CN107434825A - 一种从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法。具体步骤如下：1)取新鲜鸡蛋，收集蛋清原液；2)加入稀释缓冲液，得到蛋清稀释液A；3)加入辛酸，静置，得到蛋清稀释液B；4)加入疏水性电荷诱导磁性微球，振荡，吸附卵清白蛋白；5)用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；6)加入洗脱缓冲液，振荡，收集卵清白蛋白溶液；7)冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。本发明所开发方法的特色在于设计了一条简单快速的分离工艺流程，可以从鸡蛋清中分离卵清白蛋白，方法的关键在于从鸡蛋清中直接分离卵清白蛋白，具有操作步骤简单，分离效率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法，属于生物活性物质的分离纯化技术领域。
背景技术
我国鸡蛋资源丰富，鸡蛋中含有大量的活性蛋白，营养价值较高。随着对鸡蛋活性成分研究的不断深入，对鸡蛋的利用从简单的初加工阶段向开发具有较高附加值的生理活性成分发展。蛋清中的卵清白蛋白、卵铁传递蛋白和溶菌酶等活性蛋白分离提取和功能研究，已经越来越引起人们的关注。
卵清白蛋白是蛋清中主要活性成分之一，含有386个氨基酸，相对分子质量为45KDa，其等电点为4.5。卵清白蛋白无论从分子结构还是生物学功能上都与人血白蛋白非常类似，是人血白蛋白的潜在替代品。卵清白蛋白还可以经过酶水解加工成低分子活性肽，具有强抗氧化活性、血管舒张活性等活性。卵清白蛋白还可以与三价铁离子结合，是三价铁离子的天然载体，可开发成复合补铁剂。
目前，从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法，主要采用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等多步盐析法，或者盐析法结合离子交换层析法进行分离纯化。多步盐析法需要大量的盐，产品含盐量高，需要多次脱盐和离心等操作才能获得较高纯度的卵清白蛋白。而盐析法结合离子交换层析法，除了需要脱盐处理外，还需要复杂的层析分离设备和严格繁琐的层析分离过程，分离成本高。
发明内容
本发明的目的是提供一种从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法。
包括如下步骤：
1)取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集蛋清原液；
2)取步骤1)获得的蛋清原液，用含有0～0.5M NaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠溶液作为稀释缓冲液，按照蛋清原液与稀释缓冲液体积比1∶5加入稀释缓冲液，混合均匀，得到蛋清稀释液A；
3)取步骤2)获得的蛋清稀释液A，按照辛酸与蛋清稀释液A体积比1∶40加入辛酸，4～30℃静置2～12小时，得到蛋清稀释液B；
4)取步骤3)获得的蛋清稀释液B，每毫升蛋清稀释液B加入0.05g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡10～60分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；
5)取步骤4)吸附卵清白蛋白的磁性微球-蛋清混合液，用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；
6)取步骤5)吸附卵清白蛋白的磁性微球，用pH 3～4的醋酸-醋酸钠溶液作为洗脱缓冲液，每克疏水性电荷诱导磁性微球加入2ml洗脱缓冲液，振荡5～10分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，即为卵清白蛋白溶液；
7)取步骤6)得到的卵清白蛋白溶液，冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
所述的疏水性电荷诱导磁性微球为以5-氨基苯并咪唑为功能配基的磁性微球。
本发明通过对鸡蛋清简单预处理，采用疏水性电荷诱导磁性微球直接从预处理后的蛋清中分离得到卵清白蛋白。采用疏水性电荷诱导磁性微球直接处理预处理后的蛋清，充分利用疏水性电荷诱导配基的高吸附容量和耐盐吸附特性，以及磁性微球的磁分离的优点，无需离心、中间脱盐和过滤处理，提高分离效率，简化分离步骤，得到一个经济高效的提取卵清白蛋白的方法。本发明的优点在于：1)快速，成本低廉；2)工艺简单，易于放大；3)过程处理量大，分离效率高；4)卵清白蛋白的纯度高。
附图说明
附图1是本发明疏水性电荷诱导磁性微球在pH 5条件下对不同浓度卵清白蛋白的吸附容量。
附图2是本发明疏水性电荷诱导磁性微球分离卵清白蛋白的电泳图，第5泳道为最终产品。
具体实施方式
本发明提供一种从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法。取新鲜鸡蛋，收集蛋清原液；加入稀释缓冲液，得到蛋清稀释液A；加入辛酸，静置，得到蛋清稀释液B；加入疏水性电荷诱导磁性微球，振荡，吸附卵清白蛋白；用稀释缓冲液清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；加入洗脱缓冲液，振荡，收集得到卵清白蛋白溶液；冷冻干燥，得到卵清白蛋白的固体产品。通过本发明分离得到的卵清白蛋白纯度大于98％。
从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法包括如下步骤：
1)取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集蛋清原液；
2)取步骤1)获得的蛋清原液，用含有0～0.5M NaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠溶液作为稀释缓冲液，按照蛋清原液与稀释缓冲液体积比1∶5加入稀释缓冲液，混合均匀，得到蛋清稀释液A；
3)取步骤2)获得的蛋清稀释液A，按照辛酸与蛋清稀释液A体积比1∶40加入辛酸，4～30℃静置2～12小时，得到蛋清稀释液B；
4)取步骤3)获得的蛋清稀释液B，每毫升蛋清稀释液B加入0.05g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡10～60分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；
5)取步骤4)吸附卵清白蛋白的磁性微球-蛋清混合液，用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；
6)取步骤5)吸附卵清白蛋白的磁性微球，用pH 3～4的醋酸-醋酸钠溶液作为洗脱缓冲液，每克疏水性电荷诱导磁性微球加入2ml洗脱缓冲液，振荡5～10分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，即为卵清白蛋白溶液；
7)取步骤6)得到的卵清白蛋白溶液，冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集50ml蛋清原液；加入250ml含有0MNaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠稀释缓冲液，混合均匀，得到300ml蛋清稀释液A；加入7.5ml辛酸，4℃静置2小时；加入15.375g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡10分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；加入30.75mlpH 3的醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液，振荡5分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，得到卵清白蛋白溶液；冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
实施例2
取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集50ml蛋清原液；加入250ml含有0.5MNaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠稀释缓冲液，混合均匀，得到300ml蛋清稀释液A；加入7.5ml辛酸，30℃静置12小时；加入15.375g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡60分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；加入30.75mlpH4的醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液，振荡10分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，得到卵清白蛋白溶液；冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
实施例3
取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集50ml蛋清原液；加入250ml含有0.25MNaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠稀释缓冲液，混合均匀，得到300ml蛋清稀释液A；加入7.5ml辛酸，8℃静置6小时；加入15.375g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡30分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；加入30.75mlpH3.5的醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液，振荡8分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，得到卵清白蛋白溶液；冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
实施例4
取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集50ml蛋清原液；加入250ml含有0.5MNaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠稀释缓冲液，混合均匀，得到300ml蛋清稀释液A；加入7.5ml辛酸，25℃静置2小时；加入15.375g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡60分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；加入30.75mlpH 3的醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液，振荡10分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，得到卵清白蛋白溶液；冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
实施例5
取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集50ml蛋清原液；加入250ml含有0.1MNaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠稀释缓冲液，混合均匀，得到300ml蛋清稀释液A；加入7.5ml辛酸，30℃静置12小时；加入15.375g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡10分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；加入30.75mlpH 4的醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液，振荡5分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，得到卵清白蛋白溶液；冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
实施例6
取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集100ml蛋清原液；加入500ml含有0.1MNaCl的pH 5的醋酸-醋酸钠稀释缓冲液，混合均匀，得到600ml蛋清稀释液A；加入15ml辛酸，30℃静置12小时；加入30.75g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡10分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；加入61.5ml pH 4的醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液，振荡5分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，得到卵清白蛋白溶液；冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
Claims (2)
1.一种从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)取新鲜鸡蛋，洗净，将蛋清和蛋黄分开，收集蛋清原液；
2)取步骤1)获得的蛋清原液，用含有0～0.5M NaCl的pH5的醋酸-醋酸钠溶液作为稀释缓冲液，按照蛋清原液与稀释缓冲液体积比1∶5加入稀释缓冲液，混合均匀，得到蛋清稀释液A；
3)取步骤2)获得的蛋清稀释液A，按照辛酸与蛋清稀释液A体积比1∶40加入辛酸，4～30℃静置2～12小时，得到蛋清稀释液B；
4)取步骤3)获得的蛋清稀释液B，每毫升蛋清稀释液B加入0.05g疏水性电荷诱导磁性微球，振荡10～60分钟，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球-蛋清混合液；
5)取步骤4)吸附卵清白蛋白的磁性微球-蛋清混合液，用磁铁吸住微球，倒掉上清液以及沉淀，用稀释缓冲液多次清洗微球，得到吸附卵清白蛋白的疏水性电荷诱导磁性微球；
6)取步骤5)吸附卵清白蛋白的磁性微球，用pH3～4的醋酸-醋酸钠溶液作为洗脱缓冲液，每克疏水性电荷诱导磁性微球加入2ml洗脱缓冲液，振荡5～10分钟，用磁铁吸住微球，收集上清液，即为卵清白蛋白溶液；
7)取步骤6)得到的卵清白蛋白溶液，冷冻干燥，得到纯度＞98％的卵清白蛋白的固体产品。
2.根据权利要求1所述的一种从鸡蛋清中分离卵清白蛋白的方法，其特征在于所述的疏水性电荷诱导磁性微球为以5-氨基苯并咪唑为功能配基的磁性微球。
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