CN116640846A - 一种微小残留病灶ctDNA质控品及其制备方法和应用 - Google Patents

一种微小残留病灶ctDNA质控品及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微小残留病灶ctDNA质控品及其制备方法和应用。本发明通过筛选含有临床MRD常检基因突变位点的细胞，经细胞培养、酶切和纯化所得片段化DNA进行混合和稀释制备MRD检测ctDNA质控品，并通过超低频数字PCR检测和高深度测序方法进行准确定量。所述质控品囊括了37种临床实体肿瘤常测突变，同时包含＞3000个内源性基因突变。此外，该质控品的基因突变原料由酶切片段化方式处理细胞所得，DNA片段分布特点与临床ctDNA一致。本发明制备的质控品克服了目前市场上MRD ctDNA质控品缺陷，可应用于MRD检测技术开发、性能验证，LDT流程搭建性能确认、质量控制，MRD检测技术临床研究过程中的质量控制等。

Description

一种微小残留病灶ctDNA质控品及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种微小残留病灶ctDNA质控品及其制备方法和应用。
背景技术
微小残留病灶(Minimal Residual Disease，MRD)指肿瘤在根治性治疗(如手术切除)后，在体内的隐匿性微转移或微小残留病灶。循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)为微小残留病灶主要检测对象。基于ctDNA的MRD实时监测和评估，因其方便性和灵敏度优于传统的临床病理活检和影像学检测，可为临床的精准用药、分子分型、预后评估及疗效复发监控等诊疗过程提供具有价值的参考信息。
目前用于MRD低频ctDNA的检测主要有基于PCR和基于新一代测序(NextGeneration Sequencing，NGS)两种方法。基于PCR的检测包括数字微滴聚合酶链式反应(ddPCR)、数字PCR-流式技术BEAMing和突变扩增阻滞***(ARMS)等方法，由于仅能检测已知基因突变类型和检测通量低的劣势，综合检测能力低于基于NGS的MRD检测平台。NGS其优势在于通量高，可在短时间内检测得到大量的已知和未知的基因突变信息。标记扩增深度测序(Tam-Seq)、癌症个性化深度测序(CAPP-Seq)、集成数字错误抑制测序(iDES)、定向变异富集测序技术(phasED-seq)是基于NGS衍生开发的MRD ctDNA检测方法。这些方法目前处于研发阶段，在国内外尚无孵化成熟的MRD检测平台应用于临床，限制原因主要在于cfDNA在普通健康人群外周血含量约为7ng/ml，含量少，因患者个体差异、疾病差异以及疾病进程的不同，ctDNA占比范围仅为0.1％～5％，癌症患者术后的肿瘤细胞ctDNA游离至外周血的量更是微乎其微。2021年初《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识》中明确提出对于肺癌分子异常，推荐检测技术要求在外周血ctDNA中稳定检测出丰度≥0.02％的基因变异。该超低检测灵敏度对于目前MRD主流检测技术-肿瘤知情测序分析和肿瘤不知情测序分析的平台开发是巨大的挑战。正因超低灵敏度要求，极其容易出现假阳性和因检测平台灵敏度不足导致的假阴性风险，由于无可靠的参考标准，对检出的结果无法准确判定。因此，通过质控品建立科学可靠的质控方法和体系，对搭建的平台进行准确地性能评估和后续临床检测质控，以提升检测结果的可靠性和可重复性是助力MRD检测健康快速发展的关键。
Seracare公司和国内奥迪缇(LDT)生物科技公司近两年先后推出了MRD ctDNA质控品。国内研制面世的质控品由1对来源于肺癌的配对细胞DNA按不同比例混合制备而成，该质控品因仅选用单一癌种的1对配对细胞，包含具有临床检测意义的常检位点仅有1—3个，无法满足多癌肿MRD多位点检测平台的性能检验需求，同时也难以推广至临床进行MRD检测的日常质控，此外，ctDNA的片段大小集中于100bp—200bp范围，该产品采用超声打断方式模拟ctDNA，通过该方式获得的片段化DNA片段分布宽，小于100bp的片段(在测序时经片段筛选过滤)占比远大于ctDNA，与ctDNA的片段分布特点差异大，无法很好模拟ctDNA，进而在质控过程中会出现与临床ctDNA相同投入量，但检测结果不一致的情况，导致无法准确评估检测平台或试剂的性能以及日常监测质控失败。Seracare质控品由1对肺癌配对细胞DNA和外源合成的22个基因突变位点片段混合制备而成。该产品与LDT公司的质控品相比，扩充了致病突变基因位点数量。但Seracare质控品的缺点在于，大多数具有临床检测意义的位点片段均由化学合成工艺制备而成，这种合成的片段往往序列固定化，即突变靶点位置固定，不具备ctDNA突变靶点于片段的位置是随机的特点，而无法做到与临床样本一致。
综上，目前国内外的关于MRD ctDNA质控品的方法主要是通过配对细胞配制或是配对细胞掺入外源合成片段的方法制备。质控品存在包含临床意义的基因突变位点少或外源引入片段无法模拟临床样本的缺点。因此，目前亟需一种尽量囊括各种实体瘤常检的基因突变位点，同时与临床样本特点一致的MRD ctDNA质控品，以适配单一癌肿或多种实体瘤MRD检测平台在开发过程中性能检验、LDT流程搭建质量控制和临床MRD检测日常质控的需求。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出一种微小残留病灶ctDNA质控品及其制备方法和应用。本发明通过筛选含有临床MRD常检基因突变位点的细胞，经细胞培养、酶切和纯化所得片段化DNA进行混合和稀释制备MRD检测ctDNA质控品，并通过超低频数字PCR检测和高深度测序方法进行准确定量。所述质控品囊括了37种临床实体肿瘤常测突变，同时包含＞3000个内源性基因突变。此外，该质控品的基因突变原料由酶切片段化方式处理细胞所得，DNA片段分布特点与临床ctDNA一致。本发明公开了一种微小残留病灶ctDNA质控品，所述质控品包括38种细胞经酶切纯化所得的片段化DNA，所述各片段化DNA含有如下表所示的基因突变，所述各片段化DNA的质量份数如下表所示：
进一步的，DNA-1～DNA-37所示的基因突变位点为肿瘤细胞自身携带的基因突变位点或通过基因编辑得到的基因突变位点。
进一步的，DNA-1～DNA-37使用的细胞包括但不限于MDA-MB-134-VI、SNU-C1、SW1116、SW48、MDA-MB-468、MCF7、KATOIII、SW620、SK-LMS-1、A-253、SH-4、SNU-449、SW1088、SK-OV-3、A549、BXPC-3、NCI-H1975、NCI-N87、ME-180、RKO、HCT116、HEK293T、GM12878和KBM-7；DNA-38使用的细胞包括但不限于GM12878、KBM-7、HEK293A、HEK293T和HCT116。
进一步的，所述DNA-1～DNA-38的片段化DNA经MNase酶切所得，片段集中于100-200bp，主带大小为144bp-176bp，小片段DNA(＜100bp)占比少。即Mnase酶切所得片段DNA与临床ctDNA片段分布特点一致，因此可更好模拟ctDNA。
进一步的，所述各片段化DNA的质量份数如下表所示：
进一步的，所述质控品包含突变频率为0.5％的阳性质控品、突变频率为0.05％的阳性质控品、突变频率为0.005％的阳性质控品和阴性质控品；所述阴性质控品为不含DNA-1～DNA-37的基因突变位点的细胞经酶切纯化所得的片段化DNA。
本发明还提供一种微小残留病灶ctDNA质控品的制备方法，包括如下步骤：
S1：选择细胞进行基因编辑；具体包括如下步骤：
(1)针对目标基因的目标位点，设计特异的向导RNA；
(2)将向导RNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞；
(3)进行单细胞克隆；
(4)细胞克隆形成后，进行sanger测序，确定基因编辑成功；
S2：Mnase酶切；
(1)使用Mnase酶对细胞核小体进行酶切，然后磁珠筛选纯化；
(2)纯度测定；
OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；
OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格；
(3)DNA片段分布检测；
主带大小为144bp-176bp范围，判定合格；
S3：片段化DNA混合和稀释；
经酶切片段化和纯化所得的DNA，需按照所述质量份数进行混合，得到各基因突变靶点的基因突变频率为0.5％的阳性质控品；通过数字PCR验证突变位点变异信息；
通过对所述基因突变频率为0.5％的阳性质控品稀释10倍，获得基因突变频率为0.05％的阳性质控品，通过对所述基因突变频率为0.05％的阳性质控品稀释10倍，获得基因突变频率为0.005％的阳性质控品；DNA-38的细胞经酶切纯化所得的DNA片段，通过浓度调整后的产物即为阴性质控品；数字PCR测定基因频率，并计算基因突变频率比值；
S4：新一代测序(NGS)验证。
进一步的，步骤S1中所述向导RNA的序列如下表所示：
进一步的，步骤S3中所述数字PCR验证突变位点变异信息如下：
基因名称 突变类型 基因突变位点 COSMICv96
AKT1 SNV AKT1 E17K COSM33765
ALK Fusion EML4(13)-ALK(20)FUSION COSF408
ALK SNV ALK F1174L COSM28055
BRAF SNV BRAF V600K COSM473
BRAF SNV BRAF V600E COSM476
BRCA1 Stop Gain BRCA1 R1443* COSM979730
BRCA2 Frame Shift BRCA2 K1691fs COSM6048456
BRCA2 SNV BRCA2 D1420Y COSM3736087
BRCA2 Frame Shift BRCA2 A1784fs COSM18607
CDK12 SNV CDK12 P250H COSM4266369
EGFR SNV EGFR L858R COSM6224
EGFR del EGFR E746_A750del COSM6223
EGFR SNV EGFR T790M COSM6240
EGFR SNV EGFR S768I COSM6241
EGFR SNV EGFR L861Q COSM6213
EGFR indel EGFR L747_P753>S COSM12370
EGFR ins EGFR D770_N771insG COSM12378
EGFR SNV EGFR G719C COSM6253
FGFR3 Fusion FGFR3(17)-TACC3(4)FUSION COSF1350
Her2 ins HER2 A775_G776insYVMA COSM20959
Her2 ins HER2 Y772_A775dup COSM12558
IDH1 SNV IDH1 R132G COSM28749
IDH2 SNV IDH2 R172M COSM33732
KIT SNV KIT D816V COSM1314
KIT ins KIT Y503_F504insAY COSM12444
KRAS SNV KRAS G12C COSM516
KRAS SNV KRAS G12D COSM521
KRAS SNV KRAS Q61H COSM554
KRAS SNV KRAS G13D COSM532
NRAS SNV NRAS Q61R COSM584
NRAS SNV NRAS G12A COSM565
NTRK1 Fusion TPM3(7)-NTRK1(10)FUSION COSF1329
PDGFRA SNV PDGFRA D842V COSM736
PIK3CA SNV PIK3CA H1047R COSM775
RET Fusion CCDC6(1)-RET(12)FUSION COSF1271
ROS1 Fusion CD74(6)-ROS1(34)FUSION COSF1200
TP53 SNV TP53 R273H COSM10660
进一步的，步骤S4中进行多基因panel高深度测序，并对测序数据进行突变频率分析，检测的基因如下表所示：
本发明还提供所述微小残留病灶ctDNA质控品，或所述方法制备的微小残留病灶ctDNA质控品的微小残留病灶ctDNA检测试剂盒。
本发明还提供所述微小残留病灶ctDNA质控品、或所述方法制备的微小残留病灶ctDNA质控品、或所述微小残留病灶ctDNA检测试剂盒的应用，所述应用选自如下任意一种或多种：
(1)制备微小残留病灶ctDNA质控品的应用；
(2)制备评价微小残留病灶ctDNA检测的产品或平台的试剂的应用；
(3)制备校准微小残留病灶ctDNA结果的试剂的应用；
(4)制备优化校准微小残留病灶ctDNA检测方法或体系的试剂的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
本发明设计的微小残留病灶检测MRD ctDNA质控品为一个多梯度基因突变频率的组合套装，包括了阴性质控品和基因突变频率AF 0.005％，0.05％和0.5％的阳性质控品。MRD ctDNA质控品DNA片段集中于100—200bp，主带大小为144bp-176bp，小片段(＜100bp)占比少，即该质控品与临床ctDNA片段分布特点一致，可高度模拟ctDNA。阳性质控品包含了数字PCR验证的37个突变位点，多基因panel 35000X深度测序验证位点信息，有包含288个基因的＞3000多个变异位点，包含了常见的基因SNV，融合和碱基***缺失等癌症基因组常见结构变异。该MRD ctDNA质控品应用场景多种多样，可用于基于PCR和NGS平台的MRD检测技术开发、性能验证，LDT流程搭建性能确认、质量控制，以及MRD检测技术临床研究中质量控制等过程。该质控品的使用方法基于使用的试剂盒及平台不同，具体操作中将该质控品作为一个样本，与其他实验样本以相同技术和实验操作流程进行处理。质控品的实验结果与理论预期值的差异可反映整个操作流程和其他实验样本结果是否可信；可以用于评估从样本提取到生物信息分析的工作流程的稳定性、特异性和灵敏性，评估各样本处理方法，检测平台之间的性能差异。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提出的DRAGEN TruSightTMOncology 500ctDNA分析流程图。
图2为本发明实施例的不同方法制备ctDNA的片段分布对比图。
图3为本发明实施例的MRD ctDNA阴性质控品片段分布图。
图4为本发明实施例的MRD ctDNA基因突变AF 0.5％质控品片段分布图。
图5为本发明实施例的MRD ctDNA基因突变AF 0.05％质控品片段分布图。
图6为本发明实施例的MRD ctDNA基因突变AF 0.005％质控品片段分布图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明通过筛选含有临床MRD常检基因突变位点的细胞，经细胞培养、酶切和纯化所得片段化DNA进行混合和稀释制备MRD检测ctDNA质控品，并通过超低频数字PCR检测和高深度测序方法进行定量。所述质控品囊括了37种临床实体肿瘤常测突变，同时包含＞3000个内源性基因突变。此外，该质控品的基因突变原料均由不同细胞通过由酶切片段化方式处理所得，可最大程度模拟临床ctDNA。本发明制备的质控品克服了目前市场上MRD ctDNA质控品缺陷，可应用于MRD检测技术开发、性能验证，LDT流程搭建性能确认、质量控制，MRD检测技术临床研究过程中的质量控制等过程。
实施例1MRD ctDNA质控品细胞原料筛选
MRD ctDNA质控品来源于美国模式培养集存库(American type culturecollection，ATCC)特定培养的细胞和通过基因编辑获得的细胞，将各种细胞分别进行培养后，经酶切纯化所得的DNA进行混合和稀释，得到不同基因突变频率梯度的MRD ctDNA质控品。制备的MRD ctDNA通过数字PCR和NGS测序验证。本发明中所述的非基因编辑细胞原料来源于ATCC细胞，通过多种细胞的混合可获得大多数临床热门NGS检测的肿瘤基因突变位点。
上述提及的细胞包括但不限于MDA-MB-134-VI、SNU-C1、SW1116、SW48、MDA-MB-468、MCF7、KATOIII、SW620、SK-LMS-1、A-253、SH-4、SNU-449、SW1088、SK-OV-3、A549、BXPC-3、NCI-H1975、NCI-N87、ME-180、RKO、HCT116、HEK293T、GM12878和KBM-7。
上述提及的肿瘤突变基因突变位点包括但不限于EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、人类表皮生长因子受体2(HER2)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)等。
实施例2基因编辑细胞
本实施例中所述的基因编辑方法，可获得除所选母细胞包含的基因突变以外的绝大多数热门肿瘤相关突变，以扩充MRD ctDNA质控品包含的肿瘤基因突变位点。例如表皮生长因子受体基因(EGFR)等。具体的方法是：
A、针对目标基因的目标位点，设计特异的向导RNA(guide RNA，gRNA)，并构建向导RNA的表达载体。同时，设计并合成单链DNA(single-strand DNA，ssDNA)，用作基因编辑修复的模板。
B、将向导RNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞。
C、待细胞状态良好时，将其进行单细胞克隆。
D、细胞克隆形成后，取部分克隆进行sanger测序，确定基因编辑成功。
在基因编辑步骤a中，相关基因包括但不仅仅限于肿瘤基因，所述肿瘤基因包括但不限于EGFR、
KRAS、NRAS、BRAF、人类表皮生长因子受体2(HER2)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)等。
本实施例涉及基因编辑gRNA和ssDNA具体信息见表1。
表1基因编辑gRNA和ssDNA信息
步骤C中，采用单克隆技术和sanger测序技术筛选出具有目标基因突变和遗传稳定的单克隆细胞株。具体的方法是：
C1.待细胞的汇合度达到70％～90％时，消化并收集细胞。
C2.对细胞准确计数，按照倍比稀释的方法，用培养基将活细胞稀释至5个/mL，并将细胞混匀。
C3.取10mL细胞悬液，均匀分到一块96孔板中。
C4.待细胞克隆形成时，标记有克隆的孔，加入少量胰蛋白酶(～20μL)消化细胞：取部分细胞进行PCR，用作sanger测序；剩余细胞继续培养。
实施例3 Mnase酶切方法
(1)Mnase酶切产物制备
本实施例提及的片段化DNA通过使用Mnase酶对细胞核小体进行酶切，经磁珠筛选纯化所得。该方法获得的片段化DNA产物可模拟临床真实ctDNA，DNA结构和片段分布特点与ctDNA一致。具体的方法是：
A、离心收集细胞沉淀，加入PBS重悬。
B、加入适量Protease inhibitor cocktail和表面活性剂，静置一段时间后离心。
C、去上清，加入Mnase反应液充分重悬，37℃条件下反应一段时间。
D、加入蛋白酶K消化液，65℃孵育一段时间，以获得粗提的DNA片段。
E、加入适量磁珠混合均匀后室温孵育一段时间，样本置于磁力架，待磁珠完全吸附后去除上清。80％乙醇溶液重悬磁珠，充分混匀后，样本再置于磁力架，磁珠完全吸附后去除上清。取下磁珠，加入洗脱液混合均匀后，置于磁力架上，得上清。
步骤A中，用于单次Mnase酶切的细胞量为10^3～10^9cells；PBS重悬体积为100～900μL。
步骤B中Protease inhibitor cocktail为5～80μL；表面活性剂为0.1％ Tween80 10～50μL或1％TritonX 5～80μL；静置时间5～30min。
可选地，步骤C中Mnase反应液为：89.2μL蒸馏水+10μL 10×TC buffer+0.8μLMicrococcal Nuclease；37℃反应时间5--30min。
步骤D中蛋白酶K消化液为：198μL水+2μL Proteinase K(20mg/mL)。65℃孵育时间为30min。
步骤E中，磁珠主要用于纯化DNA。按照磁珠:样本体积为0.5:1～3:1的比例加入磁珠。洗脱液可为无酶水、Tris-EDTA缓冲液和PBS缓冲液等。
(2)浓度测定
A、使用分光光度计对纯化的产物进行DNA浓度测定。
B、浓度测定应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：
a)OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格。
b)OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。
(3)DNA片段分布检测
A、使用Agilent TapeStation 4150检测DNA片段的大小；
B、DNA片段检测，应满足如下条件：
a)主带大小为144bp-176bp范围，判定合格。
本实施例同时使用KAPA酶和超声法制备片段化DNA作为对比实验，制备得到的片段化DNA以及与真实ctDNA的对照如图2所示，可见本实施例用Mnase酶切得到的片段分布较窄，主要集中在100bp—200bp范围，小于100bp的片段占比与ctDNA相似约为17％，所以Mnase酶切所得片段化DNA最接近真实的ctDNA。而经超声法和KAPA酶切所得的片段主带大小比真实ctDNA大，片段长度分布范围宽，小于100bp的片段占比为30.2％，与ctDNA片段特点差异大，无法模拟ctDNA。
实施例4片段化DNA稀释和混合
(一)片段化DNA混合
本发明所述的经酶切片段化和纯化所得的DNA，需按照下表2特定份数进行混合，得到各基因突变靶点的基因突变频率AF为0.5％的混合物。这里表述的基因突变频率0.5％是所有突变靶位点预期值，对于单突变位点来说，通过调整靶细胞DNA和非靶细胞的DNA质量比进行混合来达到目的，最终通过数字PCR检测来确定。
具体的方法是：
A、将同一编码和批号细胞经酶切纯化的DNA片段进行混合，混合前需确认：
待混合DNA为同一编码和批号的细胞酶切纯化的；
待混合DNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格。
B、选择合适体积的管子进行混合(≥1.5mL应当用50mLBD管进行混合)。
C、配制的混合物通过数字PCR对表3中的位点进行基因频率检测。引物探针序列信息见表4。
E、将经数字PCR验证合格的混合物浓度调整至20ng/μL，并进行浓度测定。
可选地，表2特定份数混合信息如下：
表2原料混合比例
原料代码 质量份数 原料代码 质量份数
DNA-1 0.1-2份 DNA-20 0.1-2份
DNA-2 0.1-2份 DNA-21 0.1-2份
DNA-3 0.1-2份 DNA-22 0.1-2份
DNA-4 0.1-2份 DNA-23 0.1-2份
DNA-5 0.1-2份 DNA-24 0.1-2份
DNA-6 0.1-2份 DNA-25 0.1-2份
DNA-7 0.1-2份 DNA-26 0.1-2份
DNA-8 0.1-2份 DNA-27 0.1-2份
DNA-9 0.1-2份 DNA-28 0.1-2份
DNA-10 0.1-2份 DNA-29 0.1-2份
DNA-11 0.1-2份 DNA-30 0.1-2份
DNA-12 0.1-2份 DNA-31 0.1-2份
DNA-13 0.1-2份 DNA-32 0.1-2份
DNA-14 0.1-2份 DNA-33 0.1-2份
DNA-15 0.1-2份 DNA-34 0.1-2份
DNA-16 0.1-2份 DNA-35 0.1-2份
DNA-17 0.1-2份 DNA-36 0.1-2份
DNA-18 0.1-2份 DNA-37 0.1-2份
DNA-19 0.1-2份 DNA-38 26-96.3份
可选地，步骤C中，表3经数字PCR验证的基因位点信息如下：
表3数字PCR验证突变位点变异信息
步骤C中，表4数字PCR检测基因突变位点所用引物探针信息如下：
表4引物探针信息
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步骤C中，数字PCR用于检测混合中间品各基因突变位点，具体的方法是：
C1、按照下表中的反应组分配置反应的预混液，每一个位点每个样本做二至四个复孔，考虑移液损耗，故每个位点每个扩增孔配置1.1个反应的量。详细的配置组分及其加入量见下表：
Stock Con. Final Con. 1x Volume(μL)
ddPCR supermix 2x 1x 10
Primer mix 40x(36μM) 1x 0.5
Probe mix 40x(10μM) 1x 0.5
H2O - - 0
DNA template 50ng - 9
Final Volume 20
C2、微滴发生。将上述配置的预混液加入到微滴发生卡的中层孔位中，每一个孔加入20μL，将70μL微滴生成油加入到卡的下排孔位中，在微滴生成卡的两侧套上橡胶皮套，将微滴生成卡移除操作间放置于微滴生成仪内，并关闭盖子，等待微滴生成完成。
C3、微滴转移。将适当量程的移液枪调至40μL，将生成的微滴非常小心的转移到96孔PCR反应板内。将枪头的位置保持在斜4度角防止卡的底部阻塞枪头。
C4、封膜。当所有样品的微滴转移完成以后，放置一片铝膜置于96孔板的表面，用热封仪进行封膜。
C5、PCR反应。将96孔板放置于PCR仪上，并关紧盖子，按照如下程序运行，仪器升降温速度调到2-3℃/s。
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C6、信号收集。当PCR程序完成，将96孔板转移到QX200微滴读取仪上(需提前半小时开机预热)，在电脑上，打开“QuantaSoft”软件，并选择包含样品的孔，在相应的位置设置好每一个孔的名称,实验用的Supermix，对于SNP类型的实验，将实验类型设置为ABS，将“Assay 1”设置为“Mut”，“type”设置为“Ch1 Unknown”，将“Assay 2”设置为“WT”，“type”设置为“Ch2 Unknown”，选择“RUN”。
C7、数据分析。当数据读取完成以后，打开你要分析的实验数据，选择“Analyze”即可对结果进行分析。
可选地，步骤C中，数字PCR检测混合中间品各基因突变位点，检测结果应满足如下条件：
a)基因突变频率(AF)：3≤x≤0.1，判定合格。
可选地，步骤D中，将质检合格的混合物浓度稀释调整为20ng/μL，并通过分光光度计进行浓度测定。浓度测定应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：
a)浓度范围为：17ng/μL≤x≤23ng/μL，判定合格
b)OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格。
c)OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。
(二)片段化DNA混合物稀释
本实施例所述的片段DNA混合物稀释，是指通过对制备的突变频率AF为0.5％的混合物进行两次梯度稀释，以获得基因突变频率为AF 0.05％和0.005％中间品。DNA-38细胞经酶切纯化所得的DNA片段，通过浓度调整至合适范围后的产物即为阴性质控品。阴性质控品为DNA-38，其占比是100％，不含DNA-1～DNA-37。
具体的方法是：
A、DNA-38细胞经酶切纯化的DNA片段使用前需确认，待纯度测定的OD260/280、OD260/230结果合格。
B、DNA-38细胞经酶切纯化的DNA片段通过数字PCR检测阳性中间品中所检基因突变位点。
检测结果需满足以下条件：
a)检测的基因突变AF＜0.005％，判定为合格。
C、DNA-38细胞经酶切纯化的DNA片段浓度调整为20ng/μL，并经分光光度计进行测定。浓度测定，应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：
a)浓度范围为：17ng/μL≤x≤23ng/μL，判定合格。
b)OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格。
c)OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。
D、DNA-38细胞细胞酶切后DNA产物作为基质，取所需制备的突变频率AF为0.5％混合物稀释10倍，以获得AF 0.05％质控品。取所需AF 0.05％混合物稀释10倍数，得到AF0.005％质控品。浓度调整至20ng/μL。
E、筛选1～2两个位点对制备的所有梯度质控品进行数字PCR。
F、DNA-38细胞酶切纯化的浓度调整20ng/μL，所得的产物作为阴性质控品(突变频率AF为0)。制备的基因突变频率AF 0.5％，0.05％，0.005％和0，4种质控品进行浓度测定和片段大小检测。
F1、浓度测定应当连续进行3次重复检测，应满足如下条件：
a)浓度范围为：17ng/μL≤x≤23ng/μL，判定合格。
b)OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格。
c)OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格。
F2、DNA片段分布检测:
A、使用Agilent TapeStation 4150检测DNA片段的大小；
B、DNA片段检测，应满足如下条件：
a)主带大小为144bp～176bp范围，判定合格。
可选地，步骤E中，所有梯度阳性质控品进行数字PCR。目的是验证稀释的准确性。为提升低频检测准确度。复孔数量可增至8～16孔。
测定并计算所得的基因突变频率比值应满足如下条件：
a)AF 0.5％/AF 0.05％范围为：7≤X≤13，判定为合格。
b)AF 0.05％/AF 0.005％范围为：7≤X≤13，判定为合格。
实施例5新一代测序(NGS)验证
本发明所述的质控品通过NGS验证。通过提及制备方法所得的阴性质控品和基因突变频率AF
0.5％的阳性质控品，使用30ng起始DNA进行多基因panel高深度测序，并对测序结果进行突变频率分析。测序信息如表5。TruSight Oncology 500ctDNA结合了独特分子标记(UMI)和错误校正软件，可将测序错误率从0.5％降至<0.007％。检测限(LOD)为0.5％，ctDNA起始量为30ng时，35000x的测序深度敏感性可达到99.88％，特异性99.99％。
表5测序信息
高通量测序分析方法参见图1所示DRAGEN TruSightTMOncology 500ctDNA分析流程。检测的基因如表6所示：
表6高通量测序检测基因列表
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实施例6
基于上述提及的制备和检验方法，实施例6具体的实验步骤如下：
(1)Mnase酶切
参照实施例3的具体操作。
(2)片段化DNA混合
本实施例中，基因突变频率AF 0.5％ MRD ctDNA质控品是经细胞核小体酶切(Mnase)和纯化所得的原料片段DNA按照混合配比表7制备而得。37个基因突变位点中，DNA-1～DNA-37原料代码为目标基因突变位点对应细胞经酶切纯化所得的DNA，对应细胞原料信息见表7，DNA-38为GM12878细胞经酶切纯化所得的DNA。
表7 DNA原料配比表
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(3)片段化DNA稀释
本实施例中，基因突变频率AF 0.05％，0.005％ MRD ctDNA质控品是AF 0.5％质控品以10倍梯度分别稀释1次和2次制备而成。阴性质控品为经酶切纯化的GM12878细胞DNA片段调整浓度制备而成(不掺入靶标基因突变DNA)。指示稀释准确度的位点为EGFR L861Q和TPM3-NTRK1。AF 0.05％和AF 0.005％阳性质控品和阴性质控品对筛选的两个位点进行数字PCR检测，复孔数为16，以16孔的数据综合分析。此外，每个梯度阳性质控品和阴性质控品经Agilent TapeStation 4150和分光光度计进行浓度和片段大小检测。
(4)质控品NGS测序验证
本实施例，通过TruSight Oncology 500ctDNA panel对MRD ctDNA阴性质控品和AF 0.5％阳性质控品进行测序验证。
(5)结果汇总与分析
A、本发明的质控品DNA的主峰位置在144～176bp之间(如图2所示)，与临床ctDNA的片段分布特点相同，表明通过本发明的方法制备的MRD ctDNA阴阳性质控可模拟ctDNA，弥补目前通过外源引入的方式制备MRD质控品无法模拟ctDNA的缺陷。本实施例制备的质控品Agilent TapeStation 4150检测结果见图3～图6。
B、本实施例制备的质控品的分光光度计浓度测定结果见表8。结果是符合17≤X≤23ng/μL范围。该浓度设置范围可方便临床检验单次使用15～30ng进行ctDNA检验的需求。
C、本实施例制备的质控品的数字PCR结果见表9。结果是MRD ctDNA AF 0.5％的结果范围为0.2％～2.7％之间，AF在0.1％～1.0％范围的基因突变位点数占总数82％；对AF0.5％，0.05％,0.005％质控中EGFR L861Q和TPM3-NTRK1两个位点的检测数据进行计算，计算结果表明可通过梯度稀释方式获得超低频的质控品；阴性质控品实测AF＜0.005％。上述结果表明通过本发明的MRD ctDNA质控品经过数字PCR准确定量且符合临床检测位点的基因突变数多达37个，可弥补目前市场MRD ctDNA质控品检测位点少的缺陷，以满足MRD从平台开发验证到临床检验质控等阶段的不同需求。
D、本实施例制备的阴性质控品和AF 0.5％阳性质控品经TruSight Oncology500ctDNA panel验证，对37个位点的结果汇总于表9。90％基因突变位点的NGS突变频率检测结果与数字PCR结果相吻合，在同一数量级。该结果进一步表明该质控品的准确性。除此之外，与肿瘤相关且突变频率在0＜X＜2范围内的基因突变位点超过600个，汇总于表10。
表8 MRD ctDNA质控品浓度
质控品 阴性质控品 AF 0.5％质控品 AF 0.05％质控品 AF 0.005％质控品
浓度(ng/μL) 19.8 20.9 20.5 21.3
目标浓度均是20ng/μL。实际可允许在范围内波动，不影响使用。范围为17ng/μL～23ng/μL。
表9 MRD ctDNA质控品37个热点突变数字PCR与NGS检测结果
表10TSO500测序突变位点检测信息
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以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，所述质控品包括38种细胞经酶切纯化所得的片段化DNA，所述各片段化DNA含有如下表所示的基因突变，所述各片段化DNA的质量份数如下表所示：
原料代码 基因突变名称 质量份数 DNA-1 AKT1 E17K 0.1-2份 DNA-2 BRAF V600K 0.1-2份 DNA-3 CD74(6)-ROS1(34)FUSION 0.1-2份 DNA-4 EGFR L747_P753>S 0.1-2份 DNA-5 EGFR G719C 0.1-2份 DNA-6 EGFR D770_N771insG 0.1-2份 DNA-7 EGFR L858R 0.1-2份 DNA-8 EGFR L861Q 0.1-2份 DNA-9 EGFR S768I 0.1-2份 DNA-10 EGFR T790M 0.1-2份 DNA-11 HER2 A775_G776insYVMA 0.1-2份 DNA-12 IDH1 R132G 0.1-2份 DNA-13 IDH2 R172M 0.1-2份 DNA-14 KIT D816V 0.1-2份 DNA-15 KIT Y503_F504insAY 0.1-2份 DNA-16 KRAS Q61H 0.1-2份 DNA-17 PDGFRA D842V 0.1-2份 DNA-18 BRCA2 K1691fs 0.1-2份 DNA-19 KRAS G12C 0.1-2份 DNA-20 KRAS G12D 0.1-2份 DNA-21 NRAS Q61R 0.1-2份 DNA-22 TP53 R273H 0.1-2份 DNA-23 EGFR E746_A750del 0.1-2份 DNA-24 CDK12 P250H 0.1-2份 DNA-25 ALK F1174L 0.1-2份 DNA-26 EML4(13)-ALK(20)FUSION 0.1-2份 DNA-27 CCDC6(1)-RET(12)FUSION 0.1-2份 DNA-28 TPM3(7)-NTRK1(10)FUSION 0.1-2份 DNA-29 FGFR3(17)-TACC3(4)FUSION 0.1-2份 DNA-30 HER2 Y772_A775dup 0.1-2份 DNA-31 NRAS G12A 0.1-2份 DNA-32 BRCA1 R1443* 0.1-2份 DNA-33 BRCA2 A1784fs 0.1-2份 DNA-34 BRCA2 D1420Y 0.1-2份 DNA-35 BRAF V600E 0.1-2份 DNA-36 PIK3CA H1047R 0.1-2份 DNA-37 KRAS G13D 0.1-2份 DNA-38 无DNA-1～DNA-37中的37种突变 26-96.3份
2.根据权利要求1所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，DNA-1～DNA-37所示的基因突变位点为肿瘤细胞自身携带的基因突变位点或通过基因编辑得到的基因突变位点。
3.根据权利要求2所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，DNA-1～DNA-37使用的细胞包括但不限于MDA-MB-134-VI、SNU-C1、SW1116、SW48、MDA-MB-468、MCF7、KATOIII、SW620、SK-LMS-1、A-253、SH-4、SNU-449、SW1088、SK-OV-3、A549、BXPC-3、NCI-H1975、NCI-N87、ME-180、RKO、HCT116、HEK293T、GM12878和KBM-7；DNA-38使用的细胞包括但不限于GM12878、KBM-7、HEK293A、HEK293T和HCT116。
4.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于，所述DNA-1～DNA-38的片段化DNA主带大小为144bp-176bp。
5.根据权利要1～4任一项所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，所述各片段化DNA的质量份数如下表所示：
6.根据权利要求1-5任一项所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，所述质控品包含突变频率为0.5％的阳性质控品、突变频率为0.05％的阳性质控品、突变频率为0.005％的阳性质控品和阴性质控品；所述阴性质控品为不含DNA-1～DNA-37的基因突变位点的细胞经酶切纯化所得的片段化DNA。
7.一种微小残留病灶ctDNA质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：选择细胞进行基因编辑；具体包括如下步骤：
(1)针对目标基因的目标位点，设计特异的向导RNA；
(2)将向导RNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞；
(3)进行单细胞克隆；
(4)细胞克隆形成后，进行sanger测序，确定基因编辑成功；
S2：Mnase酶切；
(1)使用Mnase酶对细胞核小体进行酶切，然后磁珠筛选纯化；
(2)纯度测定；
OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；
OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格；
(3)DNA片段分布检测；
主带大小为144bp-176bp范围，判定合格；
S3：片段化DNA混合和稀释；
经酶切片段化和纯化所得的DNA，需按照权利要求1的质量份数进行混合，得到各基因突变靶点的基因突变频率为0.5％的阳性质控品；通过数字PCR验证突变位点变异信息；
通过对所述基因突变频率为0.5％的阳性质控品稀释10倍，获得基因突变频率为0.05％的阳性质控品，通过对所述基因突变频率为0.05％的阳性质控品稀释10倍，获得基因突变频率为0.005％的阳性质控品；DNA-38的细胞经酶切纯化所得的DNA片段，通过浓度调整后的产物即为阴性质控品；数字PCR测定基因突变频率，并计算基因突变频率比值；
S4：NGS测序验证。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述数字PCR验证突变位点变异信息如下：
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中进行多基因panel高深度测序，并对测序数据进行突变频率分析，检测的基因如下表所示：
10.含有权利要求1-6任一项所述微小残留病灶ctDNA质控品，或含有权利要求7-9任一项所述方法制备的微小残留病灶ctDNA质控品的微小残留病灶ctDNA检测试剂盒。
11.含有权利要求1-6任一项所述微小残留病灶ctDNA质控品、或含有权利要求7-9任一项所述方法制备的微小残留病灶ctDNA质控品、或权利要求10所述的微小残留病灶ctDNA检测试剂盒的应用，所述应用选自如下任意一种或多种：
(1)制备微小残留病灶ctDNA质控品的应用；
(2)制备评价微小残留病灶ctDNA检测或平台的试剂的应用；
(3)制备校准微小残留病灶ctDNA结果试剂的应用；
(4)制备优化校准微小残留病灶ctDNA检测方法或体系的试剂的应用。
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