CN106749677A - 一种靶向mll白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用 - Google Patents

一种靶向mll白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用，本发明的双特异性嵌合抗原受体可特异性识别MLL白血病细胞表面CD19和CD133两种肿瘤相关抗原。将TanCAR分子重组到病毒载体上并转染T淋巴细胞系，表达双特异性嵌合抗原受体，可特异性识别杀伤CD19CD133双阳性肿瘤细胞，减轻对非肿瘤细胞的杀伤作用，降低了肿瘤抗原逃逸的几率。并且TanCAR(1linker)‑Jurkat在较低效靶比即可特异性杀伤MLL白血病细胞，在之后的临床使用中会较少出现毒副作用，例如细胞因子风暴，神经毒性等。本发明的双特异性嵌合抗原受体可应用在MLL白血病治疗中，清除患者体内肿瘤，延长患者生存期。

Description

一种靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体基因。
背景技术
肿瘤特异性T细胞介导的免疫反应是机体清除肿瘤细胞的主要手段，在正常的免疫反应中，T细胞活化需要两个刺激信号。其中，T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；第二信号是由T细胞与抗原提呈细胞(APC)或其它细胞表面的共刺激分子介导产生。肿瘤细胞通过下调参与T细胞识别及抗原反应的分子表达，降低免疫原性等途径产生免疫逃逸，从而使机体的免疫***不能很好的清除肿瘤。
研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的可变区，并将scFv直接和共刺激分子(如CD28,4-1BB等)以及T细胞信号传导区域CD3-zata连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，通过scFv识别肿瘤特异性抗原，通过非MHC限制性途径与抗原反应，提供T细胞活化等第一、第二信号，促进T细胞活化，增殖，特异性杀死肿瘤细胞。自1993年，由Eshhar和他的同事们首次提出CAR的概念以来，CAR-T已经发展到第三代。第一代CAR包含胞外特异性识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3-zata或Fc段的ITAM(immonoreceptor tyrosine-based activation motifs)信号链来传递，但是第一代CAR缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能瞬时发挥效应。第二代CAR在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞活化的两种信号，如CD28,CD134/OX40,CD137/4-1BB等，增强了T细胞的增殖及细胞因子分泌的能力。第三代CAR分子在第二代的基础上又增加了另外一种共刺激信号的胞内结构域，如在共刺激结构CCD28之后仔融合一个共刺激分子如4-1BB，产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。
近年来，应用靶向CD19的嵌合抗原受体重组T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)获得了重大进展，在临床上取得了颠覆性治疗效果。但由于CD19是B细胞的表面标志，在正常B细胞以及B细胞肿瘤中均有表达，该治疗策略会带来不可避免的副作用就是使正常B细胞减少，因此患者虽然在CD19CAR-T治疗过后会有很大程度的缓解或者完全治愈，但是需要长期甚至终身通过静脉补充丙种球蛋白来避免由于B细胞减少而导致的免疫力下降，极大的降低了患者的生存质量。
发明内容
MLL白血病是一类常见的恶性急性白血病，即可以表现为B-ALL，也可以表现为AML，约占全部急性白血病的10％。尤其是婴儿白血病以及拓扑异构酶抑制剂治疗引起的继发性白血病中更是占到了70％以上。MLL极为凶险，预后极差，被认为是最难治的一类白血病，亟需寻找有效的治疗方法。
CTL19在治疗白血病的成功应用为治疗MLL打下良好的基础。但是为了保护正常的B细胞，有必要对靶向CD19的CAR-T进行的改进，使CAR-T细胞同时结合两个肿瘤相关抗原，从而使得其只能识别恶性B细胞，不识别正常B细胞。在对MLL白血病的研究过程中，我们发现表现为B-ALL的MLL白血病细胞中表面抗原CD133高表达，而其它B-ALL细胞或正常B细胞不表达CD133。CD133是常见的干细胞标记物，而正常的干细胞是不表达CD19的。也就是说，只有这一类表现为B-ALL的MLL白血病细胞才同时具有CD19和CD133两种表面抗原，因此靶向CD19/CD133的双特异CAR-T将特异地杀死这一类白血病细胞，保护正常B细胞，为MLL白血病的治愈带来希望。
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体。
本发明的第二个目的是，提供编码如上所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体的基因。
本发明的第三个目的是，提供如上所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体，所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体由CD8leader、CD19scFv、linker、CD133scFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28胞内信号区、4-1BB胞内信号区、CD3-zata胞内信号区依次串联构成，其结构如下所示；
编码所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
进一步，所述编码CD8 leader的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
进一步，所述编码CD19 scFv的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
进一步，所述编码linker的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
进一步，所述编码CD133 scFv的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
进一步，所述编码CD8的铰链区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
进一步，所述编码CD8的跨膜区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
进一步，所述编码CD28胞内信号区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
进一步，所述编码4-1BB胞内信号区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
进一步，所述编码CD3-zata胞内信号的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步，所述双特异性嵌合抗原受体特异性识别MLL白血病细胞表面CD19和CD133两种肿瘤相关抗原，特异性识别杀伤CD19/CD133双阳性肿瘤细胞。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
编码如上所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中1-63为CD8leader，64-789为CD19scFv，790-804为linker，805-1536为CD133scFv，1537-1671为CD8hinge，1672-1743为CD8transmember，1744-1866为CD28intracellular domain，1867-1992为4-1BB intracellular domain，1993-2328为CD3-zata domain。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体在制备抗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。
本发明还提供一种表达载体，所述表达载体中装载有如上任一所述的基因。
进一步，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或质粒。
进一步，所述表达载体为pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV病毒载体。
本发明优点在于：
1、本发明的双特异性嵌合抗原受体TanCAR可特异性识别MLL白血病细胞表面CD19和CD133两种肿瘤相关抗原。将TanCAR分子重组到病毒载体上并转染T淋巴细胞系，表达双特异性嵌合抗原受体，可特异性识别杀伤CD19CD133双阳性肿瘤细胞，减轻了对非肿瘤细胞的杀伤作用，降低了肿瘤抗原逃逸的几率。并且TanCAR(1linker)-Jurkat在较低效靶比即可特异性杀伤MLL白血病细胞，可在之后的临床使用中会较少出现毒副作用，例如细胞因子风暴，神经毒性等。因此本发明的双特异性嵌合抗原受体可在MLL白血病治疗中得到应用，清除患者体内肿瘤，延长患者生存期。
2、本发明的TanCAR(1linker)靶向CD19/CD133双阳性MLL白血病细胞，并且TanCAR(1linker)-Jurkat在较低效靶比即可特异性杀伤MLL白血病细胞，说明TanCAR(1linker)分子设计合理，效果显著，为治疗MLL白血病奠定基础。
附图说明
附图1为同时结合CD19与CD133的第三代TanCAR、(L:linker)结合CD19的第三代CD19CAR、结合CD133的第三代CD133CAR模式图。
附图2为TanCAR表达载体结构图。
附图3为经不同处理过后的TanCAR(3linker)-Jurkat、TanCAR(2linker)-Jurkat、TanCAR(1linker)-Jurkat、CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat和靶细胞REH,SEM共培养后CD69表达情况。
附图4为经不同处理过后的TanCAR(3linker)-Jurkat、TanCAR(2linker)-Jurkat、TanCAR(1linker)-Jurkat、CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat和靶细胞REH,SEM共培养后IL-2的分泌量。图中每一簇的前五根柱子从左至右依次为TanCAR(3linker)-Jurkat、TanCAR(2linker)-Jurkat、TanCAR(1linker)-Jurkat、CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat。
附图5为经不同处理过后的TanCAR(3linker)-Jurkat、TanCAR(2linker)-Jurkat、TanCAR(1linker)-Jurkat、CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat对靶细胞REH,SEM的杀伤作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例
本发明提供的靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体，其由CD8leader、CD19scFv、linker、CD133scFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28胞内信号区、4-1BB胞内信号区、CD3-zata胞内信号区串联构成，其结构如图1所示(TanCAR(1linker))。
编码所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其中1-63为CD8leader，64-789为CD19scFv，790-804为linker，805-1536为CD133scFv，1537-1671为CD8hinge，1672-1743为CD8transmember，1744-1866为CD28intracellular domain，1867-1992为4-1BB intracellular domain，1993-2328为CD3-zata domain。
(一)、pCDH-TanCAR(3linker)，pCDH-TanCAR(2linker)和pCDH-TanCAR(1linker)质粒的构建
本发明从可以分泌特异识别CD133的IgG1单抗AC133的杂交瘤细胞株HB-12346中获得编码该抗体可变区重链(VH)和轻链(VL)的cDNA序列，拼接合成能够结合CD133抗体的单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)序列。并且根据已经报道并广泛应用的CD19序列，设计带有CD19-scFv和CD133-scFv的TanCAR序列，并引入CD8跨膜区和CD28,4-1BB,CD3zata胞内信号区的基因片段。CD19-scFv和CD133-scFv以3种形式的linker连接，分别是：(G4S)x1即1linker、(G4S)x2即2linker和(G4S)x3即3linker。按照TanCAR(3linker)的DNA编码序列，委托生工生物工程(上海)有限公司合成整个表达框，酶切后***pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV病毒载体(图2)的EcoRI-BamHI位点之间，得到pCDH-TanCAR(3linker)，分别通过BamHI酶切和***片段得到pCDH-TanCAR(2linker)和pCDH-TanCAR(1linker)质粒。经测序正确后，使用promega公司质粒提取试剂盒提取质粒。
(二)、慢病毒包装
使用pSPAX2，pMD2G病毒包装***，Lenti-X细胞，用CaCl2转染试剂进行转染，收获病毒后，进行纯化。
(三)、T细胞株的遗传修饰
获得的病毒侵染Jurkat E6.1，获得稳转细胞株TanCAR(3linker)-Jurkat,TanCAR(2linker)-Jurkat,TanCAR(1linker)-Jurkat,CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat。
(四)体外检测肿瘤靶细胞对CAR-T细胞的激活情况
1.流式检测CAR-T细胞表面CD69分子的表达情况
效应细胞TanCAR(3linker)-Jurkat,TanCAR(2linker)-Jurkat,TanCAR(1linker)-Jurkat,CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat分别和靶细胞REH(CD19+/CD133-),SEM(CD19+/CD133+)各1x105/孔共培养于24孔板，同时设置CAR-T细胞单独培养组，作为阴性对照。各孔用含10％FBS的RPMI1640培养基补足1ml，37度孵育24h。收集细胞于1.5mlEP管中，室温300g离心5min，弃去上清，每种样品加入100ul抗体标记体系，每反应体系中含1ulCD69-APC抗体(BD)和99ulPBS。室温避光孵育30min后用PBS洗两次，流式检测CD69表达情况。结果见图3。以上结果表明TanCAR(3linker)-Jurkat,TanCAR(2linker)-Jurkat,TanCAR(1linker)-Jurkat可被靶细胞REH,SEM激活；CD19CAR-Jurkat可被靶细胞REH,SEM激活；但是CD133CAR-Jurkat只能被SEM细胞激活。其中TanCAR(1linker)-Jurkat被SEM激活水平显著高于被REH激活水平，说明TanCAR(1linker)-Jurkat有特异性识别CD19+/CD133+双阳性靶细胞的功能。
2.ELISA法测定细胞因子的水平
将TanCAR(3linker)-Jurkat,TanCAR(2linker)-Jurkat,TanCAR(1linker)-Jurkat,CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat分别和靶细胞REH,SEM，K562各1x105/孔共培养于24孔板，24h后收集上清，ELISA法测定IL-2分泌量。(IL-2ELISA试剂盒购自BD公司)。结果见图4。结果表明，与CD19、CD133双阳性细胞共培养后TanCAR-Jurkat(1linker)细胞能大量分泌IL-2，分泌量显著高于CD19CAR-Jurkat和CD133CAR-Jurkat，且高于与CD19单阳性REH共培养的TanCAR-Jurkat(1linker)细胞。以上结果表明CD19、CD133双阳性细胞比CD19单阳性细胞能够更好的激活TanCAR-Jurkat(1linker)细胞。从图4的结果还可以看到，与CD19、CD133双阳性细胞共培养后TanCAR-Jurkat(1linker)细胞IL-2的分泌量显著高于TanCAR-Jurkat(2linker)细胞和TanCAR-Jurkat(3linker)细胞，说明在相同的条件下，本发明的TanCAR-Jurkat(1linker)细胞能更好的被CD19、CD133双阳性细胞激活。
3.Annexin-V标记法检测CAR-T细胞对REH,SEM细胞的杀伤作用
将TanCAR(1linker)-Jurkat分别和celltrace yellow(购自ThermoFisher公司)标记的靶细胞REH,SEM以1:1共培养于24孔板中。24h后，用50ulAnnexin-V(购自BD公司)体系标记凋亡细胞，30min后加入200ul Bounding Burrer,上机检测。结果见图5。结果表明TanCAR(1linker)-Jurkat可以特异性识别并杀死SEM细胞，但是对REH无明显作用，说明TanCAR(1linker)靶向CD19/CD133双阳性MLL白血病细胞。并且TanCAR(1linker)-Jurkat在较低效靶比即可特异性杀伤MLL白血病细胞，说明TanCAR(1linker)分子设计合理，效果显著，为治疗MLL白血病奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120> 一种靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体基因及其应用
<130> /
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2328
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120
accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180
cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240
gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300
ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360
cagggcacca agctggagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420
ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480
ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540
agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600
tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660
gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720
cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780
gtgtccagcg gaggtggtgg atccgatgtt gtgatgactc agtctccact ctccctgccc 840
gtcacccctg gagagccggc ctccatctcc tgcaggtcta gtcagagtct tgcaaacagt 900
tatgggaaca cctatttgtc ttggtacctg cagaagccag ggcagtctcc acagctcctg 960
atctatggga tttccaacag attttctggg gtccctgaca ggttcagtgg cagtggatca 1020
ggcacagatt ttacactgaa aatcagcaga gtggaggctg aggatgttgg ggtttattac 1080
tgcttacaag gtacacatca gccgtacacg tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 1140
ggcagtacta gcggtggtgg ctccgggggc ggttccggtg ggggcggcag cagccaggtt 1200
cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc 1260
aaggcttctg gttacacctt taccgacttt gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga 1320
caagggcttg agtggatggg agatattgat cctggaactg gtgatactgc ctacaatctg 1380
aagttcaagg gcagagtcac catgaccaca gacacatcca cgagcacagc ctacatggag 1440
ctgaggagcc tgaggtctga cgacacggcc gtgtattact gtgcgttggg ggcctttgtt 1500
tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcaacca ctaccccagc accgaggcca 1560
cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga 1620
cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt 1680
tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac 1740
tgtaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1800
cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1860
cgctccaagc gcggtcggaa gaagctgctg tacatcttta agcaaccctt catgaggcct 1920
gtgcagacta ctcaagagga ggacggctgt tcatgccggt tcccagagga ggaggaaggc 1980
ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc agcgcagatg ctccagccta caagcagggg 2040
cagaaccagc tctacaacga actcaatctt ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac 2100
aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag 2160
ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag atggcagaag cctatagcga gattggtatg 2220
aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac gacggactgt accagggact cagcaccgcc 2280
accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg caggccctgc cgcctcgg 2328
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
ccc 63
<210> 3
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaaattgtga tgacccagtc acccgccact cttagccttt cacccggtga gcgcgcaacc 60
ctgtcttgca gagcctccca agacatctca aaatacctta attggtatca acagaagccc 120
ggacaggctc ctcgccttct gatctaccac accagccggc tccattctgg aatccctgcc 180
aggttcagcg gtagcggatc tgggaccgac tacaccctca ctatcagctc actgcagcca 240
gaggacttcg ctgtctattt ctgtcagcaa gggaacaccc tgccctacac ctttggacag 300
ggcaccaagc tggagattaa aggtggaggt ggcagcggag gaggtgggtc cggcggtgga 360
ggaagccagg tccaactcca agaaagcgga ccgggtcttg tgaagccatc agaaactctt 420
tcactgactt gtactgtgag cggagtgtct ctccccgatt acggggtgtc ttggatcaga 480
cagccaccgg ggaagggtct ggaatggatt ggagtgattt ggggctctga gactacttac 540
tactcttcat ccctcaagtc acgcgtcacc atctcaaagg acaactctaa gaatcaggtg 600
tcactgaaac tgtcatctgt gaccgcagcc gacaccgccg tgtactattg cgctaagcat 660
tactattatg gcgggagcta cgcaatggat tactggggac agggtactct ggtcaccgtg 720
tccagc 726
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaggtggtg gatcc 15
<210> 5
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacaccta tttgtcttgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atgggatttc caacagattt 180
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300
tacacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaaggca gtactagcgg tggtggctcc 360
gggggcggtt ccggtggggg cggcagcagc caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag 420
gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc 480
gactttgaaa tgcactgggt gcgacaggcc cctggacaag ggcttgagtg gatgggagat 540
attgatcctg gaactggtga tactgcctac aatctgaagt tcaagggcag agtcaccatg 600
accacagaca catccacgag cacagcctac atggagctga ggagcctgag gtctgacgac 660
acggccgtgt attactgtgc gttgggggcc tttgtttact ggggccaggg aaccctggtc 720
accgtctcct ca 732
<210> 6
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 7
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60
actctttact gt 72
<210> 8
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 9
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 10
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336

Claims (7)

1.一种靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体由CD8leader、CD19scFv、linker、CD133scFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28胞内信号区、4-1BB胞内信号区、CD3-zata胞内信号区串联构成，其结构如下所示；
编码所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，
编码所述CD8leader的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
编码所述CD19scFv的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
编码所述linker的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
编码所述CD133scFv的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
编码所述CD8的铰链区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
编码所述CD8的跨膜区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
编码所述CD28胞内信号区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
编码所述4-1BB胞内信号区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
编码所述CD3-zata胞内信号的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求1所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述双特异性嵌合抗原受体特异性识别MLL白血病细胞表面CD19和CD133两种肿瘤相关抗原，特异性识别杀伤CD19/CD133双阳性肿瘤细胞。
4.编码权利要求1-3所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.权利要求1所述靶向MLL白血病的双特异性嵌合抗原受体在制备抗急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中装载有如权利要求4所述的基因。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或质粒。
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