身切割，释放Gal4-VP64转录激活蛋白。Gal4-VP64转录激活蛋白激活第二融合蛋白的Gal4-UAS启动子，进而启动间皮素抗体的表达。当肿瘤细胞表面表达粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)两种肿瘤标记物时，具备粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号，该嵌合抗原受体发动免疫攻击，杀死肿瘤细胞。当粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号不存在或者只有其中一种时，该嵌合抗原受体不会发动免疫攻击，处于关闭状态。因此粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号是T细胞中嵌合抗原受体行为的“开关”，在特定的双抗原信号条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。
附图说明
图1为一实施方式CARs结构示意图；
图2为一实施方式的双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞在双抗原信号存在的条件下细胞内信号传导示意图；
图3为一实施方式的双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法的流程图；
图4为实施例1中构建的第一表达载体酶切产物的电泳图；
图5为实施例1中构建的第二表达载体酶切产物的电泳图；
图6为显微镜下观察实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞(JurkatCAR)的图片；
图7为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下的增殖结果对比图；
图8为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下的IFNγ分泌量结果对比图；
图9为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下杀伤靶细胞的流式散点结果比对图；
图10为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下对靶细胞杀伤率的统计结果比对图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一种嵌合抗原受体表达基因，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因。第一融合蛋白表达基因包括依次连接的粘蛋白-1抗体表达基因、notch受体表达基因及Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因。第二融合蛋白表达基因包括依次连接的Gal4-UAS启动子表达基因和间皮素抗体表达基因。
该嵌合抗原受体表达基因能够表达嵌合抗原受体(CAR)，从而用于肿瘤的治疗。
具体地，粘蛋白-1抗体表达基因用于表达粘蛋白-1(muc-1)。粘蛋白-1在肿瘤细胞特别是实体肿瘤细胞中表达量较高，而正常组织中表达量较低或几乎不表达，因此粘蛋白-1(muc-1)能够作为***的“理想抗原”。通过在嵌合抗原受体(CAR)中设计粘蛋白-1抗体(anti muc-1)，转染了该嵌合抗原受体(CAR)的T细胞能够特异性的靶向到肿瘤组织部位，提高特异性，减少对其他组织的伤害，有效减少癌症治疗的副作用。
在一个实施方式中，粘蛋白-1抗体表达基因包括：(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。上述核苷酸序列能够顺利表达获得粘蛋白-1抗体(anti muc-1)。
具体地，notch受体表达基因用于表达notch受体。notch受体一端连接粘蛋白-1抗体另一端连接Gal4-VP64转录激活蛋白。粘蛋白-1抗体与粘蛋白-1结合后，notch受体发生自身切割，释放Gal4-VP64转录激活蛋白。
在一个实施方式中，notch受体表达基因包括(a)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQID No.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。发明人设计合成的如SEQ ID No.2所示的序列能够顺利表达获得notch受体。
具体地，Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因用于表达Gal4-VP64转录激活蛋白。Gal4-VP64转录激活蛋白更够激活第二融合蛋白中的Gal4-UAS启动子，从而诱导第二融合蛋白中的间皮素抗体表达。
在一个实施方式中，Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施方式中，第一融合蛋白表达基因包括依次连接的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。该核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽表达式为anti muc-1-synNotch-Gal4VP64。
具体地，Gal4-UAS启动子表达基因用于表达Gal4-UAS启动子。Gal4-UAS启动子启动间皮素抗体的表达。
在一个实施方式中，Gal4-UAS启动子表达基因包括：(a)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
具体地，间皮素抗体表达基因用于表达间皮素抗体。间皮素(mesothelin)在肿瘤细胞中表达量较高，而正常组织中表达量较低或几乎不表达，因此间皮素(mesothelin)能够作为***的“理想抗原”。粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)组成双抗原信号，在双抗原信号存在的有条件下，该嵌合抗原受体发动免疫攻击，杀死肿瘤细胞。
在一个实施方式中，间皮素抗体表达基因表达基因包括：(a)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。上述核苷酸序列能够顺利表达获得间皮素抗体。
在一个实施方式中，第二融合蛋白表达基因还包括终止子表达基因，终止子表达基因与间皮素抗体表达基因连接，终止子表达基因包括：(a)、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQID No.6所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。设置终止子进一步调节第二融合蛋白的表达。
在一个实施方式中，第二融合蛋白表达基因包括依次连接的SEQ ID No.4所示的核苷酸序列、SEQ ID No5所示的核苷酸序列和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。该核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽表达式为Gal4-UAS promoter-anti mesothelin CAR-SV40_PA_terminator。
这种创新设计的嵌合抗原受体表达基因能够成功导入T细胞中形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，用于肿瘤的治疗。
一种表达载体，该表达载体中含有上述嵌合抗原受体表达基因。
具体地，表达载体例如可以为***了上述嵌合抗原受体表达基因的慢病毒载体pLV-IRES-Puro，将上述第一融合蛋白表达基因的第一融合蛋白表达基因分别***到慢病毒载体中再转染进入T细胞，获得嵌合抗原受体修饰的T细胞。
一实施方式的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，包括第一融合蛋白和第二融合蛋白。第一融合蛋白包括依次连接的粘蛋白-1抗体、notch受体及Gal4-VP64转录激活蛋白。第二融合蛋白包括依次连接的Gal4-UAS启动子和间皮素抗体。
具体地，粘蛋白-1抗体、notch受体、Gal4-VP64转录激活蛋白、Gal4-UAS启动子和间皮素抗体的具体功能以及性质可参见上文描述，在此不作赘述。
在一个实施方式中，粘蛋白-1抗体包括：(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽，或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，notch受体包括：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，Gal4-VP64转录激活蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，Gal4-UAS启动子包括：(a)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，间皮素抗体包括：(a)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，第二融合蛋白还包括终止子，终止子与间皮素抗体连接。终止子包括：(a)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
进一步地，第一融合蛋白包括依次连接的粘蛋白-1抗体、notch受体及Gal4-VP64转录激活蛋白。第一融合蛋白的表达式为anti muc-1-synNotch-Gal4VP64。
进一步地，第二融合蛋白包括依次连接的Gal4-UAS启动子、间皮素抗体和终止子。第二融合蛋白的表达式为Gal4-UAS promoter-anti mesothelin CAR-SV40_PA_terminator。
可以理解，由于嵌合抗原受体的表达基因的多态性及变异，编码相同的蛋白可能会存在多种形式的表达基因。如果表达基因中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、***、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。表达得到的蛋白质不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。因此，能够表达获得与嵌合抗原受体没有明显的功能差异的多肽或蛋白的表达基因应当认为与本申请中的嵌合抗原受体表达基因等同的表达基因。与嵌合抗原受体没有明显的功能差异的多肽或蛋白都应当认为与本申请中的嵌合抗原受体等同的蛋白。
经过不断的研究探索，成功设计出上述功能结构的嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体(CAR)能够在T细胞中特异性的表达从而用于肿瘤等的治疗。当肿瘤细胞表面表达粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)两种肿瘤标记物时，具备粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号，该嵌合抗原受体发动免疫攻击，杀死肿瘤细胞。当粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号不存在或者只有其中一种时，该嵌合抗原受体不会发动免疫攻击，处于关闭状态。因此粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号是T细胞中嵌合抗原受体行为的“开关”，在特定的双抗原信号条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。
上述嵌合抗原受体(CAR)能够运用在抗肿瘤的药物中。
一实施方式的应用中，嵌合抗原受体(CAR)用在抗乳腺癌的药物中。
一实施方式的双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)，该T细胞中T细胞中导入了上述的嵌合抗原受体表达基因。或者该T细胞中转染了上述表达载体。或者该T细胞能够表达如上述的嵌合抗原受体。
嵌合抗原受体(CAR)的表达基因以及结构请参阅上文所述，在此不作赘述。
在一个实施方式中，请参阅图2，嵌合抗原受体修饰的T细胞中的粘蛋白-1抗体与肿瘤细胞上的粘蛋白-1结合，notch受体发生自身切割，释放Gal4-VP64转录激活蛋白。Gal4-VP64转录激活蛋白激活第二融合蛋白的Gal4-UAS启动子，进而启动间皮素抗体的表达。当肿瘤细胞表面表达粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)两种肿瘤标记物时，具备粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号，分别与粘蛋白-1抗体和间皮素抗体结合，嵌合抗原受体修饰的T细胞被激活，进而发动免疫攻击，杀死肿瘤细胞。
当粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号不存在或者只有其中一种时，该嵌合抗原受体不会发动免疫攻击，处于关闭状态。
在一个实施方式中，T细胞为Jurkat细胞。Jurkat细胞属于T淋巴细胞中的一种，其增殖能力强，适宜作为嵌合抗原受体(CAR)的宿主细胞。
实验结果表明，上述双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)对表达特定粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号的肿瘤细胞有特异性的高效杀伤作用。而对不表达粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)的细胞或者只表达其中一种抗原的细胞，该嵌合抗原受体不会发动免疫攻击，处于关闭状态，对正常细胞杀伤作用很小。因此，该嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)有望应用在抗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供一种思路。该嵌合抗原受体修饰的T细胞实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少。
上述双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)能够运用在抗肿瘤的药物或抗病毒感染的药物中。
一实施方式的应用中，双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞运用在抗乳腺癌的药物中。
请参阅图3，一实施方式的双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，包括如下步骤S110～S130。
S110、提供嵌合抗原受体表达基因，该嵌合抗原受体表达基因包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因，第一融合蛋白表达基因包括依次连接的粘蛋白-1抗体表达基因、notch受体表达基因及Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因，第二融合蛋白表达基因包括依次连接的Gal4-UAS启动子表达基因和间皮素抗体表达基因。
具体地，嵌合抗原受体(CAR)的结构请参阅上文所述，在此不作赘述。
在一个实施方式中，第二融合蛋白还包括终止子，终止子与间皮素抗体连接。
在一个实施方式中，编码的第一融合蛋白的表达式为anti muc-1-synNotch-Gal4VP64。编码的第二融合蛋白的表达式为Gal4-UAS promoter-anti mesothelin CAR-SV40_PA_terminator。
具体地，通过基因合成的方式合成anti muc-1-synNotch-Gal4VP64的核酸序列以及Gal4-UAS promoter-anti mesothelin CAR-SV40_PA_terminator的核酸序列。获得嵌合抗原受体表达基因。
S120、将S110中获得的第一融合蛋白表达基因连接到慢病毒载体中，得到第一表达载体，并将S110中获得的第二融合蛋白表达基因连接到慢病毒载体中，得到第二表达载体。
具体地，将获得的第一融合蛋白表达基因、第二融合蛋白表达基因通过限制性内切酶双酶切，然后连接到经过相同限制性内切酶双酶切处理的慢病毒载体中。
在一个实施方式中，限制性内切酶例如为包括Nde I、Xho I、EcoR I或BamH I等。
在一个实施方式中，慢病毒载体为pLV-IRES-Puro。
S130、将S120中获得的第一表达载体和第二表达载体包装为慢病毒并转染至T细胞中，得到双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞。
具体地，将S120中获得的第一表达载体和第二表达载体先转染到宿主细胞如239T细胞中，扩增获得大量的慢病毒。然后将一定病毒滴度的慢病毒转染至T细胞中，获得双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)。
在一个实施方式中，表达载体包装为慢病毒并转染至T细胞中的操作中，病毒MOI值约为10。
上述制备双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，操作简便，制备获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在特定的双抗原存在条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
制备双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞
通过基因公司分别合成编码第一融合蛋白的第一融合蛋白表达基因(包括依次连接的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。第一融合蛋白的表达式为anti muc-1-synNotch-Gal4VP64。
通过EcoR I和BamH I双酶切第一融合蛋白表达基因，并克隆进慢病毒载体pLV-IRES-Puro中，得到第一表达载体。将构建好的第一表达载体EcoR I和BamH I双酶切进行鉴定，酶切产物电泳图如图4所示(其中图4中2.4kb片段为目的片段，8.1kb片段为载体本身片段)。目的片段的大小与预期相符，说明载体构建成功。
通过基因公司分别合成编码第二融合蛋白的第二融合蛋白表达基因(包括依次连接的SEQ ID No.4所示的核苷酸序列、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列和SEQ ID No.6)。第二融合蛋白的表达式为Gal4-UAS promoter-anti mesothelin CAR-SV40_PA_terminator。
通过Nde I和Xho I双酶切第二融合蛋白表达基因，并克隆进慢病毒载体pLV-IRES-Puro中，得到第二表达载体。将构建好的第二表达载体Nde I和Xho I双酶切进行鉴定，酶切产物电泳图如图5所示(其中图5中2kb片段为目的片段，9.6kb片段为载体本身片段)。目的片段的大小与预期相符，说明载体构建成功。
将上述获得的第一表达载体和第二表达载体为慢病毒，并将病毒(病毒MOI值分别为10)转染至Jurkat E6.1细胞中(T淋巴细胞株，购自美国典型物保藏中心，ATCC)，得到双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的Jurkat细胞(JurkatCAR)。
2天后，将转染后的Jurkat E6.1细胞转移到具有嘌呤霉素的RPMI 1640培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。经21天的筛选，建立具有嘌呤霉素抗性的双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的Jurkat E6.1细胞株(JurkatCAR)。显微镜下观察转染后的JurkatE6.1(JurkatCAR)细胞的生长照片如图6所示，Jurkat E6.1生长状态良好，转染成功。
测试一
双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞增殖情况测定
将5×105个实施例1中制备的JurkatCAR细胞分别加入含有U-2OS、U-2OS/muc-1+、U-2OS/muc-1+/mesothelin+、A431、A431/mesothelin+、MCF7细胞的6孔板(5×105/孔)中。其中，U-2OS为人类骨肉瘤细胞，A431为人表皮癌细胞，MCF7为人乳腺癌细胞，U-2OS、A431和MCF7均购自ATCC。U-2OS/muc-1+表示在U-2OS细胞的基础通过muc-1遗传修饰，使U-2OS过表达muc-1抗原。U-2OS/muc-1+/mesothelin+表示在U-2OS细胞的基础通过muc-1和mesothelin遗传修饰，使U-2OS过表达muc-1抗原和mesothelin抗原。A431/mesothelin+表示在A431细胞的基础通过mesothelin遗传修饰，使A431过表达mesothelin抗原。上述细胞中，U-2OS不表达muc-1抗原和mesothelin抗原。U-2OS/muc-1+和A431只能表达muc-1抗原。U-2OS/muc-1+/mesothelin+、A431/mesothelin+和MCF7能表达muc-1抗原和mesothelin抗原。
分别在第3天(D3)、第7天(D7)，对悬浮的JurkatCAR细胞进行细胞计数。结果如图7所示，与muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)双抗原表达的U-2OS/muc-1+/mesothelin+、A431/mesothelin+、MCF7细胞接触后，JurkatCAR能大量增殖。而其他组的JurkatCAR基本不增殖。以上结果表明，当muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)两种抗原信号同时存在时，JurkatCAR(双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)能大量增殖。当双信号不存在或仅存在一种信号时，JurkatCAR(双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)基本不增殖。
测试二
双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞中IFNγ分泌量测定
将5×105个实施例1中制备的JurkatCAR细胞在24孔板中与U-2OS、U-2OS/muc-1+、U-2OS/muc-1+/mesothelin+、A431、A431/mesothelin+、MCF7细胞(5×105/孔)共培养。
72小时后收集上清，通过IFNγ的ELISA检测试剂盒(BD Biosciences)检测IFNγ的分泌量。
结果如图8所示，与muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)两种抗原表达的U-2OS/muc-1+/mesothelin+、A431/mesothelin+、MCF7细胞共培养后，JurkatCAR能大量分泌IFN-γ；其他组基本不分泌IFN-γ。以上结果表明，当muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)两种抗原同时存在，JurkatCAR(双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)能够识别肿瘤细胞靶点并被激活后能够分泌更多IFN-γ。双抗原信号不存在或仅存在一种信号时，JurkatCAR(双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)只分泌少量或基本不分泌IFN-γ。
测试三
双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞体外杀伤作用测定
将实施例1中制备的JurkatCAR细胞与靶细胞U-2OS、U-2OS/muc-1+、U-2OS/muc-1+/mesothelin+、A431、A431/mesothelin+、MCF7细胞共培养(效靶比1:1)。应用CFSE/PI双标法检测遗传修饰后的JurkatCAR细胞对不同类型肿瘤细胞的体外杀伤能力。
方法如下：用终浓度为0.05μM的CFSE对1×106个靶细胞进行活细胞染色标记，将1×106个JurkatCAR细胞和1×106个CFSE标记的靶细胞混匀，200g，1min离心使细胞相互接触，在5％CO2，37℃培养箱中共孵育4h，反应结束后，加入1μg/ml PI染液，混匀，室温避光孵育15min后进行流式检测。
结果如图9和图10所示，图9中右上象限细胞群为被杀死的细胞比例。JurkatCAR能有效杀伤muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)双抗原表达的U-2OS/muc-1+/mesothelin+、A431/mesothelin+、MCF7细胞，而其他组细胞基本不杀伤。以上结果表明，当muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)两种抗原同时存在，JurkatCAR(双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)能够识别并有效杀伤靶细胞。双抗原信号不存在或仅存在一种信号时，JurkatCAR(双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)基本不杀伤靶细胞。
综上，上述双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(JurkatCAR)对表达muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)双抗原的肿瘤细胞有特异性的高效杀伤作用，而在粘蛋白-1(muc-1)和间皮素(mesothelin)双抗原信号不存在或者只有其中一种时，对细胞杀伤作用很小。因此，该嵌合抗原受体修饰的T细胞能够作为抗肿瘤的药物，为肿瘤治疗提供一种思路。该嵌合抗原受体修饰的T细胞在特定的muc-1(粘蛋白-1)和mesothelin(间皮素)双抗原存在条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgctcc ctgtcaccgc actgcttctt ccgctggcac tgctgctgca cgctgcacgg 60
cctgaggtgc agctgcagca gagcggcggc ggcctggtgc agcccggcgg cagcatgaag 120
ctgagctgcg tggccagcgg cttcaccttc agcaactact ggatgaactg ggtgcgccag 180
agccccgaga agggcctgga gtgggtggcc gagatccgcc tgaagagcaa caactacgcc 240
acccactacg ccgagagcgt gaagggccgc ttcaccatca gccgcgacga cagcaagagc 300
agcgtgtacc tgcagatgaa caacctgcgc gccgaggaca ccggcatcta ctactgcacc 360
ttcggcaaca gcttcgccta ctggggccag ggcaccaccg tgaccgtgag cagcggcggc 420
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg acatcgtggt gacccaggag 480
agcgccctga ccaccagccc cggcgagacc gtgaccctga cctgccgcag cagcaccggc 540
gccgtgacca ccagcaacta cgccaactgg gtgcaggaga agcccgacca cctgttcacc 600
ggcctgatcg gcggcaccaa caaccgcgcc cccggcgtgc ccgcccgctt cagcggcagc 660
ctgatcggcg acaaggccgc cctgaccatc accggcgccc agaccgagga cgaggccatc 720
tacttctgcg ccctgtggta cagcaaccac tgggtgttcg gcggcggcac caagctgacc 780
gtgctgggca gcgag 795
<210> 3
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcctggact acagcttcgg gggtggggcc gggcgcgaca tccccccgcc gctgatcgag 60
gaggcgtgcg agctgcccga gtgccaggag gacgcgggca acaaggtctg cagcctgcag 120
tgcaacaacc acgcgtgcgg ctgggacggc ggtgactgct ccctcaactt caatgacccc 180
tggaagaact gcacgcagtc tctgcagtgc tggaagtact tcagtgacgg ccactgtgac 240
agccagtgca actcagccgg ctgcctcttc gacggctttg actgccagcg tgcggaaggc 300
cagtgcaacc ccctgtacga ccagtactgc aaggaccact tcagcgacgg gcactgcgac 360
cagggctgca acagcgcgga gtgcgagtgg gacgggctgg actgtgcgga gcatgtaccc 420
gagaggctgg cggccggcac gctggtggtg gtggtgctga tgccgccgga gcagctgcgc 480
aacagctcct tccacttcct gcgggagctc agccgcgtgc tgcacaccaa cgtggtcttc 540
aagcgtgacg cacacggcca gcagatgatc ttcccctact acggccgcga ggaggagctg 600
cgcaagcacc ccatcaagcg tgccgccgag ggctgggccg cacctgacgc cctgctgggc 660
caggtgaagg cctcgctgct ccctggtggc agcgagggtg ggcggcggcg gagggagctg 720
gaccccatgg acgtccgcgg ctccatcgtc tacctggaga ttgacaaccg gcagtgtgtg 780
caggcctcct cgcagtgctt ccagagtgcc accgacgtgg ccgcattcct gggagcgctc 840
gcctcgctgg gcagcctcaa catcccctac aagatcgagg ccgtgcagag tgagaccgtg 900
gagccgcccc cgccggcgca gctgcacttc atgtacgtgg cggcggccgc ctttgtgctt 960
ctgttcttcg tgggctgcgg ggtgctgctg tcccgcaagc gccggcgg 1008
<210> 2
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggcc tgtgacatct gccggctgaa gaaactgaag 60
tgcagcaaag aaaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgccggtac 120
agccccaaga ccaagagaag ccccctgacc agagcccacc tgaccgaggt ggaaagccgg 180
ctggaaagac tggaacagct gtttctgctg atcttcccac gcgaggacct ggacatgatc 240
ctgaagatgg acagcctgca ggacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300
aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacaga ctggccagcg tggaaaccga catgcccctg 360
accctgcggc agcacagaat cagcgccacc agcagcagcg aggaaagcag caacaagggc 420
cagcggcagc tgacagtgtc tgctgctgca ggcggaagcg gaggctctgg cggatctgat 480
gccctggacg acttcgacct ggatatgctg ggcagcgacg ccctggatga ttttgatctg 540
gacatgctgg gatctgacgc tctggacgat ttcgatctcg acatgttggg atcagatgca 600
ctggatgact ttgacctgga catgctcgga tcatga 636
<210> 4
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catatgggcc taactggccg gtaccgagtt tctagacgga gtactgtcct ccgagcggag 60
tactgtcctc cgactggagc ggagtactgt cctccgatcg gagtactgtc ctccgcgaat 120
tccggagtac tgtcctccga agacgctagc ggggggctat aaaagggggt gggggcgttc 180
gtcctcactc tagatctgcg atctaagtaa gcttggcaat ccggtactgt tggtaaagcc 240
acc 243
<210> 6
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgg gatcccaggt acaactgcag cagtctgggc ctgagctgga gaagcctggc 120
gcttcagtga agatatcctg caaggcttct ggttactcat tcactggcta caccatgaac 180
tgggtgaagc agagccatgg aaagagcctt gagtggattg gacttattac tccttacaat 240
ggtgcttcta gctacaacca gaagttcagg ggcaaggcca cattaactgt agacaagtca 300
tccagcacag cctacatgga cctcctcagt ctgacatctg aagactctgc agtctatttc 360
tgtgcaaggg ggggttacga cgggaggggt tttgactact ggggccaagg gaccacggtc 420
accgtctcct caggtgtagg cggttcaggc ggcggtggct ctggcggtgg cggatcggac 480
atcgagctca ctcagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg 540
acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgcactggt accagcagaa gtcaggcacc 600
tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc aggtcgcttc 660
agtggcagtg ggtctggaaa ctcttactct ctcacaatca gcagcgtgga ggctgaagat 720
gatgcaactt attactgcca gcagtggagt ggttaccctc tcacgttcgg tgctgggaca 780
aagttggaaa tcaaagctag caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgattttt gggtgctggt ggtggttggt 960
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 1020
agtaagagga gcaggggagg gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1200
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1260
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1320
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1380
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1608
<210> 5
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccgcgact ctagagtcgg ggcggccggc cgcttcgagc agacatgata agatacattg 60
atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 120
gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacctcga g 171

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因；
所述第一融合蛋白表达基因包括依次连接的粘蛋白-1抗体表达基因、notch受体表达基因及Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因，所述粘蛋白-1抗体表达基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述notch受体表达基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述Gal4-VP64转录激活蛋白表达基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述第二融合蛋白表达基因包括依次连接的Gal4-UAS启动子表达基因和间皮素抗体表达基因，所述间皮素抗体表达基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述Gal4-UAS启动子表达基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述第二融合蛋白表达基因还包括终止子表达基因，所述终止子表达基因与所述间皮素抗体表达基因连接，所述终止子表达基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求1～3任一项所述的嵌合抗原受体表达基因。
5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括第一融合蛋白和第二融合蛋白；
所述第一融合蛋白包括依次连接的粘蛋白-1抗体、notch受体及Gal4-VP64转录激活蛋白，所述粘蛋白-1抗体是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽，所述notch受体是由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽，所述Gal4-VP64转录激活蛋白是由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；
所述第二融合蛋白包括依次连接的Gal4-UAS启动子和间皮素抗体，所述间皮素抗体是由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述Gal4-UAS启动子由SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。
7.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第二融合蛋白还包括终止子，所述终止子与所述间皮素抗体连接，所述第二融合蛋白中，所述终止子是由SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。
8.一种双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于，所述T细胞中导入了如权利要求1～3任一项所述的嵌合抗原受体表达基因，或者所述T细胞中转染了如权利要求4所述的表达载体，或者所述T细胞能够表达如权利要求5～7任一项所述的嵌合抗原受体。
9.如权利要求1～3任一项所述嵌合抗原受体表达基因、如权利要求4所述的表达载体、如权利要求5～7任一项所述的嵌合抗原受体或如权利要求8所述的双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤的药物中的应用。
CN201710792918.8A 2017-09-05 2017-09-05 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 Active CN107475275B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710792918.8A CN107475275B (zh) 2017-09-05 2017-09-05 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710792918.8A CN107475275B (zh) 2017-09-05 2017-09-05 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107475275A CN107475275A (zh) 2017-12-15
CN107475275B true CN107475275B (zh) 2021-01-08

Family

ID=60603677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710792918.8A Active CN107475275B (zh) 2017-09-05 2017-09-05 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107475275B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019141270A1 (zh) * 2018-01-19 2019-07-25 科济生物医药（上海）有限公司 SynNotch受体调控表达IL12
CN109180805B (zh) * 2018-08-21 2021-12-28 南方医科大学 新型SynNotch合成受体及其编码基因
CN109748973B (zh) * 2019-02-02 2022-07-26 深圳市芥至和生物科技有限公司 表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用
CN113248619A (zh) * 2020-02-10 2021-08-13 上海帝鹤思医疗科技有限公司 一种双靶向嵌合抗原受体、编码基因及重组表达载体
CN113388643A (zh) * 2021-06-18 2021-09-14 廖文强 一种具有分子开关的基因序列、质粒和免疫细胞

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106279438A (zh) * 2016-08-24 2017-01-04 胜武（北京）生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
CN106749677A (zh) * 2017-01-04 2017-05-31 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种靶向mll白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106279438A (zh) * 2016-08-24 2017-01-04 胜武（北京）生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
CN106749677A (zh) * 2017-01-04 2017-05-31 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种靶向mll白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Combinatorial Antigen Targeting: Ideal T-Cell Sensing and Anti-Tumor Response;Themeli M;《Trends Mol Med》;20160310;第22卷(第4期);全文 *
Engineering T Cells with Customized Therapeutic Response Programs Using Synthetic Notch Receptors;Roybal KT;《Cell》;20160929;第167卷(第2期);全文 *
GAL4/UAS***在转基因技术中的应用研究进展;李春峰等;《生物技术》;20061231;第16卷(第1期);第78-79页1GAL4/UAS*** *
Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen Sensing Circuits;Roybal KT等;《cell》;20160211;第164卷(第4期);第1页第1段第3页倒数第2段第16页图2；第4页第2段第14页图1（C）；第21页图5-6；第8-9页材料与方法 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107475275A (zh) 2017-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107475275B (zh) 嵌合抗原受体及其表达基因、双抗原调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用
CN108018299B (zh) 靶向bcma的嵌合抗原受体及其用途
CN106749675B (zh) 一种重组慢病毒及其应用
CN108004259B (zh) 靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其用途
CN107557336B (zh) 一种抗muc16安全型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用
CN107922951B (zh) 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1-免疫抗原受体
US11723922B2 (en) CXCR6-transduced T cells for targeted tumor therapy
JP2018531016A6 (ja) 腫瘍標的療法のためのｃｘｃｒ６形質導入ｔ細胞
CN110923255A (zh) 靶向bcma和cd19嵌合抗原受体及其用途
CN112522208A (zh) 一种转基因肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
WO2020248486A1 (zh) 以Tcm为主要效应成分的CAR-T制备方法及其应用
CN109666074B (zh) 一种趋化因子受体cxcr5的用途
WO2021259334A1 (zh) 自我调节型嵌合抗原受体及其在肿瘤免疫中的应用
CN111875708B (zh) 一种嵌合抗原受体t淋巴细胞及其在制备治疗实体肿瘤的产品中的应用
CN111983218A (zh) 一种用于检测活细胞-活细胞表面受体-配体相互作用的试剂盒
US20220380433A1 (en) Tmem59 protein dimer or chimeric expression receptor improving t cell function
CN110714018A (zh) 靶向egfrviii的嵌合抗原受体及其用途
CN107446937B (zh) 嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用
CN113735981A (zh) Cd19-car-t细胞及其制备方法
CN112048021A (zh) 一种靶向ror2的嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、t细胞及其应用
CN111763264A (zh) 一种靶向psca的嵌合抗原受体及其应用
CN108165568B (zh) 一种培养CD19CAR-iNKT细胞方法及用途
CN112480266B (zh) 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体脐血有核细胞及应用
CN110564749A (zh) 靶向egfr的嵌合抗原受体及其用途
US11359012B1 (en) Specific chimeric antigen receptor cells targeting human CLDN18A2, preparation method and application thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20191009

Address after: 518129 6 / F, building 6, Yunli intelligent park, developed road, Bantian street, Longgang District, Shenzhen City, Guangdong Province

Applicant after: Shenzhen Huayun Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 518051 Nanhai Road, Nanshan District, Shenzhen, Shenzhen, Guangdong

Applicant before: Shenzhen University

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant