CN111763264A - 一种靶向psca的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向PSCA的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗PSCA单链抗体；所述信号转导结构域包括OX40、CD3ζ和TLR1。本发明的嵌合抗原受体不仅对PSCA阳性肿瘤细胞具有靶向作用，而且可以高效激活T细胞、消除调节性T细胞免疫抑制作用、促进记忆性T细胞的形成，构建的表达嵌合抗原受体的T细胞具有显著增强的肿瘤细胞杀伤能力。

Description

一种靶向PSCA的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种靶向PSCA的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞亦称为CAR-T细胞，是利用基因工程技术将特异性识别抗原的单链可变区(scFv)与T细胞共刺激和激活信号(如CD28、4-1BB、OX40、CD3ζ等)相串联，表达于T细胞上，从而赋予T细胞特异性识别靶标蛋白的功能，并针对表达靶标蛋白的细胞产生杀伤作用。将制备好的CAR-T细胞回输到肿瘤患者体内，通过发挥CAR-T细胞靶向特定肿瘤抗原的功效，从而达到消除肿瘤细胞的目的。
近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。然而，CAR-T疗法始终面临着肿瘤复发、抗药的问题。
因此，有必要对嵌合抗原受体进行进一步改进，不仅提高嵌合抗原受体对肿瘤抗原的靶向结合能力，而且提高嵌合抗原受体对T细胞的活性激活功能。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种靶向PSCA的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体不仅对PSCA阳性肿瘤细胞具有靶向作用，而且可以高效激活T细胞，在治疗实体瘤方面具有广阔的前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域包括抗PSCA单链抗体；
所述信号转导结构域包括OX40、CD3ζ和TLR1。
本发明中，采用抗PSCA单链抗体作为抗原结合结构域，与信号传导结构域连接后构建嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，对T细胞具有高效的激活作用。
优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSSPFTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYIHWVRQAPGKGLEWVAWIDPENGDTEFVPKFQGRATISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCKTGGFWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPC。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。
优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。
优选地，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗PSCA单链抗体、CD8α、OX40、CD3ζ和TLR1串联组成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
SEQ ID NO:2：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSSPFTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYIHWVRQAPGKGLEWVAWIDPENGDTEFVPKFQGRATISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCKTGGFWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKEGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLTEQAKK。
第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述编码基因包括抗PSCA单链抗体编码序列。
优选地，所述编码基因还包括CD8α信号肽编码序列、CD8α编码序列、OX40编码序列、CD3ζ编码序列和TLR1编码序列。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的慢病毒载体。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。
第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。
第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。
第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞在制备疾病治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括肿瘤。
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、***或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明构建的嵌合抗原受体采用抗PSCA单链抗体作为抗原结合结构域，与信号传导结构域OX40、CD3ζ和TLR1连接后构建嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，对T细胞具有显著提高的激活活性，消除调节性T细胞免疫抑制作用、促进记忆性T细胞的形成；
(2)本发明构建的表达嵌合抗原受体的T细胞对PSCA阳性肿瘤细胞具有显著的清除杀伤作用。
附图说明
图1为WT、αPSCA-CAR-T、αPSCA-CAR-T1-T对K562和K562-PSCA的杀伤效率；
图2为WT、αPSCA-CAR-T、αPSCA-CAR-T1-T与K562-PSCA共培养后IL-2的分泌；
图3为WT、αPSCA-CAR-T、αPSCA-CAR-T1-T与K562-PSCA共培养后IFN-γ的分泌。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1CAR分子载体的构建
本实施例构建了抗原结合结构域为抗PSCA单链抗体、信号转导结构域为OX40、CD3ζ和TLR1的嵌合抗原受体αPSCA-CAR-T1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
首先基因合成αPSCA-CAR-T1的编码基因，并在编码基因的5’端和3’端分别添加Pme1和Spe1酶切位点及其保护碱基；
利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，37℃水浴中孵育30min，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物；
将酶切产物连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接体系如表1所示，得到含有αPSCA-CAR-T1的编码基因的慢病毒载体。
表1
组分 用量(μL)
pWPXLd-eGFP质粒 2(50ng)
CAR基因 10(150ng)
T4 DNA连接缓冲液 2
T4 DNA连接酶(NEB) 1
ddH<sub>2</sub>O 5
本实施例同时构建αPSCA-CAR(antiPSCA scFv-CD8α-OX40-CD3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。
实施例2慢病毒包装
将实施例1构建的慢病毒载体转入大肠杆菌，挑选阳性单克隆进行过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取慢病毒载体，进行病毒包装；
使用293T细胞进行病毒包装，配制如表2所示的包装体系，pWPXLd-表达质粒包括含有αPSCA-CAR-T1的编码基因的慢病毒载体和含有αPSCA-CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体；
表2
Figure BDA0002613196920000071
将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；
将表2所示的质粒混合液与PEI混合，吹打混匀，室温静置25～30min；
将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；
培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；
包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；
1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒，4℃保存待用。
实施例3T细胞激活和慢病毒转染
从成人外周血中分离单个核细胞(PBMC)，使用T细胞分选试剂盒将总T细胞分选出来，经过CD3和CD28抗体体外刺激24小时后，加入实施例2制备的过表达CAR分子的重组慢病毒；
转导12h后，对T细胞进行离心换液；转导三天后，利用流式细胞术测定GFP阳性细胞含量，评估CAR-T的比例；
按照每毫升培养基培养2×106个细胞的密度培养扩增CAR-T细胞，获得αPSCA-CAR-T1-T、αPSCA-CAR-T和WT(转染空白对照eGFP慢病毒)细胞，十天后将细胞冻存，待用。
实施例4CAR-T细胞的功能评估
本实施例采用实施例3制备的CAR-T细胞实施体外杀伤，步骤如下：
首先，计数PSCA阴性细胞K562、PSCA阳性细胞K562-PSCA、αPSCA-CAR-T1-T细胞、αPSCA-CAR-T细胞和WT细胞，于白色平底96孔板中，将CAR-T细胞与K562或K562-PSCA按照1:1的比例接种，每组设置3个复孔，250g离心5min后，使用200μL含5％胎牛血清的IMDM培养基共培养24h；
共培养结束后，，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、αPSCA-CAR-T和αPSCA-CAR-T1-T对K562-PSCA的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
如图1所示，αPSCA-CAR-T1-T细胞对表达PSCA的肿瘤靶细胞的杀伤效率显著高于αPSCA-CAR-T细胞和WT细胞，αPSCA-CAR-T2-T细胞具有很强的肿瘤杀伤活性。
取WT、αPSCA-CAR-T和αPSCA-CAR-T1-T分别与K562或K562-PSCA细胞共培养18h后的上清液，ELISA检测上清液中的IL-2水平。
如图2所示，αPSCA-CAR-T1-T细胞分泌的IL-2水平高于αPSCA-CAR-T和WT，说明嵌合抗原受体的TLR1提高了CAR-T细胞分泌IL-2的能力，即TLR1促进了T细胞增殖。
实施例5
分别将K562、K562-PSCA细胞按照5×105细胞/孔的密度接种24孔板，随后加入WT、αPSCA-CAR-T或αPSCA-CAR-T1-T，于孵箱中共培养12h；采用IFN-γELISA检测试剂盒对共培养上清进行检测。
如图3所示，αPSCA-CAR-T1-T细胞分泌IFN-γ的水平高于αPSCA-CAR-T和WT，说明αPSCA-CAR-T1-T在杀伤肿瘤细胞的同时能够分泌细胞因子发挥杀伤功能。
综上所述，本发明采用抗PSCA单链抗体作为抗原结合结构域，与含有TLR1的信号传导结构域连接后构建嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，对T细胞具有高效的激活作用；表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞肿瘤细胞具有显著的清除杀伤作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种靶向PSCA的嵌合抗原受体及其应用
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Asp
165 170 175
Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe Gln Gly Arg Ala
180 185 190
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly Gly
210 215 220
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250
<210> 2
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
35 40 45
Ser Val Arg Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
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100 105 110
Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp
165 170 175
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180 185 190
Val Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys
195 200 205
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210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Thr
260 265 270
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
275 280 285
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290 295 300
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
305 310 315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
325 330 335
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340 345 350
Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp
355 360 365
Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
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420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala Ile
625 630 635 640
Asn Ile Lys Leu Thr Glu Gln Ala Lys Lys
645 650

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域包括抗PSCA单链抗体；
所述信号转导结构域包括OX40、CD3ζ和TLR1。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域包括SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；
优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。
4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗PSCA单链抗体、CD8α、OX40、CD3ζ和TLR1串联组成；
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述编码基因包括抗PSCA单链抗体编码序列；
优选地，所述编码基因还包括CD8α信号肽编码序列、CD8α编码序列、OX40编码序列、CD3ζ编码序列和TLR1编码序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求5所述的编码基因的慢病毒载体。
7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求6所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。
8.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有权利要求5所述的编码基因；
优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的重组慢病毒。
9.一种权利要求8所述的嵌合抗原受T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。
10.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的编码基因、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的重组慢病毒或权利要求8所述的嵌合抗原受体T细胞在制备疾病治疗药物中的应用；
优选地，所述疾病包括肿瘤；
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、***或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
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