CN108998553A - 一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物 - Google Patents

一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物 Download PDF

Info

Publication number
CN108998553A
CN108998553A CN201810921068.1A CN201810921068A CN108998553A CN 108998553 A CN108998553 A CN 108998553A CN 201810921068 A CN201810921068 A CN 201810921068A CN 108998553 A CN108998553 A CN 108998553A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
est
ssr
sequence
base
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810921068.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李文清
解孝满
赵鹏
王磊
袁晓莺
仝伯强
刘鵾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CENTER FOR FOREST GENETIC RESOURCES OF SHANDONG PROVINCE
Northwest University
Original Assignee
CENTER FOR FOREST GENETIC RESOURCES OF SHANDONG PROVINCE
Northwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CENTER FOR FOREST GENETIC RESOURCES OF SHANDONG PROVINCE, Northwest University filed Critical CENTER FOR FOREST GENETIC RESOURCES OF SHANDONG PROVINCE
Priority to CN201810921068.1A priority Critical patent/CN108998553A/zh
Publication of CN108998553A publication Critical patent/CN108998553A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物，所述的方法可用于筛选多态性好、稳定性高的EST‑SSR分子标记引物，进而后续对该属植物进行群体遗传和适应进化方面的研究。本发明在胡桃属物种转录组数据分析过程中，设计开发的EST‑SSR多态性微卫星位点并从开发的33‑77对EST‑SSR引物中筛选出12‑39对多态性好且稳定性高的EST‑SSR引物，条带清晰、能100％扩增，可靠性强，只需常规PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管测序仪即可完成对该分子标记的快速筛选。开发的双亲遗传且与基因功能相关的EST‑SSR分子标记，可作为胡桃属群体遗传多样性和适应进化研究的引物，可为进一步遗传图谱构建、基因定位及分子辅助育种等研究提供科学依据。

Description

一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物
技术领域
本发明属于植物分子生物技术领域，涉及一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物。
背景技术
EST-SSR是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记，与基因组SSR相比，EST-SSR具有在植物物种之间可转移性的优点。目前，EST-SSR被广泛应用于植物基因组学研究如遗传图谱构建、比较作图、遗传多样性评价、种质鉴定、***发育与进化研究等方面。传统基因组SSR标记开发费时、费力、且成本较高，需要投入大量的人力物力。而基于转录组数据，通过搜索SSR的EST-SSR标记开发具有稳定性高、通用性好、成本低、开发简单快捷等特点而备受关注。因为一些转录组微卫星标记可以转移到一些相关分类中，他们可以被有效用于群体进化分析、群体遗传研究和比较定位中，EST-SSRs数据不仅可开发功能，RNA-seq对于罕见转录本、多样化拼接和细胞中基因表达水平都有潜在的恢复作用，此外，采用高通量测序的方法对胡桃属物种丰富的遗传资源进行EST-SSR分子标记的开发筛选及遗传多样性研究，有利于特异资源的挖掘、分子标记辅助育种提供技术指导，有助于理解植物进化与适应。另外，在转录组数据分析的基础上开发EST-SSR引物，从中筛选多态性高、稳定性好的标记，这对胡桃属物种种质资源的保护具有重要的意义。
在引物开发方面，虽然胡桃属物种已开展一些基于分子标记的遗传研究，但主要是采用SSR、RAPD、ISSR、AFLP标记技术进行遗传多样性和品种鉴别等方面的研究(陈少瑜等2006，2011)，尤其在GenBank中有关于泡核桃的基因组资源只有17条核苷酸序列和181个蛋白序列。在泡核桃基因组DNA中并未出现微卫星位点的资料记载，所有关于泡核桃的研究(Wang et al.2015；Gunn et al.2010)受到了可利用的多态性标记数目及不存在可利用的ESTs(expressed sequence tags)标签的限制。尤其是通过转录组测序，表达功能基因注释等技术，进行泡核桃特异EST-SSR引物的开发还很有限，目前国内外均未见文献报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明给出了一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物，解决了现有技术中缺乏快速筛选胡桃属植物EST-SSR分子标记方法的问题。同时得到了引物，该引物的扩增稳定性和多态性良好。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
一种胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物，所述引物的正向引物序列为F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列为R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。
一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，对待筛选的植物进行RNA提取，所述的RNA进行de novo测序后得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到多态性微卫星位点目标引物；
所述的数据处理包括：
(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；
(2)再根据碱基重复类型进行EST-SSR降序排列后，将碱基重复类型为单碱基重复且碱基重复次数小于18的EST-SSR删除；
(3)根据EST-SSR碱基重复单元总数进行降序排列，删除碱基重复单元总数小于60的序列；
(4)根据EST-SSR引物PCR扩增产物片段大小进行升序排列，删除扩增产物片段大小在140bp以下并且碱基重复单元总数小于20的引物序列；
(5)根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，删除碱基重复单元总数小于18的引物序列；
(6)然后根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，再删除碱基重复类型为Pc的碱基序列；
(7)依次以引物PCR扩增产物大小和碱基重复单元总数对EST-SSR进行降序排列，保留总序列数目中的位于前50％的引物序列为初筛序列；
(8)在初筛序列中选取产物片段长度为142-280bp的引物；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度段均保证对应五对引物，通过PCR扩增筛选即得多态性EST-SSR引物。
可选的，对胡桃属植物的叶片、芽和/或果实进行RNA的提取，对所述的RNA进行denovo测序后得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到胡桃属多态性微卫星位点目标引物。
可选的，利用Illumina Hiseq对提取得到的RNA进行高通量测序后得到原始reads，原始reads经如下处理后得到clean reads；再对clean reads进行de novo组装，得到转录本序列；
(1)去除不确定碱基比例占总碱基数的5％以上的reads；
(2)去除质量值Q≤10的碱基数达整条序列20％以上的reads；
(3)去除含测序接头的reads。
可选的，使用Trinity对得到的clean reads进行de novo组装，得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes；
通过MISA脚本http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html对Unigenes进行微卫星位点识别。
可选的，所述的引物设计采用http://primer3.sourceforge.net/releases.php设计引物，然后进行设计得到的引物的多态性扩增；控制产物片段长度为142-280bp；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度均保证对应五对引物；即得EST-SSR引物；
引物设计参数：核苷酸长度为18bp-23bp，扩增产物大小为142-280bp，最适退火温度为58℃，GC含量为50％-60％。
一种引物，所述的引物采用本发明所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法筛选得到。
本发明的有益效果：
(1)从大量的序列中快速筛选目标引物。
(2)本方法筛选的分子标记特异性极高，稳定性极强，只需要常规PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色显色步骤即可完成对引物多态性及稳定性的鉴定，为胡桃属及其他物种的辅助育种提供理论和技术上的支持。
附图说明
图1为实施例一中的PCR扩增条件；各引物退火温度见表1；
图2为泡核桃(J.sigillata)EST-SSR引物PCR扩增的泡核桃聚丙烯凝胶电泳图谱，(a)表示引物JS5720对泡核桃48个个体PCR扩增产物图谱；M为DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)(b)为引物JS6809对泡核桃48个个体PCR扩增产物图谱；M为DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)；
图3为核桃(J.regia)43个个体引物JR6508PCR扩增产物聚丙烯凝胶电泳图谱；M为DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)；
图4为麻核桃(J.hopeiensis)38个个体引物JH42753PCR扩增产物聚丙烯凝胶电泳图谱；M为DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)；
图5为野核桃(J.cathayensis)48个个体引物JC8125PCR扩增产物聚丙烯凝胶电泳图谱；M为DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)；箭头表示具有多态性的PCR扩增产物片段；白色数字为引物扩增具体片段碱基大小值(bp)。
图6为胡桃楸(J.mandshurica)32个个体引物JM78331PCR扩增产物聚丙烯凝胶电泳图谱；M为DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)；
图7为五个胡桃属物种扩增胡桃楸筛选的EST-SSR引物JM68820以及核桃筛选的引物JR6439PCR的聚丙烯凝胶电泳图谱；M为DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)。数字表示扩增的五个胡桃属植物48个个体，其中胡桃楸(J.mandshurica)9个个体，麻核桃(J.hopeiensis)10个个体，核桃(J.regia)10个个体，野核桃(J.cathayensis)9个个体，泡核桃(J.sigillata)10个个体。
图中的数字表示DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)(所用DNA Marker为PBR322)，图中的箭头是标出的部分具有多态性的PCR扩增产物片段。
具体实施方式
一、名词解释：
引物扩增产物大小：假设有一个很长的基因，但是设计引物的时候，只是选择这个基因上的一部分，也就是说上游引物和下游引物的特异性决定了引物片段大小。
Unigenes：先对组装的结果进行聚类分析，因为一个基因会有组装完整和不完整的结果都会在初步组装的结果中，聚类分析就是将同一个基因的类似序列聚在一起。然后在这些聚类中选择最长的转录本就是该基因序列的Unigenes。
de novo测序：也叫从头测序，不需要任何基因序列信息即可对某个物种进行测序。用生物信息学的分析方法对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。
EST-SSR：基于EST序列开发的位于转录区的SSR标记，除具有基因组SSR标记的优良特征外，还能够反映出转录区的差异，检测出转录区的多态性，进而能够反映出种质之间真实的遗传多样性。
碱基重复类型：碱基重复类型也就是核苷酸重复类型，如(T)20、(AG)7、(TCG)6、(CCAA)5、(TTCGT)5和(TTGGAA)5的碱基重复类型分别为单碱基重复、二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复和六碱基重复，且分别用P1、P2、P3、P4、P5和P6表示，即括号内的碱基数为碱基重复类型，括号外的数字为碱基重复次数；碱基重复类型为“c"即比较复杂的序列：用Pc(c为complex的首字母)表示。即碱基重复类型比较复杂的序列就是：序列中同时存在两种或两种以上的重复单元类型(单碱基重复、二碱基重复、三碱基重复、四碱基重复、五碱基重复和六碱基重复)的微卫星SSR序列:也就说Pc可能为P1+P2、P1+P3、P1+P4、P1+P5、P2+P3、P2+P4........等多种重复单元类型组合。
碱基重复单元：碱基重复单元＝(碱基重复类型×碱基重复次数)。
GC含量：一条序列中G和C碱基占这条序列中所有碱基数的比例。
胡桃属(Juglans)隶属于胡桃科(Juglandaceae)，约有21-23个种，主要分布在北美、亚洲、欧洲以及印度半岛。我国是世界胡桃属植物分布中心和起源地之一(Aradhya etal.，2007)，是重要的核桃产区，种质资源丰富(Wang et al.，2008；赵鹏，2011)，分布十分广泛，其中包括大量人工栽培和野生胡桃属植物资源(路安民等，1990)。主要有以下5个种：核桃、泡核桃(J.sigillata)、麻核桃(J.hopeiensis)、胡桃楸(J.mandshurica)和野核桃(J.cathayensis)(匡可任等，1979；奚声珂，1987)。本研究以胡桃属五个物种的转录组数据为基础，开发双亲遗传且与基因功能相关的EST-SSR分子标记引物，并从中筛选出12-39对具有多态性且稳定性好的引物，进行胡桃属群体遗传及适应进化研究，以期为进一步遗传图谱构建、基因定位及分子辅助育种等研究提供依据。
本发明基于Illumina HiSeq 2500高通量测序平台，通过转录组测序获得Unigenes并设计引物进而快速筛选EST-SSR分子标记，并通过表达功能基因注释使得设计开发的EST-SSR多态性微卫星位点包含的功能基因被匹配到NCBI蛋白库中已经确定的生物功能，解决了现有技术中缺乏快速筛选胡桃属植物EST-SSR分子标记方法的问题。
根据Hu et al.2016中的方法对胡桃属植物的成熟健康树种的新鲜叶片、芽、未成熟果实进行RNA提取、定量及测序(Hu et al.2016)。RNA-seq(Illumina,NEB,Beverly,MA,USA)建库使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit。从头组装使用Trinity(Grabherret al.2011)的默认参数设置得到Contigs，双端测序在北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成(www.novogene.cn)后得到非冗余Unigene数据库同时采用NCBI基因注释(GeneOntology，GO)和蛋白家族注释(Pfam)两种库注释Unigenes。
通过MISA脚本(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)在组装好的Unigenes中进行微卫星位点的识别。33-77条Unigenes被用于此项研究，共检测到包括有微卫星位点的序列有7,118-26,088条序列，PCR扩增程序和等位基因的确定方法遵照(Hu etal.2016)。
具体的，采用PCR扩增(体系：2×PCR Mixture 5μL、F primer 0.2μL、R primer0.2μL、DNA 1μL及ddH2O 2.6μL)的方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法筛选出多态性且稳定性好的引物进行胡桃属群体遗传和适应进化的科学研究。
更具体的，在所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染、显色之后通过BIO-RAD凝胶成像***照相检验保存，之后使用相关软件进行统计分析。
再具体的，所述的双亲遗传且与基因功能相关的EST-SSR分子标记，可作为胡桃属群体遗传多样性和适应进化研究的引物。
基因组学数据经常被用于基因发掘和分子标记开发，本发明通过对五个胡桃属样本RNA提取、定量及测序(Hu et al.2016)，Unigenes表达功能基因注释，并运用微卫星分子标记的原理，对自主开发的33-77对EST-SSR分子标记引物进行多态性及稳定性方面的筛选，开发得到12-39对EST-SSR分子标记引物，其特征在于多态性好，稳定性高,带型清晰、能100％扩增，可靠性强。同时，设计开发的多态性微卫星位点包含的功能基因被匹配到NCBI蛋白库中已经确定的生物功能。
所述的由转录组测序设计开发的双亲遗传且与基因功能相关的EST-SSR分子标记，可作为胡桃属植物群体遗传多样性和适应进化研究的引物。
采用PCR扩增(10μL体系：2×PCR Mixture 5μL、F primer 0.2μL、R primer 0.2μL、DNA 5μL及ddH2O 2.6μL)和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，对开发的21-45对EST-SSR分子标记进行多态性及稳定性方面的筛选，并挖掘其包含的功能基因所匹配的生物功能。
电泳银染显色之后通过BIO-RAD凝胶成像***照相检验保存，之后使用相关软件进行统计分析。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而以下实施例、实验例仅对本发明进行进一步说明，而不是用来限制本发明。
筛选方法的具体步骤：
一、根据Huetal.2016中的方法,对胡桃属五个种的新鲜叶片、芽、未成熟果实进行RNA的提取；
二、利用Illumina Hiseq高通量测序后，得到4.29-5.04GB的原始reads，测序后获得的原始序列其中有测序接头和测序质量低的reads不利于序列组装拼接和后续的数据分析。需要做如下处理，以获得clean reads。
(1)去除不确定碱基比例占总碱基数的5％以上的reads；
(2)去除质量值Q≤10的碱基数达整条序列20％以上的低质量reads；
(3)去除含测序接头的reads。
三、使用Trinity(Grabherr et al.2011)对得到的高质量reads进行de novo组装，得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes。
四、对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计，(通过MISA脚本(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)在组装好的Unigenes中进行微卫星位点的识别)，参数的设置(1、单碱基重复序列删除；2、大于等于五个重复单元序列保留)。
Primer3(http://primer3.sourceforge.net/releases.php)设计引物，然后进行引物多态性扩增。设计参数：最优核苷酸长度为21bp(18bp-23bp)，扩增产物大小为142-280bp，最适退火温度为58℃，最佳GC含量设定为50％(50％-60％)。设计引物后，扩增这70个位点，控制产物片段保持在142-280bp，每个长度均保证五对引物，长度范围是142-280bp，按10bp为分组标准。
五、对得到的引物进行筛选：
(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；
(2)再根据碱基重复类型进行EST-SSR降序排列后，将碱基重复类型为一碱基重复且碱基重复次数小于18的EST-SSR删除；
(3)根据EST-SSR碱基重复单元总数进行降序排列，删除碱基重复单元总数小于60的序列；
(4)根据EST-SSR引物PCR扩增产物片段大小进行升序排列，删除扩增产物片段大小在140bp以下并且碱基重复单元总数小于20的引物序列；
(5)根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，删除碱基重复单元总数小于18的引物序列；
(6)然后根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，再删除碱基重复类型为Pc的碱基序列；
(7)依次以引物PCR扩增产物大小和碱基重复单元总数对EST-SSR进行降序排列，保留总序列数目中的位于前50％的引物序列；
(8)从步骤(7)筛选出符合条件的引物序列中，选取产物片段长度为142-280bp的引物；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度均保证对应五对引物，通过PCR扩增筛选即得多态性EST-SSR引物。
实施例一：泡核桃EST-SSR引物设计、功能注释及验证
(一)样本采集、RNA提取及RNA-seq建库
本实验团队于2015年6月12日起在云南省各地，将泡核桃植物的成熟健康树种的新鲜叶片、芽、未成熟果实取样处理后带回实验室保存。根据Hu et al.2016中的方法进行RNA提取、定量及测序(Hu et al.2016)。
RNA-seq(Illumina,NEB,Beverly,MA,USA)建库使用NEBNext Ultra RNA LibraryPrep Kit。为了区别每个样本的来源(叶、芽和未成熟果实)，通过添加注释小标来完成。从头组装使用Trinity(Grabherr et al.2011)的默认参数设置得到Contigs，双端测序在北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成后得到非冗余Unigene数据库。使用BLAST软件将Unigenes序列与GO数据库(Gene Ontology，GO)和蛋白家族注释(Pfam)数据库比对，获得Unigenes的注释信息。
二、SSRs的发掘及引物设计
通过MISA脚本(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)在组装好的Unigenes中进行微卫星位点的识别。70条Unigenes被用于此项研究，共检测到包括有微卫星位点的序列有7,119条序列，此项分析的参数设置包括：1、单碱基重复序列删除；2、大于等于五个重复单元序列保留。设计引物后，扩增这70个位点，控制产物片段保持在142-280bp，每个长度均保证五对引物，长度范围是142-280bp，按10bp为分组标准。
使用Primer3(http://primer3.sourceforge.net/releases.php)设计引物，然后进行引物多态性扩增。设计参数：最优核苷酸长度为21bp(18bp-23bp)，扩增产物大小为142-280bp，最适退火温度为58℃，最佳GC含量设定为50％(50％-60％)。
然后对设计得到的引物进行筛选：
(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；
(2)再根据碱基重复类型进行EST-SSR降序排列后，将碱基重复类型为一碱基重复且碱基重复次数小于18的EST-SSR删除；
(3)根据EST-SSR碱基重复单元总数进行降序排列，删除碱基重复单元总数小于60的序列；
(4)根据EST-SSR引物PCR扩增产物片段大小进行升序排列，删除扩增产物片段大小在140bp以下并且碱基重复单元总数小于20的引物序列；
(5)根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，删除碱基重复单元总数小于18的引物序列；
(6)然后根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，再删除碱基重复类型为Pc的碱基序列；
(7)依次以引物PCR扩增产物大小和碱基重复单元总数对EST-SSR进行降序排列，保留总序列数目中的位于前50％的引物序列为初筛序列。
初筛序列，以下每个长度均保证五对引物，长度范围是142-280bp，按10bp为分组标准。片段大小范围为142-150(5对)，150-160(5对)；160-170(5对)；170-180(5对)；180-190(5对)；190-200(5对)；200-210(5对)；210-220(5对)；220-230(5对)；230-240(5对)；240-250(5对)；250-260(5对)；260-270(5对)；270-280(5对)；最后一共得到70对引物进行扩增。
三、扩增条件和引物验证
1、样本采集及DNA提取
为了验证EST-SSR引物的多态性，从泡核桃样本中随机选取三个居群(N＝3×16)进行转录组引物开发，3个泡核桃居群分别采自云南省维西县塔城镇，云南省楚雄市南华县和贵州省水城县补那村。新鲜的样本叶片经硅胶处理进行干燥，并且按照Doyle和Doyle(1987)方法(Doyle and Doyle.1987)提取DNA，置于-20℃冰箱保存。
2、条带的筛选与验证
(1)以48个泡核桃样品DNA为模板进行PCR扩增，10uL反应体系中包含以下溶液或试剂，具体见表1：
表1
PCR扩增程序为(具体退火温度见表1)。
(2)扩增结束后，采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。使用pBR322DNA/MspI为参照，通过银染及显色后在白光下观察PCR扩增产物目的片段；筛选得到的引物序列见表1。JS为泡核桃拉丁名Juglans sigillata的首字母缩写，用于表示泡核桃；F表示正向引物，R表示反向引物，通过PCR扩增的方法就能进行多态性引物的验证，操作简单，可靠性强。
3、结果
RNA测序使用Illumina HiSeq 2500平台(100bp paired end)，一共产生了4.29GB的序列。平均的Q30百分数(测序误差率低于0.05％)为90.99，GC含量百分数为45.16。使用Trinity软件从头组装共产生170,811个转录本，其中包括83,112条Unigenes。转录本读长为201bp-15,705bp，N50:2,171bp。Unigenes的长度范围从201bp到12,402bp，且N50值为1,147bp。
根据分析结果，有7,118条转录组Unigenes中包含SSRs序列，在所有的Unigenes(8,3112)中占8.6％。在这些位点中，单核苷酸重复是最常见的，大约有3,425，所占比重为47.9％(3425/7118)，接着是二核苷酸重复(2649/3693；71.73％)、三核苷酸重复(948/3693；25.67％)，包含四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复单元的位点仅发现96个。在EST-SSRs中主要的碱基重复类型为A/T，占46.82％，接下来是AG/CT，占14.26％；GA/TC占14.03％；AT/TA占6.71％；三碱基GAA/TTC占1.44％；AGA/TCT占1.38％。
本研究挑选的70对引物中仅21对被成功扩增而且在泡核桃居群中有多态性。具有多态性的EST-SSRs的碱基重复形式多样，范围为二碱基重复到六碱基重复，在这21个多态性微卫星位点中，包含的功能基因被匹配到NCBI蛋白库中已经确定的生物功能，主要与牛磺酸代谢(JS2009)、吡哆醛磷酸盐相关的酶(JS9948)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(JS9772)等功能相关。具体来说，牛磺酸在肝脏中和胆酸生成牛磺胆酸，并随胆汁排出到消化道中，可促进脂肪的消化吸收；磷酸吡哆醛是氨基酸代谢中的转氨酶及脱羧酶的辅酶，是临床上用于治疗帕金森综合症的药物，促进转氨酶进行转氨作用提高体内多巴胺的含量；羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂在临床上可用作降血脂药和降胆固醇药以及动脉粥样硬化病预防药。这些功能与泡核桃果实促进脂肪酸代谢、健脑补脑、有效防止动脉硬化，降低胆固醇的药用功效高度契合，进一步体现了泡核桃植物具有很重要的科研价值。
从发现的ESTs的基因池中，随机的选取了自主开发的70条包含微卫星位点的Unigenes，设计引物并对这些引物进行多态性及稳定性方面的筛选，共得到21对成功扩增并且多态性好，稳定性高的引物(表1)
图2中横向的数字1-48为选取的泡核桃个体，从图2中可以看出该引物都能100％扩增，具有很好的多态性，扩增的每个引物也有很大的特异性。图2结果显示两个条带的即为多态性引物，根据扩增的片段大小的特异性即可完成引物的快速筛选。
实施例二：核桃EST-SSR引物设计及验证
一、样本采集、RNA提取及RNA-seq建库，SSRs的发掘及引物设计具体步骤见实施例一。最后一共得到77对引物进行扩增
二、扩增条件和引物验证
1、样本采集及DNA提取
为了验证EST-SSR引物的多态性，从核桃样本中随机选取6个野生居群和5个栽培居群(N＝11×8)进行转录组引物开发，11个核桃居群分别来自贵州遵义、四川南充、西藏林芝、甘肃天水、新疆阿克苏、湖南龙山、江西南昌、贵州、云南保山、山西运城、湖南慈利。新鲜的样本叶片经硅胶处理进行干燥，并且按照Doyle和Doyle(1987)方法(Doyle andDoyle.1987)提取DNA，置于-20摄氏度冰箱保存。
2、条带的筛选与验证具体步骤见实施例一
3、结果
经过高通量测序后，一共产生了4.98GB的高质量reads。使用高质量reads进行denovo组装获得转录本序列，然后将每个转录本序列聚类分析结果最长的一个转录本序列作为Unigenes，共得到117,229个Unigenes。转录本读长为250,222bp，N50:1955bp。Unigenes的长度范围从201bp到17,048bp，且N50值为1,226bp。
根据分析结果，有26,088条转录组Unigenes中包含SSRs序列，在所有的Unigenes中占22.3％。在这些位点中，单核苷酸重复是最常见的，所占比重为50.2％，接着是二核苷酸重复(35.8％)、三核苷酸重复(12.1％)，包含四核苷酸重复(8.3％)、五核苷酸重复(0.1％)、六核苷酸重复单元(0.1％)。在EST-SSRs中主要的碱基重复类型AG/CT(57.7％)，接下来是AT/AT(9.6％)，AAG/CCT(7.6％)，AC/GT(5.7％)和AGG/CCT(3.2％)。
从发现的ESTs的基因池中，随机的选取了自主开发的77条包含微卫星位点的Unigenes，设计引物并对这些引物进行多态性及稳定性方面的筛选，共得到39对成功扩增并且多态性好，稳定性高的引物(表2)
图3是对引物JR6508进行的扩增，图中横向的数字为选取的核桃个体，白色箭头为标注的部分具有多态性的PCR扩增产物片段，白色数字表示DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)，从图3中我们可以看出该引物都能100％扩增，具有很好的多态性，扩增的每个引物也有很大的特异性。图3结果显示两个条带的即为多态性引物，根据扩增的片段大小的特异性即可完成引物的快速筛选。
实施例三：麻核桃EST-SSR引物设计及验证
一、样本采集、RNA提取及RNA-seq建库，SSRs的发掘及引物设计具体步骤见实施例一。最后一共得到33对引物进行扩增
二、扩增条件和引物验证
1、样本采集及DNA提取
为了验证EST-SSR引物的多态性，从麻核桃样本中随机选取2个居群,共27个个体进行转录组引物开发，2个麻核桃居群分别来自河北涞水(N＝15)、北京小龙门(N＝12)。新鲜的样本叶片经硅胶处理进行干燥，并且按照Doyle和Doyle(1987)方法(Doyle andDoyle.1987)提取DNA，置于-20摄氏度冰箱保存。
2、条带的筛选与验证具体步骤同实施例一
3、结果
RNA测序使用Illumina HiSeq 2500平台(100bp paired end)，一共产生了4.29GB的序列。GC含量百分数为46.6。使用Trinity软件从头组装共产生217,803个转录本，其中包括93,822条Unigenes。转录本读长为201bp-13,169bp，N50:1677bp。
根据分析结果，有16,699条转录组Unigenes中包含SSRs序列，在所有的Unigenes中占17.8％。在这些位点中，单核苷酸重复是最常见的，所占比重为43.2％，接着是二核苷酸重复(37.0％)、三核苷酸重复(13.7％)。在EST-SSRs中主要的碱基重复类型为A/T(44.3％)，接下来是AG/CT(32.8％)，AAG/CTT(4.7％)，AT/AT(3.6％)和AC/GT(2.7％)。
从发现的ESTs的基因池中，随机的选取了自主开发的33条包含微卫星位点的Unigenes，设计引物并对这些引物进行多态性及稳定性方面的筛选，共得到25对成功扩增并且多态性好，稳定性高的引物(表3)
图4是对引物JH42753进行的扩增，图中横向的数字为选取的麻核桃个体，白色箭头为标注的部分具有多态性的PCR扩增产物片段，白色数字表示DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)，从图4中我们可以看出该引物都能100％扩增，具有很好的多态性，扩增的每个引物也有很大的特异性。图4结果显示两个条带的即为多态性引物，根据扩增的片段大小的特异性即可完成引物的快速筛选。
实施例四：野核桃EST-SSR引物设计及验证
一、样本采集、RNA提取及RNA-seq建库，SSRs的发掘及引物设计具体步骤见实施例一。最后一共得到62对引物进行扩增
二、扩增条件和引物验证
1、样本采集及DNA提取
为了验证EST-SSR引物的多态性，从野核桃样本中随机选取11个居群，共96个个体进行转录组引物开发，11个麻核桃居群分别来自广西阳朔、陕西户县、陕西眉县、湖北神农架、湖北柳林、湖南石门等。DNA提取具体步骤同实施例一。
2、条带的筛选与验证具体步骤同实施例一
3、结果
RNA测序使用Illumina HiSeq平台(100bp paired end)，一共产生了5.0GB的序列。使用Trinity软件从头组装共产生273,094个转录本，其中包括116,814条Unigenes。
根据分析结果，有22,484条转录组Unigenes中包含SSRs序列，在所有的Unigenes中占19.2％。在这些位点中，最常见的是二核苷酸重复(39.9％)、接下来是三核苷酸重复(13.3％)、四核苷酸重复(1.4％)。
从发现的ESTs的基因池中，随机的选取了自主开发的62条包含微卫星位点的Unigenes，设计引物并对这些引物进行多态性及稳定性方面的筛选，共得到12对成功扩增并且多态性好，稳定性高的引物(表4)
图5是对引物JC8125进行的扩增，图中横向的数字为选取的野核桃个体，白色箭头为标注的部分具有多态性的PCR扩增产物片段，白色数字表示DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)，从图5中可以看出该引物都能100％扩增，具有很好的多态性，扩增的每个引物也有很大的特异性。图5结果显示两个条带的即为多态性引物，根据扩增的片段大小特异性即可完成引物的快速筛选。
实施例五：胡桃楸EST-SSR引物设计及验证
一、样本采集、RNA提取及RNA-seq建库，SSRs的发掘及引物设计具体步骤见实施例一。最后一共得到63对引物进行扩增
二、扩增条件和引物验证
1、样本采集及DNA提取
为了验证EST-SSR引物的多态性，从胡桃楸样本中随机选取3个居群，共48个个体进行转录组引物开发，3个胡桃楸居群分别来自北京(N＝14)、吉林长白山(N＝6)、河北兴隆县(N＝4)、北京小龙门(N＝24)等。DNA提取具体步骤同实施例一。
2、条带的筛选与验证具体步骤同实施例一
3、结果
RNA测序使用Illumina HiSeq平台(100bp paired end)，一共产生了5.04GB的序列。平均的Q30百分数(测序误差率低于0.05％)为91.17，GC含量百分数为45.27。使用Trinity软件从头组装共产生205,305个转录本，其中包括99,869条Unigenes。转录本读长为201bp-13,402bp，N50:1863bp。Unigenes的长度范围从201bp到13,402bp，且N50值为1309bp。
根据分析结果，有22,019条转录组Unigenes中包含SSRs序列，在所有的Unigenes中占22％。在这些位点中，最常见的是单核苷酸重复(43.2％)、接下来是二核苷酸重复(37.0％)、三核苷酸重复(13.7％)。
从发现的ESTs的基因池中，随机的选取了自主开发的63条包含微卫星位点的Unigenes，设计引物并对这些引物进行多态性及稳定性方面的筛选，共得到20对成功扩增并且多态性好，稳定性高的引物(表5)
图6是对引物JM78331进行的扩增，图中横向的数字为选取的胡桃楸个体，白色箭头为标注的部分具有多态性的PCR扩增产物片段，白色数字表示DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)，从图6中我们可以看出该引物都能100％扩增，具有很好的多态性，扩增的每个引物也有很大的特异性。图6结果显示两个条带的即为多态性引物，根据扩增的片段大小的特异性即可完成引物的快速筛选。
总的来说，筛选的EST-SSR分子标记引物有较高的通用性，可以应用到核桃、野核桃、麻核桃、胡桃楸、泡核桃等胡桃属物种中，如图7所示为胡桃楸筛选的引物JM68820以及核桃筛选的引物JR6439扩增胡桃属五个物种的结果，从结果中可以看出，筛选的引物在其他物种中也有很高的多态性以及特异性，开发的双亲遗传且与基因功能相关的EST-SSR分子标记也可作为胡桃属群体遗传多样性和适应进化研究的引物。图7说明在某一物种筛选出的多态性引物对其他种也有很强的通用性，图中横向的数字表示扩增的五个种的个体顺序，依次为胡桃楸、麻核桃、核桃、野核桃、泡核桃，每个物种之间用Marker隔开；纵向的数字表示DNA Marker扩增的DNA标准分子量(bp)(所用DNA Marker为PBR322)，图中的箭头是标出的部分具有多态性的PCR扩增产物片段。
综上所述，EST-SSRs是典型的可以联系相关物种的标记而且EST-SSRs所表现出来的多态性可以作为研究物种在基因表达差异的基础，指示群体的适应性差异(Bradbury etal.2013)和辅助育种工作。尤其是在胡桃属物种中，这种标记或许是一种对于胡桃属及其他植物之间物种形成和群体遗传多样性分析的极好的工具，同时也对于该属植物种质资源的保护，提高环境适应性具有实践性的意义。
表2
表3
表4
表5
核苷酸序列表电子文件
<110>西北大学、山东省林木种质资源中心
<120>一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>泡核桃
<220>胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物正向引物
<400>1
TCCACCTAAGTGAGGGCTTG
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>泡核桃
<220>胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物反向引物
<400>2
GAGTGGTGGTGGAGGATGAT

Claims (7)

1.一种胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物，其特征在于，所述引物的正向引物序列为F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列为R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。
2.一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，对待筛选的植物进行RNA提取，所述的RNA进行de novo测序后得到转录本序列，然后将每个转录本序列聚类分析结果最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到多态性微卫星位点目标引物；
所述的数据处理包括：
(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；
(2)再根据碱基重复类型进行EST-SSR降序排列后，将碱基重复类型为单碱基重复且碱基重复次数小于18的EST-SSR删除；
(3)根据EST-SSR碱基重复单元总数进行降序排列，删除碱基重复单元总数小于60的序列；
(4)根据EST-SSR引物PCR扩增产物片段大小进行升序排列，删除扩增产物片段大小在140bp以下并且碱基重复单元总数小于20的引物序列；
(5)根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，删除碱基重复单元总数小于18的引物序列；
(6)然后根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，再删除碱基重复类型为Pc的碱基序列；
(7)依次以引物PCR扩增产物大小和碱基重复单元总数对EST-SSR进行降序排列，保留总序列数目中的位于前50％的引物序列为初筛序列；
(8)在初筛序列中选取产物片段长度为142-280bp的引物；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度段均保证对应五对引物，通过PCR扩增筛选即得多态性EST-SSR引物。
3.根据权利要求2所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，对胡桃属植物的叶片、芽和/或果实进行RNA的提取，对所述的RNA进行de novo测序后得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到胡桃属多态性微卫星位点目标引物。
4.根据权利要求2所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，利用Illumina Hiseq对提取得到的RNA进行高通量测序后得到原始reads，原始reads经如下处理后得到clean reads；再对clean reads进行de novo组装，得到转录本序列；
(1)去除不确定碱基比例占总碱基数的5％以上的reads；
(2)去除质量值Q≤10的碱基数达整条序列20％以上的reads；
(3)去除含测序接头的reads。
5.根据权利要求4所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，使用Trinity对得到的clean reads进行de novo组装，得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes；
通过MISA脚本http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html对Unigenes进行微卫星位点识别。
6.根据权利要求2所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，所述的引物设计采用http://primer3.sourceforge.net/releases.php设计引物，然后进行设计得到的引物的多态性扩增；控制产物片段长度为142-280bp；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度均保证对应五对引物；即得EST-SSR引物；
引物设计参数：核苷酸长度为18bp-23bp，扩增产物大小为142-280bp，最适退火温度为58℃，GC含量为50％-60％。
7.一种引物，其特征在于，所述的引物采用权利要求2-6任一权利要求所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法筛选得到。
CN201810921068.1A 2018-08-14 2018-08-14 一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物 Pending CN108998553A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810921068.1A CN108998553A (zh) 2018-08-14 2018-08-14 一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810921068.1A CN108998553A (zh) 2018-08-14 2018-08-14 一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108998553A true CN108998553A (zh) 2018-12-14

Family

ID=64595897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810921068.1A Pending CN108998553A (zh) 2018-08-14 2018-08-14 一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108998553A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846430A (zh) * 2019-11-13 2020-02-28 中国农业科学院作物科学研究所 一种大豆ssr标记高通量多重pcr的方法
CN111057784A (zh) * 2020-01-14 2020-04-24 四川农业大学 一种与核桃黑斑病相关的ssr分子标记引物及其应用
CN112349347A (zh) * 2020-09-25 2021-02-09 江苏农林职业技术学院 一种草莓功能基因连锁ssr标记的开发方法
CN114317764A (zh) * 2021-11-29 2022-04-12 西北大学 林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1925672A1 (en) * 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
CN103642912A (zh) * 2013-11-29 2014-03-19 中国农业科学院作物科学研究所 基于转录组测序开发绿豆ssr引物的方法
CN105087574A (zh) * 2015-09-17 2015-11-25 江苏省农业科学院 藜麦est-ssr分子标记及其开发方法与应用
CN107475253A (zh) * 2016-06-08 2017-12-15 汪建平 微卫星不稳定性位点-bat26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒
CN108300798A (zh) * 2018-04-10 2018-07-20 新疆农业科学院园艺作物研究所 一种核桃微卫星dna标记指纹图谱构建方法及其应用的引物对

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1925672A1 (en) * 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
CN103642912A (zh) * 2013-11-29 2014-03-19 中国农业科学院作物科学研究所 基于转录组测序开发绿豆ssr引物的方法
CN105087574A (zh) * 2015-09-17 2015-11-25 江苏省农业科学院 藜麦est-ssr分子标记及其开发方法与应用
CN107475253A (zh) * 2016-06-08 2017-12-15 汪建平 微卫星不稳定性位点-bat26位点的检测引物、扩增体系及检测试剂盒
CN108300798A (zh) * 2018-04-10 2018-07-20 新疆农业科学院园艺作物研究所 一种核桃微卫星dna标记指纹图谱构建方法及其应用的引物对

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846430A (zh) * 2019-11-13 2020-02-28 中国农业科学院作物科学研究所 一种大豆ssr标记高通量多重pcr的方法
CN111057784A (zh) * 2020-01-14 2020-04-24 四川农业大学 一种与核桃黑斑病相关的ssr分子标记引物及其应用
CN111057784B (zh) * 2020-01-14 2022-06-07 四川农业大学 一种与核桃黑斑病相关的ssr分子标记引物及其应用
CN112349347A (zh) * 2020-09-25 2021-02-09 江苏农林职业技术学院 一种草莓功能基因连锁ssr标记的开发方法
CN112349347B (zh) * 2020-09-25 2023-11-10 江苏农林职业技术学院 一种草莓功能基因连锁ssr标记的开发方法
CN114317764A (zh) * 2021-11-29 2022-04-12 西北大学 林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用
CN114317764B (zh) * 2021-11-29 2024-02-27 西北大学 林麝微卫星位点组合、引物组合、试剂盒及亲权鉴定应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108998553A (zh) 一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物
CN109468405B (zh) 基于转录组测序开发的云锦杜鹃ssr引物对及筛选方法与应用
CN106754886A (zh) 基于转录测序获得黑果枸杞ssr引物的方法
CN107201408A (zh) 一种基于转录组测序开发剑麻ssr引物的方法
CN109337997B (zh) 一种山茶属多态性叶绿体基因组微卫星分子标记引物及筛选和甄别近缘种的方法
CN114672588B (zh) 一种SNP分子标记Cpa03g017250：8及其扩增引物、检测试剂盒和应用
CN108192893B (zh) 基于转录组测序开发艾纳香ssr引物的方法
CN110951911B (zh) 基于转录组的椴树属est-ssr引物及其筛选方法和应用
CN109536632B (zh) 基于转录组测序开发的满山红ssr引物对及筛选方法与应用
CN109750093B (zh) 鉴别或辅助鉴别甘草的方法
CN108754018B (zh) 一种刺五加目的基因ssr分子标记的筛选方法及应用
CN111979341B (zh) 一种基于罗氏沼虾转录组序列开发的引物组及其应用
CN106167825B (zh) 一种黄颡鱼生长特性相关的微卫星标记及其检测和应用
CN111944917B (zh) 一种基于转录组测序开发山茶属植物ssr引物的方法
CN116144819B (zh) 与南瓜果肉类胡萝卜素主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用
CN116179738B (zh) 一种用于鉴定沉香品种的ssr分子标记的核心引物组及应用
CN110878376A (zh) 用于鉴定霍山石斛的ssr分子标记引物及其应用
CN113684301B (zh) 鉴定杏果皮毛性状的snp标记、引物及应用
CN111663002B (zh) 一种区分甘蔗种间二号染色体遗传背景的ssr标记与应用
CN111663001B (zh) 一种区分甘蔗种间三号染色体遗传背景的ssr标记与应用
CN106929587A (zh) 寒兰基因组中含有ssr位点的基因片段的pcr引物设计方法
CN114107545A (zh) 一种冬瓜果面蜡粉基因的caps分子标记及其应用
CN113462811A (zh) 一种砂仁ssr分子标记引物组及其应用
CN106701965A (zh) 一种基于单核苷酸多态性标记的桑树遗传分型方法
CN109735644B (zh) 鉴别或辅助鉴别甘草的引物对及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181214

RJ01 Rejection of invention patent application after publication