CN1037103C - 从人尿中制备生物活性蛋白的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从人尿中制备生物活性蛋白的方法，具体地说，本发明涉及应用超滤、加酸或加金属离子、以及一系列柱色谱，同时从人尿中制备若干种生物活性蛋白(如表皮生长因子、尿激酶和清蛋白)的经济而高效的方法。

Description

从人尿中制备生物活性蛋白的新方法
本发明涉及从人尿中制备生物活性蛋白的新方法，更具体地说，涉及从人尿中同时制备若干种药学上有用的蛋白质的、经济而高效的方法。
人体每天要排出约1.5升尿，尿中含有氯化物、磷酸盐和硫酸盐等盐类；钾、钠和钙等无机离子；以及大量的脲和少量蛋白质。
在上述蛋白质中已发现了诸如尿激酶(Williams，J.R.B.，Br.J，Exp.Pathol.32：530，1951)、表皮生长因子(Jaspar，J.M.和Franchimant，P.，Eur.J.Biochem.166：295，1987)和集落刺激因子(Xu Tao等，Biol，Chem.Hopper-Seyler，368：187，1987)等生物活性蛋白。
然而，只有从尿中分离出的尿激酶被证明可应用于药学领域的相关工业，对其他蛋白的注意力则只集中在满足纯化过程中某些技术课题的研究需要。
对于从人尿中分离蛋白质，先有技术已采用了使用氧化铝、活性炭和硅藻土的纯化方法(美国专利3711377 ；日本专利82037316)；应用化学添加剂如金属离子的沉淀法；用于分离促黄体激素(美国专利4123510)和人绒毛膜***(美国专利4123509)的超滤法；以及阳离子交换法(日本专利52061289；日本专利50069285)等。然而这些方法就收率而言并不有效，而且对所要纯化的蛋白质的种类有限制。
所以，仍然需要研究一种经济而高效的纯化方法，使其能应用于来源于人尿的各种生物活性蛋白，同时又能减少尿样的损失。
所以，本发明的主要目的是，应用一系列高效而简单的纯化方法，从人尿中同时分级分离出各种生物活性蛋白，这些生物活性蛋白除尿激酶外还有表皮生长因子和清蛋白等。
本发明的上述目的和其他目的及特征，可从下面结合附图所作的描述中看出。附图中：
图1至8图示了从人尿中制备生物活性蛋白的分离方法；
图9、10、14、15、16、18、20、21、23是本发明所采用的各种色谱洗脱曲线；
图11、12和13分别说明了pH、锌离子和铜离子对所得沉淀物中尿蛋白含量的影响；
图17、19和22分别给出了表皮生长因子、尿激酶和清蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图形。
用下列分离和纯化程序进一步说明本发明。
尿液的浓缩
取采自健康男性的尿液，在4-30℃的温度范围内进行浓缩。在滤膜(孔径为0.2-0.8μm)和带有1,000和5,000道尔顿分子筛的超滤装置上，将尿液浓缩10-100倍。将所得的浓缩液溶解在1-50mM缓冲液(pH6-9)如乙酸盐、柠檬酸盐和Tris等缓冲液中，并再次浓缩而得到更浓的溶液。用真空蒸发法和冰冻干燥法可得到粉状浓缩物，将其溶于所述缓冲液中备用。
酸/金属离子的加入
上述浓缩液可直接进行柱色谱，但就收率和/或纯化倍数而言这样做并不有效。在这种情况下，本发明人采用一系列纯化步骤得到了出人意料的结果，即：在尿浓缩液中加入酸或金属离子，对上清液和沉淀物进行分级分离；然后对所得的两相分别进行柱色谱。
分级分离是通过控制浓缩尿液的pH或金属离子浓度而实现的，即：用盐酸或硫酸溶液将pH控制在2-6；用氯化锌或硫酸铜将金属离子浓度控制在1-50mM。将所得溶液搅拌5分钟至24小时，离心分离上清液和沉淀物；将所得沉淀物溶于所述缓冲液中。
通过控制pH对尿蛋白进行分级分离所依据的原理是：蛋白质在其自身的等电点处沉淀。所得的上清液中含有15％的总尿蛋白，特另是在表皮生长因子的情况下，用等电点沉淀法可得到比先有技术(Jaspar，J.M.和Franchimant，P.，Eur.J.Biochem.166：295，1987)高两倍多的纯化效率。尿激酶和清蛋白大部分都存在于沉淀物中，可分别用阴离子交换剂通过控制酸度而进行分级分离；采用亲和柱将尿激酶(Holmberg，L.等，Biochem.Biophys.Acta.445：215，1976)和清蛋白(Travis，J.等，Biochem.J.157：301，1976)进一步纯化。
另一方面，用金属离子进行蛋白质沉淀的化学原理是：金属离子如锌或铜与蛋白质的组氨酸残基形成配合物。这一分离方法对本发明的特异性蛋白质效率很高。
将上述方法得到的样品加到过滤或离心装置上除去不溶物后备用。
色谱
对柱色谱法中所用的树脂进行选择，以满足经济/高效的要求，并减少浓缩/溶剂交换步骤。所用树脂如下：离子交换色谱：结合有二乙氨基乙基(DEAE)、季化氨乙基(QAE)、羧甲基(CM)或磺丙基(SP)的疏水性多糖；吸附色谱：硅胶或氧化铝；凝胶过滤色谱：Sephadex或Sephacryl；亲和色谱：苯甲脒-Sepharose 6B或蓝色Sepharose CL-6B。
柱色谱中采用的缓冲液如下：阴离子交换剂：1-50mM磷酸盐或Tris缓冲液(pH 6-9)；阳离子交换剂：1-50mM乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液(pH3-6)。通过控制盐如氯化钾或氯化钠的浓度或控制酸度(pH)进行洗脱。
在凝胶过滤和吸附色谱中，分别使用含10-200mM氯化钠的1-50mM缓冲液(pH 6-9)和5-100mM缓冲液(pH3-6)，通过加入醇类溶剂或控制酸度进行洗脱。
在亲和柱色谱中使用1-50mM磷酸盐或Tris缓冲液(pH6-9)或5-500mM甘氨酸缓冲液(pH 2-4)；在反相柱色谱中使用18碳的硅胶，用含有三氟乙酸和乙腈的溶剂进行洗脱。
纯化尿蛋白的分析
尿激酶是一种含有411个氨基酸残基的丝氨酸蛋白酶，它是分子量为54,000道尔顿的血纤维蛋白溶酶原激活剂。从其N末端切下135个氨基酸残基，得到分子量为34,000道尔顿的修饰尿激酶，它和54,000道尔顿的完整尿激酶一样，也能水解凝血酶(White，W.F.等，Biochemistry 5：2160，1966)。尿激酶的测定方法包括：测定血纤维蛋白溶解作用(Astrup.T.和Mullertz，S.，Arch.Biochem.Biophys.40：346，1952)；测定生色团S-2444(N-焦Glu-Gly-Arg-对硝基苯胺)的解离(Pannell，R.和Gurewich，V.，Blood 69：22，1987)。
表皮生长因子是一种约5,000道尔顿的蛋白质，它是一种含有53个氨基酸残基的促有丝***因子。本发明采用放射免疫测定法(Jaspar，J.M.和Franchimant，P.，Eur.J.CancerClin.Oncol.20：1343，1985)来测定其生物活性。
清蛋白是一种起维持血液渗透压作用的66,000道尔顿的蛋白质，它与脂肪酸、氨基酸等向细胞的转运有关(Theodore，P.Jr.，The Plasma Proteins I：133，1975)；本发明采用的测定方法是测定HPLC洗脱曲线中的标准清蛋白峰。
用Lowry等的方法定量测定总蛋白(Lowry，O.H.等，J.Biol.Chem.193：265，1951)。
用下列实施例进一步说明本发明，这些实施例不应认为是限制本发明的范围。
                      实施例1
采集100升成年男子尿，在0.45μm膜滤器上过滤，用排阻限为2000道尔顿的分子筛浓缩至2升。在此溶液中加入20升缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.6)，用与上述相同的方法得到2升浓缩尿。从浓缩尿中取0.5升尿浓缩液进行冰冻干燥，得到4.3g尿粉末(见图1)。将2g尿粉末溶于5ml缓冲液(40mMTris-HCl，pH7.6)，所得溶液通过已用含50mM氯化钠的缓冲液预平衡的Sephacryl S-300(16×190 mm)进行分级分离(见图4)。以5ml为一个级分收集洗脱出的各级分，以测定280nm处的光吸收。分别测定尿激酶、表皮生长因子和清蛋白的活性。结果示于图9和表1。
表1.
样品    总蛋白(mg)              活性和量 比活*(mg/mg)(单位/mg)(ug/mg) 收率(％) 纯度(倍数)
   清蛋白(mg)     尿激酶(单位)   h-EGF(ug)
尿浓缩液   1,048     440     7,830     333     0.42/7.5/0.32     100     1
清蛋白级分     461     295     0.64     67     1.5
尿激酶级分     264     6,573     24.9     84     3.3
h-EGF级分     38     147     3.8     44     11.9
h-EGF：人表皮生长因子*  ：比活以mg/mg或μg/mg为单位来表示，即每mg
   总蛋白中尿蛋白的量。
                   实施例2
按与实施例1类似的方式将5升尿浓缩至0.2升，所得的浓缩尿在用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.6)平衡过的DEAE-Sepharose柱(50×200mm)上进行分级分离，用含0-1M NaCl线性梯度的缓冲液(40mM乙酸钠，pH4.6)洗脱(见图4)。以40ml为一级分收集洗脱出的各级分，按与实施例1类似的方式测定280nm处的光吸收和活性。结果示于图10和表2。表2.
样品 总蛋白(mg)               活性和量    比活*(mg/mg)(单位/mg)(ug/mg)   收率(％)     纯度(倍数)
清蛋白(mg) 尿激酶(单位) h-EGF(ug)
尿浓缩液    235     99    1.559     65   0.42/6.6/0.27    100      1
清蛋白级分     94     64     0.68     65     1.6
尿激酶级分     14     727     48     51.9     47     7.9
h-EGF级分     74     48     0.65     74     2.4
h-EGF：人表皮生长因子*  ：比活以mg/mg或μg/mg为单位来表示，即每mg
   总蛋白中尿蛋白的量。
                实施例3
按与实施例1类似的方式将3升尿浓缩至0.2升，以10ml为一份将所得的尿浓缩液分成若干等份。在各等份试样中加入5NHCl将其pH调至3.0至5.6的范围，各试样的pH间隔固定为0.2。搅拌约1小时后，所得溶液以12,000×g离心10分钟(见图2)。在所得的沉淀物中加入缓冲液(40mM乙酸钠，pH7.2)，测定总蛋白含量及尿激酶、清蛋白和表皮生长因子的活性，如图11所证实，在pH3.4至4.4时进行上清液和沉淀物的分级分离，对所述蛋白的纯化来说很有效。
                     实施例4
在按与实施例3类似的方式分出的10ml尿浓缩液等份试样中，加入氯化锌至终浓度为1、2、4、6、8、10和20mM，所得溶液按与实施例3类似的方式进行离心(见图3)。将每个沉淀物溶于10ml缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.2，含5mMEDTA)。每个溶液的总蛋白含量和清蛋白、尿激酶、表皮生长因子的活性示于图12。
                     实施例5
按与实施例4类似的方式进行实验，不同的是使用硫酸铜代替氯化锌(见图3)。结果示于图13。
                     实施例6
按与实施例1类似的方式将20升尿浓缩至0.5升。按与实施例3类似的方式，将上述浓缩尿在pH4.0下分级分离成上清液和沉淀物。所得上清液进行下列处理(见图6)：将485ml上清液加到用40mM乙酸钠缓冲液(pH4.2)预平衡过的硅胶柱(50×200mm)上，用含有20％(v/v)  乙醇的40mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)进行色谱分离。将含有表皮生长因子的活性级分合并，用Amicon YMO2膜浓缩至20ml。
所得溶液在已用含50mM NaCl的20mM乙酸钠缓冲液预平衡的Sephadex G-50柱(26×1500mm)上进行分级分离。将含有表皮生长因子的活性级分加到已用0.1％(v/v)三氟乙酸预平衡过的PepRPC(商品名)反相HPLC柱上，用50％(v/v)乙腈作洗脱剂进行分级分离。用真空蒸发器和冰冻干燥器将含有表皮生长因子活性的活性级分干燥至46μg。一系列制备过程示于表3和图14、15、16和17。
图14、15和16分别给出尿浓缩液在硅胶、SephadexG-50和反相HPLC柱上进行色谱分离时，人表皮生长因子(h-EGF)的洗脱曲线。
图17给出了从浓缩尿中纯化出的人表皮生长因子的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(20％(v/v))电泳图形：泳道1是高分子量标记物；泳道2是尿浓缩液；泳道3是pH 4.0的上清液；泳道4是硅胶色谱分离出的人表皮生长因子(h-EGF)级分；泳道5是SephadexG-50上分离出的h-EGF级分；泳道6是PepRPC上分离出的h-EGF级分；泳道7是小鼠表皮生长因子；泳道8是低分子量标记物。
表3.
样品 总蛋白(mg)     h-EGF(ug)    比活*(ug/mg)    收率(％)    纯度(倍数)
尿浓缩液     950     272     0.29     100     1
 上清液     148     244     1.65     90     6
硅胶柱流出液     26     126     4.58     46     17
Sephadex G-50柱流出液     3.3     98     29.7     36     102
反相柱流出液 0.05 46 920 17 3,172
h-EGF：人表皮生长因子*  ：比活以μg/mg为单位来表示，即每mg总
   蛋白中h-EGF的量。
为制备尿激酶和清蛋白，对pH 4.0下离心得到的沉淀物进行进一步纯化(见图5)。在沉淀物中加入200ml 20mMTris-HCl缓冲液(pH 7.8)，将所得溶液搅拌2小时得到完全溶解的溶液，在用与上述相同缓冲液预平衡过的DEAE-Sepharose柱(50×200mm)上进行色谱分离。用初始缓冲液和40mM乙酸钠缓冲液(pH 4.6)进行洗脱，分别收集含尿激酶和清蛋白的活性级分(见图24)。
将洗脱出的尿激酶级分浓缩至体积为200ml，再加到已用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.6)预平衡的苯甲脒-Sepharose 6B柱(26×150mm)上，用缓冲液(50mM甘氨酸-HCl，pH 3.69)进行分级分离(见图18)。合并含尿激酶活性的级分并冰冻干燥，得到29,800单位的尿激酶。结果示于表4和图18、19。
图18给出了尿浓缩液在苯甲脒-Sepharose 6B柱上进行色谱分离时的尿激酶洗脱曲线。图19给出了从浓缩尿中纯化出的尿激酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12.5％(v/v))电泳图形：泳道1为中等分子量标记物；泳道2为尿浓缩液；泳道3为pH 4.0的沉淀物；泳道4为在DEAE-Sepharose上分离出的尿激酶级分的前半部分；泳道5为所述级分的后半部分；泳道6为在苯甲脒-Sepharose 6B上分离出的尿激酶级分；泳道7为标准尿激酶；泳道8为低分子量标记物。
表4.
     样品 总蛋白(mg)   尿激酶活性(单位)    比活(单位/mg)    收率(％)     纯度(倍数)
尿浓缩液   950   62.000     65.2     100      1
    沉淀物   807   59.100     73.2     95     1.1
 DEAE-Sepharose柱流出液   48.5   33,100     682     53     10.5
    苯甲脒-Sepharose 6B柱流出液 0.34 29,800 87,647 48 1,344
将从DEAE-Sepharose柱得到的清蛋白级分，在蓝色Sepharose CL-6B柱(20×100mm)和SephacrylS-300柱(16×900mm)上进行色谱分离。用含有2MNaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)进行洗脱。将所得级分冰冻干燥，得到188mg清蛋白，结果示于表5和图20、21、22 。
图20和21分别给出了尿浓缩液在蓝色Sepharose CL-6B和Sephacryl S-300凝胶过滤柱上进行色谱分离时的清蛋白洗脱曲线。
图22给出了从浓缩尿中纯化出的清蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12.5％(v/v))电泳图形：泳道1为标准牛血清清蛋白；泳道2为尿浓缩液；泳道3为pH4.0的沉淀物；泳道4为在DEAE-Sepharose上分离出的清蛋白级分；泳道5为在蓝色Sepharose CL-6B上分离出的清蛋白级分；泳道6为在Sephacryl S-300上分离出的清蛋白级分；泳道7为标准血清清蛋白；泳道8为高分子量标记物。
表5.
样品   总蛋白(mg)   清蛋白(mg)     比活*(mg/mg)    收率(％)    纯度(倍数)
尿浓缩液     950     410     0.43     100     1
     沉淀物     807     372     0.46     91     1.1
 DEAE-Sepharose柱流出液     404     275     0.68     67     1.6
 蓝色SepharoseCL-6B柱流出液 210 198 0.94 48 2.2
 Sephacryl S-300柱流出液     190     188     0.99     46     2.3
*：比活以mg/mg为单位来表示，即每mg总蛋白
中清蛋白的量。
                     实施例7
取250ml按与实施例4类似方式纯化出的20倍浓缩尿，向其中加入氯化锌至浓度为8mM，将所得溶液搅拌约1小时，离心(12,000×g，20分钟)，得到沉淀物。向所得沉淀物中加入4ml 500mM EDTA和20ml缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.6)，得到完全溶解液，所得溶液在已用缓冲液(20mMTris-HCl，pH 7.6)预平衡的Sephadex LH-20柱(26×900mm)上进行分级分离(见图23)。合并流出液中的蛋白级分并加到DEAE-Sepharose柱上(见图7)。结果与表2和图10所示结果类似。
                    实施例8
按与实施例7类似的方式进行纯化步骤，不同的是用硫酸铜代替氯化锌。结果与表2和图10所示结果类似。
                    实施例9
取实施例7中用Sephadex LH-20柱色谱法制得的蛋白级分，在Sephacryl S-300柱上进行分级分离，得到清蛋白、尿激酶和表皮生长因子。结果与表1和图9所示结果类似。
                    实施例10
按与实施例9相同的方式进行纯化步骤，不同的是用硫酸铜代替氯化锌。结果与实施例9类似。
                     实施例11
如实施例6所说明的那样，对由实施例7、8、9和10得到的清蛋白、尿激酶和表皮生长因子进行进一步的纯化。尿激酶在苯甲脒-Sepharose 6B柱上进上分级分离，清蛋自在蓝色Sepharose CL-6B和Sephacryl S-300上进行分级分离，表皮生长因子在Sephadex G-50和PepRPC反相柱上进行分级分离。
如上所证实，本发明的方法可应用于同时分离诸如尿激酶、清蛋白、表皮生长因子等生物活性蛋白。本发明专门提供用特征性的分级分离和预纯化步骤来纯化尿蛋白的经济而高效的方法。

Claims (6)

1.一种从人尿中制备清蛋白、尿激酶和表皮生长因子的方法，该方法包括下列步骤：
(i)通过排阻限为1000～5000道尔顿的超滤法浓缩人尿；
(ii)向所述浓缩尿中加入酸以达到最终pH值为2～6，或加入氯化锌或硫酸铜的金属离子以达到最终浓度为1～50mM，然后离心生成物，以便分级分离上清液和沉淀物；和
(iii)将所述上清液或沉淀物施加到吸附色谱法、凝胶过滤色谱法和反相色谱法上，以制得纯化的表皮生长因子；
将所述上清液或沉淀物施加到离子交换色谱法和亲和色谱法上，以制得纯化的尿激酶；或
将所述上清液或沉淀物施加到离子交换色谱法、亲和色谱法和凝胶过滤色谱法上，以制得纯化的清蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述吸附色谱法使用选自硅胶和氧化铝的树脂。
3.权利要求1的方法，其中所述凝胶过滤色谱法使用选自Sephadex和Sephacryl的树脂。
4.权利要求1的方法，其中所述反相色谱法使用C18-PepRPC树脂。
5.权利要求1的方法，其中离子交换色谱法使用选自二乙氨基乙基树脂、季化氨乙基树脂、羧甲基树脂和磺丙基树脂的树脂。
6.权利要求1的方法，其中亲和色谱法分别使用用于尿激酶的苯甲脒-Sepharose 6B和用于清蛋白的蓝色Sepharose CL-6B树脂。
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