CN107460185B - 热稳定性提高的碱性果胶酶突变体及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了热稳定性提高的碱性果胶酶突变体及其编码基因与应用。本发明对野生型碱性果胶酶的2个位点进行定点突变，获得了酶活及热稳定性提升且最适作用温度降低的碱性果胶酶突变体。其中双突变体pelN‑K93I/G241A的最适酶活温度比突变前降低了5℃，Tm提高了1.671℃，在60℃条件下的半衰期延长了15.86分钟，Km由2.59g/L降为1.1g/L，最适酶活温度由67.5℃降低至60℃。本发明的突变体具有更高的热稳定性和更好的苎麻脱胶率，因此更适合脱胶工艺，在纺织工业上具有更好的应用潜能。

Description

热稳定性提高的碱性果胶酶突变体及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及热稳定性提高的碱性果胶酶突变体及其编码基因与应用。
背景技术
在传统的棉麻精炼工艺中，一般使用高浓度的强碱溶液处理退浆后的棉麻织物，除去植物表面的非纤维成分。在这个过程中，不仅会损伤棉麻的纤维成分，影响下游产品的品质，而且工艺过程中引入大量的化学成分，增加了废水的处理难度和产品的生产成本。近些年来生物酶处理法越来越受到人们的关注，其中以碱性果胶酶为主。酶精炼能够显著降低能源消耗，简化废水处理，并且能够选择性的去除棉麻表面的果胶质、蜡质等非纤维性成分，处理过程不会损伤纤维性成分，提高产品的柔软度和强度，是未来纺织行业清洁生产的方向。
目前，酶法脱胶工艺一般在较高的温度(50-60℃)下进行，而脱胶过程一般持续4-8h。然而，当温度上升到45℃以上时，果胶酶的酶活会随着温度的升高急剧下降，在60℃下水浴处理0.5h，酶活残余40％左右，严重影响果胶酶的作用效果。因此，为了提高果胶酶的利用率，开发经济、有效的热稳定剂对于酶法脱胶的产业化应用有着重要的研究意义和市场价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何提高碱性果胶酶的热稳定性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下(1)-(5)中任一种：
(1)将碱性果胶酶第241位氨基酸残基由甘氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；
(2)将碱性果胶酶第241位氨基酸残基由甘氨酸突变为缬氨酸得到的蛋白质；
(3)将碱性果胶酶第93位氨基酸残基由赖氨酸突变为异亮氨酸，且将第241位氨基酸残基由甘氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；
(4)将碱性果胶酶第93位氨基酸残基由赖氨酸突变为异亮氨酸得到的蛋白质；
(5)在(1)-(4)中任一所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述碱性果胶酶为如下a1)或a2)的蛋白质：
a1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
a2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a1)衍生的蛋白质。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了编码上述蛋白质的基因。
上述基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)的DNA分子：
(b1)序列2所示的DNA分子；
(b2)序列3所示的DNA分子；
(b3)序列4所示的DNA分子；
(b4)序列5所示的DNA分子；
(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述c1)-c4)中的任一种生物材料：
c1)含有上述基因的表达盒；
c2)含有上述基因的重组载体；
c3)含有上述基因的重组菌；
c4)含有上述基因的转基因细胞系。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述生物材料在制备热稳定性提高的碱性果胶酶中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在酶法脱胶中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在提高酶法脱胶率中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种热稳定性提高的碱性果胶酶的制备方法。
本发明提供的热稳定性提高的碱性果胶酶的制备方法是将上述蛋白质的编码基因在受体微生物中进行表达得到所述热稳定性提高的碱性果胶酶。
上述方法中，将上述蛋白质的编码基因在生物中进行表达的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达上述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到上述蛋白质。所述蛋白质的编码基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)或(b6)的DNA分子：
(b1)序列2所示的DNA分子；
(b2)序列3所示的DNA分子；
(b3)序列4所示的DNA分子；
(b4)序列5所示的DNA分子；
(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b6)与(b1)或(b2)或(b3)或(b4)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述方法中，所述受体微生物可为原核微生物；所述原核微生物可为细菌；所述细菌可为大肠杆菌；所述大肠杆菌具体为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种酶法脱胶的方法。
本发明提供的酶法脱胶的方法包括采用上述蛋白质进行脱胶的步骤。在本发明的具体实施例中，用上述蛋白质对苎麻进行脱胶。结果表明：和野生型碱性果胶酶相比，上述蛋白质(本发明的突变体)的苎麻脱胶率显著提高。
本发明选择Paenibacillus sp.0602(GenBank登录号：KC351190)来源的碱性果胶酶PelN-WT的2个位点进行突变，分别获得了PelN-K93I、PelN-G241A、PelN-G241V三个单点突变体。突变前后碱性果胶酶的最适酶活温度以及热稳定性都有明显的变化，突变体PelN-K93I的最适酶活温度下降为60℃，在45℃条件下突变体的比酶活提高了1.75倍；突变体PelN-G241A和PelN-G241V的热稳定明显提高，在60℃条件下半衰期比PelN-WT分别延长0.85和0.41倍，Tm提高了1.799℃和1.284℃。单个突变对蛋白质特性的影响往往是独立存在的，而且存在叠加效应，为了进一步提高PelN的特性，对碱性果胶酶PelN-WT的2个位点同时进行突变得到碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A，在60℃条件下的半衰期为49.33分钟，比PelN-WT延长了15.86分钟，Km由2.59g/l降为1.1g/l，最适酶活温度由67.5℃降低到60℃；在45℃条件下的比酶活提高了68.98％；Tm提高了1.671℃。苎麻脱胶的测定结果表明，在相同操作流程下，各单点突变体PelN-K93I，PelN-G241A，PelN-G241V以及双突变体PelN-K93I/G241A对苎麻的脱胶率有不同程度的提高。本发明利用蛋白质工程技术，通过对Paenibacillus sp.0602碱性果胶酶PelN进行定点突变，获得了热稳定性和催化效率提高、最适酶活温度降低的碱性果胶酶突变体，实验证明：本发明的突变体具有更高的热稳定性和更好的苎麻脱胶率，更适合脱胶工艺，在纺织工业上具有更好的应用潜能。
附图说明
图1为碱性果胶酶野生型以及突变体的SDS-PAGE电泳图。
图2为碱性果胶酶PelN突变体的热稳定性。
图3为碱性果胶酶PelN突变体的DSC曲线。
图4为碱性果胶酶PelN突变体的最适酶活温度。
图5为碱性果胶酶PelN突变体对麻类的脱胶率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的菌株、质粒与试剂的购买处如下：表达载体pET-22b(+)购自Novagen公司。克隆菌株Escherichia coli DH5α和表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞、DNA纯化回收以及胶回收试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶均为Fermentas系列。不饱和聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯。
实施例1、碱性果胶酶PelN突变体的基因序列制备
一、碱性果胶酶PelN单突变体的基因序列的制备
对序列1所示的野生型碱性果胶酶PelN基因进行突变，得到碱性果胶酶PelN突变体基因。具体步骤如下：通过分段PCR扩增的方法将突变核苷酸引入PelN基因；其中前段序列PCR所用的正向引物为PelN通用引物PelN-F(下划线部分为酶切位点)，反向引物为含有突变位点的特定引物(黑体部分为突变的核苷酸)，模板为PelN基因。后段序列PCR所用的正向引物为含有突变位点的特定引物(黑体部分为突变的核苷酸)，反向引物为PelN通用引物PelN-R(下划线部分为酶切位点)，模板为PelN基因，回收分段PCR产物。将两段PCR产物等比例混合，以正向通用引物和反向通用引物进行第二次PCR，PCR产物通过0.7％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收1200bp附近的片段。
最终得到序列2所示的碱性果胶酶PelN单突变体K93I的基因序列、序列3所示的碱性果胶酶PelN单突变体G241A的基因序列和序列4所示的碱性果胶酶PelN单突变体G241V的基因序列。
表1、引物序列
名称 序列 描述
PelN_F GGAATTC<u>CATATG</u>GCGGGCAATGCAG Nde1，PelN 5’
PelN_R CC<u>CTCGAG</u>ATAGCTCGTCTTC Xho1，PelN 3’
K93I_F AAGCAGACTGGTGTCAGCATAATTACGG K93I
K93I_R GTCCACCGTAATTATGCTGACACCAGTC K93I
G241A_F ATTATTGCCATCTCTGCGTCGCAGAAAA G241A
G241A_R ACCTTTTTTCTGCGACGCAGAGATGGCA G241A
G241V_F ATTATTGCCATCTCTGTATCGCAGAAAA G241V
G241V_R ACCTTTTTTCTGCGATACAGAGATGGCA G241V
二、碱性果胶酶PelN双突变体的基因序列制备
对碱性果胶酶PelN单突变体K93I的基因序列按照碱性果胶酶PelN单突变体G241A的基因序列的突变方法进行突变，得到序列5所示的碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的基因序列。
三、测序验证
将步骤一和步骤二获得的碱性果胶酶PelN单突变体K93I的基因序列、碱性果胶酶PelN单突变体G241A的基因序列、碱性果胶酶PelN单突变体G241V的基因序列和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的基因序列，经过限制性内切酶处理后与载体相连后转化克隆菌株Escherichia coli DH5α。转化子经测序验证表明：所有的单突变体的基因序列和双突变体的基因序列中的突变位点均与预期结果一致。
实施例2、碱性果胶酶PelN突变体的制备
一、表达载体的构建
将序列1所示的野生型碱性果胶酶PelN的基因序列***表达载体pET-22b(+)的Nde1和Xho1酶切位点间，且保持表达载体pET-22b(+)的其他序列不变，得到表达载体PelN；表达载体PelN表达C端带有HIS标签的野生型碱性果胶酶PelN，野生型碱性果胶酶PelN的氨基酸序列为序列6。
将序列2所示的碱性果胶酶PelN单突变体K93I的基因序列***表达载体pET-22b(+)的Nde1和Xho1酶切位点间，且保持表达载体pET-22b(+)的其他序列不变，得到表达载体K93I；表达载体K93I表达C端带有HIS标签的碱性果胶酶PelN突变体K93I，碱性果胶酶PelN突变体K93I的氨基酸序列为将序列6第93位的赖氨酸突变为异亮氨酸，且保持序列6的其他氨基酸序列不变后得到的序列。
将序列3所示的碱性果胶酶PelN单突变体G241A的基因序列***表达载体pET-22b(+)的Nde1和Xho1酶切位点间，且保持表达载体pET-22b(+)的其他序列不变，得到表达载体G241A；表达载体G241A表达C端带有HIS标签的碱性果胶酶PelN突变体G241A，碱性果胶酶PelN突变体G241A的氨基酸序列为将序列6第241位的甘氨酸突变为丙氨酸，且保持序列6的其他氨基酸序列不变后得到的序列。
将序列4所示的碱性果胶酶PelN单突变体G241V的基因序列***表达载体pET-22b(+)的Nde1和Xho1酶切位点间，且保持表达载体pET-22b(+)的其他序列不变，得到表达载体G241V；表达载体G241V表达C端带有HIS标签的碱性果胶酶PelN突变体G241V，碱性果胶酶PelN突变体G241V的氨基酸序列为将序列6第241位的甘氨酸突变为缬氨酸，且保持序列6的其他氨基酸序列不变后得到的序列。
将序列5所示的碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的基因序列***表达载体pET-22b(+)的Nde1和Xho1酶切位点间，且保持表达载体pET-22b(+)的其他序列不变，得到表达载体K93I/G241A。表达载体K93I/G241A表达C端带有HIS标签的碱性果胶酶PelN突变体K93I/G241A，碱性果胶酶PelN突变体K93I/G241A的氨基酸序列为将序列6第93位的赖氨酸突变为异亮氨酸，且将序列6第241位的甘氨酸突变为丙氨酸，且保持序列6的其他氨基酸序列不变后得到的序列。
二、重组菌的构建
分别将步骤一中的表达载体PelN、表达载体K93I、表达载体G241A、表达载体G241V和表达载体K93I/G241A通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，分别得到重组菌PelN/BL21(DE3)、重组菌K93I/BL21(DE3)、重组菌G241A/BL21(DE3)、重组菌G241V/BL21(DE3)和重组菌K93I/G241A/BL21(DE3)。
三、碱性果胶酶PelN突变体的诱导表达与纯化
1、碱性果胶酶PelN突变体的诱导表达
分别将重组菌PelN/BL21(DE3)、重组菌K93I/BL21(DE3)、重组菌G241A/BL21(DE3)、重组菌G241V/BL21(DE3)和重组菌K93I/G241A/BL21(DE3)接入种子培养基中，37℃、200r/min过夜震荡。以1％接种量接种至100mL的表达培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.6，然后加入IPTG至终浓度为100μM，26℃继续震荡培养40h，分别获得发酵液。
所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，氨苄50μg/mL，所述种子培养基的pH值为7.2。
所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油10g/L，磷酸二氢钾17mmol/L，磷酸氢二钾70mmol/L。
2、碱性果胶酶PelN突变体的纯化
将上述获得的发酵液8000r/min离心10min，收集上清液。将上清液进行亲和纯化，使用镍柱(购于GE公司)的体积为10mL，使用的缓冲液如下：平衡液A：0.02M PBS；洗脱液B：含0.4M咪唑的0.02M PBS。洗脱过程如下：(1)将层析柱用20mL平衡液平衡，流速为2mL/min；(2)发酵液经过0.5μm的微孔滤膜过滤后上样；(3)用平衡液和洗脱液梯度混合洗脱，40mL5％B液洗脱，流速2mL/min，B液的梯度从5％-84％，流速1mL/min。收集A280吸收值超过0.3mAU的峰，每管收集1mL液体。将收集的洗脱液透析袋4℃透析过夜后，分别得到纯化后的野生型碱性果胶酶PelN酶液、碱性果胶酶PelN单突变体K93I酶液、碱性果胶酶PelN单突变体G241A酶液、碱性果胶酶PelN单突变体G241V酶液和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A酶液。
所有样品的纯化过程都通过SDS-PAGE验证，结果如图1所示。从图中可以看出：野生型碱性果胶酶PelN、碱性果胶酶PelN单突变体K93I、碱性果胶酶PelN单突变体G241A、碱性果胶酶PelN单突变体G241V和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的大小均为48kDa。
实施例3、野生型碱性果胶酶PelN和突变体的热稳定性比较
本发明比较了野生型碱性果胶酶PelN(PelN-WT，简称PelN或wild)和碱性果胶酶PelN单突变体K93I(PelN-K93I，简称K93I)、碱性果胶酶PelN单突变体G241A(PelN-G241A，简称G241A)、碱性果胶酶PelN单突变体G241V(PelN-G241V，简称G241V)和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A(PelN-K93I/G241A，简称K93I/G241A)的热稳定性变化，其中野生型碱性果胶酶PelN是Paenibacillus sp.0602(GenBank登录号：KC351190)来源的碱性果胶酶PelN-WT(氨基酸序列为序列6，其编码基因序列为序列1)。
一、野生型碱性果胶酶PelN和突变体在60℃条件下处理不同时间后的剩余酶活、半衰期和比活力的比较
1、剩余酶活
将实施例2中获得的纯化后的野生型碱性果胶酶PelN酶液和各个突变体酶液置于60℃恒温水浴，分别在水浴处理0min、20min、40min、60min、100min和120min时进行取样，取得的样品置于冰上10min后测量碱性果胶酶酶活，以60℃下保温0min的酶活作为100％，计算保温不同时间后的酶活残留率(％)。酶活残留率(％)的计算公式：b/a×100％。其中，a为水浴0min时的酶活，单位为U/mL；b为水浴n min后的酶活，单位为U/mL。n为20min、40min、60min、100min或120min。
上述碱性果胶酶酶活的测定方法如下：
1)将纯化后的野生型碱性果胶酶PelN酶液和各个突变体酶液用甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，pH9.4)稀释后作为待测溶液；
2)分别按照如下实验组和对照组进行实验：
实验组：在2ml溶液甲中加入20μL待测溶液，45℃反应15min，加入3mL 0.03mol/LH3PO4水溶液(终止液)，测定235nm的吸光度值；
对照组：在2ml溶液甲中依次加入3mL 0.03mol/L H3PO4水溶液和20μL待测溶液，测定235nm的吸光度值。碱性果胶酶酶活(U/mL)计算公式如下：△OD235×106×稀释倍数×V0/103×t×4600×b×V1。其中，△OD235＝实验组235nm的吸光度值-对照组235nm的吸光度值；4600为不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数，单位为L·mol-1·cm-1；t为酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)，单位为min，本实验中为15min；b为比色杯厚度，单位为cm，本实验中为1cm；V0为体系总体积数，单位为mL，本实验中为5.02mL；V1为酶液体积数，单位为mL，本实验中为0.02mL。
上述溶液甲的配方：含0.2g/100ml多聚半乳糖醛酸(购自Sigma-Aldrich公司，货号81325-50G)和0.44mmol/L CaCl2的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，pH9.4)。
碱性果胶酶一个标准酶活单位(1U)定义为：在上述条件下，1min反应时间内使PGA产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所需的酶量。
结果如图2所示。从图中可以看出：碱性果胶酶PelN单突变体G241A、碱性果胶酶PelN单突变体G241V和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的酶活残留率均高于野生型，由于酶活残留率和热稳定性是正相关，因此碱性果胶酶PelN单突变体G241A、碱性果胶酶PelN单突变体G241V和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的热稳定性均高于野生型。其中，碱性果胶酶PelN单突变体PelN-G241A热稳定性最好，其次是碱性果胶酶PelN单突变体G241V和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A。
2、半衰期
以剩余酶活为纵坐标，处理时间为横坐标绘制曲线，根据曲线得到野生型碱性果胶酶PelN及各个突变体在60℃处理条件下的半衰期。
结果如表2所示。从表中可以看出：除了碱性果胶酶PelN单突变体PelN-K93I的半衰期与PelN-WT类似，碱性果胶酶PelN单突变体G241A、碱性果胶酶PelN单突变体G241V和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的半衰期均有所提高。
表2、野生型与各突变体在60℃时的半衰期
PelN-WT PelN-K93I PelN-G241A PelN-G241V PelN-G241A/K93I
半衰期(分钟) 33.47 32.84 61.86 47.09 49.33
3、比活力
将实施例2中获得的纯化后的野生型碱性果胶酶PelN酶液和各个突变体酶液稀释不同倍数，测定酶蛋白浓度和酶活力，计算酶的比活力，酶的比活力定义为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数。
结果如表3所示。从表中可以看出：碱性果胶酶PelN单突变体PelN-K93I的比活力明显高于野生型，同样碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的比活力也明显高于野生型，说明碱性果胶酶第93位的赖氨酸与碱性果胶酶的催化效率相关。
表3、各突变体与野生型的比活力
PelN-WT PelN-K93I PelN-G241A PelN-G241V PelN-G241A/K93I
比活力(U/mg) 1602 2797 1449 1704 2707
二、野生型碱性果胶酶PelN和突变体的最适酶活温度
将实施例2中获得的纯化后的野生型碱性果胶酶PelN酶液和各个突变体酶液分别在不同温度：30℃-80℃之间每隔5℃测定碱性果胶酶酶活，确定最适酶活温度，并以最高酶活作为100％，计算不同温度下的相对酶活。相对酶活(％)＝不同温度下酶活占最高酶活的比例。
结果如图4所示。和野生型相比，碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A和碱性果胶酶PelN单突变体K93I的最适酶活温度均下降为60℃。
三、野生型碱性果胶酶PelN和突变体的Tm值比较
Tm值由示差扫描量热法(Nano DSC)测定，将纯化后的野生型碱性果胶酶PelN酶液和各个突变体酶液用0.02M PBS缓冲液稀释至相同浓度0.2mg/ml，以1℃/min的速度从40℃扫描到80℃，压力维持在0.3Mpa。
结果如图3所示。碱性果胶酶PelN单突变体K93I的Tm值与野生型碱性果胶酶PelN(PelN-WT)相比没有变化，而碱性果胶酶PelN单突变体G241A和碱性果胶酶PelN单突变体G241V的Tm值比野生型碱性果胶酶PelN分别提高了1.799℃和1.284℃。碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的Tm值比野生型碱性果胶酶PelN提高了1.671 ℃。
表4、各突变体与野生型的Tm值
PelN-WT PelN-K93I PelN-G241A PelN-G241V PelN-G241A/K93I
Tm值(℃) 71.561 71.544 73.36 72.845 73.232
四、野生型碱性果胶酶PelN和突变体的动力学性质参数测定
在45℃和pH9.4条件下，以不同底物浓度的半乳糖醛酸进行酶活测定。每个酶活性测定进行了至少三个重复。使用GraphPad Prism软件和米式方程得到初始反应速度，从而进一步得到野生型碱性果胶酶PelN和各个突变体催化反应的动力学参数Km和Kcat。结果如表5所示。
表5、各突变体与野生型的酶动力学性质参数
K<sub>m</sub>(g/l) k<sub>cat</sub><sup>b</sup>(10<sup>3</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>cat</sub>/Km(10<sup>3</sup>l/g·min)
PelN-WT 2.59 4.23 1.62
PelN-K93I 0.55 0.48 0.87
PelN-G241A 2.29 4.55 1.99
PelN-G241V 2.96 7.01 2.37
PelN-G241A/K93I 1.10 1.00 0.91
实施例4、野生型碱性果胶酶PelN和突变体的脱胶能力比较
1、反应体系的制备
将1克苎麻浸泡在含有野生型碱性果胶酶PelN或其突变体的50mL glycin-NaOH缓冲液(pH 9.8)中，得到脱胶体系，野生型碱性果胶酶PelN或其突变体在脱胶体系中的浓度均为30U/mL。以不含有碱性果胶酶的glycin-NaOH缓冲液为对照。突变体为实施例2中制备的碱性果胶酶PelN单突变体K93I、碱性果胶酶PelN单突变体G241A、碱性果胶酶PelN单突变体G241V或碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A。
2、脱胶处理
将步骤1中的各个脱胶体系在250℃条件下处理12小时，清洗苎麻，115℃下干燥后称重，根据损失重量计算苎麻脱胶率。
结果如图5所示。从图中可以看出：和野生型碱性果胶酶PelN相比，碱性果胶酶PelN单突变体K93I、碱性果胶酶PelN单突变体G241A、碱性果胶酶PelN单突变体G241V和碱性果胶酶PelN双突变体K93I/G241A的脱胶率均有所提高，说明本发明获得的突变体具有更好的苎麻脱胶率，更适合脱胶工艺，在纺织工业上具有更好的应用潜能。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>热稳定性提高的碱性果胶酶突变体及其编码基因与应用
<160>6
<210>1
<211>1365bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
atggcgggca atgcagatta caatctgacc ggcttctctc aaggcaatac gggtggaggc 60
gtaatcagtg agtctaacac ggctgtgtac aaaaaagtgt acaatgccac cgacctggcg 120
ctggctttaa aaaagaactc cggtgtcaaa gtcgtcgaaa ttatgaatga cctcaacctg 180
ggatggaacg agattccaag tgcggcgcag acctcacctt ttgccaagca taacgatgcg 240
ctgacacatc ctgtgttgaa gcagactggt gtcagcaaaa ttacggtgga cggcttcaat 300
ggcctgacca ttttttccgc gaacgggtcc aaaatcaaac acgctgccat ttccgtgaaa 360
cgcagctcca acgtcatcat tcgcaatctg gagttcgatg agctgtggga gtgggatgag 420
tccaccaaag gagactatga caaaaacgat tgggattaca ttacactaga ggaaagcagc 480
ggcgtatgga ttgaccactg cggtttcaat aaagcctatg acggacttgt ggattcgaaa 540
aaaggaacca gcggcgtgac catttcctgg tctaccttca aaggggatga cggcagcccg 600
aacagctggg ttacccgcca gattaatgaa atggaagcaa acaaggcttc ctacccaatg 660
tacaactacc tgcgcagcag tgcggttggc ttaagcaaag aagatattat tgccatctct 720
ggttcgcaga aaaaaggtca tcttgtcggt gcgaccagtg atgaatcggc aaacgccaat 780
ctctccatca cgttacacca taatgtctat aaagacattc aggaccggat gccgcgactg 840
cggggcggta atgcacatgc ctacaacatc atcatggatg ccacagatgc ccgtgcagct 900
caaacgcgta ttacaagtgg tatggcagca gcaattgctt ccaaaggtta caaattcggg 960
attaccagca acggggctat ttccactgaa agtaatgctg tgctggttga aaaatcggtg 1020
atcaaggatg tgcagtaccc ggtgcgcaac aatcagacgg atccgaccaa cgctacgtac 1080
acaggtaaaa ttagggtagc agatacgatc tactcgctgg atgggagctc cttccgtggc 1140
agccgtgata cggcgggaag cccactggct cctgttccgg ctgcaatcaa accgttttcg 1200
tggaacggct tctccatact gccttacagc tatcagctgg atgatccatc tacactgaat 1260
gcacgcctga ccgcttccaa tggtgcgggt gcaggcaagc tatcctggtc taaggacaac 1320
tggctgaaga cgagctatct cgagcaccac caccaccacc actga 1365
<210>2
<211>1365bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atggcgggca atgcagatta caatctgacc ggcttctctc aaggcaatac gggtggaggc 60
gtaatcagtg agtctaacac ggctgtgtac aaaaaagtgt acaatgccac cgacctggcg 120
ctggctttaa aaaagaactc cggtgtcaaa gtcgtcgaaa ttatgaatga cctcaacctg 180
ggatggaacg agattccaag tgcggcgcag acctcacctt ttgccaagca taacgatgcg 240
ctgacacatc ctgtgttgaa gcagactggt gtcagcataa ttacggtgga cggcttcaat 300
ggcctgacca ttttttccgc gaacgggtcc aaaatcaaac acgctgccat ttccgtgaaa 360
cgcagctcca acgtcatcat tcgcaatctg gagttcgatg agctgtggga gtgggatgag 420
tccaccaaag gagactatga caaaaacgat tgggattaca ttacactaga ggaaagcagc 480
ggcgtatgga ttgaccactg cggtttcaat aaagcctatg acggacttgt ggattcgaaa 540
aaaggaacca gcggcgtgac catttcctgg tctaccttca aaggggatga cggcagcccg 600
aacagctggg ttacccgcca gattaatgaa atggaagcaa acaaggcttc ctacccaatg 660
tacaactacc tgcgcagcag tgcggttggc ttaagcaaag aagatattat tgccatctct 720
ggttcgcaga aaaaaggtca tcttgtcggt gcgaccagtg atgaatcggc aaacgccaat 780
ctctccatca cgttacacca taatgtctat aaagacattc aggaccggat gccgcgactg 840
cggggcggta atgcacatgc ctacaacatc atcatggatg ccacagatgc ccgtgcagct 900
caaacgcgta ttacaagtgg tatggcagca gcaattgctt ccaaaggtta caaattcggg 960
attaccagca acggggctat ttccactgaa agtaatgctg tgctggttga aaaatcggtg 1020
atcaaggatg tgcagtaccc ggtgcgcaac aatcagacgg atccgaccaa cgctacgtac 1080
acaggtaaaa ttagggtagc agatacgatc tactcgctgg atgggagctc cttccgtggc 1140
agccgtgata cggcgggaag cccactggct cctgttccgg ctgcaatcaa accgttttcg 1200
tggaacggct tctccatact gccttacagc tatcagctgg atgatccatc tacactgaat 1260
gcacgcctga ccgcttccaa tggtgcgggt gcaggcaagc tatcctggtc taaggacaac 1320
tggctgaaga cgagctatct cgagcaccac caccaccacc actga 1365
<210>3
<211>1365bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
atggcgggca atgcagatta caatctgacc ggcttctctc aaggcaatac gggtggaggc 60
gtaatcagtg agtctaacac ggctgtgtac aaaaaagtgt acaatgccac cgacctggcg 120
ctggctttaa aaaagaactc cggtgtcaaa gtcgtcgaaa ttatgaatga cctcaacctg 180
ggatggaacg agattccaag tgcggcgcag acctcacctt ttgccaagca taacgatgcg 240
ctgacacatc ctgtgttgaa gcagactggt gtcagcaaaa ttacggtgga cggcttcaat 300
ggcctgacca ttttttccgc gaacgggtcc aaaatcaaac acgctgccat ttccgtgaaa 360
cgcagctcca acgtcatcat tcgcaatctg gagttcgatg agctgtggga gtgggatgag 420
tccaccaaag gagactatga caaaaacgat tgggattaca ttacactaga ggaaagcagc 480
ggcgtatgga ttgaccactg cggtttcaat aaagcctatg acggacttgt ggattcgaaa 540
aaaggaacca gcggcgtgac catttcctgg tctaccttca aaggggatga cggcagcccg 600
aacagctggg ttacccgcca gattaatgaa atggaagcaa acaaggcttc ctacccaatg 660
tacaactacc tgcgcagcag tgcggttggc ttaagcaaag aagatattat tgccatctct 720
gcgtcgcaga aaaaaggtca tcttgtcggt gcgaccagtg atgaatcggc aaacgccaat 780
ctctccatca cgttacacca taatgtctat aaagacattc aggaccggat gccgcgactg 840
cggggcggta atgcacatgc ctacaacatc atcatggatg ccacagatgc ccgtgcagct 900
caaacgcgta ttacaagtgg tatggcagca gcaattgctt ccaaaggtta caaattcggg 960
attaccagca acggggctat ttccactgaa agtaatgctg tgctggttga aaaatcggtg 1020
atcaaggatg tgcagtaccc ggtgcgcaac aatcagacgg atccgaccaa cgctacgtac 1080
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<210>4
<211>1365bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
atggcgggca atgcagatta caatctgacc ggcttctctc aaggcaatac gggtggaggc 60
gtaatcagtg agtctaacac ggctgtgtac aaaaaagtgt acaatgccac cgacctggcg 120
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ggatggaacg agattccaag tgcggcgcag acctcacctt ttgccaagca taacgatgcg 240
ctgacacatc ctgtgttgaa gcagactggt gtcagcaaaa ttacggtgga cggcttcaat 300
ggcctgacca ttttttccgc gaacgggtcc aaaatcaaac acgctgccat ttccgtgaaa 360
cgcagctcca acgtcatcat tcgcaatctg gagttcgatg agctgtggga gtgggatgag 420
tccaccaaag gagactatga caaaaacgat tgggattaca ttacactaga ggaaagcagc 480
ggcgtatgga ttgaccactg cggtttcaat aaagcctatg acggacttgt ggattcgaaa 540
aaaggaacca gcggcgtgac catttcctgg tctaccttca aaggggatga cggcagcccg 600
aacagctggg ttacccgcca gattaatgaa atggaagcaa acaaggcttc ctacccaatg 660
tacaactacc tgcgcagcag tgcggttggc ttaagcaaag aagatattat tgccatctct 720
gtatcgcaga aaaaaggtca tcttgtcggt gcgaccagtg atgaatcggc aaacgccaat 780
ctctccatca cgttacacca taatgtctat aaagacattc aggaccggat gccgcgactg 840
cggggcggta atgcacatgc ctacaacatc atcatggatg ccacagatgc ccgtgcagct 900
caaacgcgta ttacaagtgg tatggcagca gcaattgctt ccaaaggtta caaattcggg 960
attaccagca acggggctat ttccactgaa agtaatgctg tgctggttga aaaatcggtg 1020
atcaaggatg tgcagtaccc ggtgcgcaac aatcagacgg atccgaccaa cgctacgtac 1080
acaggtaaaa ttagggtagc agatacgatc tactcgctgg atgggagctc cttccgtggc 1140
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tggaacggct tctccatact gccttacagc tatcagctgg atgatccatc tacactgaat 1260
gcacgcctga ccgcttccaa tggtgcgggt gcaggcaagc tatcctggtc taaggacaac 1320
tggctgaaga cgagctatct cgagcaccac caccaccacc actga 1365
<210>5
<211>1365bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
atggcgggca atgcagatta caatctgacc ggcttctctc aaggcaatac gggtggaggc 60
gtaatcagtg agtctaacac ggctgtgtac aaaaaagtgt acaatgccac cgacctggcg 120
ctggctttaa aaaagaactc cggtgtcaaa gtcgtcgaaa ttatgaatga cctcaacctg 180
ggatggaacg agattccaag tgcggcgcag acctcacctt ttgccaagca taacgatgcg 240
ctgacacatc ctgtgttgaa gcagactggt gtcagcataa ttacggtgga cggcttcaat 300
ggcctgacca ttttttccgc gaacgggtcc aaaatcaaac acgctgccat ttccgtgaaa 360
cgcagctcca acgtcatcat tcgcaatctg gagttcgatg agctgtggga gtgggatgag 420
tccaccaaag gagactatga caaaaacgat tgggattaca ttacactaga ggaaagcagc 480
ggcgtatgga ttgaccactg cggtttcaat aaagcctatg acggacttgt ggattcgaaa 540
aaaggaacca gcggcgtgac catttcctgg tctaccttca aaggggatga cggcagcccg 600
aacagctggg ttacccgcca gattaatgaa atggaagcaa acaaggcttc ctacccaatg 660
tacaactacc tgcgcagcag tgcggttggc ttaagcaaag aagatattat tgccatctct 720
gcgtcgcaga aaaaaggtca tcttgtcggt gcgaccagtg atgaatcggc aaacgccaat 780
ctctccatca cgttacacca taatgtctat aaagacattc aggaccggat gccgcgactg 840
cggggcggta atgcacatgc ctacaacatc atcatggatg ccacagatgc ccgtgcagct 900
caaacgcgta ttacaagtgg tatggcagca gcaattgctt ccaaaggtta caaattcggg 960
attaccagca acggggctat ttccactgaa agtaatgctg tgctggttga aaaatcggtg 1020
atcaaggatg tgcagtaccc ggtgcgcaac aatcagacgg atccgaccaa cgctacgtac 1080
acaggtaaaa ttagggtagc agatacgatc tactcgctgg atgggagctc cttccgtggc 1140
agccgtgata cggcgggaag cccactggct cctgttccgg ctgcaatcaa accgttttcg 1200
tggaacggct tctccatact gccttacagc tatcagctgg atgatccatc tacactgaat 1260
gcacgcctga ccgcttccaa tggtgcgggt gcaggcaagc tatcctggtc taaggacaac 1320
tggctgaaga cgagctatct cgagcaccac caccaccacc actga 1365
<210>6
<211>454
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
Met Ala Gly Asn Ala Asp Tyr Asn Leu Thr Gly Phe Ser Gln Gly Asn
1 5 10 15
Thr Gly Gly Gly Val Ile Ser Glu Ser Asn Thr Ala Val Tyr Lys Lys
20 25 30
Val Tyr Asn Ala Thr Asp Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Asn Ser Gly
35 40 45
Val Lys Val Val Glu Ile Met Asn Asp Leu Asn Leu Gly Trp Asn Glu
50 55 60
Ile Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ser Pro Phe Ala Lys His Asn Asp Ala
65 70 75 80
Leu Thr His Pro Val Leu Lys Gln Thr Gly Val Ser Lys Ile Thr Val
85 90 95
Asp Gly Phe Asn Gly Leu Thr Ile Phe Ser Ala Asn Gly Ser Lys Ile
100 105 110
Lys His Ala Ala Ile Ser Val Lys Arg Ser Ser Asn Val Ile Ile Arg
115 120 125
Asn Leu Glu Phe Asp Glu Leu Trp Glu Trp Asp Glu Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Asp Tyr Asp Lys Asn Asp Trp Asp Tyr Ile Thr Leu Glu Glu Ser Ser
145 150 155 160
Gly Val Trp Ile Asp His Cys Gly Phe Asn Lys Ala Tyr Asp Gly Leu
165 170 175
Val Asp Ser Lys Lys Gly Thr Ser Gly Val Thr Ile Ser Trp Ser Thr
180 185 190
Phe Lys Gly Asp Asp Gly Ser Pro Asn Ser Trp Val Thr Arg Gln Ile
195 200 205
Asn Glu Met Glu Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Pro Met Tyr Asn Tyr Leu
210 215 220
Arg Ser Ser Ala Val Gly Leu Ser Lys Glu Asp Ile Ile Ala Ile Ser
225 230 235 240
Gly Ser Gln Lys Lys Gly His Leu Val Gly Ala Thr Ser Asp Glu Ser
245 250 255
Ala Asn Ala Asn Leu Ser Ile Thr Leu His His Asn Val Tyr Lys Asp
260 265 270
Ile Gln Asp Arg Met Pro Arg Leu Arg Gly Gly Asn Ala His Ala Tyr
275 280 285
Asn Ile Ile Met Asp Ala Thr Asp Ala Arg Ala Ala Gln Thr Arg Ile
290 295 300
Thr Ser Gly Met Ala Ala Ala Ile Ala Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Gly
305 310 315 320
Ile Thr Ser Asn Gly Ala Ile Ser Thr Glu Ser Asn Ala Val Leu Val
325 330 335
Glu Lys Ser Val Ile Lys Asp Val Gln Tyr Pro Val Arg Asn Asn Gln
340 345 350
Thr Asp Pro Thr Asn Ala Thr Tyr Thr Gly Lys Ile Arg Val Ala Asp
355 360 365
Thr Ile Tyr Ser Leu Asp Gly Ser Ser Phe Arg Gly Ser Arg Asp Thr
370 375 380
Ala Gly Ser Pro Leu Ala Pro Val Pro Ala Ala Ile Lys Pro Phe Ser
385 390 395 400
Trp Asn Gly Phe Ser Ile Leu Pro Tyr Ser Tyr Gln Leu Asp Asp Pro
405 410 415
Ser Thr Leu Asn Ala Arg Leu Thr Ala Ser Asn Gly Ala Gly Ala Gly
420 425 430
Lys Leu Ser Trp Ser Lys Asp Asn Trp Leu Lys Thr Ser Tyr Leu Glu
435 440 445
His His His His His His
450

Claims (13)

1.一种蛋白质，是如下（1）-（3）中任一种：
（1）将碱性果胶酶第241位氨基酸残基由甘氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；
（2）将碱性果胶酶第241位氨基酸残基由甘氨酸突变为缬氨酸得到的蛋白质；
（3）将碱性果胶酶第93位氨基酸残基由赖氨酸突变为异亮氨酸，且将第241位氨基酸残基由甘氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；
所述碱性果胶酶为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（b1）或（b2）或（b3）的DNA分子：
（b1）序列3所示的DNA分子；
（b2）序列4所示的DNA分子；
（b3）序列5所示的DNA分子.
4.下述c1）-c4）中的任一种生物材料：
c1）含有权利要求2或3所述基因的表达盒；
c2）含有权利要求2或3所述基因的重组载体；
c3）含有权利要求2或3所述基因的重组菌；
c4）含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。
5.权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述生物材料在制备热稳定性提高的碱性果胶酶中的应用；
或，权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述生物材料在酶法脱胶中的应用；
或，权利要求1所述蛋白质或权利要求4所述生物材料在提高酶法脱胶率中的应用。
6.一种热稳定性提高的碱性果胶酶的制备方法，是将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在受体微生物中进行表达得到所述热稳定性提高的碱性果胶酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在受体微生物中进行表达的方法包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1所述蛋白质。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的蛋白质的编码基因为如下（b1）或（b2）或（b3）的DNA分子：
（b1）序列3所示的DNA分子；
（b2）序列4所示的DNA分子；
（b3）序列5所示的DNA分子。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述受体微生物为原核微生物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述原核微生物为细菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli BL21（DE3）。
13.一种酶法脱胶的方法，包括采用权利要求1所述的蛋白质进行脱胶的步骤。
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