CN107475253B - 微卫星不稳定性位点-bat26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒 - Google Patents

微卫星不稳定性位点-bat26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及微卫星不稳定性位点‑BAT26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒。该引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。采用本发明的引物进行高分辨率熔解曲线法‑HRM检测，具有很高的灵敏度和特异性。

Description

微卫星不稳定性位点-BAT26位点的检测引物、扩增体系及检 测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种检测肿瘤细胞中微卫星稳定性的扩增体系及检测试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在世界范围内的恶性肿瘤疾病当中，发病率高居第4位，是一种常见恶性肿瘤，死亡率高居第2位，严重威胁着人类的健康与生活。结直肠癌的发病过程所表现出的许多特性与某些遗传学改变相关，为了使更多结肠癌患者得到更科学合理的治疗，探索相关遗传指标来判断患者的预后和化疗疗效、指导患者的个体化治疗一直是受推崇的主题。近年来，微卫星不稳定性(MSI)的相关临床和基础方面研究取得了较好的进展，对MSI状态与CRC的关系有了更深入的认识。例如高度微卫星不稳定(MSI-H)的结直肠癌患者较低度微卫星不稳定(MSI-L)和微卫星稳定(MSS)的患者具有更好的预后。
目前，检测微卫星不稳定性状态的方法包括MMR蛋白免疫组化法、片段分析法、HRM法等。上述后两种均属于基于PCR技术的方法，其引物的选择均是对检测灵敏度有极其重要影响的因素。片段分析法是目前公认的金标准方法，但该方法成本较高，检测时间较长，并且必须在价格昂贵的测序仪上进行分析。HRM法则具有快速、成本低、灵敏度高等优点，同时只需在荧光定量PCR仪上即可进行分析。但HRM法对引物设计的要求很高：引物既要有很好的特异性，又要求其扩增出的片段足够短，才能对其突变样本获得较好的分辨能力。
BAT26位点是微卫星不稳定性检测的重要位点之一，但目前对其进行HRM法检测的研究很少，仅有一篇报导(Ramunas Janavicius，2010)曾尝试使用HRM方法检测结直肠癌标本中BAT25、BAT26两个位点的检测，但检测例数不多，缺少大样本的临床验证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对微卫星不稳定性位点-BAT26位点进行HRM法检测的引物/扩增体系/检测试剂盒。
发明通过以下技术方案实现：
首先，发明提供了一种引物，其序列选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO.1:TGCAGCAGTCAGAGCCCTTA
SEQ ID NO.2:GCTTCTTCAGTATATGTCAATGAAAACA
本发明提供了一种针对BAT26位点进行HRM法检测的试剂盒，含有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示引物。
在该试剂盒中，各组分的用量配比如下(总体积20-25μL的扩增体系)：
组分 用量(μL)
10×Buffer 2-2.5
dNTP 2-2.5
EvaGreen 1-1.25
SEQ ID NO:1引物 1-1.25
SEQ ID NO:2引物 1-1.25
Taq酶 0.2-0.25
无酶水 11.8-15
DNA模板 1-5
优选地，该试剂盒还含有EvaGreen。优选地，还含有dNTP。优选地，还含有Taq酶。更优选地，还含有缓冲溶液。
采用上述的引物/扩增体系/检测试剂盒，可以对BAT26位点进行MSI检测，获得很好的敏感性和特异性。具体的，可以采用如下方法：
1.信号收集：配制上述扩增体系，分别加入50-100ng结直肠癌患者肿瘤和正常组织的DNA模板，将含有标本的扩增体系放入Roche LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪中进行检测，程序如下：95℃10min→(95℃20s→58℃20s→72℃20s)40cycles→熔解温度(70-83℃)，收集信号频率为12次/℃。
2.结果分析：将肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线进行对比，若肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而该病人正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示该患者BAT26位点不稳定，从而判断该患者为微卫星不稳定(MSI)型患者。反之，则表示该患者BAT26位点稳定，但需结合其他位点的信息方可判断患者的MSI状态。
作为示例，以本发明方法检测BAT26位点不稳定的样本，其检测结果如图1所示，肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线不同；以本发明方法检测BAT26位点稳定的样本，其检测结果如图2所示，肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线均为单峰。
本发明经过多次探索发现，采用本发明的引物进行HRM法检测BAT26位点的稳定性，通过与Promega公司的MSI片段分析法(金标准方法)试剂盒检测结果比较，本专利发明方法灵敏度为100％，特异性达到97.67％。
本发明操作程序大大简化，每检测一个样本的时间相较片段分析法缩短了约1小时，且HRM法成本大大降低(降低80％)。另外，HRM法无需使用基因分析仪，只需一台带有HRM功能的荧光定量PCR即可。
附图说明
图1为肿瘤组织的熔解曲线显示出两个熔解峰，对应正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰的结果示例。
图2为肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均只显示出一个熔解峰的结果示例。
图3为肿瘤组织和对应正常组织的熔解曲线均显示出几个熔解峰结果示例。
图4为HRM法无扩增引物的结果示例。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1.微卫星不稳定性位点-BAT26位点的检测方法
1.使用Blend Taq Plus酶(Toyobo，CAT NO.BTQ-201)配置如下反应体系
组分 用量(μL)
10×Buffer 2.5
dNTP 2.5
EvaGreen 1.25
SEQ ID NO:1引物 1.25
SEQ ID NO:2引物 1.25
Taq酶 0.25
无酶水 15
2.将结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA模板浓度调整至50-100ng/ul。在上述体系中分别加入1ul的DNA模板。
上述结直肠癌患者肿瘤组织来源：中山大学附属第六医院手术切除肿瘤标本制备的石蜡切片。
结直肠癌患者的正常组织来源：中山大学附属第六医院手术切除瘤旁远端正常组织制备的石蜡切片。
3.涡旋混匀后，使用Roche LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪进行检测，程序如下：95℃10min→(95℃20s→58℃20s→72℃20s)40cycles→熔解温度(70-83℃)，收集信号频率为12次/℃。
4.将同一患者的肿瘤组织的熔解曲线与正常组织的熔解曲线进行对比，判读待测标本BAT26位点的稳定性。
实施例2.不同引物对的结果对比
在实验过程中发明人摸索了多组引物组合对实验结果的影响。实验证明，引物组合决定了方法的可行性。以下为采用多组示例性引物以实施例1方法进行实验所得结果(表1)。
表1.摸索过程采用的6对引物组合及其产生峰型、判读结果比较
Figure BDA0001013322190000041
注：本HRM检测法，其PCR程序总共设置40个循环。样品扩增CT值为18-25为宜，若样品扩增CT值不在该范围内，则判读为该次PCR反应无法扩增或扩增效果不好，最后有可能会影响扩增产物的量和后续的HRM分析。
上述结果图谱仅示例性地显示出其中一部分。其余图谱未直接示出。
结果显示，该例肿瘤患者使用商品化试剂盒检测判读为BAT26位点不稳定，使用上述六对引物，分别进行本发明所述HRM法进行检测。发现只有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示引物(即上列表中一引物对1)可以准确判读该例患者BAT26位点不稳定，其余五对引物(即上列表中引物对2-6)均无法准确判读。尽管通过软件设计出了诸多针对BAT26位点的引物(不限于上述示例性的引物)，然而，采用HRM法检测的结果显示，其中一大部分的引物无法准确判读，而SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2则突出地得到了准确的结果。
实施例3.本发明方法与片段分析法试剂盒的检测结果比较。
样本：由中山大学附属第六医院病理科取材切片的100对(即肿瘤组织及其对应正常组织)结直肠癌病人标本。
本发明方法：步骤如实施例1，采用的引物为：F:TGCAGCAGTCAGAGCCCTTA R:GCTTCTTCAGTATATGTCAATGAAAACA(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)。
片段分析方法：选用Promega MSI Analysis System(CAT NO.MD1641)试剂盒，该试剂盒以多重荧光PCR为基础来检测人类细胞中微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)。其检测方法是：分别提取来自正常组织和肿瘤组织的DNA，分别扩增5个微卫星不稳定位点(BAT25，BAT26，NR21，NR24，MONO27)，比较两者产生的微卫星位点的毛细管电泳图谱。若在肿瘤组织中的毛细管电泳图谱与正常组织的不同，则提示存在MSI。该试剂盒包含的荧光标记引物可以扩增7个标志物，其中包含本专利发明中的BAT26检测位点。工作步骤参照产品说明书。该方法是目前现有技术中较受认可的方法，被称为金标准方法。
100例结直肠癌患者的肿瘤组织和正常组织的BAT26位点均进行了金标准方法和本发明方法的检测，结果比对如表2所示。
表2.本发明方法与金标准方法的检测结果比较
Figure BDA0001013322190000051
根据上表数据，计算本发明方法灵敏度＝57/(57+0)×100％＝100％，特异性＝42/(42+1)×100％＝97.67％。100例标本中，仅有1例结果不相符，使用本发明方法测得BAT26位点不稳定，使用试剂盒检测结果为BAT26位点稳定。估计是由于该例标本属于低丰度突变，金标准法由于检测灵敏度低不能检出，而本发明的灵敏度高，针对低丰度突变的样品也可检出。
实施例4.针对25例陈旧标本，本发明方法与片段分析法试剂盒的检测结果比较。
样本：由中山大学附属第六医院病理科取材切片的25对(即肿瘤组织及其对应正常组织)结直肠癌病人标本，所有标本均为存储3年以上的石蜡包埋组织。
本发明方法：步骤如实施例3。25对癌组织和正常组织标本的BAT26位点均进行了两种方法的检测，结果比对如下：
表3.针对陈旧标本，本发明方法与片段分析法试剂盒的检测结果比较
Figure BDA0001013322190000061
Figure BDA0001013322190000071
25对陈旧标本中，使用试剂盒检测的检出率为18/25*100％＝72％，而采用本发明方法的检出率为24/25*100＝96％。本专利所述的检出率更高，这是因为本专利所述的引物特异性较高，扩增及分析的条件组合较优，故针对疑难样品(如片段化或陈旧DNA，低浓度DNA)也可检出，说明本发明方法对样本DNA的质量要求低，适用性广。
并且在现有试剂盒检测方法所能检出的18个样品检测结果中，本发明检测结果与其吻合率为100％。结果提示了本发明方法准确可靠，且大幅提高样品检测成功率(提高了33％)。
实施例5.本发明方法与试剂盒检测BAT26位点的时间及成本对比
计算方法：针对实施例3中使用两种方法均有检测结果的100对待测标本进行核算。结果如表4所示。
表4.本发明方法与毛细管电泳法试剂盒的检测BAT26位点的时间和成本比较
Figure BDA0001013322190000072
由结果可知，使用本发明方法进行微卫星不稳定性位点-BAT26位点的检测，每个标本的检测时间比片段分析法缩短了50％，同时每个标本的检测成本降低了80％。使用本发明的所述方法针对微卫星不稳定性(MSI)检测，可以大大节约检测时间和成本，更好的服务临床病人。
Figure IDA0001013322260000011
Figure IDA0001013322260000021
Figure IDA0001013322260000031

Claims (11)

1.一种引物，其特征在于序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.一种扩增体系，其特征在于含有如权利要求1所述的引物。
3.如权利要求2所述的扩增体系，其特征在于还含有EvaGreen。
4.如权利要求2所述的扩增体系，其特征在于含有如下体积比的组分：10×Buffer:dNTP:EvaGreen:SEQ ID NO:1引物:SEQ ID NO:2引物:Taq酶:无酶水＝2-2.5:2-2.5:1-1.25:1-1.25:1-1.25:0.2-0.25:12-15。
5.一种针对微卫星不稳定性位点-BAT26位点进行检测的试剂盒，其特征在于含有如权利要求1所述的引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于其系使用HRM法检测的试剂盒。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还含有EvaGreen。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还含有dNTP。
9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还含有Taq酶。
10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于含有如下体积比的组分：10×Buffer:dNTP:EvaGreen:SEQ ID NO:1引物:SEQ ID NO:2引物:Taq酶:无酶水＝2-2.5:2-2.5:1-1.25:1-1.25:1-1.25:0.2-0.25:12-15。
11.一种采用如权利要求5所述试剂盒的检测***，包括PCR反应设备，其特征在于，***PCR程序为：95℃10min→(95℃20s→58℃20s→72℃20s)40循环→熔解温度(70-83℃)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108998553A (zh) * 2018-08-14 2018-12-14 西北大学 一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物
CN114182011B (zh) * 2020-09-14 2023-09-15 中山大学附属第六医院 检测微卫星bat25位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
CN114182012B (zh) * 2020-09-14 2023-09-15 中山大学附属第六医院 检测微卫星mono27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005100816A4 (en) * 2005-09-30 2005-11-24 Gregory Capern Pacer Remote Heart Rate Monitor
CN102230004A (zh) * 2011-06-08 2011-11-02 北京阅微基因技术有限公司 肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒
CN103555843A (zh) * 2013-11-05 2014-02-05 上海赛安生物医药科技有限公司 结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005100816A4 (en) * 2005-09-30 2005-11-24 Gregory Capern Pacer Remote Heart Rate Monitor
CN102230004A (zh) * 2011-06-08 2011-11-02 北京阅微基因技术有限公司 肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒
CN103555843A (zh) * 2013-11-05 2014-02-05 上海赛安生物医药科技有限公司 结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Microsatellite Instability Detection by High-Resolution Melting Analysis;Ramunas Janavicius等;《Clinical Chemistry》;20101231;第56卷(第1期);第1751页右栏倒数第1、2段、第1752页左栏"PCR-HRM ASSAY AND ANALYSIS"部分、表2 *

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