CN107428780A - 苯并二氮杂*二聚体、其缀合物及制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

具有由式(I)表示的结构的苯并二氮杂二聚体，其中R1是(Ia)或(Ib)；其中在式(I)、(Ia)和(Ib)中的变量如本申请所述。该二聚体可用作抗癌药，特别是当用于抗体‑药物缀合物(ADC)中时。

Description

苯并二氮杂*二聚体、其缀合物及制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月14日提交的美国临时申请序列号USSN 62/103,157和2015年9月9日提交的美国临时申请序列号USSN 62/215,928的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明的技术领域
本发明涉及苯并二氮杂二聚体、由其衍生的二聚体-连接体化合物及其缀合物，及它们的制备和使用方法。
背景技术
已知具有苯并二氮杂环***的几种天然存在的细胞毒性化合物。考虑到在该分子骨架中额外存在与二氮杂环稠合的五元吡咯烷环，这些化合物通常称为吡咯并苯并二氮杂或PBD。实例包括托马霉素和安曲霉素。
PBD具有抗菌和抗肿瘤活性，后面的特征导致对其作为抗癌药物的关注。机制上，PBD以序列选择性方式结合到DNA的小沟，并且一旦结合则使DNA烷基化。已研究不同取代基的结构-活性关系(SAR)(Antonow等人，2010；Thurston等人，1999)。
另外的研究显示，PBD二聚体显示特别有希望作为抗癌剂。一般PBD二聚体的核结构可由式(A-1)表示，其中X为连接两个二聚体半部的桥连基团。
与单体PBD一样，二聚体为DNA小沟的结合剂-烷基化剂。由于为双官能，由二聚体烷基化产生交联DNA，使DNA修复更困难(DNA烷基化通过亚胺基进行。有一个还原的亚胺基的PDB仍可烷基化DNA，但不能使其交联。它们仍为生物活性，虽然一般较小，但它们的不同药物动力学曲线对一些应用可能是优选的)。关于从自然产生单体到合成单体到合成二聚体作为抗肿瘤剂PBD的演进的综述，见Hartley 2011。
已通过A/A’和C/C’环上的取代基、C/C’环中的不饱和度、桥连基团X的结构和长度、环B/B’中亚胺双键的氧化或还原及这些特征的组合探索PBD二聚体的SAR。参见Bose等人，1992，Gregson等人，1999，Gregson等人，2001a和2001b，Gregson等人，2004，Gregson等人，2009，Hartley等人，2012，Howard等人，2007，Howard等人，2009a.Howard等人，2010，Howard等人，2013a和2013b，Liu等人，2007，Thurston等人，1996，Thurston等人，2006，和Thurston等人，2008。大多数PBD二聚体通过8/8’桥连接，如上所示，但也已公开7/7’桥(Howard等人，2009b)。
产生强烈关注的抗癌剂的一个类型为抗体-药物缀合物(ADC，也称为免疫缀合物)。在ADC中，治疗剂(也称为药物、有效载荷或弹头)共价连接到其抗原由癌细胞表达(肿瘤相关的抗原)的抗体。通过结合到抗原，抗体将ADC输送到癌部位。在那里，共价键断裂或抗体降解引起治疗剂释放。相反，当ADC在血液***中循环时，由于共价连接到抗体，治疗剂保持非活性。因此，由于其定位释放，在ADC中使用的治疗剂可比普通化学治疗剂有效得多(即，有细胞毒性)。关于对ADC的综述，见Schrama等人，2006。
已提出PBD二聚体作为在ADC中的药物。连接体连结到抗体的连接可通过位于C/C’环中的官能团、桥连基团X或通过在B/B’环中跨亚胺基的加成来实现。见Beau-Larvor等人，2014，Bouchard等人，2013，Commercon等人，2013a和2013b，Flygare等人，2013，Gauzy等人，2012，Howard 2104a-2014e，Howard等人，2011，Howard等人，2013c和2013d，Howard等人，2014a-2014h，Jeffrey等人，2013，Jeffrey等人，2014a和2014b，及Zhao等人，2014。
也已提出另一种类型苯并二氮杂二聚体作为治疗剂用于ADC。结构上，这种类型可视作为进一步具有稠合到各C/C’环的苯基环的PBD二聚体，如式(A-2)和(A-3)中所示。见Chari等人，2013，Li等人，2013，Fishkin等人，2014，Li等人，2014。
也已公开具有其它环***的苯并二氮杂化合物，例如四氢异喹啉并[2，1-c][1，4]苯并二氮杂。Kothakonda等人，2004。
关于本文中以第一作者或发明人引用的文献和年份的完全引用在本申请结尾列出。
发明概述
本发明提供新的苯并二氮杂二聚体，优选其中至少一个苯并二氮杂单元具有稠合到苯并二氮杂环***的四氢异喹啉(THIQ)环***。可任选还原苯并二氮杂环***中的亚胺键。
二聚体的两个单元(半部)可具有THIQ环***(“THIQ-THIQ二聚体”或“THIQ同型二聚体”)，或者一个单元可具有THIQ环***，另一个单元具有不同的苯并二氮杂环***，例如PBD环***(一般“THIQ异质二聚体”，或者在此具体实例中，“THIQ-PBD二聚体”)。在THIQ-THIQ二聚体中，两个单元可相同(“对称THIQ-THIQ二聚体”)或不同(“不对称THIQ-THIQ二聚体”)。
因此，本发明提供具有由式(I)表示的结构的苯并二氮杂二聚体或其药学上可接受的盐：
其中，
R1与式(Ia)或式(Ib)相符：
G和G’各自为C或N，其条件为不多于两个G或两个G’为N；
各R2独立为H或C1-C5烷基；
R3和R4各自独立为H、F、Cl、Br、OH、C1-C3烷基、O(C1-C3烷基)、氰基、(CH2)0-5NH2或NO2；
二氮杂环***中的各双线独立表示单键或双键；
如果到与R5连接(即，与R5关联)的N的双线为单键，则各R5为H，如果双线为双键，则R5不存在；
如果到与R6连接(即，与R6关联)的C的双线为单键，则各R6为H、OH、SO3Na或SO3K，如果双线为双键，则R6不存在；
R7、R8、R9和R10各自独立为H、C1-C5烷基、C≡C(CH2)1-5X2、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、O(CH2)2-5X2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基，
或者在R7、R8、R9或R10连接(即，关联)到为N的G或G’时，这些R7、R8、R9或R10不存在；
式(Ib)的环C中的虚线表示任选存在C1-C2、C2-C3或C2-R11双键；
R11为H、＝O、＝CH2、＝CH(C1-C5烷基)、CH＝CH(CH2)1-5X2、C≡C(CH2)1-5X2、C1-C5烷基、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、未取代或被(CH2)0-5X2、O(CH2)2-5X2取代的4-至7-元芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基；
如果C1-C2、C2-C3或C2-R11双键存在，则R11’不存在，否则R11’为H；
X是
X1是CH2、O、NH、S(O)0-2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3至7元环亚烷基或杂环亚烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的6元亚芳基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5元杂亚芳基；
各X2独立为H、F、Cl、Br、OH、O(C1-C3烷基)、O(C1-C3亚烷基)、CO2H、N3、CN、NO2、CO2(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C5烷基)、N(C1-C5烷基)2、SH、CHO、N(CH2CH2)2N(C1-C3烷基)、NHNH2或C(＝O)NHNH2；
x和y独立地为1、2或3；
各Y独立为CH2、C＝O或CHR12，其中各R12独立为F、Cl、Br或C1-C3烷基；并且
Y’和Y”独立为CH2、C＝O或CHR12，其中各R12独立为F、Cl、Br或C1-C3烷基，其条件为存在Y’和Y”至少之一(即，相关的下标为1)。
在另一个实施方案中，本发明提供一种缀合物，该缀合物包含共价结合到靶向部分的式(I)的二聚体，靶向部分特异或优先结合到靶细胞上的化学实体，靶细胞优选为癌细胞。靶向部分优选为抗体，更优选单克隆抗体，甚至更优选人单克隆抗体，且化学实体为肿瘤相关的抗原。肿瘤相关的抗原可以为在癌细胞表面显示的抗原，或者由癌细胞分泌进入周围胞外空间的抗原。优选肿瘤相关的抗原为与正常细胞比较由癌细胞过表达的抗原，或者由癌细胞表达而非正常细胞表达的抗原。
在另一个实施方案中，本发明提供一种共价结合到连接体部分的式(I)的二聚体，连接体部分具有适合缀合到靶向部分的反应性官能团。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患癌的患者的癌症的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的本发明的二聚体或其与靶向部分的缀合物。在另一个实施方案中提供本发明的二聚体或其与靶向部分的缀合物用于制备治疗患癌的患者的癌症的药物的用途。本发明的二聚体或其与靶向部分的缀合物也可用于体外、回体或体内抑制癌细胞增殖。癌症可尤其为肺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌或肝癌。
附图简述
图1、2和3显示了用于制备本发明的二聚体的各种中间体的合成方案。
图4显示了制备对称THIQ-THIQ二聚体的通用方案。图4a显示了特定THIQ-THIQ二聚体的合成。
图5显示了制备不对称THIQ-THIQ二聚体的通用方案。
图6显示了制备本发明的二聚体的方案，其中连接两个二聚体半部的桥不是双侧对称的。
图7a和7b显示了制备THIQ-PBD二聚体的方案。
图8显示了制备另外的不对称THIQ-THIQ二聚体的方案。
图9显示了制备另一种THIQ-PBD二聚体的方案。
图10和11显示了本发明的二聚体的合成方案，其中连接两个二聚体半部的桥具有胺基，适于连接用于构建ADC的连接体基团。
图12和13描绘了下文称为“类型(a)”的二聚体-连接体化合物的合成方案。
图14和15描绘了用于制备下文称为“类型(b)”的二聚体-连接体化合物的中间体的合成方案，而图16描绘了从如此制备的中间体进行的这种二聚体-连接体化合物的合成。
图17显示了下文称为THIQ-AZI二聚体的二聚体类型的制备方案。
图18a和18b组合显示了适合于制备类型(a)二聚体-连接体化合物的二聚体和由其制备的二聚体-连接体的合成。
图19和20显示了另外的THIQ-THIQ二聚体的合成方案。
图21和22显示了另外的“类型(b)”二聚体-连接体化合物的合成方案。
图23涉及具有烷基氨基的二聚体-连接体化合物的合成，其可以在转谷氨酰胺酶介导的缀合中作为胺供体。
实施方案描述
定义
“抗体”指完整抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链变体。完整抗体为包含由二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的蛋白质。各重链包括含三个域CH1、CH2和CH3的重链可变区(VH)和重链不变区。各轻链包括含一个单域CL的轻链可变区(VL或Vk)和轻链不变区。VH和VL区可进一步分成高变性区，也称为互补决定区(CDR)，这些区散布有更保守的框架区(FR)。各VH和VL包括从氨基-到羧基-端按以下次序布置的3个CDR和4个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可变区包含与抗原相互作用的结合域。不变区可介导抗体结合到宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。如果抗体结合到抗原X的KD为5x10-8M或更小，更优选1x10-8M或更小，更优选6x10-9M或更小，更优选3x10-9M或更小，甚至更优选2x10-9M或更小，则称为抗体“特异结合”到抗原X。抗体可以为嵌合、人源化或优选人抗体。可工程设计重链不变区，以影响糖基化类型或程度，延长抗体半衰期，增加或减小与效应细胞或补体***的相互作用，或者调节一些其它性质。通过代替、增加或删除一个或多个氨基酸或者通过用来自另一个免疫球蛋白类型的域代替一种域或者前述手段的组合，可实现工程设计。
抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”(或简单为“抗体部分”或“抗体片段”)指保持特异结合到抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段实现，例如(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，基本为具有铰链区的部分的Fab(见，例如Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，第6版，Saunders Elsevier 2007)；(iv)Fd片段，由VH和CH1域组成；(v)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH域组成；(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，由VH域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，包含单一可变域和两个不变域的重链可变区。优选的抗原结合片段为Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv和Fd片段。另外，虽然Fv片段的两个域VL和VH由单独的基因编码，但它们可用重组方法通过合成连接体连接，合成连接体使它们能够作为单蛋白链产生，其中VL和VH区配对成单价分子(称为单链Fv或scFv)，见例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。
“分离的抗体”指基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异结合抗原X的分离抗体基本不含特异结合抗原X以外的抗原的抗体)。然而，特异结合抗原X的分离抗体具有对其它抗原的交叉反应性，例如，来自其它物类的抗原X分子。在某些实施方案中，分离抗体特异结合到人抗原X，且不与其它(非人)抗原X抗原交叉反应。另外，分离抗体可基本不含其它细胞物质和/或化学物质。
“单克隆抗体”或“单克隆抗体组成”指单分子组成抗体分子的制备物，这显示对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
“人抗体”指具有可变区的抗体，其中框架和CDR区二者(及不变区，如果存在)均从人生殖系免疫球蛋白序列衍生。人抗体可包括后修饰，包括天然或合成修饰。人抗体可包括未由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由随机或位点特异性诱变体外或由体细胞突变体内引起的突变)。然而，“人抗体”不包括其中从另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)生殖系衍生的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。
“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的具有可变区的抗体，其中框架和CDR区二者均从人生殖系免疫球蛋白序列衍生。在一个实施方案中，人单克隆抗体由包括从转基因非人动物得到的B细胞的杂交瘤产生，所述转基因非人动物例如转基因小鼠，具有包含人重链转基因和融合到无限增殖化细胞的轻链转基因的基因组。
“脂族”指直链或支链、饱和或不饱和非芳族烃部分，该部分具有规定的碳原子数(例如，如在“C3脂族”、“C1-5脂族”、“C1-C5脂族”或“C1至C5脂族”中，对于具有1至5个碳原子的脂族部分，后三个短语同义)，或者，在未明确规定碳原子数时，1至4个碳原子(在不饱和脂族部分情况下，2至4个碳)。类似认识适用于其它类型中的碳数，如在C2-4烯烃、C4-C7脂环族等中。
“烷基”指饱和脂族部分，指定碳原子数的相同规定也适用。作为实例，C1-C4烷基部分包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基、1-丁基、2-丁基等。“亚烷基”指烷基的二价对应物，例如CH2CH2、CH2CH2CH2和CH2CH2CH2CH2。
“烯基”指具有至少一个碳-碳双键的脂族部分，指定碳原子数的相同规定也适用。作为实例，C2-C4烯基部分包括但不限于乙烯基、2-丙烯基(烯丙基或丙-2-烯基)、顺-1-丙烯基、反-1-丙烯基、E-(或Z-)2-丁烯基、3-丁烯基、1，3-丁二烯基(丁-1，3-二烯基)等。
“炔基”指具有至少一个碳-碳三键的脂族部分，指定碳原子数的相同规定也适用。作为实例，C2-C4炔基包括乙炔基、炔丙基(丙-2-炔基)、1-丙炔基、丁-2-炔基等。
“脂环族”指具有1至3个环的饱和或不饱和、非芳族烃部分，各环具有3至8个(优选3至6个)碳原子。“环烷基”指其中各环饱和的脂环族部分。“环烯基”指其中至少一个环具有至少一个碳-碳双键的脂环族部分。“环炔基”指其中至少一个环具有至少一个碳-碳三键的脂环族部分。作为实例，脂环族部分包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基和金刚烷基。优选的脂环族部分为环烷基，尤其环丙基、环丁基、环戊基和环己基。“亚环烷基”指环烷基的二价对应物。
“杂脂环族”指其中在其至少一个环中最多三个(优选1至2个)碳已用独立选自N、O或S的杂原子代替的脂环族部分，其中N和S可任选经氧化，且N可任选经季铵化。类似地，“杂环烷基”、“杂环烯基”和“杂环炔基”分别指其中至少一个环已如此修饰的环烷基、环烯基或环炔基部分。示例性杂脂环族部分包括氮丙啶基、氮杂丁环基、1，3-二氧杂环己烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃基砜、吗啉基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、硫吗啉基砜、1，3-二氧杂环戊烷基、四氢-1，1-二氧代-噻吩基、1，4-二氧杂环己烷基、硫杂丁环基等。“亚杂环烷基”指杂环烷基的二价对应物。
“烷氧基”、“芳氧基”、“烷硫基”和“芳硫基”分别指-O(烷基)、-O(芳基)、-S(烷基)和-S(芳基)。实例分别为甲氧基、苯氧基、甲硫基和苯硫基。
“卤素”或“卤”指氟、氯、溴或碘。
“芳基”指具有单、双或三环环***的烃部分，其中各环具有3至7个碳原子，且至少一个环为芳族。环***中的环可相互稠合(如在萘基)或相互连接(如在联二苯基)，并且可稠合或连接到非芳族环(如在茚满基或在环己基苯基)。进一步作为实例，芳基部分包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联二苯基、菲基、蒽基和苊基。“亚芳基”指芳基的二价对应物，例如1，2-亚苯基、1，3-亚苯基或1，4-亚苯基。
“杂芳基”指具有单、双或三环环***的部分，其中各环具有3至7个碳原子，且至少一个环为包含1至4个独立选自N、O或S的杂原子的芳族环，其中N和S可任选经氧化，且N可任选经季铵化。这种包含至少一个杂原子的芳族环可稠合到其它类型环(如在苯并呋喃基或四氢异喹啉基)，或直接连接到其它类型环(如在苯基吡啶基或2-环戊基吡啶基)。进一步作为实例，杂芳基部分包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、***基、四唑基、吡啶基、N-氧代吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、噌啉基、喹唑啉基(quinozalinyl)、萘啶基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻吩基、噁二唑基、噻二唑基、吩噻唑基(phenothiazolyl)、苯并咪唑基、苯并***基、二苯并呋喃基、咔唑基、二苯并噻吩基、吖啶基等。“亚杂芳基”指杂芳基的二价对应物。
在指示一个部分可取代时，例如，使用“未取代或被取代”或“任选被取代”的用语，如在“未取代或被取代的C1-C5烷基”或“任选被取代的杂芳基”中，这个部分可具有一个或多个独立选择的取代基，优选1至5个，更优选1至2个。本领域的技术人员可关于连接取代基的部分来选择取代基和取代模式，以提供化学稳定且能够通过本领域的技术人员已知的技术和本文所述方法合成的化合物。
“芳基烷基”、“(杂脂环族)烷基”、“芳基烯基”、“芳基炔基”、“二芳基烷基”等指烷基、烯基或炔基部分可视情况用芳基、杂脂环族、二芳基等部分取代，可视情况在烷基、烯基或炔基部分具有开放(未满足的)化合价，例如在苄基、苯乙基、N-咪唑基乙基、N-吗啉代乙基等。相反，“烷基芳基”、“烯基环烷基”等指芳基、环烷基等部分可视情况用烷基、烯基等部分取代，例如在甲基苯基(甲苯基)或烯丙基环己基中。“羟基烷基”、“卤代烷基”、“烷基芳基”、“氰基芳基”等指烷基、芳基等部分可视情况用一个或多个已确定的取代基取代(可视情况为羟基、卤代等)。
例如，容许的取代基包括但不限于烷基(尤其甲基或乙基)、烯基(尤其烯丙基)、炔基、芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代(尤其氟代)、卤代烷基(尤其三氟甲基)、羟基、羟基烷基(尤其羟基乙基)、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)(尤其-OCF3)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)、-SO2N(烷基)2等。
在被取代的部分为脂族部分时，优选的取代基为芳基、杂芳基、脂环族、杂脂环族、卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、-O(芳基)、烷硫基、芳硫基、＝O、＝NH、＝N(烷基)、＝NOH、＝NO(烷基)、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(＝O)烷基、-S(环烷基)、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)和-SO2N(烷基)2。更优选的取代基为卤代、羟基、氰基、硝基、烷氧基、-O(芳基)、＝O、＝NOH、＝NO(烷基)、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2和-NHC(＝NH)NH2。尤其优选为苯基、氰基、卤代、羟基、硝基、C1-C4烷氧基、-O(C2-C4亚烷基)OH和-O(C2-C4亚烷基)卤代。
在被取代的部分为脂环族、杂脂环族、芳基或杂芳基部分时，优选的取代基为烷基、烯基、炔基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-O(卤代烷基)、-O(芳基)、-O(环烷基)、-O(杂环烷基)、烷硫基、芳硫基、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、叠氮基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NH(羟基烷基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2、-NHC(＝NH)NH2、-OSO2(烷基)、-SH、-S(烷基)、-S(芳基)、-S(环烷基)、-S(＝O)烷基、-SO2(烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(烷基)和-SO2N(烷基)2。更优选的取代基为烷基、烯基、卤代、卤代烷基、羟基、羟基烷基、氰基、硝基、烷氧基、-O(羟基烷基)、-C(＝O)(烷基)、-C(＝O)H、-CO2H、-C(＝O)NHOH、-C(＝O)O(烷基)、-C(＝O)O(羟基烷基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烷基)、-C(＝O)N(烷基)2、-OC(＝O)(烷基)、-OC(＝O)(羟基烷基)、-OC(＝O)O(烷基)、-OC(＝O)O(羟基烷基)、-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NH(烷基)、-OC(＝O)N(烷基)2、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(芳基)、-NHC(＝O)(烷基)、-NHC(＝O)H、-NHC(＝O)NH2、-NHC(＝O)NH(烷基)、-NHC(＝O)N(烷基)2和-NHC(＝NH)NH2。尤其优选为C1-C4烷基、氰基、硝基、卤代和C1-C4烷氧基。
在陈述一个范围时，如在“C1-C5烷基”或“5至10％”时，此范围包括范围的端点，如在第一种情况下在C1和C5中，在第二种情况下在5％和10％中。
除非明确指明具体立体异构体(例如，在结构式中在相关立体中心通过加粗实键或虚键表示，在结构式中将双键描绘为E或Z构型，或者使用立体化学命名的名称)，所有立体异构体均作为纯化合物及其混合物包括在本发明的范围内。除非另外指明，各单独的对映异构体、非对映异构体、几何异构体及其组合和混合物均为本发明所包含。
本领域的技术人员应理解，化合物可具有等价于本文所用结构式中描绘那些的互变异构形式(例如，酮和烯醇形式)、共振形式和两性离子形式，且结构式包括这些互变异构、共振或两性离子形式。
“药学上可接受的酯”指体内(例如，在人体中)水解产生母体化合物或其盐或者本身具有类似于母体化合物的活性的酯。适合的酯包括C1-C5-烷基酯、C2-C5烯基酯或C2-C5炔基酯，尤其甲酯、乙酯或正丙酯。
“药学上可接受的盐”指适用于药物制剂的化合物的盐。在化合物具有一个或多个碱性基团时，盐可以为酸加成盐，如硫酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、氢碘酸盐、硝酸盐、盐酸盐、乳酸盐、甲基硫酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、乳糖酸盐、辛二酸盐、甲苯磺酸盐等。在化合物具有一个或多个酸性基团时，盐可以为例如钙盐、钾盐、镁盐、甲基葡胺盐、铵盐、锌盐、哌嗪盐、氨丁三醇盐、锂盐、胆碱盐、二乙胺盐、4-苯基环己基胺盐、双苄基乙二胺盐、钠盐、四甲基铵盐等。在本发明的范围内也包括多晶结晶型和溶剂合物。
在本说明书的式中，与键成横向的波形线或在键末端的星号(*)表示共价连接部位。例如，在式中声明R为指
在本说明书的式中，在芳族环的两个碳之间横穿芳族环的键指连接到键的基团可位于芳族环的任何可利用位置。例如，式表示
二聚体
在式(I)、(Ia)和(Ib)中，优选每个R2是Me。更优选地，每个R2是Me，并且每个R3、R4、R7、R8和R10是H(对于R7、R8和R10，当存在时)。
在式(I)和(Ia)中，优选每个R7、R8和R10是H，每个R9独立地是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或(特别是对位异构体)。
在式(Ia)的优选实施方案中，每个G’是C，Y’和Y”都是CH2。在式(Ia)的另一个优选实施方案中，一个G’是N，Y’是CH2，Y”不存在(即相关的下标是O)。
优选地，在式(I)中，每个X2独立地为Me、CO2H、NH2、NH(C1-C5烷基)、N(C1-C5烷基)2、SH、CHO、N(CH2CH2)2N(C1-C3烷基)、NHNH2或C(＝O)NHNH2。
在式(Ib)中，R11优选为H、＝CH2、CH＝CHMe、＝CHMe、C≡CCH2NH2、(特别是对位异构体)或
在式(I)中，X优选为
其中X1是CH2、O或NH；X2是CO2H或NH2；x和y之和为2或4。
更优选地，X是
优选地，当式包括两个苯并二氮杂环***且每个都显示有双线时，这些双线中的至少一个是双键。
本发明的二聚体可以是THIQ-THIQ二聚体；也就是说，在式(I)中，R1是根据式(Ia)。这样的二聚体可以由式(IIa)表示
其中，
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、双线和X如上文发明概述部分关于式(I)所定义的。
在根据式(IIa)的优选实施方案中，THIQ-THIQ二聚体由式(IIa’)表示，
其中，
每个R9独立地是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或(特别是对位异构体)；且
X是
THIQ-THIQ二聚体的具体实例包括：
特别优选的THIQ-THIQ二聚体是(IIa-16)和(IIa-20)。
在另一个实施方案中，本发明的二聚体是THIQ-PBD二聚体；也就是说，在式(I)中，R1是根据式(Ib)。这样的二聚体可以由式(IIb)表示：
其中，
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R11’、双线环C中的虚线和X如上文发明概述部分关于式(I)所定义的。
根据式(IIb)的优选的THIQ-PBD二聚体由式(IIb’)表示：
其中
R9是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或(特别是对位异构体)；
R11是H、＝CH2、CH＝CHMe、＝CHMe、C≡CCH2NH2、(特别是对位异构体)或且
X是
THIQ-PBD二聚体的具体实例包括：
特别优选的THIQ-PBD二聚体是(IIb-03)。
在另一个实施方案中，本发明的二聚体包含具有THIQ环***的苯并二氮杂单元和具有氮杂二氢吲哚(AZI)环***的苯并二氮杂单元(“THIQ-AZI二聚体”)。这样的二聚体可以由式(IIc)表示：
其中
一个G’是N，其它G’是C；
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、双线和X如上文发明概述部分关于式(I)所定义的。
THIQ-AZI二聚体的实例是化合物(IIc-01)：
总述
本发明的二聚体可本身作为治疗剂使用，但优选作为与特异或优先结合到癌细胞上的化学实体的靶向部分的缀合物使用。靶向部分优选为抗体或其抗原结合部分，且化学实体为肿瘤相关的抗原。
因此，本发明的另一个实施方案为包含本发明的二聚体和配体的缀合物，由式(II)表示：
[D(XD)a(C)c(XZ)b]mZ (II)
其中Z为配体，D为本发明的二聚体，并且-(XD)aC(XZ)b-共同称为“连接体部分”或“连接体”，因为它们连接Z和D。在连接体内，C为设计在二聚体D的预期生物作用部位或附近裂解的可裂解基团；XD和XZ被称为间隔基部分(或“间隔基”)，因为它们分别使D和C及C和Z隔开；下标a、b和c独立为0或1(即，任选存在XD、XZ和C)。下标m为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(优选1、2、3或4)。以下更充分描述D、XD、C、XZ和Z。
配体Z，例如抗体，起靶向作用。通过结合到其抗原或受体所处的靶组织或细胞，配体Z指向那里的缀合物。(在配体Z为抗体时，缀合物有时称为抗体-药物缀合物(ADC)或免疫缀合物。优选靶组织或细胞为癌组织或细胞，抗原或受体为肿瘤相关的抗原，即，仅由癌细胞表达或与非癌细胞比较由癌细胞过表达的抗原。在靶组织或细胞的基团C裂解释放二聚体D，以局部发挥其细胞毒性作用。在某些情况下，缀合物通过胞吞内化进入靶细胞，并在靶细胞内发生裂解。以此方式，在预期作用部位实现二聚体D精确输送，从而减小需要的剂量。而且，二聚体D在其缀合态通常为生物非活性(或显著较小活性)，从而减小对非靶组织或细胞的不需要毒性。由于抗癌药物通常一般对细胞为高毒性，因此，这是一个重要考虑。
如下标m反映，根据配体Z可用于缀合的部位数和所用试验条件，各配体Z分子可与多于一个二聚体D缀合。本领域的技术人员应理解，虽然各单独配体Z分子缀合到整数个二聚体D，但可分析二聚体D与配体Z非整数比的缀合物制备物，反映统计平均。将该比称为取代比(SR)或同义称为药物-抗体比(DAR)。
配体Z
优选配体Z为抗体。为方便和简洁起见且不作为限制，随后本文关于配体Z缀合的详细讨论在其为抗体的环境条件下撰写，但本领域的技术人员应了解，可缀合其它类型配体Z，加上必要的变更。例如，用叶酸作为配体的缀合物可靶向其表面上具有叶酸盐受体的细胞(Leamon等人，Cancer Res.2008，68(23)，9839)。出于同样原因，以下详细讨论主要根据1∶1的抗体Z∶类似物D比(m＝1)撰写。
优选配体Z对肿瘤相关抗原为抗体，从而允许选择性靶向癌细胞。此类抗原的实例包括间皮素、***特异性膜抗原(PSMA)、CD19、CD22、CD30、CD70、B7H3、B7H4(也称为O8E)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、RG1、岩藻糖基-GM1、CTLA-4和CD44。抗体可以为动物(例如，鼠)、嵌合、人源化或优选人抗体。抗体优选为单克隆，尤其单克隆人抗体。对一些前述抗原的人单克隆抗体的制备公开于Korman等人，US 8,609,816 B2(2013；B7H4，也称为08E；具体为抗体2A7，1G11和2F9)；Rao-Naik等人，8,097,703 B2(2012；CD19；具体为抗体5G7，13F1，46E8，21D4，21D4a，47G4，27F3和3C10)；King等人，US 8,481,683 B2(2013；CD22；具体为抗体12C5，19A3，16F7和23C6)；Keler等人，US 7,387,776 B2(2008；CD30；具体为抗体5F11，2H9和17G1)；Terrett等人，US 8,124,738 B2(2012；CD70；具体为抗体2H5，10B4，8B5，18E7和69A7)；Korman等人，US 6,984,720 B1(2006；CTLA-4；具体为抗体10D1，4B6和1E2)；Vistica等人，US 8,383,118 B2(2013，岩藻糖基-GM1，具体为抗体5B1，5B1a，7D4，7E4，13B8和18D5)Korman等人，US 8,008,449 B2(2011；PD-1；具体为抗体17D8，2D3，4H1，5C4，4A11，7D3和5F4)；Huang等人，US 2009/0297438 A1(2009；PSMA.具体为抗体1C3，2A10，2F5，2C6)；Cardarelli等人，US 7,875,278 B2(2011；PSMA；具体为抗体4A3，7F12，8C12，8A11，16F9，2A10，2C6，2F5和1C3)；Terrett等人，US 8,222,375 B2(2012；PTK7；具体为抗体3G8，4D5，12C6，12C6a和7C8)；Terrett等人，US 8,680,247 B2(2014；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；具体为抗体4A6，11E7和16D10)；Harkins等人，US 7,335,748 B2(2008；RG1；具体为抗体A，B，C和D)；Terrett等人，US 8,268,970 B2(2012；间皮素；具体为抗体3C10，6A4和7B1)；Xu等人，US 2010/0092484 A1(2010；CD44；具体为抗体14G9.B8.B4，2D1.A3.D12和1A9.A6.B9)；Deshpande等人，US 8,258,266 B2(2012；IP10；具体为抗体1D4，1E1，2G1，3C4，6A5，6A8，7C10，8F6，10A12，10A12S和13C4)；Kuhne等人，Us 8,450,464 B2(2013；CXCR4；具体为抗体F7，F9，D1和E2)；和Korman等人，US 7,943,743 B2(2011；PD-L1；具体为抗体3G10，12A4，10A5，5F8，10H10，1B12，7H1，11E6，12B7和13G4)，其公开内容通过引用结合到本文中。各前述抗体可与本发明的二聚体用于ADC中。
配体Z也可以为抗原片段或抗体模拟物，例如亲和抗体(affibody)、域抗体(dAb)、纳米抗体、单抗体(unibody)、DARPin、anticalin、versabody、duocalin、脂笼蛋白(lipocalin)或avimer。
配体Z上数个不同反应性基团中的任一个可以为缀合部位，包括赖氨酸残基上的ε-氨基、悬垂糖类部分、羧酸基团、二硫基和硫醇基。各类型反应性基团表现一种平衡，有一些优点，也有一些缺点。关于适用于缀合的抗体反应性基团的综述，见例如Garnett，Adv.Drug Delivery Rev.53(2001)，171-216，与Dubowchik和Walker，Pharmacology&Therapeutics 83(1999)，67-123，其公开内容通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，配体Z通过赖氨酸ε-氨基缀合。大多数抗体具有多个赖氨酸ε-氨基，可用在本领域已知的技术通过酰胺、脲、硫脲或氨基甲酸酯键缀合。然而，难以控制哪个ε-氨基反应和有多少ε-氨基反应，导致在缀合物制备中批与批的潜在可变性。缀合也可导致对保持抗体天然构象重要的质子化ε-氨基的中和，或者可在接近抗原结合部位或在该部位的赖氨酸发生，这些都不是希望的情况。
在另一个实施方案中，由于很多抗体糖基化，配体Z可通过糖侧链缀合。糖侧链可用高碘酸盐氧化产生醛基，它又可与胺反应形成亚胺基，例如，在缩氨基脲、肟或腙中。如果需要，亚胺基可通过用氰基硼氢化钠还原转化成更稳定胺基。关于通过糖侧链缀合的另外的公开内容，见例如Rodwell等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83，2632-2636(1986)，其公开内容通过引用结合到本文中。与赖氨酸ε-氨基一样，有关于缀合部位位置和化学计量再现性的问题。
在另一个实施方案中，配体Z可通过羧酸基团缀合。在一个实施方案中，使末端羧酸基团官能化，以产生碳酰肼，碳酰肼然后与携带醛的缀合部分反应。见Fisch等人，Bioconjugate Chemistry 1992，3，147-153。
在另一个实施方案中，抗体Z可通过二硫基缀合，二硫基桥连抗体Z上的半胱氨酸残基和缀合物另一部分上的硫。一些抗体缺乏游离硫醇(硫氢)基，但具有二硫基，例如，在铰链区。在这种情况下，可通过还原天然二硫基产生游离硫醇基。如此产生的硫醇基然后可用于缀合。见，例如Packard等人，Biochemistry 1986，25，3548-3552；King等人，CancerRes.54，6176-6185(1994)；和Doronina等人，Nature Biotechnol.21(7)，778-784(2003)，其公开内容通过引用结合到本文中。同样，也有关于缀合部位位置和化学计量及抗体天然构象可能破坏的问题。
已知一些方法将游离硫醇基引入抗体，而不破坏天然二硫键，这种方法可用本发明的配体Z实施。根据所用方法，可在预定位置引入可预测数量的游离硫氢基。在一种方法中，制备突变的抗体，其中半胱氨酸被另一种氨基酸代替。见，例如，Eigenbrot等人，US 7,521,541 B2(2009)；Chilkoti等人，Bioconjugate Chem.1994，5，504-507；Urnovitz等人，US 4,698,420(1987)；Stimmel等人，J.Biol.Chem.，275(39)，30445-30450(2000)；Bam等人，US 7,311,902 B2(2007)；Kuan等人，J.Biol.Chem.，269(10)，7610-7618(1994)；Poon等人，J.Biol.Chem.，270(15)，8571-8577(1995)。在另一种方法中，将额外半胱氨酸加到C-末端。见，例如Cumber等人，J.Immunol.，149，120-126(1992)；King et al，Cancer Res.，54，6176-6185(1994)；Li等人，Bioconjugate Chem.，13，985-995(2002)；Yang等人，ProteinEngineering，16，761-770(2003)；和Olafson等人，Protein Engineering Design&Selection，17，21-27(2004)。引入游离半胱氨酸的一种优选方法为Liu等人，WO 2009/026274 A1教导的方法，其中将携带半胱氨酸的氨基酸序列加到抗体重链的C-末端。这种方法在远离抗原结合部位的已知位置引入已知数量的半胱氨酸残基(1个/重链)。在本段落中引用文献的公开内容均通过引用结合到本文中。
在另一个实施方案中，可用试剂使赖氨酸ε-氨基修饰，例如2-亚氨基硫杂环戊烷或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)，从而使ε-氨基转化成硫醇基或二硫基，在某种程度上产生半胱氨酸代替物。然而，这种方法受相同缀合位置和与合适ε-氨基有相关的化学计量限制。
连接体组分
如上提到，本发明的缀合物的连接体部分包含最多三个要素：可裂解基团C和任选的间隔基XZ和XD。
可裂解基团C为在生理条件下可裂解的基团，优选选择条件使其相对稳定，同时缀合物处于血浆体循环中，但一旦缀合物达到其预期作用部位，即，接近靶细胞、在其上或处于其内，就容易地裂解。优选在抗体Z结合到靶细胞表面上显示的抗原时，缀合物通过靶细胞内化。随后，在靶细胞的囊泡体(早期细胞内体、晚期细胞内体或尤其溶酶体)中发生基团C裂解。
在一个实施方案中，基团C为pH敏感基团。血浆中的pH略高于中性，而溶酶体内的pH为酸性，约为5。因此，其裂解被酸催化的基团C在溶酶体内以比在血浆中快数个数量级的速率裂解。适合酸敏感性基团的实例包括顺-乌头酰基酰胺和腙，例如描述于Shen等人，US4,631,190(1986)；Shen等人，US 5,144,011(1992)；Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.102，1048-1054(1981)和Yang等人，Proc.Natl Acad.Sci(USA)，85，1189-1193(1988)；其公开内容通过引用结合到本文中。
在另一个实施方案中，基团C为二硫化物。二硫化物可通过硫醇-二硫化物交换机制以取决于环境硫醇浓度的速率裂解。由于谷胱甘肽和其它硫醇的胞内浓度高于其血清浓度，二硫化物的裂解速率在胞内更高。另外，通过调节二硫化物的空间和电子性质(例如，烷基-芳基二硫化物与烷基-烷基二硫化物、芳基环上的取代等)，可调节硫醇-二硫化物交换速率，使得能够设计具有提高血清稳定性或特定裂解速率的二硫键。关于涉及缀合物中二硫可裂解基团的另外的公开内容，见例如Thorpe等人，Cancer Res.48，6396-6403(1988)；Santi等人，US 7,541,530 B2(2009)；Ng等人，US 6,989,452 B2(2006)；Ng等人，WO 2002/096910 A1；Boyd等人，US 7,691,962 B2；和Sufi等人，US 2010/0145036 A1；其公开内容通过引用结合到本文中。
与血清中的蛋白酶相反，优选可裂解基团为由靶细胞内蛋白酶选择性裂解的肽。一般可裂解肽基团包含1至20个氨基酸，优选1至6个氨基酸，更优选1至3个氨基酸。氨基酸可以为天然和/或非天然α-氨基酸。天然氨基酸为由基因密码编码的氨基酸和由其衍生的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸和O-磷酸丝氨酸。就此而论，术语“氨基酸”也包括氨基酸类似物和模拟物。类似物为具有天然氨基酸的相同一般H2N(R)CHCO2H结构的化合物，不同之处在于R基团不是在天然氨基酸中发现的。类似物的实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸-亚砜和蛋氨酸甲基硫鎓。氨基酸模拟物为具有不同于α-氨基酸一般化学结构的结构但以类似方式作用的化合物。该氨基酸可以为基因编码氨基酸的“L”立体化学和对映异构“D”立体化学。
优选基团C包含为蛋白酶的裂解识别序列的氨基酸序列。很多裂解识别序列在本领域熟知。见，例如Matayoshi等人，Science 247：954(1990)；Dunn等人，Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等人，Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等人，Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith等人，Meth.Enzymol.244：412(1994)；和Bouvier等人，Meth.Enzymol.248：614(1995)；其公开内容通过引用结合到本文中。
对于不旨在由细胞内化的缀合物，可选择基团C，使其被靶组织附近胞外基质中存在的蛋白酶裂解，例如，由附近临终细胞释放的蛋白酶或肿瘤相关的蛋白酶。示例性胞外肿瘤相关的蛋白酶为基质金属蛋白酶(MMP)、甲拌磷寡肽酶(TOP)和CD10。
对于旨在由细胞内化的缀合物，基团C优选包含为了由内体或溶酶体蛋白酶(尤其后者)裂解而选择的氨基酸序列。此类蛋白酶的非限制实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L和S，尤其组织蛋白酶B。组织蛋白酶B优先裂解在序列-AA2-AA1-的肽，其中AA1为碱性或强氢键合氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸)，AA2为疏水氨基酸(例如，苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，例如Val-Cit(其中Cit表示瓜氨酸)或Val-Lys。(在本文中，除非上下文另外清楚地指明，氨基酸序列以N-至-C方向书写，如在H2N-AA2-AA1-CO2H中)。Lys-Val-Ala、Asp-Val-Ala、Val-Ala、Lys-Val-Cit和Asp-Val-Cit也是用于组织蛋白酶B的底物肽基序，虽然在一些情况下，裂解速率可能较慢。关于组织蛋白酶-可裂解基团的另外的资料，见Dubowchik等人，Biorg.Med.Chem.Lett.8，3341-3346(1998)；Dubowchik等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8 3347-3352(1998)；和Dubowchik等人，Bioconjugate Chem.13，855-869(2002)；其公开内容通过引用结合到本公开。可用于裂解肽基连接体的另一种酶为豆英蛋白(legumain)，一种优先在Ala-Ala-Asn裂解的溶酶体半胱氨酸蛋白酶。
在一个实施方案中，基团C为包含二氨基酸序列-AA2-AA1-的肽，其中AA1为赖氨酸、精氨酸或瓜氨酸，AA2为苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在另一个实施方案中，C由选自Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Lys、Cit、Ser和Glu的1至3个氨基酸的序列组成。
制备和设计由单一氨基酸组成的可裂解基团C公开于Chen等人，US 8,664,407 B2(2014)；其公开内容通过引用结合到本文中。
基团C也可以为光可裂解基团，例如在曝露于光时裂解的硝基苄基醚。
基团C可直接结合到抗体Z或类似物D，即，可视情况不存在间隔基XZ和XD。例如，如果基团C为二硫化物，则两个硫之一可以为半胱氨酸残基或在抗体Z上的代替物。或者，基团C可以为结合到抗体糖侧链上的醛的腙。或者，基团C可以为与抗体Z的赖氨酸ε-氨基形成的肽键。在一个优选的实施方案中，二聚体D通过到二聚体D中羧基或胺基的肽基键直接结合到基团C。
存在时，间隔基XZ在基团C和抗体Z之间提供空间隔离，以免前者空间干扰后者抗原结合，或者后者空间干扰前者裂解。可进一步用间隔基XZ给予缀合物增加的溶解性或减小的聚集性。间隔基XZ可包含一个或多个可以任何几种组合装配的模块片段。用于间隔基XZ的适合片段的实例为：
及其组合，
其中下标g为0或1，下标h为1至24，优选2至4。这些片段可组合，如下所示：
存在时，间隔基XD在基团C和二聚体D之间提供空间隔离，以免后者空间或电子干扰前者裂解。间隔基XD也可用于将另外的分子质量和化学官能引入缀合物。一般另外的质量和官能会影响缀合物的血清半衰期和其它性质。因此，通过合理选择间隔基，可调节缀合物的血清半衰期。间隔基XD也可从模块片段装配，如以上间隔基XZ上下文中所述。
存在时，间隔基XZ和/或XD分别在Z和C或D和C之间优选提供4至25个原子的线性隔离，更优选4至20个原子。
除了共价连接抗体和药物外，连接体也可完成其它功能。例如，连接体可包含聚(乙二醇)(PEG)基团，该基团提高缀合化学进行期间或在最终ADC产物中的溶解性。存在PEG基团时，它可结合到间隔基XZ或XD或二者。PEG基团中的重复单元数可以为2至20，优选在4和10之间。
间隔基XZ或XD或二者可包含自分解部分。自分解部分为这样一种部分，该部分(1)结合到基团C和抗体Z或二聚体D，并且(2)具有一种结构使从基团C裂解引发反应序列，视情况而使自分解部分自身与抗体Z或二聚体D断键。换句话讲，在远离抗体Z或二聚体D的部位反应(从基团C裂解)也使XZ-Z或XD-D键断裂。在间隔基XD的情况下，存在自分解部分合乎需要，因为如果在缀合物裂解后，间隔基XD或其部分若保持连接到二聚体D，后者的生物活性就可能被削弱。在可裂解基团C为多肽时，使用自分解部分尤其合乎需要，在此情况下，自分解部分一般位于附近。
结合到配偶分子D上的羟基或氨基的示例性自分解部分(i)-(v)显示如下：
自分解部分为虚线a和b(或虚线b和c)之间的结构，且具有显示提供背景的相邻结构特征。自分解部分(i)和(v)结合到二聚体D-NH2(即，二聚体D通过氨基缀合)，而自分解部分(ii)、(iii)和(iv)结合到二聚体D-OH(即，二聚体D通过羟基或羧基缀合)。在虚线b酰胺键裂解(例如，通过肽酶)释放酰胺氮作为胺氮，引发反应序列，反应序列导致在虚线a键裂解，随之可视情况释放D-OH或D-NH2。或者，触发自分解反应的裂解可通过不同类型酶，例如通过β-葡糖醛酸糖苷酶，如在结构(vi)的情况下。在某些情况下，可串联使用自分解基团，如结构(vii)所示。在此情况下，在虚线c裂解通过1，6-消除反应触发虚线b和c之间部分的自分解，随后通过环化-消除反应进行虚线a和b之间部分的自分解。关于自分解部分的另外的公开内容，见Carl等人，J.Med.Chem.，24(3)，479-480(1981)；Carl等人，WO 81/01145(1981)；Dubowchik等人，Pharmacology&Therapeutics，83，67-123(1999)；Firestone等人，US 6,214,345 B1(2001)；Toki等人，J.Org.Chem.67，1866-1872(2002)；Doronina等人，Nature Biotechnology 21(7)，778-784(2003)(erratum，p.941)；Boyd等人，US 7,691,962B2；Boyd等人，US 2008/0279868 A1；Sufi等人，WO 2008/083312 A2；Feng，US 7,375,078B2；Jeffrey等人，US 8039,273；和Senter等人，US 2003/0096743 A1；其公开内容通过引用结合到本文中。优选的自分解基团为对氨基苄基氧基羰基(PABC)，如结构(i)中所示。
在另一个实施方案中，抗体靶向部分和二聚体D通过不可裂解连接体连接，即，不存在要素C。抗体降解最终使连接体减小到不干扰二聚体D生物活性的小的附加部分。
缀合技术
本发明的缀合物优选通过以下制成：首先制备包含本发明的类似物(由下式中D表示)和连接体(XD)a(C)c(XZ)b(其中XD、C、XZ、a、b和c如关于式(II)所限定)的化合物，以生成由式(III)表示的类似物-连接体组成：
D-(XD)a(C)c(XZ)b-R31 (III)
其中R31为适合与抗体Z上互补官能团反应形成缀合物的官能团。适合基团R31的实例包括氨基、叠氮、环辛炔、
其中R32为Cl、Br、F、甲磺酸基或甲苯磺酸基，R33为Cl、Br、I、F、OH、-O-N-琥珀酰亚胺基、-O-(4-硝基苯基)、-O-五氟苯基或-O-四氟苯基。一般适用于制备适合部分D-(XD)aC(XZ)b-R31的化学反应公开于Ng等人，US 7,087,600 B2(2006)；Ng等人，US 6,989,452 B2(2006)；Ng等人，US 7,129,261 B2(2006)；Ng等人，WO 02/096910 A1；Boyd等人，US 7,691,962 B2；Chen等人，US 7,517,903 B2(2009)；Gangwar等人，US 7,714,016 B2(2010)；Boyd等人，US 2008/0279868 A1；Gangwar等人，US 7,847,105 B2(2010)；Gangwar等人，US 7,968,586 B2(2011)；Sufi等人，US 2010/0145036 A1；和Chen等人，US 2010/0113476 A1；其公开内容通过引用结合到本文中。
优选反应性官能团-R31为-NH2、-OH、-CO2H、-SH、马来酰亚胺基、环辛炔、叠氮基(-N3)、羟氨基(-ONH2)或N-羟基琥珀酰亚胺基。尤其优选的官能团-R31为：
-OH基团可用抗体上的羧基酯化，例如，天冬氨酸或谷氨酸侧链上。
-CO2H基团可用-OH基酯化，或者用抗体上(例如，赖氨酸侧链上)的氨基酰胺化。
N-羟基琥珀酰亚胺基在官能上为活化的羧基，并且可简便地通过与氨基(例如，来自赖氨酸)反应酰胺化。
在迈克尔加成反应中，马来酰亚胺基可与抗体上的-SH基(例如，来自半胱氨酸或来自抗体化学修饰引入硫氢基官能)缀合。
多种技术可将-SH基引入抗体。在一种优选的技术中，抗体中赖氨酸残基侧链中的ε-氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷反应，以引入游离硫醇(-SH)基。为了实现缀合，硫醇基可与马来酰亚胺或其它亲核受体基团反应：
一般达到每抗体2至3个硫醇的硫醇化水平。关于代表性方法，见Cong等人，2014，其公开内容通过引用结合到本文中。因此，在一个实施方案中，用于缀合到本发明的二聚体的抗体具有一个或多个通过与亚氨基硫杂环戊烷反应修饰的赖氨酸残基(优选2至3个)。
在作为上述的“镜像”的迈克尔加成反应中，基团-SH也可用于缀合，其中抗体已修饰，向其引入马来酰亚胺基。利用4-(马来酰亚胺基甲基)-环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)或其磺化变体磺基-SMCC，两种试剂均购自Sigma-Aldrich，可使抗体修饰为具有马来酰亚胺基。
一种供选缀合技术利用无铜“点击化学”，其中跨环辛炔的受张力的炔键加叠氮基，以生成1，2，3-***环。见例如，Agard等人，J.Amer.Chem.Soc.2004，126，15046；Best，Biochemistry 2009，48，6571，其公开内容通过引用结合到本文中。叠氮化物可位于抗体上，而环辛炔位于药物部分上，或者反之亦然。优选的环辛炔基团为二苯并环辛炔(DIBO)。具有DIBO基团的各种试剂可得自Invitrogen/Molecular Probes，Eugene，Oregon。以下反应显示其中DIBO基团连接到抗体(Ab)的情况的点击化学缀合：
另一种缀合技术包括将非天然氨基酸引入抗体，非天然氨基酸提供与药物部分中反应性官能团缀合的官能。例如，非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸可结合到抗体或其它多肽，如Tian等人，WO 2008/030612 A2(2008)中所教导。通过与连接体-药物部分上的羟氨基生成肟，对乙酰基苯丙氨酸中的酮基可以为缀合部位。或者，可使非天然氨基酸对叠氮基苯丙氨酸结合到抗体，以提供用于通过点击化学缀合的叠氮官能团，如上讨论。使用无细胞方法，非天然氨基酸也可结合到抗体或其它多肽，如Goerke等人，US 2010/0093024 A1(2010)和Goerke等人，Biotechnol.Bioeng.2009，102(2)，400-416中所教导。前述公开通过引用结合到本文中。因此，在一个实施方案中，用于与本发明的二聚体制备缀合物的抗体具有一个或多个由非天然氨基酸代替的氨基酸，优选为对乙酰基苯丙氨酸或对叠氮基苯丙氨酸，更优选对乙酰基苯丙氨酸。
根据Jeger等人，Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，9995，其它缀合技术使用转谷氨酰胺酶(优选细菌转谷氨酰胺酶或BTG)。BTG在谷氨酰胺的侧链酰胺(胺受体)和亚烷基氨基(胺给体)之间形成酰胺键，可例如为赖氨酸或5-氨基-正戊基的ε-氨基。在一种典型缀合反应中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而亚烷基氨基位于连接体-药物部分上，如下所示：
多肽链上谷氨酰胺残基的定位对其对BTG介导转酰氨基作用的敏感性具有大的影响。抗体上的谷氨酰胺残基正常都不是BTG底物。然而，如果抗体去糖基化，糖基化部位为天冬酰胺297(N297)，则附近的谷氨酰胺295(Q295)呈现易受BTG影响。抗体可通过用PNGase F(肽-N-糖苷酶F)处理酶催去糖基化。或者，通过在不变区引入N297A突变以去除N297糖基化部位，可无糖苷合成抗体。此外，已显示，在抗体中N297Q取代不仅排除糖基化，而且引入第二谷氨酰胺残基(在297位)，那也是胺受体。因此，在一个实施方案中，使缀合到本发明的二聚体的抗体去糖基化。在另一个实施方案中，抗体具有N297Q取代。本领域的技术人员应理解，通过合成后修饰或通过引入N297A突变去糖基化产生每抗体2个BTG反应性谷氨酰胺残基(1个/重链，在295位)，而具有N297Q取代的抗体具有4个BTG反应性谷氨酰胺残基(2个/重链，在295和297位)。
缀合也可用分选酶A实现，如教导于Levary等人，PLoS One 2011，6(4)，e18342；Proft，Biotechnol.Lett.2010，32，1-10；Ploegh等人，WO 2010/087994 A2(2010)；和Mao等人，WO 2005/051976 A2(2005)。分选酶A识别基序(一般为LPXTG，其中X为任何天然氨基酸)可位于配体Z上，亲核受体基序(一般为GGG)可以为式(III)中的基团R31，或者反之亦然。
二聚体-连接体化合物
一般地，本发明的二聚体的ADC包括连接到二聚体上官能团的连接体，该连接体结合到抗体。考虑到可利用的缀合技术的多样性，本发明的二聚体可精细分成适用于缀合到抗体的很多不同二聚体-连接体化合物。
一般有三种不同模式用于连接体结合到本发明的二聚体，如下图中所示(为简单起见，环中的变量和任选取代基未显示)：
在类型(a)二聚体-连接体化合物中，用于连接连接体的官能团位于两个二聚体半部之间的桥X中。在类型(b)二聚体-连接体化合物中，连接体作为跨亚胺双键的加成产物连接。在类型(c)和(c’)二聚体-连接体化合物中，用于连接体的连接的官能团位于THIQ、AZI或PBD的“外侧”环。
在一个实施方案中，类型(a)二聚体-连接体化合物可由式(IIIa)表示：
其中
T为自分解基团；
t为0或1；
AAa和各AAb独立选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
u为0或1；
p为1、2、3或4；
q为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(优选2、3、4或8)；
r为1、2、3、4或5；
s为0或1；
R31为
XA为
其中每个x和y为1、2或3，条件是x与y之和为2或4；星号(*)表示每个XA与相邻O和R1的键合位置；如果T存在，波形线表示每个XA与T的键合位置，如果T不存在，波形线表示每个XA与AAa的键合位置；且
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、G、Y和双线如上文发明概述部分关于式(I)所定义的。
在一个优选的实施方案中，在式(IIIa)中u为1。
根据式(IIIa)的优选的类型(a)二聚体-连接体化合物由式(IIIa’)表示：
其中各R9独立地是H、O(CH2CH2O)1-4H、(CH2CH2O)1-4(C1-C3烷基)、OH、Cl、F或Br。
优选在式(IIIa)和(IIIa’)中，XA是
类型(a)二聚体-连接体化合物的实例包括：
二聚体-连接体的优选亚类符合下式：
其中下标n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
特别优选的类型(a)二聚体连接体化合物是(IIIa-03)和(IIIa-04)。
在另一个实施方案中，类型(b)二聚体-连接体化合物可由式(IIIb)表示：
其中，
T、t、AAa、AAb、u、p、q、s、r和R31如关于式(IIIa)所定义；且R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、X、Y和G如上文发明概述部分所定义的。
在一个优选的实施方案中，在式(IIIb)中u为1。
根据式(IIIb)的优选的类型(b)二聚体由式(IIIb’)表示，
其中，
每个R9独立地是H、O(CH2CH2O)1-4H、(CH2CH2O)1-4(C1-C3烷基)、OH、Cl、F或Br，且
X是
类型(b)二聚体-连接体化合物的实例包括：
在一个实施方案中，类型(c)二聚体-连接体化合物可由式(IIIc)表示：
其中，
T、t、AAa、AAb、u、p、q、s、r和R31如关于式(IIIa)所定义；且R1、R2、R3、R4、R5、R6、Z和双线如上文发明概述部分所定义的。
在优选的实施方案中，在式(IIIc)中u为1。
根据式(IIIc)的优选的类型(c)二聚体-连接体化合物由式(IIIc’)表示：
其中
R9是H、O(CH2CH2O)1-4H、(CH2CH2O)1-4(C1-C3烷基)、OH、Cl、F或Br；且X是
类型(c)二聚体-连接体化合物的实例包括：
优选的类型(c’)二聚体-连接体由式(IIIc”)表示：
其中，
T、t、AAa、AAb、u、p、q、s、r和R31如关于式(IIIa)所定义的；且每个R50独立地为H、O(C1-C3烷基)、O(C2-C3亚烷基)、O(C2-C3炔基)、F、Cl、Br或CN。
优选地，在式(IIIc”)中，该部分
是
根据式(IIIc”)的二聚体-连接体的实例是：
特别优选的类型(c)/(c’)二聚体-连接体化合物是(IIIc-08)。
式(IIIa)、(IIIa’)、(IIIb)、(IIIb’)、(IIIc)、(IIIc’)和(IIIc”)中的R31是能够与抗体上的互补官能团反应以实现缀合的反应性官能团，如上所述。
在式(IIIa)、(IIIa’)、(IIIb)、(IIIb’)、(IIIc)、(IIIc’)和(IIIc”)中，-AAa-[AAb]p-表示长度由p值决定的多肽(如果p为1，则为二肽，如果p为3，则为四肽等)。AAa在多肽的羧基末端，其羧基与二聚体的胺氮形成肽(酰胺)键。相反，最后的AAb在多肽的氨基末端，其α-氨基分别与以下形成肽键：
取决于s是1还是0。优选的多肽-AAa-[AAb]p-是Val-Cit、Val-Lys、Lys-Val-Ala、Asp-Val-Ala、Val-Ala、Lys-Val-Cit、Ala-Val-Cit、Val-Gly、Val-Gln和Asp-Val-Cit，以常规的N-到-C方向书写，如H2N-Val-Cit-CO2H)。更优选地，多肽是Val-Cit、Val-Lys或Val-Ala。优选地，多肽-AAa-[AAb]p-可被靶(癌)细胞内发现的酶例如组织蛋白酶、特别是组织蛋白酶B裂解。
如下标所示，t等于0或1，自分解基团T任选存在于式(IIIa)、(IIIa’)、(IIIb)、(IIIb’)、(IIIc)、(IIIc’)和(IIIc”)的二聚体-连接体化合物中。当存在时，自分解基团T优选为对氨基苄基氧基羰基(PABC)基团，其结构如下所示，星号(*)表示与二聚体的胺氮键合的PABC末端，波形线表示与多肽-AAa-[AAb]p-键合的末端。
在优选的实施方案中，在式(IIIa)、(IIIa’)、(IIIb)、(IIIb’)、(IIIc)、(IIIc’)或(IIIc”)中，基团R31是
在另一优选的实施方案中，在式(IIIa)、(IIIa’)、(IIIb)、(IIIb’)、(IIIc)、(IIIc’)或(IIIc”)中，基团R31是
缀合物的制备
该通用方法基于通过赖氨酸ε-氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷反应使游离硫醇基引入抗体，随后与含马来酰亚胺的药物-连接体部分反应，如上所述。最初，使抗体缓冲交换进入含50mM NaCl和2mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)，并浓缩到5-10mg/mL。通过2-亚氨基硫杂环戊烷加到抗体实现硫醇化。要加的2-亚氨基硫杂环戊烷的量可通过初步试验确定，并因抗体而异。在初步试验中，2-亚氨基硫杂环戊烷增量滴定加到抗体，并在RT(室温，约25℃)用抗体培养1h后，用SEPHADEXTM G-25柱使抗体脱盐进入50mMHEPES、5mM甘氨酸、2mM DTPA，pH 5.5，通过与二硫二吡啶(DTDP)反应快速确定引入的硫醇基数。硫醇基与DTDP反应引起释放巯基吡啶，可在324nm光谱监测。一般使用0.5-1.0mg/mL蛋白浓度的样品。可用在280nm的吸光度精确测定样品中蛋白的浓度，然后将各样品的等分试样(0.9mL)用0.1mL DTDP(5mM在乙醇中的储备溶液)在RT培养10min。也在旁培养单独缓冲液加上DTDP的空白样品。10min后，测定在324nm的吸光度，并用关于19,800M-1巯基吡啶的消光系数对硫醇基数目定量。
一般每抗体约2至3个硫醇基的硫醇化水平合乎需要。例如，可利用一些抗体，通过加入15倍的摩尔过量2-亚氨基硫杂环戊烷，随后在RT培养1h达到。然后用2-亚氨基硫杂环戊烷以所需摩尔比培养抗体，然后脱盐进入缀合缓冲液(50mM HEPES，5mM甘氨酸，2mMDTPA，pH 5.5))。在冰上保持硫醇化物质，同时如上所述对引入的硫醇数定量。
在验证引入的硫醇数后，以每硫醇2.5倍的摩尔过量加入药物(二聚体)-连接体部分。使缀合反应在包含25％丙二醇和5％海藻糖最终浓度的缀合缓冲液中进行。一般使药物-连接体储备溶液溶于100％DMSO。储备溶液直接加到硫醇化抗体。
在轻轻搅拌下，在RT培养缀合反应混合物2h。然后将10倍的摩尔过量N-乙基马来酰亚胺(100mM在DMSO中的储备溶液)加到缀合混合物，并搅拌另外1小时，以封闭任何未反应硫醇。
然后通过0.2μ滤器过滤样品。使物质通过TFF VivaFlow 50Sartorius 30MWCOPES膜缓冲交换进入10mg/mL甘氨酸、20mg/mL山梨糖醇、15％乙腈pH 5.0(5X TFF缓冲交换体积)，以去除任何未反应药物。通过TFF最终配制为20mg/mL山梨糖醇、10mg/mL甘氨酸，pH5.0。
可将以下方法用于二聚体-连接体化合物的转谷氨酰胺酶介导缀合，其中连接体具有可作为胺给体的胺基。抗体可以为具有转谷氨酰胺酶-反应性谷氨酰胺的抗体，例如，具有N297A或N297Q取代的抗体。缀合通过重组细菌转谷氨酰胺酶以5∶1抗体∶酶摩尔比进行。缀合用标准规程在50mM Tris缓冲液pH 8.0中进行，在37℃培养过夜。使得到缀合物在用50mM Tris，pH 8.0预平衡的Protein A柱上纯化。缀合物用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 3.5洗脱。洗脱的级分用1M Tris pH 9.0中和。缀合物可在20mg/mL山梨糖醇、10mg/mL甘氨酸pH5.0中配制。
本领域的技术人员应了解，上述条件和方法为示例性而非限制性，用于缀合的其它方法在本领域已知，并可用于本发明。
缀合物
在一个实施方案中，本发明的缀合物从类型(a)二聚体-连接体化合物得到，并且可由式(IVa)表示：
其中，
Ab是抗体；
R40是
其中键合到Ab的R40的开放化合价由星号(*)表示，键合到(CH2)r的R40的开放化合价由波形线表示；
m为1、2、3或4；
T、t、AAa、AAb、u、p、q、s、r和XA如关于式(IIIa)所定义；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Y、G和双线如上文发明概述部分所定义的。
在优选的实施方案中，在式(IVa)中u为1。
根据式(IVa)的优选的缀合物由式(IVa’)表示：
其中
R9是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或(特别是对位异构体)；且
XA是
其中星号(*)表示每个XA与相邻的O和R1的键合位置，如果T存在，波形线表示每个XA与T的键合位置，如果T不存在，波形线表示每个XA与AAa的键合位置。
在另一个实施方案中，本发明的缀合物衍生自类型(b)二聚体-连接体化合物，并且可由式(IVb)表示：
其中，
Ab、R40、m、T、t、AAa、AAb、u、p、q、s和r如关于式(IVa)所定义；R1、R2、R3、R4、R7、R8、R9、R10、Y、G和X如上文发明概述部分关于式(I)所定义的。
在优选的实施方案中，在式(IVb)中u为1。
根据式(IVb)的优选的缀合物由式(IVb’)表示：
其中，
R9是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或(特别是对位异构体)；且
X是
在另一个实施方案中，本发明的缀合物衍生自类型(c)二聚体-连接体化合物，并且可由式(IVc)表示：
其中，
Ab、R40、m、T、t、AAa、AAb、u、p、q、s和r如关于式(IVa)所定义；且R1、R2、R3、R4、R5、R6、Y、X和双线如上文发明概述部分所定义的。
在优选的实施方案中，在式(IVc)中u是1。
根据式(IVc)的优选的缀合物由式(IVc’)表示：
其中
R9是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或(特别是对位异构体)；且
X是
在另一个实施方案中，本发明的缀合物具有由式(IVc”)表示的结构
其中Ab、R40、m、T、t、AAa、AAb、u、p、q、s和r如关于式(IVa)所定义；并且各R50独立地为H、O(C1-C3烷基)、O(C2-C3亚烷基)、O(C2-C3炔基)、F、Cl、Br或CN。
上文关于式(IIIa)、(IIIa’)、(IIIb)、(IIIb’)、(IIIc)、(IIIc’)和(IIIc”)的二聚体连接体陈述的对于多肽-AAa-[AAb]p-和自分解基团T的优选方案也适用于式(IVa)、(IVa’)、(IVb)、(IVb’)、(IVc)、(IVc’)和(IVc”)的缀合物。
在式(IVa)、(IVb)、(IVc)和(IVc”)中，如果下标t和u均为0，则连接体是不可裂解型的，并且依赖于抗体Ab的降解以释放药物。如果聚乙二醇的存在是有益的，例如通过在缀合期间增加药物-连接体化合物的溶解度，并且不影响药物的生物活性，聚乙二醇组分任选地可以存在(即，s为1)。
药物组合物
在另一个方面，本公开提供一种药物组合物，所述药物组合物包含用药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的本发明的化合物或其缀合物。它可任选包含一种或多种另外的药物活性成分，例如抗体或另一种药物。药物组合物可在联合治疗中与另一种治疗剂一起给药，尤其另一种抗癌剂。
药物组合物可包含一种或多种赋形剂。可使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣料、崩解剂、润滑剂、增甜剂、防腐剂、等渗剂及其组合。选择和使用适合赋形剂教导于Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)，其公开内容通过引用结合到本文中。
优选药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊椎或表皮给药(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，活性化合物可在材料中包衣，以保护化合物不受酸作用和可使其失活的其它自然条件侵害。短语“胃肠外给药”指除经肠和局部给药以外的通常通过注射的给药方式，包括而不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊椎内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，药物组合物可通过非胃肠外途径给药，例如局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、口服、***、直肠、舌下或局部。
药物组合物可以采用无菌水溶液或分散体形式。它们也可在微乳液、脂质体或适用于达到高药物浓度的其它有序结构中配制。组合物也可以冻干物形式提供，例如通过在给药前在水中重组。
可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量取决于要治疗的患者和具体给药方式，一般为产生治疗效果的组合物的量。通常，基于100％，该量为约0.01％至约99％活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％活性成分与药学上可接受的载体组合。
调节剂量方案，以提供治疗响应。例如，可给予单一推注，可随时间给予数个分开剂量，或者由情况紧急状态而定成比例减小或增加剂量。为了容易给药和剂量均匀性，尤其有利以剂量单位形式配制胃肠外组合物。“剂量单位形式”指适合作为单一剂量用于要治疗患者的物理离散单位，各单位包含计算产生所需治疗响应的预定量活性化合物，与所需的药物载体结合。
剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg的主体体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重，1mg/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，或者0.1至5mg/kg。示例性治疗方案是每周施用一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每三个月一次，或每三至六个月一次。优选的剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下给药计划之一：(i)每四周给药，六次剂量，然后每三个月给药；(ii)每三周给药；(iii)给予3mg/kg体重一次，随后每三周给予1mg/kg体重。在一些方法中，调整剂量以获得约1-1000μg/mL的血浆抗体浓度，并且在一些方法中约25-300μg/mL的血浆抗体浓度。
“治疗有效量”的本发明化合物优选导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或预防由于疾病的痛苦而导致的损伤或残疾。例如，为了治疗带有肿瘤的患者，“治疗有效量”优选相对于未治疗的患者抑制肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，还更优选至少约80％。治疗有效量的治疗性化合物可以降低肿瘤大小，或以其他方式改善患者的症状，所述患者通常是人，但可以是另一种哺乳动物。
药物组合物可以是受控或持续释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送***。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可以通过医疗器械给予，例如(1)无针皮下注射器械(例如US 5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微型输液泵(US 4,487,603)；(3)透皮器械(US 4,486,194)；(4)输液装置(US 4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透器械(US 4,439,196和4,475,196)；其公开内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，可以配制药物组合物以确保体内适当分布。例如，为了确保本发明的治疗化合物穿过血脑屏障，它们可以配制在脂质体中，脂质体可另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见例如US 4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman等人，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen和Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；以及Killion和Fidler(1994)Immunomethods4：273。
用途
本发明的化合物或其缀合物可用于治疗疾病，例如但不限于过度增殖性疾病，包括：头颈部癌，包括头、颈、鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、口腔、口咽、喉、下咽、唾液腺和副神经节肿瘤；肝脏和胆道癌，特别是肝细胞癌；肠癌，特别是结肠直肠癌；卵巢癌；小细胞和非小细胞肺癌(SCLC和NSCLC)；乳腺癌肉瘤，如纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、胚胎横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤(leiomysosarcoma)、神经纤维肉瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤和泡状软组织肉瘤；白血病，如急性早幼粒细胞白血病(APL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性骨髓性白血病(CML)；中枢神经***的肿瘤，特别是脑癌；多发性骨髓瘤(MM)，淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B系大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和T细胞间变性大细胞淋巴瘤。临床上，本文描述的方法的实践和组合物的用途将导致癌性生长的大小或数量的减少和/或相关症状的减少(如适用)。在病理学上，本文描述的方法的实践和组合物的用途将产生病理相关的反应，例如：抑制癌细胞增殖，减小癌或肿瘤的大小，预防进一步转移和抑制肿瘤血管生成。治疗这种疾病的方法包括向患者施用治疗有效量的本发明组合。可以根据需要重复该方法。特别是癌症可以是肾、肺、胃或卵巢癌。
本发明化合物或其缀合物可与其它治疗剂组合给予，其它治疗剂包括抗体、烷化剂、血管生成抑制剂、抗代谢物、DNA裂解剂、DNA交联剂、DNA嵌合剂、DNA小沟结合剂、烯二炔、热休克蛋白90抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、免疫调节剂、微管稳定剂、核苷(嘌呤或嘧啶)类似物、核出口抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶(I或II)抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。具体的治疗剂包括阿达木单抗、安丝菌素P3、澳瑞他汀(auristatin)、苯达莫司汀、贝伐珠单抗、比卡鲁胺、博来霉素、硼替佐米、白消安、callistatin A、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、顺铂、克拉屈滨、阿糖胞苷、cryptophycins、达卡巴嗪、达沙替尼、柔红霉素、多西紫杉醇、多柔比星、倍癌霉素(duocarmycin)、dynemycin A、埃博霉素(Epothilones)、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他滨、易普利姆玛(ipilimumab)、羟基脲、伊马替尼、英夫利昔单抗、干扰素、白介素、β-拉帕醌(β-lapachone)、来那度胺、伊立替康、美登素、氮芥(mechlorethamine)、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、尼罗替尼、奥沙利铂、紫杉醇、丙卡巴肼、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、6-硫代胍、噻替派、替尼泊苷、托泊替康、曲妥珠单抗、曲古抑菌素A、长春花碱、长春新碱和长春地辛。
实施例
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，其通过举例说明而非限制的方式提供。以下一般程序是说明性的，本领域技术人员理解，可以使用替代但等同的方法。
一些1H-NMR光谱在Bruker 600、500或400MHz仪器上进行，化学位移以ppm(δ)表示，参考四甲基硅烷(δ＝0.0)。通常，在减压下进行蒸发。
这两种LC/MS分析方法是说明性的：
A柱：Waters BEH C18，2.0x 50mm，1.7-μm颗粒；流动相A：含有0.05％TFA的水；流动相B：含有0.05％TFA的乙腈；[在1.5分钟内2-98％，3分钟运行时间]；温度：40℃；流速：0.8mL/min，紫外检测器设置在220或254nm。
B柱：PhenomenexLuna，2.0x 30mm，3-μm颗粒；流动相A：10％乙腈/90％含有0.1％TFA的水；流动相B：90％乙腈/10％含有0.1％TFA的水；[在2分钟内0-100％，4分钟运行时间]；温度：40℃；流速：1.0mL/min，紫外检测器设置在220或254nm。
实施例1-中间体化合物6
该实施例和图1涉及中间体化合物6的合成，其用于制备本发明的二聚体。
4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酰氯1如下从相应的甲酯制备：向4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸甲酯(Harve Chem，15g，47.3mmol)在四氢呋喃(THF，350mL)中的溶液中加入NaOH水溶液(56.7mL，142mmol，2.5M)。将反应在50℃下搅拌5小时。将反应冷却至室温(RT)，然后真空浓缩除去THF。剩余的水层用HCl水溶液(6N)酸化至pH2。将所得黄色沉淀物过滤，用水洗涤，真空干燥，得到4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(14.32g，100％产率)。LCMS(M+H)＝304.08.1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.60(s，1H)，7.53-7.45(m，2H)，7.45-7.31(m，3H)，7.29(s，1H)，5.23(s，2H)，3.98(s，3H)。
向上述硝基苯甲酸(3.5g，11.54mmol)在THF(150mL)中的溶液中滴加草酰氯(1.212mL，13.85mmol)，然后加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF，50μL)。将所得溶液在室温下搅拌2小时，然后真空浓缩，得到酰氯1，为黄色固体。
在0℃将酰氯1溶于THF(35mL)中并滴加到(S)-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸苄酯对甲苯磺酸盐2(Accela，5.58g，12.70mmol)和三乙胺(4.83mL，34.6mmol)在THF(80mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后用水猝灭并浓缩以除去THF。所得混合物用EtOAc(3x)萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(80g柱，在15分钟内从0％至100％EtOAc/二氯甲烷(DCM)的梯度)纯化粗产物混合物，得到酯3(6.25g，98％产率)。LCMS(M+H)＝553.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.95-7.72(m，1H)，7.57-7.35(m，5H)，7.34-7.0(m，8H)，7.14-6.98(m，1H)，6.94-6.69(m，1H)，5.39-5.19(m，2H)，5.19-5.08(m，1H)，4.99(q，J＝12.4Hz，1H)，4.75(d，J＝17.4Hz，1H)，4.65-4.40(m，2H)，4.28(d，J＝15.6Hz，1H)，3.86(br.s.，3H)，3.71(s，1H)，3.50-3.18(m，1H)。
将酯3(6.25g，11.31mmol)，锌(4.44g，67.9mmol)和NH4Cl(7.26g，136mmol)在MeOH(50mL)中的悬浮液在50℃下加热16小时。将反应冷却至室温并用MeOH稀释。将所得混合物通过CELITETM垫过滤，依次用EtOAc、DCM和MeOH洗涤。合并滤液并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(120g柱，在15分钟内从0％至100％EtOAc/DCM的梯度)纯化粗产物混合物，得到二酮4(4.5g，96％产率)。LCMS(M+H)＝415.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.49-7.40(m，4H)，7.32(br.s.，6H)，，6.45(s，1H)，5.19(s，2H)，5.13(d，J＝15.4Hz，1H)，4.47(d，J＝15.2Hz，1H)，4.21(t，J＝6.7Hz，1H)，3.93(s，3H)，3.52(dd，J＝15.4，7.0Hz，1H)，3.02(dd，J＝15.4，6.4Hz，1H)。
将二酮4(4.5g，10.86mmol)的DMF(54.3ml)溶液冷却至0℃，再分批加入NaH(在矿物油中的60％分散体，0.54g，13.57mmol)。将所得混合物搅拌30分钟，然后加入(2-(氯甲氧基)乙基)三甲基硅烷(SEM-Cl，2.31ml，13.03mmol)。将反应升温至室温，并搅拌1小时，然后用水猝灭。所得混合物用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(80g柱，在15分钟内从0％至50％EtOAc/DCM的梯度)纯化粗产物混合物，得到SEM-二酮5(4.60g，78％产率)。LCMS(M+H)＝545.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.59-7.41(m，2H)，7.40-7.21(m，9H)，5.43(d，J＝9.9Hz，1H)，5.21(s，2H)，5.14(d，J＝15.2Hz，1H)，4.50(d，J＝9.7Hz，1H)，4.41(d，J＝15.2Hz，1H)，4.33-4.16(m，1H)，4.13(d，J＝7.3Hz，1H)，3.92(s，3H)，3.82-3.46(m，3H)，3.06-2.84(m，1H)，1.26(t，J＝7.2Hz，1H)，0.97(ddd，J＝9.9，6.8，2.6Hz，2H)，0.10-0.01(m，9H)。
将SEM-二酮5(4.68g，8.59mmol)和Pd/C(10％，0.457g)在EtOH(10mL)中的悬浮液在H2气球下在室温下搅拌3小时。将反应通过CELITETM垫过滤，用EtOH洗涤，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(120g柱，在15分钟内从0％至100％EtOAc/DCM的梯度)纯化粗产物混合物，得到化合物6(3.23g，83％产率)。LCMS(M+H)＝455.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.40-7.21(m，5H)，5.97(s，1H)，5.46(d，J＝9.7Hz，1H)，5.18(d，J＝15.4Hz，1H)，4.72(d，J＝9.7Hz，1H)，4.58-4.24(m，2H)，3.95(s，3H)，3.83-3.44(m，3H)，3.14-2.88(m，1H)，0.99(t，J＝8.0Hz，2H)，0.14(s，9H)。
实施例2-中间体化合物13
该实施例和图2涉及用于制备本发明二聚体的中间体化合物13的合成。
在0℃将酰氯1溶于THF(30mL)中并滴加到羧酸酯7(Borzilleri等人，WO2014/047024 A1(2014)，1.6g，6.39mmol)和NEt3(2.67mL，19.2mmol)在THF(20mL)中的溶液中。将反应溶液缓慢升温至室温并搅拌30分钟。将反应用水猝灭并浓缩以除去THF。所得混合物用EtOAc(3x)萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(80g柱，在15分钟内从0％至100％EtOAc/己烷的梯度)纯化粗产物混合物，得到乙酯8(2.66g，78％产率)。LCMS(M+H)＝536.4。
将乙酯8(1.75g，3.55mmol)、锌(1.394g，21.32mmol)和NH4Cl(2.281g，42.6mmol)在MeOH(10mL)中的悬浮液在50℃下加热过夜。将反应混合物通过CELITETM垫过滤，用大量20％MeOH的DCM溶液洗涤。将滤液浓缩，得到氨基二酮9，为白色固体(1.25g，2.90mmol，82％产率)。LCMS(M+H)＝430.3 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.26(br.s.，1H)，7.53-7.31(m，6H)，7.24(s，1H)，6.92(d，J＝7.9Hz，1H)，6.78(s，1H)，6.50-6.41(m，2H)，5.07(d，J＝4.6Hz，2H)，5.00-4.88(m，2H)，4.84(d，J＝15.0Hz，1H)，4.09(d，J＝15.0Hz，1H)，4.01(t，J＝6.9Hz，1H)，3.75(s，3H)，3.12(dd，J＝15.3，7.6Hz，1H)，2.78(dd，J＝15.2，6.2Hz，1H)。
向氨基二酮9(1.6g，3.73mmol)和三苯甲基氯(1.246g，4.47mmol)在DCM(10mL)中的溶液中加入NEt3(0.779mL，5.59mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时并浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(80g柱，0-50％EtOAc/己烷)纯化粗产物混合物，得到三苯甲基二酮10，为白色固体(2.2g，3.27mmol，88％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.01(s，1H)，7.50-7.12(m，22H)，6.77(d，J＝8.4Hz，1H)，6.47-6.34(m，2H)，6.16(dd，J＝8.1，2.4Hz，1H)，5.02(br.s.，1H)，4.91(d，J＝15.2Hz，1H)，4.18-4.09(m，2H)，4.05(t，J＝6.9Hz，1H)，3.92(s，3H)，3.28(dd，J＝15.4，7.7Hz，1H)，2.75(dd，J＝15.4，6.4Hz，1H)。
在0℃向三苯甲基二酮10(2.2g，3.27mmol)的DMF(15mL)溶液中加入NaH(在矿物油中的60％分散体，0.236g，3.93mmol)。将混合物搅拌30分钟，然后加入SEM-Cl(0.697ml，3.93mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，然后用盐水猝灭。将反应混合物用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，0-50％EtOAc/己烷)纯化粗产物混合物，得到SEM-二酮11(2.1g，2.62mmol，80％产率)。LCMS(M-三苯甲基)＝560.4 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.48-7.42(m，2H)，7.41-7.32(m，9H)，7.31-7.18(m，11H)，6.77(d，J＝8.1Hz，1H)，6.38(d，J＝2.2Hz，1H)，6.19(dd，J＝8.3，2.3Hz，1H)，5.45(d，J＝9.7Hz，1H)，5.21(s，2H)，5.08-4.92(m，2H)，4.49(d，J＝9.7Hz，1H)，4.13-4.08(m，1H)，4.02(d，J＝15.2Hz，1H)，3.93(s，3H)，3.71(td，J＝9.6，7.0Hz，1H)，3.61(td，J＝9.6，7.2Hz，1H)，3.36(dd，J＝15.5，8.3Hz，1H)，2.72(dd，J＝15.5，6.5Hz，1H)，1.05-0.92(m，2H)，0.06(s，9H)。
将SEM-二酮11(950mg，1.18mmol)和Pd/C(10％，200mg)在EtOAc(20mL)中的悬浮液在H2气球下搅拌2天。将反应混合物通过CELITETM垫过滤，并用EtOAc再用MeOH洗涤。将合并的滤液浓缩并使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，0-100％EtOAc/己烷)纯化，得到化合物12(510mg，1.08mmol，90％产率)。LCMS(M+H)＝470.2 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.33(s，1H)，7.27(s，1H)，7.09(d，J＝8.6Hz，1H)，6.67-6.54(m，2H)，6.02(s，1H)，5.47(d，J＝9.7Hz，1H)，5.11(d，J＝15.2Hz，1H)，4.71(d，J＝9.7Hz，1H)，4.29(d，J＝15.2Hz，1H)，4.22(dd，J＝7.7，6.5Hz，1H)，3.94(s，3H)，3.79-3.60(m，4H)，3.47(dd，J＝15.4，7.7Hz，1H)，2.90(dd，J＝15.5，6.4Hz，1H)，1.09-0.94(m，2H)，0.05(s，9H)。
在0℃向化合物12(500mg，1.065mmol)在THF(3mL)中的溶液中加入NEt3(0.742mL，5.32mmol)。滴加氯甲酸烯丙酯12a(513mg，4.26mmol)。将所得溶液在0℃下搅拌2小时。将反应用MeOH(5mL)稀释，加入LiOH水溶液(2mL，2N)。将所得混合物在室温下搅拌16小时。将反应用EtOAC稀释并用盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。粗产物通过ISCO硅胶色谱法(24g柱，0-10％MeOH/DCM)纯化，得到化合物13，为白色固体(440mg，0.795mmol，74.6％产率)。LCMS(M+H)＝554.2.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.38-7.30(m，3H)，7.27-7.21(m，2H)，6.96(s，1H)，6.28(s，1H)，6.02-5.89(m，1H)，5.44(d，J＝9.8Hz，1H)，5.35(dq，J＝17.2，1.5Hz，1H)，5.26(dq，J＝10.4，1.3Hz，1H)，5.10(d，J＝15.4Hz，1H)，4.70(d，J＝9.8Hz，1H)，4.66(d，J＝5.1Hz，2H)，4.40(d，J＝15.4Hz，1H)，4.31-4.23(m，1H)，3.91(s，3H)，3.79-3.58(m，2H)，3.51(dd，J＝15.6，7.3Hz，1H)，2.96(dd，J＝15.5，6.4Hz，1H)，1.07-0.95(m，2H)，0.03(s，9H)。
实施例3-中间体化合物19
该实施例和图3涉及用作合成本发明二聚体的中间体的化合物19的合成。
在0℃将酰氯1溶于THF(30mL)中并滴加到羧酸酯14(Buchstaller等人，US2007/0191423 A1(2007)，1.6g，5.21mmol)和NEt3(2.9mL，20.8mmol)在THF(20mL)中的溶液中。将反应溶液在0℃下搅拌2小时，然后用水猝灭。所得混合物用EtOAc(3x)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥并真空浓缩。然后将所得混合物吸收到MeOH(50mL)中。加入碳酸钾(1g)。将所得悬浮液在室温下搅拌1小时，然后通过CELITETM垫过滤并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(220g柱，在15分钟内从0％至50％EtOAc/己烷的梯度)纯化粗产物混合物，得到酯15(1.75gg，68％产率)。LCMS(M+H)＝493.1。
将酯15(1.75g，3.55mmol)、锌(1.394g，21.32mmol)和NH4Cl(2.281g，42.6mmol)在MeOH(10mL)中的悬浮液在50℃下加热过夜。然后将反应混合物通过CELITETM垫过滤，用20％MeOH/DCM洗涤。将滤液浓缩，得到化合物16(1.25g，2.90mmol，82％产率)。LCMS(M+H)＝431.3.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.25(br.s.，1H)，9.26(s，1H)，7.53-7.32(m，5H)，7.24(s，1H)，7.07(d，J＝8.1Hz，1H)，6.79(s，1H)，6.71-6.60(m，2H)，5.08(d，J＝4.0Hz，2H)，4.83(d，J＝15.2Hz，1H)，4.22(d，J＝15.4Hz，1H)，4.08(t，J＝6.7Hz，1H)，3.76(s，3H)，3.16(dd，J＝15.4，6.8Hz，1H)，2.85(dd，J＝15.1，6.3Hz，1H)。
向化合物16(1.25g，2.90mmol)的DCM(40mL)溶液中加入对甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS，0.073g，0.290mmol)和四氢吡喃(THP，2.84mL，29.0mmol)。将反应在室温下搅拌过夜，然后用饱和NaHCO3水溶液猝灭。所得混合物用DCM(3x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(40g柱0-100％EtOAc/己烷)纯化粗产物混合物，得到化合物17，为白色固体(1.15g，2.235mmol，77％产率)。LCMS(M+H)＝515.3。
向冷却的化合物17(1.2g，2.332mmol)的DMF(10mL)溶液中加入NaH(在矿物油中的60％分散体，0.168g，2.80mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟，然后升温至室温，搅拌10分钟，然后冷却回到0℃。然后加入SEM-Cl(0.496mL，2.80mmol)。将反应在0℃下搅拌30分钟，然后升温至室温并搅拌1小时。然后将反应用盐水猝灭。所得混合物用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，0-50％EtOAc/己烷)纯化粗产物混合物，得到化合物18(875mg，1.357mmol，58.2％)。LCMS(M+H)＝645.5.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.48-7.41(m，2H)，7.39-7.28(m，4H)，7.24(s，1H)，7.19(d，J＝8.1Hz，1H)，7.02-6.92(m，2H)，5.51-5.32(m，2H)，5.20(s，2H)，5.12(dd，J＝15.3，3.2Hz，1H)，4.50(dd，J＝9.8，1.7Hz，1H)，4.33(dd，J＝15.3，5.2Hz，1H)，4.22(ddd，J＝7.4，6.5，4.3Hz，1H)，3.91(s，4H)，3.76-3.56(m，3H)，3.47(dd，J＝15.4，7.7Hz，1H)，2.92(dd，J＝15.4，6.4Hz，1H)，2.03-1.92(m，1H)，1.88-1.81(m，2H)，1.74-1.57(m，3H)，0.97(ddd，J＝9.7，6.8，2.6Hz，2H)，0.09-0.01(m，9H)。
将化合物18(875mg，1.357mmol)和Pd/C(10％，87mg)在EtOAc(10mL)中的悬浮液在H2气球下搅拌2小时。然后将反应混合物通过CELITETM垫过滤并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，0-100％EtOAc/己烷)纯化粗产物混合物，得到化合物19，为白色固体(485mg，0.874mmol，产率64.4％)。LCMS(M+H)＝555.1.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.33(d，J＝0.7Hz，1H)，7.27(s，1H)，7.22(d，J＝8.1Hz，1H)，7.04-6.95(m，2H)，6.01(s，1H)，5.46(d，J＝9.7Hz，1H)，5.44-5.34(m，1H)，5.16(dd，J＝15.3，2.6Hz，1H)，4.71(dd，J＝9.7，1.8Hz，1H)，4.35(dd，J＝15.3，4.5Hz，1H)，4.25(ddd，J＝7.7，6.4，4.0Hz，1H)，4.01-3.87(m，4H)，3.80-3.59(m，3H)，3.52(dd，J＝15.5，7.8Hz，1H)，2.95(dd，J＝15.5，6.4Hz，1H)，2.05-1.96(m，1H)，1.92-1.82(m，2H)，1.77-1.62(m，3H)，1.06-0.97(m，2H)，0.05(s，9H)。
实施例4-对称THIQ-THIQ二聚体
图4显示了制备对称THIQ-THIQ二聚体的通用方案。连接两个单体半部的桥来源于化合物20a。
基团X5是离去基团，例如I、Br、Cl、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯。基团RX允许桥的结构可变性。本领域技术人员将理解，在某些情况下，RX中的官能团可能需要在合成过程中根据需要进行保护和去保护。示例性基团RX包括：
尽管图4的方案具有一般适用性，但是为了简单起见，THIQ环***中的芳族环已被描述为未取代的。本领域技术人员将理解，它可以具有如上所定义的取代基。
遵循图4的构思，如下合成化合物(IIa-02)。
将化合物6(50mg，0.11mmol)和1，5-二碘戊烷(17.8mg，0.055mmol)和K2CO3(15.2mg，0.11mmol)在DMF(1mL)中的悬浮液在室温下搅拌14小时。然后将反应混合物用H2O稀释并用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(12g柱，在15分钟内从0％至10％MeOH/DCM的梯度)纯化粗产物混合物，得到化合物21，其中每个R9为H(22mg，21％产率)。LCMS(M+H)＝977.8。
在0℃下向上述反应产物(22mg，0.023mmol)的THF/EtOH(1∶1，1mL)溶液中加入THF中的LiBH4溶液(2M，116μL，0.232mmol)。将反应缓慢升温至室温，并搅拌15分钟，然后用盐水猝灭。所得混合物用氯仿萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。然后将粗产物吸收于EtOH/氯仿(1∶1，2mL)中。加入硅胶(700mg)，然后加入水(0.6mL)。将所得悬浮液在室温下搅拌24小时，然后过滤，用10％MeOH/氯仿洗涤。将滤液浓缩并使用反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20×100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA酸的水；梯度：20-70％B，15分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到二聚体(IIa-02)(7.5mg，9.86μmol，43.8％产率)LCMSM+H＝685.2.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.55(s，2H)，7.49(d，J＝5.3Hz，2H)，7.42-7.31(m，8H)，6.82(s，2H)，5.03(d，J＝15.6Hz，2H)，4.58(d，J＝15.4Hz，2H)，4.26-4.04(m，4H)，4.00-3.92(m，8H)，3.37-3.25(m，2H)，3.21-3.10(m，2H)，2.02-1.90(m，4H)，1.70(d，J＝7.3Hz，2H)。
按照图4的一般方案，合成了另外的对称THIQ-THIQ二聚体：
(a)化合物6和1，3-二溴丙烷的二聚体(IIa-01)：LCMS M+H＝657.2.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.55(s，2H)，7.49(d，J＝5.3Hz，2H)，7.42-7.30(m，8H)，6.87(s，2H)，5.03(d，J＝15.6Hz，2H)，4.58(d，J＝15.4Hz，2H)，4.31(tdd，J＝9.6，6.1，3.6Hz，4H)，3.95(s，6H)，3.94(s，2H)，3.37-3.24(m，2H)，3.21-3.10(m，2H)，2.44(t，J＝6.1Hz，2H)。
(b)化合物6和1-碘-2-(2-碘乙氧基)乙烷的二聚体(IIa-07)：LCMS M+H＝687.2.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.55(s，2H)，7.49(d，J＝5.3Hz，2H)，7.40-7.31(m，8H)，6.86(s，2H)，5.02(d，J＝15.4Hz，2H)，4.58(d，J＝15.4Hz，2H)，4.36-4.18(m，4H)，4.07-4.00(m，4H)，3.97-3.92(m，8H)，3.35-3.24(m，2H)，3.22-3.12(m，2H)。
(c)化合物13和1，5-二碘戊烷的二聚体(IIa-08)：LCMS M+H＝883.3.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.55(s，2H)，7.49(d，J＝5.3Hz，2H)，7.44-7.33(m，6H)，6.81(s，2H)，6.69(s，2H)，6.00(dd，J＝17.1，10.5Hz，2H)，5.40(dd，J＝17.3，1.4Hz，2H)，5.30(dd，J＝10.5，1.2Hz，2H)，5.01(d，J＝15.6Hz，2H)，4.71(d，J＝5.5Hz，4H)，4.53(d，J＝15.6Hz，2H)，3.96(s，6H)，3.31-3.19(m，2H)，3.17-3.06(m，2H)，1.97(br.s.，4H)，1.75-1.66(m，2H)。
实施例5-化合物(IIa-05)
该实施例和图4a涉及化合物(IIa-05)((6aS，6a′S)-3，3′-(((5-氨基-1，3-亚苯基)双(亚甲基))双(氧基))双(2-甲氧基-6a，7-二氢苯并[5，6][1，4]二氮杂并[1，2-b]异喹啉-14(12H)-酮))的合成，再次按照图4的一般合成方案，但需要保护-去保护循环，如下所示：
将5-硝基-间二甲苯-α，α-二醇24a(Aldrich，1g，5.46mmol)和Pd/C(291mg，0.273mmol)在MeOH(50mL)中的悬浮液在H2气球下室温下搅拌2小时。将反应通过CELITETM过滤，真空浓缩。粗制的5-氨基-1，3-亚苯基)二甲醇24b不经进一步纯化用于下一步骤。LCMS(M+H)＝154。
在0℃向二甲醇24b(600mg，3.92mmol)、K2CO3(650mg，4.7mmol)的THF(10mL)悬浮液中加入氯甲酸烯丙酯12a(0.5mL，4.7mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，然后升温至室温，并在室温下搅拌3小时。然后将反应用水猝灭并用EtOAc萃取(2x)。将有机层干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，在15分钟内从0％至100％EtOAC/DCM的梯度)纯化粗产物，得到氨基甲酸烯丙酯24c(200mg，21.5％产率)。LCMS(M+23)＝261.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.31(s，2H)，6.91(s，1H)，5.99(ddt，J＝17.2，10.6，5.4Hz，1H)，5.36(dq，J＝17.2，1.6Hz，1H)，5.24(dq，J＝10.6，1.4Hz，1H)，5.13(t，J＝5.7Hz，2H)，4.60(dt，J＝5.4，1.3Hz，2H)，4.44(d，J＝5.5Hz，4H)。
将上述氨基甲酸烯丙酯(462.5mg，1.949mmol)和三乙胺(0.815mL，5.85mmol)在DCM(20mL)中的悬浮液冷却至-10℃，用甲磺酰氯(Ms-Cl，0.395mL，5.07mmol)处理。将有机层用冰冷水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到二甲磺酸酯24d(750mg，95％产率)。LCMS(M+H)＝394.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.52(s，2H)，7.15(s，1H)，7.04(s，1H)，6.09-5.87(m，1H)，5.39(dd，J＝17.2，1.5Hz，1H)，5.29(dd，J＝10.3，1.3Hz，1H)，5.21(s，4H)，4.69(dt，J＝5.7，1.2Hz，2H)，3.02(s，6H)。
在室温下，用化合物6(312mg，0.686mmol)和K2CO3(142mg，1.029mmol)处理二甲磺酸酯24d(135mg，0.343mmol)的二甲基亚砜(DMSO，16mL)溶液2小时。将反应用水猝灭并用EtOAc(3x)萃取。将混合物干燥并真空浓缩。将粗产物通过ISCO硅胶色谱法(40g柱，15分钟内从0％至100％EtOAc/己烷的梯度)纯化，得到氨基甲酸酯24e(250mg，66％产率)。LCMS(M+1)＝1110.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.51(s，2H)，7.38-7.13(m，14H)，6.96-6.75(m，1H)，6.12-5.86(m，1H)，5.48(d，J＝10.1Hz，2H)，5.43-5.32(m，1H)，5.32-5.23(m，1H)，5.23-4.99(m，6H)，4.74-4.53(m，4H)，4.41(d，J＝15.2Hz，2H)，4.30(d，J＝0.9Hz，2H)，3.96-3.83(m，6H)，3.81-3.46(m，6H)，2.98(s，2H)，1.14-0.85(m，4H)，0.13-0.08(m，18H)。
在0℃向氨基甲酸酯24e(200mg，0.180mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入Pd(Ph3P)4(8.33mg，7.20μmol)和吗啉(0.038mL，0.432mmol)。将反应在0℃下搅拌2小时。将反应混合物用饱和氯化铵水溶液(5mL)猝灭，并用EtOAc(10mL)萃取。有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后用饱和NaCl水溶液洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，在15分钟内从0％至10％甲醇/DCM的梯度)纯化粗产物，得到化合物24f(160mg，87％产率)。LCMS(M+1)＝1026.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.38-7.30(m，6H)，7.28(d，J＝5.1Hz，7H)，6.92-6.85(m，1H)，6.76(d，J＝1.1Hz，2H)，5.47(d，J＝10.1Hz，2H)，5.18(d，J＝15.2Hz，2H)，5.08(d，J＝8.6Hz，4H)，4.65(d，J＝10.1Hz，2H)，4.42(d，J＝15.4Hz，2H)，4.30(d，J＝0.9Hz，2H)，3.92(s，6H)，3.82-3.50(m，8H)，3.09-2.94(m，2H)，1.11-0.88(m，4H)，0.10-0.03(m，18H)。
向0℃的化合物24f(22mg，0.021mmol)在THF(233μL)和EtOH(233μL)中的溶液中加入LiBH4(214μL，0.429mmol，2M的THF溶液)溶液。将反应缓慢升温至室温，并在室温下搅拌2小时。反应用水猝灭，用氯仿(2x)萃取，然后用氯仿/MeOH(2x)萃取。将合并的有机萃取物用Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物溶于氯仿/EtOH/水(1∶1∶1，2mL)中，加入硅胶(0.7g)，将反应在室温下搅拌3天。将反应混合物通过CELITETM塞过滤，用氯仿洗涤，浓缩溶液。残余物通过反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20×100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：20-80％B，20分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到二聚体(IIa-05)，分离为浅黄色固体(8.1mg，产率46.3％)。LCMS(M+1)＝734.1H NMR(400MHz，氯仿-d)d 7.57(s，1H)，7.47(d，J＝5.3Hz，1H)，7.43-7.30(m，4H)，6.99-6.79(m，1H)，6.73(s，1H)，5.40-4.90(m，4H)，4.59(d，J＝15.4Hz，1H)，4.17-3.85(m，4H)，3.39-3.05(m，2H)。
实施例6-亚胺双键的还原
该实施例描述了有一个或两个亚胺键被还原的各种THIQ-THIQ二聚体的制备。
在本实施例的第一部分中，制备的二聚体为(IIa-03)和(IIa-04)。
在0℃向二聚体(IIa-01)(6mg，9.14μmol)在THF(0.7mL)中的溶液中加入NaBH4(0.691mg，0.018mmol)。将所得混合物搅拌40分钟，然后用水猝灭。混合物用氯仿(3x)萃取。合并有机层并真空浓缩。通过反相HPLC分离二聚体(IIa-03)(LCMS(M+1)：659.1)和(IIa-04)(LCMS(M+1)：661.1)(柱：Phenomenex Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：15-60％B，20分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)。
在本实施例的下一部分中，制备(6aS，6a′S)-3，3′-(戊烷-1，5-二基双(氧基))双(2-甲氧基-5，6，6a，7-四氢苯并[5，6][1，4]二氮杂并[1，2-b]异喹啉-14(12H)-酮)(IIa-06)：向二聚体(IIa-02)(28mg，0.041mmol)在THF/MeOH(1∶1，1mL)中的溶液中加入NaBH4(1.548mg，0.041mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。加入第二批NaBH4(1.548mg，0.041mmol)，并将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应用水猝灭并用DCM萃取。将合并的有机层浓缩并使用反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：20-80％B，20分钟；流速：20mL/min；检测：220nm的UV)，得到化合物(IIa-06)(4.2mg，5.49μmol，产率13.41％；LCMS(M+1)：689.2)。
实施例7-不对称THIQ-THIQ二聚体
该实施例涉及不对称THIQ-THIQ二聚体的合成。图5显示了其合成的一般方案。图中的基团RE和RE’可以是如上所定义的各种取代基。
该实施例的第一部分涉及二聚体(S)-10-羟基-2-甲氧基-3-((5-(((S)-2-甲氧基-14-氧代-6a，7，12，14-四氢苯并[5，6][1，4]二氮杂并[1，2-b]异喹啉-3-基)氧基)戊基)氧基)-6a，7-二氢苯并[5，6][1，4]二氮杂并[1，2-b]异喹啉-14(12H)-酮(IIa-15)的合成，按以下反应方案进行：
向化合物6(250mg，0.550mmol)和K2CO3(304mg，2.200mmol)在DMSO(5mL)中的悬浮液中加入1，5-二碘戊烷(891mg，2.75mmol)。将反应在室温下搅拌2小时，然后用EtOAc稀释并用盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(12g柱，0-10％MeOH/DCM的梯度)纯化粗产物，得到化合物6a，为黄色油状物(275mg，0.423mmol，77％产率)。LCMS：(M+H)＝651.2 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.33-7.24(m，5H)，7.21(s，1H)，5.50(d，J＝9.9Hz，1H)，5.15(d，J＝15.4Hz，1H)，4.66(d，J＝9.9Hz，1H)，4.41(d，J＝15.4Hz，1H)，4.33-4.25(m，1H)，4.05(d，J＝8.6Hz，2H)，3.89(s，3H)，3.80(td，J＝9.6，6.9Hz，1H)，3.72-3.62(m，1H)，3.56(dd，J＝15.5，7.4Hz，1H)，3.22(t，J＝6.9Hz，2H)，3.00(dd，J＝15.6，6.4Hz，1H)，1.98-1.80(m，4H)，1.67-1.54(m，2H)，0.98(ddd，J＝9.8，6.7，2.9Hz，2H)，0.04(s，9H)。
向化合物6a(135mg，0.208mmol)和化合物19(110mg，0.198mmol)在DMSO(3mL)中的溶液中加入K2CO3(82mg，0.595mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌5小时。然后将反应用EtOAc稀释并用水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。将残余物吸收于MeOH(10mL)中。加入PPTS(～15mg)，将反应在40℃下搅拌1小时。然后将反应浓缩并使用ISCO硅胶色谱法(0-100％EtOAc/己烷，24g柱)纯化，得到化合物6b(141mg，0.142mmol，71.6％产率)。LCMS(M+H)＝993.7.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.36-7.29(m，4H)，7.27-7.24(m，1H)，7.23-7.10(m，4H)，6.94(d，J＝2.2Hz，1H)，6.79(dd，J＝8.1，2.4Hz，1H)，5.51(t，J＝9.6Hz，2H)，5.18(dd，J＝19.4，15.2Hz，2H)，4.69(dd，J＝9.9，7.5Hz，2H)，4.42(d，J＝15.4Hz，1H)，4.37-4.26(m，2H)，4.22(dd，J＝7.7，6.6Hz，1H)，4.09-4.00(m，3H)，3.88(d，J＝2.6Hz，6H)，3.80(dd，J＝7.0，4.6Hz，2H)，3.68(dd，J＝6.8，5.1Hz，2H)，3.60-3.43(m，2H)，3.10-2.82(m，2H)，2.00-1.87(m，4H)，1.69(br.s.，2H)，0.98(td，J＝6.6，3.3Hz，4H)，0.10-0.02(m，18H)。
在-78℃向化合物6b(18mg，0.018mmol)在THF(0.6mL)中的溶液中加入三乙基硼氢化锂溶液(1M的THF溶液，362μL，0.362mmol)。将反应在-78℃下搅拌1小时，然后用水(1mL)猝灭。然后用氯仿(3x)萃取反应。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。然后将残余物吸收于氯仿/EtOH(1∶1，2mL)。加入硅胶(0.8g)，然后加入水(0.6mL)。将所得悬浮液在室温下搅拌1天，然后过滤，用10％MeOH/氯仿洗涤。将滤液真空浓缩并使用反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％三氟乙酸的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：20-80％B，20分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到二聚体(IIa-15)(4.8mg，6.16μmol，产率34.0％)。LCMS(M+H)＝701.2。
由化合物6b合成二聚体(S)-2，10-二甲氧基-3-((5-(((S)-2-甲氧基-14-氧代-6a，7，12，14-四氢苯并[5，6][1，4]二氮杂并[1，2-b]异喹啉-3-基)氧基)戊基)氧基)-6a，7-二氢苯并[5，6][1，4]二氮杂[1，2-b]异喹啉-14(12H)-酮(IIa-12)如下进行。使用K2CO3将化合物6b用碘甲烷烷基化，得到相应的甲氧基产物。
LCMS(M+H)＝1007.6。总体上按照上述程序用LiEt3BH还原，得到二聚体(IIa-12)。LCMS(M+H)＝715.3 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.55(d，J＝1.6Hz，2H)，7.50(d，J＝5.3Hz，2H)，7.41-7.30(m，5H)，6.94-6.86(m，2H)，6.81(m，1H)，5.01(t，J＝14.9Hz，2H)，4.67-4.47(m，2H)，4.24-4.01(m，5H)，3.96(s，6H)，3.86(s，3H)，3.34-3.02(m，4H)，2.02-1.88(m，4H)。
按照上述程序，经必要修改，合成了另外的不对称THIQ-THIQ二聚体：
(a)(IIa-13)：LCMS(M+H)＝758.3.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.55(d，J＝2.2Hz，2H)，7.49(dd，J＝5.3，3.4Hz，2H)，7.42-7.33(m，5H)，6.95-6.89(m，2H)，6.86-6.77(m，2H)，6.54(br.s.，1H)，5.57(br.s.，1H)，5.02(dd，J＝15.5，10.9Hz，2H)，4.62-4.56(m.，2H)，4.20-4.02(m，6H)，3.96(s，3H)，3.96(s，3H)，3.90-3.84(m，3H)，3.31-3.05(m，5H)，1.96(m，4H)。
(b)(IIa-14)：LCMS(M+H)＝803.3。
(c)(IIa-17)：LCMS(M+H)＝745.2。
实施例8-具有不对称桥的二聚体
该实施例和图6说明了制备二聚体的合成策略，其中连接两个二聚体半部的桥不是双侧对称的。关于二聚体(IIa-09)作具体说明。
向(2-羟乙基)氨基甲酸苄酯29(Aldrich，0.781g，4mmol)和NEt3(1.115mL，8.00mmol)的溶液中加入对甲苯磺酰氯(TsCl，0.915g，4.80mmol)。将反应在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩并使用ISCO硅胶色谱法(0-100％EtOAC/HEx，40g柱)纯化，得到甲苯磺酸酯30(0.85g，2.43mmol，60.8％产率)。LCMS(M+H)＝350。
向化合物6(160mg，0.352mmol)和甲苯磺酸酯30(135mg，0.387mmol)的DMF(3mL)溶液中加入K2CO3(97mg，0.704mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌2小时。将反应用EtOAc稀释，依次用LiCl水溶液和盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM，24g柱)纯化粗物质，得到化合物31。LCMS(M+H)＝632.3。
将化合物31和10％Pd/C(25mg)在MeOH(8mL)中的悬浮液在H2气球下搅拌5小时。然后将反应用N2吹扫，通过CELITETM垫过滤，浓缩，得到化合物32(150mg，0.301mmol，86％产率)。LCMS(M+H)＝498 1H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.65(d，J＝8.2Hz，1H)，7.38-7.23(m，4H)，7.21(s，1H)，7.07(d，J＝7.9Hz，1H)，6.90-6.64(m，3H)，5.41(d，J＝10.2Hz，1H)，5.14(d，J＝15.3Hz，1H)，4.76(d，J＝10.1Hz，1H)，4.44-4.33(m，2H)，4.32-4.17(m，3H)，3.80(s，3H)，3.72-3.50(m，4H)，3.39-3.30(m，2H)，3.05-2.93(m，1H)，0.98-0.87(m，2H)，0.00(s，9H)。
在0℃下向化合物32(65mg，0.131mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入NEt3(0.055mL，0.39mmol)和2-氯乙酰氯32a(22.13mg，0.196mmol)。将溶液搅拌1小时，然后用DCM稀释。有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物与化合物6(59.4mg，0.131mmol)和K2CO3(4.2mg，0.392mmol)合并，并悬浮于DMSO(1mL)中。将所得混合物在50℃下加热4小时。冷却至室温后，将反应用EtOAc稀释并用盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM，24g柱)纯化粗物质，得到乙酰胺33(95mg，0.096mmol，73.3％产率)。LCMS(M+H)＝992.5。
在-78℃向乙酰胺33(40mg，0.040mmol)在THF(0.6mL)中的溶液中加入LiEt3BH(0.4mL，1M的THF溶液)溶液。然后将反应在-78℃下搅拌1小时，然后用水(1mL)猝灭。然后将反应混合物用氯仿(3x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。然后将残余物吸收于氯仿/EtOH(1∶1，2mL)中。加入硅胶(0.8g)，然后加入水(0.6mL)。将所得悬浮液在室温下搅拌1天，然后过滤，用10％MeOH/氯仿洗涤。将滤液真空浓缩并使用反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈∶含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈∶含有0.1％TFA的水；梯度：15-70％B，15分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到二聚体(IIa-09)(11mg，0.014mmol，产率35.1％)。LCMS(M+H)＝700.2 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.57(d，J＝9.5Hz，2H)，7.48(dd，J＝5.3，0.9Hz，2H)，7.40-7.31(m，9H)，6.83(d，J＝4.0Hz，2H)，5.01(d，J＝15.6Hz，2H)，4.64-4.51(m，4H)，4.20(td，J＝9.4，5.0Hz，2H)，3.96(s，3H)，3.95(s，3H)，3.91-3.82(m，4H)，3.34-3.23(m，2H)，3.20-3.11(m，2H)。
实施例9-THIQ-PBD二聚体
图5的一般方案可用于制备THIQ-PBD二聚体，其中两个THIQ单体单元之一被PBD单体单元代替。首先可以将THIQ单体单元烷基化，然后连接PBD单体单元，反之亦然。
该实施例和图7a和7b示出了THIQ-PBD二聚体的合成，特别是关于二聚体(IIb-01)和(IIb-02)。
首先描述二聚体(IIb-01)的制备。合成方案总结在图7a中，并举例说明了首先将THIQ烷基化的方法。
将化合物6a(上述实施例7，50mg，0.077mmol)、K2CO3(31.9mg，0.231mmol)和二酮35(CAS Reg.No.132391-70-9，Howard等人，2014c，40.3mg，0.154mmol)在DMF(1.5mL)中的悬浮液在50℃下加热2小时。将反应冷却至室温并用水猝灭。所得混合物用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(24g柱，0-10％MeOH/DCM)纯化粗物质，得到化合物36。LCMS(M+H)＝785.4。
将化合物36溶于DMF(0.5mL)中。将溶液冷却至0℃，然后依次加入NaH(矿物油中的60％分散体，3.07mg，0.077mmol)和SEM-Cl(0.014mL，0.077mmol)。将反应升温至室温并搅拌2小时。然后将反应用水猝灭，用EtOAc萃取，用Na2SO4干燥，真空浓缩。将粗化合物37不经进一步纯化用于下一步骤(14mg，0.015mmol，20％产率)。LCMS(M+H)＝915.7。
在0℃下，向粗制的化合物37(14mg，0.015mmol)在THF/EtOH(1∶1，1mL)中的溶液中加入LiBH4(101μl，0.202mmol，2M的THF溶液)溶液。将反应缓慢升温至室温，并搅拌15分钟，然后用盐水猝灭。所得混合物用CHCl3(3x)萃取。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。然后将残余物吸收于EtOH/氯仿(1∶1，2mL)中。加入硅胶(700mg)，然后加入水(0.6mL)。将所得悬浮液在室温下搅拌1天，然后过滤，用10％MeOH/CHCl3洗涤。将滤液浓缩并通过反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90CH3CN∶含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈∶含有0.1％TFA的水；梯度：15-60％B，20分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到(IIb-01)(0.92mg，1.330μmol，8.69％产率)。LCMS(M+H)＝623.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.69(d，J＝4.4Hz，1H)，7.57-7.53(m，2H)，7.50(d，J＝5.1Hz，1H)，7.41-7.32(m，4H)，6.82(d，J＝1.5Hz，2H)，5.03(d，J＝15.6Hz，1H)，4.59(d，J＝15.6Hz，1H)，4.18-4.06(m，4H)，3.97(s，3H)，3.96(s，3H)，3.75(d，J＝7.3Hz，4H)，3.61(dt，J＝11.8，7.8Hz，1H)，3.34-3.26(m，1H)，3.22-3.15(m，1H)，2.34(br.s.，2H)，2.11-2.06(m，1H)，2.01-1.94(m，4H)，1.71-1.66(m，2H)。
现在阐述二聚体(IIb-02)的合成，合成方案总结在图7b中。在该例中，首先将PBD单体单元烷基化，然后与THIQ单体单元结合。
向化合物9(220mg，0.512mmol)在MeOH(3mL)和THF(3mL)中的溶液中加入甲醛(37％水溶液，0.572mL，7.68mmol)和几滴乙酸。将溶液在室温下搅拌10分钟，然后加入Na(CN)BH3(129mg，2.049mmol)。然后将反应在室温下搅拌2小时，然后真空浓缩。将粗物质使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM，24g柱)纯化，得到化合物38a(230mg，0.503mmol，98％产率)。LCMS(M+H)＝458。
在0℃向化合物38a(230mg，0.503mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入NaH(在矿物油中的60％分散体，25.1mg，0.628mmol)。将混合物搅拌15分钟，然后加入SEM-Cl(0.111mL，0.628mmol)。将反应缓慢升温至室温并搅拌过夜。然后将反应用水猝灭并用EtOAc萃取(3x)。将合并的有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM)纯化粗物质，得到化合物38b。LCMS(M+H)＝588.2。
将化合物38b与10％Pd/C(20mg)混合并悬浮于EtOH/EtOAc(1∶1，10mL)中。将混合物用N2吹扫，然后在H2气球下搅拌4小时。然后将反应通过CELITETM垫过滤并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM，40g柱)纯化粗物质，得到化合物38c(190mg，0.382mmol，产率76％)。LCMS(M+H)＝498.2。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.45(s，1H)，7.21(s，1H)，7.18-7.10(m，1H)，6.69(m.，2H)，5.51(d，J＝9.9Hz，1H)，5.12(d，J＝15.2Hz，1H)，4.65(d，J＝10.1Hz，1H)，4.33(d，J＝15.2Hz，1H)，4.24(d，J＝0.4Hz，1H)，3.91(s，3H)，3.79(s，1H)，3.72-3.63(m，1H)，3.52-3.40(m，1H)，2.93(s，6H)，1.05-0.89(m，2H)，0.03(s，9H)。
化合物38d总体上按照上述程序制备。LCMS(M+H)＝393.4.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.38(s，1H)，7.27(s，1H)，6.34(s，1H)，5.46(d，J＝9.8Hz，1H)，4.70(d，J＝9.8Hz，1H)，4.19-4.06(m，1H)，3.96(s，3H)，3.80-3.60(m，3H)，3.60-3.53(m，1H)，3.50(d，J＝2.9Hz，2H)，2.78-2.68(m，1H)，2.19-1.95(m，3H)，1.05-0.96(m，2H)，0.08-0.02(m，9H)。
向化合物38d(1.2g，3.06mmol)在DMF(10mL)中的溶液中加入K2CO3(1.268g，9.17mmol)和1，5-二碘戊烷(5.94g，18.34mmol)。将反应在室温下搅拌2小时，然后用水猝灭。所得混合物用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(24g柱，0-10％MeOH/DCM)纯化粗产物，得到化合物38e(1.52g，2.58mmol，84％产率)。LCMS(M+H)＝589.1。
向化合物38e(22.12mg，0.038mmol)和化合物38c(17mg，0.034mmol)在DMSO(1mL)中的溶液中加入K2CO3(9.44mg，0.068mmol)。将所得混合物在室温下搅拌14小时。然后将反应用EtOAc稀释并依次用水和盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM，24g柱)纯化粗产物，得到化合物38f(27mg，0.028mmol，82％产率)。LCMS(M+H)＝958.3。
化合物38f总体上按照上述程序通过还原转化成二聚体(IIb-02)。LCMS(M+H)＝666.2.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.68(d，J＝4.4Hz，1H)，7.54(d，J＝1.8Hz，2H)，7.52(d，J＝5.3Hz，1H)，7.23(d，J＝8.8Hz，1H)，6.82(d，J＝1.8Hz，2H)，6.73-6.65(m，2H)，4.97(d，J＝15.4Hz，1H)，4.53(d，J＝15.4Hz，1H)，4.29-4.03(m，4H)，3.96(s，3H)，3.92(s，3H)，3.84(ddd，J＝11.7，7.1，4.5Hz，1H)，3.78-3.72(m，1H)，3.66-3.56(m，1H)，3.28-3.17(m，1H)，3.06(dd，J＝15.4，4.2Hz，1H)，3.01-2.95(m，6H)，2.34(td，J＝6.7，3.0Hz，2H)，2.16-1.90(m，6H)，1.78-1.62(m，3H)。
实施例10-THIQ-THIQ二聚体(IIa-10)和(IIa-11)
该实施例和图8涉及二聚体(IIa-10)和(IIa-11)的制备。
向化合物6a(100mg，0.154mmol)和化合物13(68mg，0.123mmol)的DMSO(3mL)溶液中加入K2CO3(50.9mg，0.368mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌5小时。然后将反应用EtOAc稀释，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM，12g柱)纯化粗物质，得到氨基甲酸酯39(124mg，0.115mmol，94％产率)。LCMS(M+H)＝1076.3.1HNMR(400MHz，氯仿-d)δ7.30(d，J＝0.9Hz，6H)，7.27-7.18(m，5H)，6.89(s，1H)，6.01-5.88(m，1H)，5.49(dd，J＝9.9，4.0Hz，2H)，5.34(dd，J＝17.3，1.4Hz，1H)，5.25(dd，J＝10.3，1.1Hz，1H)，5.18-5.04(m，2H)，4.71-4.62(m，4H)，4.40(d，J＝15.4Hz，2H)，4.32-4.22(m，2H)，4.09-3.97(m，4H)，3.90-3.84(m，6H)，3.82-3.73(m，2H)，3.71-3.44(m，5H)，3.08-2.90(m，2H)，1.99-1.90(m，4H)，1.04-0.91(m，4H)，0.02(s，9H)，0.02(s，9H)。
在0℃向氨基甲酸酯39(124mg，0.115mmol)在DCM(6mL)中的溶液中加入吗啉(0.080mL，0.922mmol)。用N2吹扫反应后，加入Pd(Ph3P)4(13.31mg，0.012mmol)。将反应缓慢升温至室温，在N2下搅拌2小时。然后将反应浓缩并使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM)纯化，得到相应的苯胺化合物(90mg，0.091mmol，79％产率)。LCMS(M+H)＝992.5。
在-78℃向前述苯胺化合物(89mg，0.090mmol)在THF(3mL)中的溶液中加入LiEt3BH(1M，在THF中，0.448mL，0.448mmol)。将反应在-78℃下搅拌1小时。然后将反应用水(1mL)猝灭并用氯仿(3x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。然后将残余物吸收于氯仿/EtOH(1∶1，2mL)中。加入硅胶(0.7g)，然后加入水(0.6mL)。将所得悬浮液在室温下搅拌1天，然后过滤，用10％MeOH/氯仿洗涤。将滤液浓缩并在HPLC上纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈∶含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈∶含有0.1％TFA的水；梯度：20-70％B，20分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到二聚体(IIa-10)(19mg，0.024mmol，产率27.2％)。LCMS(M+H)＝700.2 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.54(d，J＝2.4Hz，2H)，7.50(t，J＝4.7Hz，2H)，7.41-7.31(m，5H)，7.15(d，J＝8.6Hz，1H)，6.81(d，J＝1.8Hz，2H)，6.73-6.59(m，2H)，5.02(d，J＝15.6Hz，1H)，4.92(d，J＝15.4Hz，1H)，4.58(d，J＝15.6Hz，1H)，4.47(d，J＝15.4Hz，1H)，4.22-4.03(m，3H)，4.00-3.70(m，9H)，3.34-3.25(m，1H)，3.18(dt，J＝15.4，4.2Hz，2H)，3.09-3.00(m，1H)，2.03-1.92(m，4H)，1.76-1.63(m，2H)。
向二聚体(IIa-10)(4.5mg，6.43μmol)、Fmoc-GLY-OH(Chem-Impex，3.82mg，0.013mmol)和N，N，N′，N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并***-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HATU，4.89mg，0.013mmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA，3.37μL，0.019mmol)。将反应在室温下搅拌4小时，然后加入哌啶(100uL)。将所得混合物在室温下搅拌1小时。然后将粗反应混合物用DMF稀释，过滤并在反相HPLC上纯化(柱：Phenomenex LunaC18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈∶含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈∶含有0.1％TFA的水；梯度：20-70％B，20分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到二聚体(IIa-11)(0.94mg，1.180μmol，产率18.35％)。LCMS(M+H)＝757.2。
实施例11-THIQ-PBD二聚体(IIb-03)
该实施例和图9涉及THIQ-PBD二聚体(IIb-03)的制备。
化合物41总体上按照前述实施例的程序制备。LCMS(M+H)＝409.1 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.32(s，1H)，7.25(s，1H)，6.30(s，1H)，5.45(d，J＝9.7Hz，1H)，4.71(d，J＝9.8Hz，1H)，4.65(br.s.，1H)，4.30(dd，J＝7.9，5.9Hz，1H)，4.00-3.84(m，4H)，3.79-3.57(m，3H)，2.97(dt，J＝13.5，5.5Hz，1H)，2.86(br.s.，1H)，2.21-2.08(m，1H)，1.00(t，J＝8.4Hz，2H)，0.03(s，9H)。
向二酮41(500mg，1.224mmol)在DMSO(3mL)中的溶液中加入1，3-二溴丙烷42(1730mg，8.57mmol)和K2CO3(423mg，3.06mmol)。将反应在室温下搅拌3小时。然后将反应用水猝灭并用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法纯化粗产物(0-10％MeOH/DCM，40g柱)，得到溴丙氧基PBD 43(540mg，0.918mmmol，75％)，为白色泡沫。LCMS(M+H)＝531.2。
向总体上按照上述实施例的程序制备的THIQ单体19(100mg，0.180mmol)和溴丙氧基PBD 43(117mg，0.198mmol)在DMSO(2mL)中的溶液中加入K2CO3(62.3mg，0.451mmol)。将混合物在室温下搅拌16小时。然后将反应用EtOAc稀释并依次用水和盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥并浓缩。将所得混合物吸收于MeOH(10mL)中，并加入PPTS(20mg)。将反应在40℃下搅拌1小时。将反应浓缩，吸收于EtOAc中，用NaHCO3水溶液洗涤，然后用盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-20％EtOAc/己烷，24g柱)纯化粗产物，得到化合物45(150mg，0.163mmol，91％产率)。LCMS：(M+H)＝919.3。
向化合物45(150mg，0.163mmol)的DMSO(2mL)溶液中加入K2CO3(67.7mg，0.490mmol)和碘甲烷(46.3mg，0.326mmol)。将混合物在室温下搅拌16小时。然后将反应用EtOAc稀释并用水洗涤。将有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。粗产物46不经进一步纯化即用于下一步骤。LCMS(M+H)＝933.5。
向0℃的粗品46(150mg，0.161mmol)在DCM(804μL)和DMSO(804μL)中的溶液中加入三乙胺(112μl，0.804mmol)，然后加入三氧化硫吡啶络合物(51.2mg，0.321mmol)。将反应升温至室温并搅拌16小时。然后将反应用DCM(30mL)稀释，依次用饱和NH4Cl水溶液(10mL)、H2O(2×10mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗物质通过ISCO硅胶快速色谱法(24g柱；0-100％EtOAc-CH2Cl2的梯度)纯化，得到酮47(112mg，0.084mmol，52.4％产率)。LCMS(M+H)＝930.5。
向酮47(112mg，0.120mmol)的DCM(2mL)溶液中加入2，6-二甲基吡啶(0.028mL，0.241mmol)。然后将溶液冷却至-78℃。然后滴加三氟甲磺酸酐(0.030mL，0.180mmol)。将反应缓慢升温至0℃并搅拌2小时。然后将反应用盐水猝灭并用DCM萃取。分离有机层，用Na2SO4干燥，真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM，24g柱)纯化粗产物，得到三氟甲磺酸酯48(81mg，0.076mmol，产率63.3％)。LCMS(M+H)＝1062。
向具有螺帽顶部的小瓶中加入三氟甲磺酸酯48(81mg，0.076mmol)、4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯胺48a(20.03mg，0.091mmol)和[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯合钯(II)(2.79mg，3.81μmol)。将小瓶抽空并用N2回填。加入THF(2mL)和K3PO4水溶液(1M，0.38μl，0.38mmol)。将混合物在N2下在45℃下搅拌2小时。将反应用EtOAc稀释并用盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。使用ISCO硅胶快速色谱法(12g柱；线性梯度0-100％EtOAc-Hex)纯化粗物质，得到化合物49(53mg，0.053mmol，69.1％产率)。LCMS(M+H)＝1006.3.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.41(s，1H)，7.33(s，1H)，7.29-7.20(m，6H)，6.91-6.80(m，2H)，6.68(d，J＝8.6Hz，2H)，5.51(dd，J＝11.9，10.0Hz，2H)，5.13(d，J＝15.4Hz，1H)，4.75(dd，J＝16.8，10.0Hz，2H)，4.60(dd，J＝10.6，3.4Hz，1H)，4.39(d，J＝15.3Hz，1H)，4.33-4.21(m，5H)，3.93(s，3H)，3.89(s，3H)，3.82(s，3H)，3.80-3.74(m，3H)，3.69(tdd，J＝9.5，7.2，5.0Hz，2H)，3.51(dd，J＝15.5，7.5Hz，1H)，3.12(ddd，J＝16.1，10.6，2.1Hz，1H)，3.03-2.87(m，1H)，2.44(t，J＝5.9Hz，2H)，1.03-0.92(m，4H)，0.04(s，9H)，0.03(s，9H)。
在-78℃向化合物49(7mg，6.96μmol)在THF(1mL)中的溶液中滴加三乙基硼氢化锂(0.070mL，0.070mmol，1M的THF溶液)溶液。将反应在-78℃下搅拌1小时，然后用盐水猝灭。混合物用10％MeOH/氯仿(3x)萃取。将合并的有机层用Na2SO4干燥，真空浓缩。将残余物吸收于THF/EtOH(1∶1，2mL)中。加入甲酸水溶液(0.05％，1mL)。然后将反应在室温下搅拌2小时。混合物用NaHCO3水溶液中和，用氯仿(3x)萃取。将合并的有机层浓缩并使用ISCO硅胶快速色谱法(0-6％MeOH/DCM，4g柱)纯化，得到二聚体(IIb-03)(2.1mg，2.65μmol，产率38.1％)。LCMS(M+H)＝714.0。
实施例12-二聚体(IIa-16)和(IIa-18)
该实施例和图10和11涉及在连接二聚体的两个半部的桥中具有胺基团的二聚体的合成，该胺基团是用于连接连接体的合适的官能团。(参见上文讨论的类型(a)二聚体-连接体化合物。)
用于合成二聚体(IIa-16)((6aS，6a′S)-3，3′-((氮烷二基双(乙烷-2，1-二基))双(氧基))双(2-甲氧基-6a，7-二氢苯并[5，6][1，4]二氮杂并[1，2-b]异喹啉-14(12H)-酮))的方案示于图10。
在0℃向2，2′-氮烷二基二乙醇50(5g，47.6mmol，Fluka)和K2CO3(6.57g，47.6mmol)在乙腈(50mL)中的悬浮液中加入氯甲酸烯丙酯12a(5.07mL，47.6mmol)并在室温下搅拌3小时。LCMS显示产物的形成。将反应混合物冷却至0℃，用水(200mL)猝灭，并用EtOAc(3×100mL)萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3(100mL)、水(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机层用MgSO4干燥并浓缩，得到氨基甲酸酯51(2.55g，13.48mmol，28.3％产率)，为浅黄色油状物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.94(m，1H)，5.32(dd，J＝17.6，1.6Hz，1H)，5.24(dd，J＝10.4，1.2Hz，1H)，4.62(d，J＝6.8Hz，2H)，3.84(d，J＝12.4Hz，2H)，3.52(s，2H)，2.86(s，2H).LCMS：[M+1]＝190.1。
在0℃向氨基甲酸酯51(600mg，3.17mmol)和NEt3(1.768mL，12.68mmol)在DCM(5mL)中的溶液中加入TsCl(1814mg，9.51mmol)的DCM(5mL)溶液，并在室温下搅拌1小时。LCMS显示产物形成。将反应溶液浓缩，粗产物在COMBIFLASHTM上使用80g二氧化硅柱和经25分钟0-70％EtOAc/己烷纯化，70％级分提供化合物52，为稠油状物(54％产率)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.78(m，4H)，7.38(m，4H)，5.82(m，1H)，5.22(m，2H)，4.48(m，2H)，4.13(m，4H)，3.52(m，4H)，2.47(s，6H).LCMS：[M+Na]＝520.1。
将化合物52(39.8mg，0.080mmol)和化合物6(80mg，0.176mmol)和K2CO3(33.2mg，0.240mmol)在DMSO(1.5mL)中的溶液在50℃下搅拌19小时。LCMS显示对应于产物的主峰。将反应混合物倒入含有AcOH(0.027mL，0.480mmol，30mL)的水中。加入饱和盐水(10mL)，用EtOAc(3×15mL)萃取。将合并的有机层浓缩并在ISCO COMBIFLASHTM24g柱上纯化，使用经30分钟0-100％EtOAc/己烷。70％EtOAc/己烷级分提供化合物53(64％产率)。LCMS(m+1)＝1062.5。
向化合物53(54mg，0.051mmol)在THF(4mL)中的溶液中加入吗啉(0.022mL，0.254mmol)和Pd(Ph3P)4(2.94mg，2.54μmol)，并在室温下在氮气气氛下搅拌2小时。LCMS显示反应完成。将反应混合物浓缩并使用0-8％MeOH/DCM在ISCOCOMBIFLASHTM24g柱上纯化，得到化合物54，为白色固体(64％产率)。LCMS：(m+1)＝978.5。
在-76℃下向化合物54(35mg，0.036mmol)在THF(4mL)中的溶液中加入LiEt3BH(0.179mL，0.179mmol)。将溶液搅拌1小时。LCMS显示反应完成。将反应用冷水(20mL)猝灭，反应混合物用CHCl3(3×10mL)萃取。所得残余物用DCM/EtOH/水(1∶2∶1＝4mL)和硅胶(1g)处理4天。将该混合物通过烧结玻璃漏斗过滤，硅胶用CHCl3-MeOH(8∶2，100毫升)洗涤。将滤液在高真空下浓缩，并在24g硅胶柱上纯化，使用MeOH/DCM。20％MeOH/DCM级分提供65％产率的二聚体(IIa-16)。LCMS：(m+1)＝686.3。
类似地制备二聚体(IIa-18)，起始于2-氨基-丙醇-1，3-二醇55并经历化合物56、57、58和59。
化合物56：浅黄色油状物，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.94(m，1H)，5.50(brs，1H)，5.29(m，2H)，4.60(d，J＝7.2Hz，2H)，3.83(m，5H).LCMS(m+1)＝176。
化合物57：白色固体，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.78(m，4H)，7.38(m，4H)，5.88(m，1H)，5.25(m，2H)，5.02(brs，1H)，4.53(d，J＝5.6Hz，2H)，4.09(m，5H)，2.48(s，6H)。
化合物58：MS(m+1)＝1048。
化合物59：LCMS(m+1)＝964.46。
二聚体(IIa-18)：LCMS(m+1)＝672.3。
实施例13-类型(a)二聚体-连接体(IIIa-01)
该实施例和图12描述了类型(a)二聚体-连接体(IIIa-01)的制备。
向100mL圆底烧瓶中加入Fmoc-Val-Cit60(Firestone等人，US 6,214,345 B1(2001)，实施例56，363mg，0.731mmol)、HATU(278mg，0.731mmol)和DMF(20mL)。将所得溶液在0℃下搅拌10分钟，然后加入2，6-二甲基吡啶(0.113mL，0.97mmol)。将混合物加入到化合物24f(500mg，0.487mmol)中。将反应混合物缓慢升温至室温并搅拌5小时。然后将反应用10％LiCl溶液猝灭并用EtOAc(3x)萃取。合并的有机层用10％LiCl再用盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥并真空浓缩。使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，在15分钟内从0％至10％MeOH/DCM的梯度)纯化粗产物混合物，得到化合物61a(520mg，71％产率)。LCMS(M+1)＝1504.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.83-7.69(m，4H)，7.58(br.s.，2H)，7.45-7.17(m，16H)，7.15-6.93(m，1H)，5.45(d，J＝10.1Hz，2H)，5.24-4.97(m，7H)，4.71(d，J＝9.7Hz，5H)，4.56-4.02(m，8H)，3.87(s，6H)，3.79-3.49(m，8H)，3.03(d，J＝6.4Hz，3H)，1.77(s，7H)，1.09-0.82(m，11H)，0.10-0.10(m，18H)。
向化合物61a(580mg，0.385mmol)的DMF(7.7mL)溶液中加入哌啶(191μl，1.927mmol)。将反应在室温下搅拌1小时。然后将粗产物混合物浓缩并使用ISCO硅胶色谱法(40g柱，在15分钟内从0％至10％MeOH/DCM的梯度)纯化，得到化合物61b(318mg，64％产率)。LCMS(M+1)＝1282。
向-78℃的化合物61b(200mg，0.156mmol)的THF(4mL)溶液中加入LiEt3BH(0.780mL，0.780mmol)(1M的THF溶液)溶液。将反应在-78℃下搅拌2小时。反应用水猝灭，用氯仿(2x)萃取，然后用氯仿/MeOH(2x)萃取。将合并的有机萃取物干燥并浓缩。然后将残余物吸收于氯仿/EtOH/水(1∶1∶1，4mL)中，加入硅胶(0.7g)。将所得悬浮液在室温下搅拌3天，然后通过CELITETM塞过滤，用氯仿洗涤并浓缩。将该物质吸收在DMF中，并通过反相HPLC纯化，得到化合物62(57mg，36.9％产率)。LCMS(M+H)＝990 1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.62-7.50(m，2H)，7.50-7.25(m，12H)，6.88-6.68(m，1H)，5.33-4.67(m，6H)，4.66-4.29(m，3H)，4.02-3.69(m，6H)，3.47-2.84(m，6H)，2.46-1.74(m，2H)，1.59(br.s.，4H)，1.09-0.74(m，6H)。
向化合物62(23mg，0.023mmol)和化合物62a(得自QuantaBio的MAL-dPEG8-酯；32mg，0.046mmol)的DMSO(1.4mL)溶液中加入2，6-二甲基吡啶(5.41μl，0.046mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。将粗产物混合物过滤并通过反相HPLC纯化(柱：Luna C18 20×100mm；流动相A：10∶90乙腈∶含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈∶含有0.1％三氟乙酸的水；梯度：20-70％B，经17分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)。含有产物的级分通过PL-HCO3 MP 500mg筒(Agilent)。通过重力收集滤液，用4mL ACN洗涤柱。将合并的滤液浓缩并冻干，得到二聚体-连接体(IIIa-01)(3mg，35.8％产率)。LCMS(M+1)＝1564。
实施例14-类型(a)二聚体-连接体(IIIa-02)
该实施例和图13描述了类型(a)二聚体-连接体(IIIa-02)的制备。
向碳酸酯63(3.92mg，3.50μmol，按下文所述制备)和二聚体(IIa-16)(2mg，2.92μmol)的DMSO(0.2mL)溶液中加入DIEA(1.528μL，8.75μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过R-HPLC使用乙腈/水(0.05％甲酸)在30分钟内纯化，得到含产物的级分，将其通过碱性树脂(PL-HCO3MP-树脂1.8mmol/g；Agilent Part#PL3540-C603)过滤，并用乙腈(5mL)洗涤。冻干得到二聚体-连接体(IIIa-02)，为白色固体，产率52％。LCMS(m+1)＝1666。
本领域技术人员将理解，在本实施例和前述实施例中制备类型(a)二聚体连接体化合物的程序可以经过必要的修改以适用于制备其它类型(a)二聚体连接体化合物。
实施例15-类型(b)二聚体-连接体化合物
该实施例和图14-16涉及用于合成类型(b)二聚体-连接体化合物的化合物73和74的制备，以及从它们制备这些二聚体-连接体化合物。
在0℃向烧瓶中加入5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酸64(CAS Reg.No.1430738-03-6，9.0g，24.36mmol)和HATU(10.19g，26.8mmol)的DCM(100mL)溶液。将反应混合物搅拌10分钟，并用DIEA(4.68mL，26.8mmol)和异喹啉65(CASReg.No.215928-81-7，7.43g，26.8mmol)处理。将反应在0℃保持3小时，然后在室温下搅拌24小时。将反应混合物倒入饱和NH4Cl和DCM中。收集有机相并浓缩至残余物。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)进一步纯化，用10％-30％EtOAc/己烷洗脱。收集产物并浓缩，得到酰胺66，为浅褐色油状物(10.15g，66％产率)。LCMS M+H＝629.65。
将酰胺66(10.1g，16.06mmol)在MeOH(200mL)中的溶液冷却至0℃，加入NH4Cl(4.29g，80mmol)和锌粉(5.25g，80mmol)。将所得绿色悬浮液在0℃下搅拌45分钟，然后升温至室温过夜。将反应混合物通过CELITETM垫过滤(用MeOH洗涤)，将滤液浓缩至残余物。将残余物吸收在DCM中并加载到硅胶垫上。将其用50％EtOAc和己烷冲洗，得到苯胺67(8.02g，83％产率)。LCMS M+H＝599.35。
将苯胺67(2500mg，4.17mmol)溶于DCM(50mL)中，加入吡啶(0.878mL，10.85mmol)。将混合物冷却至-78℃，加入氯甲酸烯丙酯12a(0.579mL，5.43mmol)。将反应混合物在该温度下保持1小时，然后升温至室温。将反应混合物倒入饱和NH4Cl和DCM中。将混合物用DCM萃取并通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用10％-50％EtOAc/己烷洗脱，得到氨基甲酸酯68(2.5g，88％产率)。LCMS M+H＝683.40。
将氨基甲酸酯68(1.372g，2.009mmol)溶于MeOH(20mL)中。加入10％浓HCl/MeOH(2mL，6.58mmol)。将混合物老化20分钟，并用NaHCO3(0.591g，7.03mmol)水溶液猝灭。混合物用水稀释，用DCM萃取4次。将合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用10-50％EtOAc/己烷洗脱，得到醇69(963mg，84％产率)。)。LCMS M+H＝569.25。
将草酰氯(2.0M，1.450mL，2.90mmol)溶于DCM(30mL)中，然后将混合物在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃。向其中加入DMSO(0.515mL，7.25mmol，溶于～2mL DCM中以防止加入期间冻结)，并将温度保持在-78℃。20分钟后，将溶于DCM(10mL)的醇69(1.65g，2.90mmol)加入到反应中。将其再搅拌30分钟，然后加入NEt3(2.022mL，14.50mmol)。10分钟后，使反应升温至室温。将其用饱和NH4Cl猝灭并用DCM(2x)萃取。将有机相合并，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩至残余物。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用30％-100％EtOAc/己烷洗脱。收集产物并浓缩，得到缩醛胺70，为白色固体(1.51g，92％产率)。)。LCMS M+H＝567.30。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.39-7.24(m，5H)，7.22(s，1H)，6.67(s，1H)，5.75(dd，J＝11.2，5.6Hz，1H)，5.31(dd，J＝9.5，4.0Hz，1H)，5.22-5.07(m，2H)，4.84(d，J＝15.8Hz，1H)，4.64-4.49(m，2H)，4.44(d，J＝5.3Hz，1H)，3.87(s，3H)，3.77-3.61(m，1H)，3.28-3.01(m，3H)，1.34-1.18(m，3H)，1.09(dd，J＝7.4，2.6Hz，18H)。
将缩醛胺70(776mg，1.369mmol)溶于DCM(12毫升)中，加入2，6-二甲基吡啶(0.638mL，5.48mmol)。将混合物在冰浴上冷却，加入叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TBSOTf，0.943mL，4.11mmol)。将混合物老化30分钟，用DCM稀释，用饱和NaHCO3溶液猝灭，并用DCM萃取2次。将合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用10-30％EtOAc/己烷洗脱，得到甲硅烷基醚71(907.6mg，1.333mmol，97％产率)。1H-NMR显示纯化的物质被～0.25当量的2，6-二甲基吡啶(～4重量％)污染，但不经任何进一步的纯化而被采用。LCMS M+H＝681.25。
将甲硅烷基醚71(907mg，1.332mmol)溶于DMF(5mL和水(0.1ml)中。加入乙酸锂(88mg，1.332mmol)，将混合物老化过夜。大部分DMF在氮气流下蒸发。将残余物用EtOAc稀释，用0.1M柠檬酸洗涤2次，然后用盐水洗涤1次。有机相经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用30-70％EtOAc/己烷洗脱，得到含有一些EtOAc的酚72(707.4mg，1.107mmol，83％产率)(借助1H-NMR)(约1.3当量；产率调整为考虑到EtOAc)。LCMS M+H＝525.10。
酚72(290mg，0.553mmol)溶于丙酮(2800μl)中，加入碳酸铯(180mg，0.553mmol)和1，5-二碘戊烷(400μL，2.69mmol)。将小瓶密封并加热至60℃过夜。使反应进行过夜后，蒸发溶剂，残余物在EtOAc和水之间分配。将混合物萃取两次，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到粗残余物，将其通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用10-50％EtOAc/己烷洗脱，得到化合物73(381mg，96％产率)。LCMS M+H＝721.10。
使用1，3-二碘丙烷类似地由酚72制备化合物74。
现在阐述图15的方案：将化合物67(2.1g，3.51mmol)溶于DCM(30mL)中，加入吡啶(0.3mL，3.71mmol)。将混合物冷却至0℃。加入氯甲酸4-硝基苯酯67a(0.707g，3.51mmol)，并将混合物在相同温度下老化7分钟。加入化合物75(CAS Reg.No.1343407-91-9，1.323g，3.51mmol)和DIEA(0.750mL，4.29mmol)在DMF(3mL)中的溶液。将混合物在室温下放置在旋转蒸发器上以除去DCM。20分钟后，将DMF在氮气流下蒸发，然后残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用10-100％EtOAc/己烷洗脱，得到化合物76(1.579g，1.575mmol，产率44.9％)。LCMS M+H＝1002.50。
将化合物76(1.579g，1.575mmol)在MeOH(14.4ml)中的溶液用10％浓HCl/MeOH(1.6ml，5.27mmol)处理。混合物老化30分钟，用饱和NaHCO3猝灭，用氯仿(3x)萃取。将合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到残余物。将残余物与另一批相同的反应(从0.816g化合物76开始)合并，以进行纯化。合并的粗残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用20-100％EtOAc/己烷洗脱，得到氨基甲酸酯77(1.7412g，1.961mmol，82％产率)。LCMS M+H＝888.30。
将草酰氯(2.0M，1.00mL，2.000mmol)在10mL DCM中的溶液冷却至-78℃。滴加DMSO(0.348mL，4.90mmol)在5mL DCM中的溶液，并将混合物在相同温度下老化10分钟。滴加氨基甲酸酯77(1741.2mg，1.961mmol)在5mL DCM中的溶液，再将混合物老化15分钟。滴加NEt3(1.366mL，9.80mmol)；将混合物在相同温度下老化5分钟，然后除去冷浴，将混合物升温至室温。将混合物用NH4Cl溶液猝灭并用DCM萃取两次。将合并的有机相用水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用50-80％EtOAc/己烷洗脱，得到化合物78(1376.7mg，1.554mmol，79％产率)。LCMS M+H＝886.30。
将化合物78(1045mg，1.179mmol)溶于DCM(10ml)中，加入2，6-二甲基吡啶(0.549ml，4.72mmol)。将混合物在冰浴上冷却，加入TBSOTf(0.813ml，3.54mmol)。1小时后，将混合物用DCM稀释，用饱和NaHCO3和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用20-100％EtOAc/己烷洗脱。获得一些混合级分，其通过硅胶色谱法(Biotage)再次纯化，用50％EtOAc/己烷(等度)洗脱。将纯级分合并，得到化合物79(676.9mg，0.677mmol，57.4％产率)。LCMS M+H＝1000.30。
将化合物79(676mg，0.676mmol)在DMF(5mL)和水(0.1mL)中的溶液用乙酸锂(44.6mg，0.676mmol)处理。将混合物老化过夜，并在氮气流下蒸发溶剂。将残余物在EtOAc和0.1M柠檬酸之间分配。分离各相，有机相用0.1M柠檬酸洗涤两次，用盐水洗涤一次，然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用50-100％EtOAc/己烷洗脱，得到化合物80(543.6mg，0.644mmol，95％产率)。LCMS M+H＝844.35。
现在阐述图16，其显示了先前制备的中间体化合物73和80用于制备二聚体-连接体(IIIb-01)的方案。
将化合物73(326mg，0.452mmol)和化合物80(318mg，0.377mmol)在丙酮(1884μl)中的溶液用碳酸铯(123mg，0.377mmol)处理。将含有混合物的小瓶密封并在60℃下加热。使反应进行过夜后，将反应混合物用EtOAc稀释，用0.1M柠檬酸和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至残余物。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用50-80％EtOAc/己烷洗脱。这得到被邻近洗脱杂质污染的化合物81(338mg，0.235mmol，产率为62.4％)。无需进一步纯化即将混合物用于下一步骤(产率未对纯度校正)。LCMS M+H＝1436.65。HRMS测定值M+H＝1436.6881，计算值＝1436.6916。对于邻近洗脱杂质的HRMS M+H＝1378.6485。
向化合物81(107mg，0.074mmol，来自于前述步骤的不纯物)的THF(2mL)溶液中加入氟化四丁基铵(TBAF，1.0M，0.16mL，0.160mmol)。将混合物老化10分钟，用EtOAc稀释，依次用水、饱和NaHCO3和盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(Biotage)纯化粗残余物，用1-10％MeOH/DCM洗脱，得到被邻近洗脱杂质污染的化合物82(71mg，0.059mmol，79％产率)(产率未对纯度校正)。LCMS M+Na＝1230.25。HRMS测定值M+H＝1208.5170，计算值＝1208.5187。对于邻近洗脱杂质的HRMS M+H＝1150.4755。
向小瓶中加入化合物82(71mg，0.059mmol，来自于前述步骤的不纯物)，并加入0.042M吡咯烷的DCM溶液(3.50mL，0.147mmol)，然后加入四(三苯基膦)钯(4.07mg，3.53μmol)。将混合物老化1小时，用DCM稀释，并用饱和NH4Cl洗涤。将水部分用DCM再萃取，合并有机相，用盐水洗涤，盐水层再次用DCM萃取，合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。将残余物溶于DMF中，通过制备型HPLC经三次注射纯化(Sunfire C18制备型OBD柱19×100mm，溶剂A＝95％水，5％ACN+0.1％TFA，溶剂B＝55％水，95％ACN+0.1％TFA；梯度为经过10分钟0-100％B，保持至12分钟，通过在254nm的UV收集级分)。将纯化的级分通过PL-HCO3-MP SPE500mg/6mL筒，得到作为游离碱的产物。蒸发游离碱的溶液，得到化合物83(30mg，0.029mmol，49.9％产率)。LCMS M+H＝1022.25。
向小瓶中加入化合物83(18.10mg，0.059mmol)，然后加入0.05M DIEA/DMF(0.8ml，0.040mmol)。将该混合物老化过夜，然后用DMF(～0.4mL)稀释，并通过制备型HPLC(1次注射)纯化(Sunfire C18制备型OBD柱19×100mm，溶剂A＝95％水，5％ACN+0.1％TFA，溶剂B＝55％水，95％ACN+0.1％TFA；梯度为经过10分钟0-100％B，保持至12分钟，通过在254nm的UV收集级分)。将纯化的级分通过PL-HCO3-MP SPE 500mg/6mL筒，得到作为游离碱的二聚体-连接体(IIIb-01)(19.6mg，0.015mmol，52.2％产率)。LCMS M+H＝1216。HRMS测定值M+H＝1215.5387，计算值＝1215.5397。
类似地按照上述程序制备另外的二聚体-连接体化合物：
(a)化合物74和80用于制备二聚体-连接体(IIIb-03)：LCMS M+H＝1187.20。HRMS测定值M+H＝1187.5087，计算值＝1187.5084。
(b)二聚体-连接体(IIIb-01)和(IIIb-03)用氰基硼氢化钠还原，分别得到二聚体-连接体(IIIb-05)(LCMS(M+2H)/2＝609.55。HRMS测定值M+H＝1217.5561，计算值＝1217.5554)和(IIIb-06)(LCMS M+H＝1189。HRMS测定值M+H＝1189.5268，计算值＝1189.5241)。
(c)通过与化合物62a结合将化合物83转化成二聚体-连接体(IIIb-02)：LCMS(M+2H)/2＝799.25。HRMS测定值M+H＝1596.7390，计算值＝1596.7396。
(d)化合物81通过用四(三苯基膦)钯还原并与化合物84结合而转化为二聚体-连接体(IIIb-04)：LCMS M+H＝1329。HRMS测定值M+H＝1329.6247，计算值＝1329.6262。
本领域技术人员将理解，类型(b)THIQ-PBD二聚体-连接体化合物可以使用化合物73或74或化合物80的PBD等同物并另外类似地按照上述程序制备。
实施例16-类型(c)二聚体-连接体
通过从化合物39(实施例10)中除去Alloc基团制备的化合物85与化合物60结合，并通过类似地遵循上述程序转化成化合物86。
向化合物86(9.6mg，10.04μmol)和2，6-二甲基吡啶(2.152mg，0.020mmol)在DMSO(0.7mL)中的溶液中加入酯(13.85mg，0.020mmol)在DMSO(100uL)中的溶液。将反应在室温下搅拌1小时。然后将溶液用乙腈稀释，过滤并使用反相HPLC纯化(柱：Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：0-70％B，15分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)。含有产物的级分通过PL-HCO3MP 500mg柱(Agilent)。通过重力收集滤液，用4mL ACN洗涤柱。将合并的滤液浓缩并冻干，得到二聚体-连接体(IIIc-01)(9.4mg，5.53μmol，55.0％产率)。
LCMS(M+H)＝1530。
化合物87(LCMS(M+2H)＝435.9)由化合物85类似地按照上述程序加以必要的修改进行制备。
向化合物87(5mg，5.75μmol)和2，5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯(1.949mg，6.32μmol)的DMSO(0.2mL)溶液中加入2，6-二甲基吡啶(1.339μl，0.011mmol)。将反应在室温下搅拌4小时。然后将反应用DMF(1mL)稀释，过滤并使用反相HPLC纯化(柱：Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：20-80％B，15分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)。含有产物的级分通过PL-HCO3 MP 500mg筒(Agilent)。通过重力收集滤液，并用4mL乙腈洗涤柱。将合并的滤液浓缩并冻干，得到二聚体连接体(IIIc-07)(1.8mg，1.524μmol，26.5％产率)。LCMS(M+H)＝1063.4。
化合物88由化合物49类似地按照上述程序制备。LCMS(M+H)＝884.7。
向化合物84(12.03mg，0.039mmol)和化合物88(23mg，0.026mmol)的DMSO(0.2mL)溶液中加入2，6-二甲基吡啶(6.06μl，0.052mmol)。将反应在室温下搅拌5小时，然后用DCM稀释，并使用ISCO硅胶色谱法(0-15％MeOH/DCM，12g柱)纯化。然后将含有所需产物的级分浓缩，得到浅黄色泡沫，将其吸收于H2O/THF(2∶1，4mL)中，并将其冻干，得到二聚体-连接体(IIIc-08)(9.5mg，7.94μmol，30.5％产率)。LCMS(M+H)＝1077.8。
实施例17-在连接体中具有自分解基团的类型(c)二聚体-连接体
该实施例说明了二聚体-连接体化合物的制备，其中连接体具有PABC自分解基团，例如二聚体-连接体(IIIc-02)。连接体部分如下组装：
向化合物89(Firestone等人，US 6,124,345 B1(2001)，实施例57；0.75g，1.246mmol)在DMF(2ml)和THF(8mL)中的溶液中加入二乙胺(2.81ml，26.9mmol)。将反应在室温下搅拌1.5小时并浓缩。将粗产物用DCM研磨，过滤并在真空下干燥，得到化合物90，为白色固体。LCMS(M+H)＝380.2 1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.06(s，1H)，8.15(d，J＝7.3Hz，1H)，7.56(d，J＝8.5Hz，2H)，7.26(d，J＝8.3Hz，2H)，6.00(t，J＝5.4Hz，1H)，5.43(s，2H)，5.13(t，J＝5.3Hz，1H)，4.56-4.33(m，3H)，3.07-2.93(m，3H)，2.00-1.55(m，5H)，1.49-1.32(m，2H)，0.90(d，J＝6.8Hz，3H)，0.80(d，J＝6.8Hz，3H)。
向化合物90(79mg，0.209mmol)在DMSO(2mL)中的溶液中加入酯(120mg，0.174mmol)在DMSO(1mL)中的溶液，然后加入2，6-二甲基吡啶(37.3mg，0.348mmol)。将反应在室温下搅拌3小时。加入碳酸二(4-硝基苯基)酯(63.5mg，0.209mmol)在DMF(2mL)中的溶液，然后加入2，6-二甲基吡啶(37.3mg，0.348mmol)。然后将反应在室温下搅拌12小时。然后加入DIPEA(0.061mL，0.348mmol)，并将反应在室温下搅拌3小时。将粗产物混合物用DMF稀释，过滤并使用反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C18 20x100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：0-70％B，15分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到化合物63(40mg，0.036mmol，产率20.54％)。LCMS(M+H)＝1119.5。
向化合物(IIa-10)(3.5mg，5.00μmol)中加入化合物91(5.60mg，5.00μmol)的DMSO(0.16mL)溶液，然后加入DIPEA(2.62μL，0.015mmol)和HOAt(0.6mg，5.00μmol)。将反应在室温下搅拌24小时并用DMF稀释，过滤并使用反相HPLC纯化(柱：Phenomenex Luna C1820x100mm；流动相A：10∶90乙腈：含有0.1％TFA的水；流动相B：90∶10乙腈：含有0.1％TFA的水；梯度：20-80％B，15分钟；流速：20mL/min；检测：在220nm的UV)，得到二聚体-连接体(IIIc-02)(2.1mg，1.188μmol，23.74％产率)，为白色固体。LCMS(M+H)＝1679.6。
类似地按照上述方法制备具有自分解基团的另外的二聚体-连接体化合物：
(IIIc-03)LCMS(M+2H)/2＝876.1。
(IIIc-04)LCMS(M+2H)/2＝790.5。
(IIIc-05)LCMS(M+H)＝1650.9。
(IIIc-06)LCMS(M+H)＝1593.9。
本领域技术人员将理解，具有PABC自分解基团或其它自分解基团的类型(c)或其它类型的其它二聚体-连接体化合物可以经过必要的修改而类似地制备。
实施例18-THIQ-AZI二聚体
该实施例和图17涉及THIQ-AZI二聚体的制备，特别是二聚体(IIc-01)。
向Parr瓶中加入化合物90a(CAS Reg.No.1210045-50-3，3.0g，8.27mmol)和氢氧化钯/碳(20％，50％湿；1.0g，0.712mmol)，悬浮于乙醇(60mL)和乙酸(10mL)中。将其置于Parr装置上并充入55psi氢气。振荡过夜后，将反应混合物通过CELITETM过滤，将滤液浓缩，留下残余物。将残余物用EtOAc稀释并用饱和NaHCO3洗涤。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用20％-50％EtOAC/己烷洗脱，得到外消旋产物(2.49g，83％产率)，为透明油状物。LCMS(M+H)＝365.55.1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ8.44-8.16(m，2H)，7.79-7.42(m，1H)，4.48(br.s.，1H)，3.74(d，J＝6.5Hz，2H)，3.36-3.18(m，1H)，3.18-3.00(m，1H)，1.65-1.49(m，9H)，0.75(s，9H)，0.11-0.23(m，6H)。该外消旋体通过手性SFC色谱法(LuxCellulose-221.2 x 250mm，5uM柱，用30％乙腈/CO2，140巴，35℃洗脱)进一步纯化，得到两个峰。收集第二个洗脱峰((-)异构体)，得到氮杂二氢吲哚91，为无色油状物(1.01g，总产率34％)。
向小瓶中加入在MeOH(4mL)中的氮杂二氢吲哚91(850mg，2.332mmol)。向其中加入4M HCl/二噁烷(8.5ml，34.0mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩至残余物，然后吸收于MeOH和***中。再次浓缩(2x)，得到去保护的残余物。将该残余物与乙腈(1mL)一起装入烧瓶中。向其中加入叔丁基-二甲基氯硅烷(TBS-Cl，446mg，2.96mmol)和咪唑(671mg，9.86mmol)，将反应在室温下搅拌2小时。将反应混合物用DCM稀释并用饱和NH4Cl洗涤。将有机相洗涤两次，然后浓缩至残余物。残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用5％(10％NH4OH/MeOH)/氯仿洗脱。收集产物并浓缩成化合物92，为透明油状物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)d 8.00-7.84(m，2H)，6.77(br.s.，1H)，6.40(d，J＝5.8Hz，1H)，3.95(dd，J＝9.9，5.1Hz，1H)，3.54(d，J＝5.8Hz，2H)，3.05(dd，J＝16.2，9.9Hz，1H)，2.77-2.59(m，1H)，0.83(s，9H)，0.03(d，J＝7.5Hz，6H)。
向小瓶中加入化合物93(CAS Reg.No.313644-41-6，420mg，0.863mmol)的5mL DMF溶液。向其中加入HATU(821mg，2.159mmol)。老化30分钟后，加入化合物65(252mg，0.907mmol)和化合物92(240mg，0.907mmol)和DIPEA(0.754mL，4.32mmol)在2mL DMF中的溶液。再老化一小时后，将混合物转移到含有～100mL水的烧瓶中，并将混合物用1N HCl酸化。通过过滤收集所得固体并用水洗涤。收集湿固体，溶于DCM中，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。粗残余物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用0-10％MeOH/DCM洗脱，得到三种产物。中间洗脱峰为异质二聚酰胺94(353.1mg，0.356mmol，41.2％产率)。LCMS(M+H)＝992.30。
将酰胺94(200mg，0.202mmol)溶于THF(2mL)中。向其中加入水(200μl，11.10mmol)和P(Me)3(605μL，0.605mmol)。老化～30分钟后，蒸发溶剂，样品与甲苯共沸。将残余物溶于DCM(10mL)中。加入吡啶(0.08mL，1.00mmol)，将混合物冷却至-78℃。加入氯甲酸烯丙酯12a(64.5μL，0.605mmol)，将混合物在相同温度下搅拌30分钟，然后升温至室温。将混合物用NH4Cl猝灭，用DCM萃取两次，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。将残余物再次溶解在7∶1∶1∶2AcOH/THF/MeOH/水(总共3mL)中并搅拌过夜。因为去保护缓慢，搅拌过夜后，加入0.5ml 10％HCl/MeOH，再过30分钟后完全去保护。将反应混合物小心地转移到饱和NaHCO3中以中和。将混合物用DCM萃取三次，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。粗产物通过硅胶色谱法(Biotage)纯化，用3-6％(10％NH4OH/MeOH)/氯仿洗脱。收集主峰，得到化合物95(95.7mg，0.109mmol，54.0％产率)。
LCMS(M+H)＝880.15。
向烧瓶中加入DMSO(0.018mL，0.256mmol)/0.5mL DCM并冷却至-78℃。滴加草酰氯(0.061mL，0.123mmol)。将反应混合物在相同温度下老化10分钟，此时滴加化合物95(45mg，0.051mmol)在0.5mL DCM中的溶液。再次老化30分钟后，滴加三乙胺(0.071mL，0.511mmol)。在-78℃下搅拌30分钟后，除去冷浴，将反应混合物升温至环境温度。混合物用饱和NH4Cl猝灭并用DCM萃取三次。萃取物用NH4Cl洗涤三次，用盐水洗涤一次，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。将粗残余物溶于DCM(3mL)中，加入吡咯烷(0.017mL，0.201mmol)和四(三苯基膦)钯(2.90mg，2.51μmol)。将混合物老化1小时，用NH4Cl洗涤，然后用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至残余物。通过制备型HPLC(sunfire ACN/水0.1％TFA)纯化残余物，在运行前将NaHCO3钠溶液置于管中立即中和样品。收集主峰以通过蒸发过量溶剂然后用DCM萃取提供预期的产物。产物通过biotage DCM/MeOH 3-6％逐步梯度(每次增加1％)再次纯化。收集主峰，用氯仿共沸多次以除去甲醇，得到THIQ-AZI二聚体(IIc-01)(7mg，8.34μmol，16.60％产率)。
LCMS(M+H)＝672.15。
实施例19-二聚体-连接体(IIIa-03)
向化合物96(Senter等人，2010；10mg，0.014mmol)和二聚体IIa-16(13.01mg，0.019mmol)在DMSO(0.5mL)中的溶液中加入Hunig碱(7.10μL，0.041mmol)，在室温下搅拌过夜。将其在Shimadzu R-HPLC上使用XBridge prep C18，5μm柱和5-55％乙腈/水(0.05％甲酸)经30分钟纯化。
在24分钟收集的级分提供二聚体-连接体IIIa-03(5.6mg，4.36μmol，32.2％产率)。将具有正确质量的级分通过碱性树脂(PL-HCO3 MP-树脂1.8mmol/g；Agilent Part#PL3540-#603)过滤，用乙腈(5mL)洗涤，然后冷冻干燥。
MS(m+1)＝1284。
实施例20-二聚体IIa-20和二聚体-连接体IIIa-04
该实施例和图18a和18b涉及二聚体(IIa-20)和二聚体-连接体(IIIa-04)的合成。
在0℃向三苯基膦(1.385g，5.28mmol)、化合物20(2g，4.40mmol)和化合物51(1.165g，6.16mmol)的THF(10mL)溶液中滴加偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD，1.026mL，5.28mmol)。在室温下搅拌过夜。浓缩并使用0-100％EtOAc/己烷洗脱液在ISCOCOMBIFLASHTM 120g柱上纯化，得到醇108(1.28g，2.045mmol，46.5％产率)，为白色固体。MS(m+Na)＝648.2.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.48(m，3H)，7.33(m，2H)，7.22(m，1H)，5.93(m，1H)，5.50(t，J＝10.0Hz，1H)，5.31(d，J＝16.0Hz，1H)，5.22(dd，J＝10.8，1.6Hz，1H)，5.17(d，J＝15.2Hz，1H)，4.70(t，J＝11.2Hz，1H)，4.63(m，2H)，4.43(m，1H)，4.30(m，2H)，4.22(m，1H)，3.97(m，1H)，3.90(s，3H)，3.79(m，4H)，3.57(m，4H)，3.01(dd，J＝15.2，2.0Hz，1H)，2.07(m，2H)，1.88(m，2H)，0.997(m，2H)，0.06(s，9H)。
将醇108(0.64g，1.023mmol)和三乙胺(TEA，0.214mL，1.534mmol)在DCM(10mL)中的悬浮液冷却至0℃，用甲磺酰氯(MsCl，0.104mL，1.330mmol)处理。在0℃下搅拌60分钟后，LCMS显示50％转化成产物。加入更多的TEA(0.214mL，1.534mmol)和MsCl(0.104mL，1.330mmol)，继续搅拌1小时以得到完全转化。将反应用冰冷水(30mL)猝灭，用DCM(2×30mL)萃取，并用冰冷水(30ml)洗涤。将有机层用MgSO4干燥，并在旋转蒸发仪中浓缩，得到甲磺酸酯109(0.713g，1.012mmol，99％产率)。MS(m+1)＝704.2。
向化合物106(336mg，0.852mmol)和甲磺酸酯109(500mg，0.710mmol)在DMSO(2mL)中的溶液中加入K2CO3(196mg，1.421mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc(50mL)和水(50mL)稀释。水层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层浓缩并在ISCO COMBIFLASHTM 80g柱上使用0-100％EtOAc/己烷洗脱梯度经45分钟纯化，得到化合物110(180mg，0.180mmol，25.3％产率)。MS(m+1)＝1003.3。
在-76℃下向化合物110(180mg，0.180mmol)在THF(4mL)中的溶液中加入三乙基硼氢化锂(SUPER HYDRIDETM，0.898mL，0.898mmol)。将反应混合物搅拌1小时。将反应用冷水(1mL)猝灭并用DCM(3×10mL)萃取。将有机层浓缩并用DCM/EtOH/水(1∶2∶1＝4mL)和硅胶(1g)处理2天。将该混合物通过烧结漏斗过滤，硅胶用DCM-MeOH(8∶2，50mL)洗涤。将滤液在高真空下浓缩，并在40g硅胶柱上使用MeOH/DCM洗脱液经15分钟纯化。10％MeOH/DCM级分在9分钟时提供化合物111(151mg，0.143mmol，80％产率)，为白色固体。MS(m+1)＝856.3。
向化合物111(151mg，0.176mmol)的DCM(3mL)溶液中加入Pd(PPh3)4(10.19mg，8.82μmol)和吡咯烷(0.058mL，0.706mmol)。将反应混合物在氮气下在室温下搅拌。浓缩并在ISCO 24g硅胶柱上使用0-20％MeOH/DCM纯化，得到二聚体(IIa-20)(42mg，0.058mmol，32.9％产率)，为白色固体。MS(m+1)＝688.2.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.55(s，1H)，7.48(d，J＝5.2Hz，1H)，7.41(s，1H)，7.25-7.40(m，9H)，7.21(m，1H)，6.85(s，1H)，6.27(s，1H)，5.03(d，J＝15.6Hz，1H)，4.83(q，J＝15.6Hz，2H)，4.57(d，J＝15.2，1H)，4.30(m，2H)，4.21(t，J＝5.2Hz，2H)，4.13(m，1H)，3.94(s，3H)，3.84(s，3H)，3.51(s，1H)，3.46(dd，J＝10.8，2.0Hz，1H)，3.20-3.30(m，6H)，3.12(dd，J＝15.2，6.0Hz，2H)，2.83(dd，J＝15.2，5.6Hz，2H)。
向碳酸对硝基苯酯96(20mg，0.027mmol)和二聚体(IIa-20)(22.37mg，0.033mmol)的DMSO(1mL)的溶液中加入DIPEA(0.014mL，0.081mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。反应产物通过R-HPLC，使用XBridge prep OBD C18，5μm柱(30×250mm)和5-55％乙腈/水(0.05％甲酸)经40分钟(4次注射)纯化。在31.8分钟收集的级分通过碱性树脂(PL-HCO3MP-树脂1.8mmol/g；Agilent Part#PL3540-#603)过滤，并用乙腈(5mL)洗涤。冻干得到二聚体-连接体(IIIa-04)(8mg，5.91μmol，21.79％产率)，为白色固体。MS(m+1)＝1286.5。
实施例21-二聚体IIa-21
该实施例和图19涉及二聚体(IIa-21)的合成。
将酚72(68mg，0.13mmol)、1，3-双(溴甲基)苯97(17mg，0.065mmol)和Cs2CO3(42mg，0.13mmol)在丙酮(0.4ml)中的悬浮液加热至40℃达1小时。混合物用0.1M柠檬酸猝灭并用EtOAc萃取三次。将合并的有机物用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。混合物通过硅胶色谱法纯化，用30-80％EtOAc/己烷梯度洗脱，得到两种化合物。首先洗脱的是单烷基化化合物99(15.6mg，17％产率)。LCMS M+H＝707.10。第二洗脱的是二聚体98(13.5mg，18％产率)。LCMS M+H＝1151.20。
将二聚体98(13.5mg，0.012mmol)溶于吡咯烷的DCM(0.042M，0.7ml，0.029mmol)溶液中，加入Pd(PPh3)4(2.0mg，1.7μmol)。将混合物搅拌30分钟，并在DCM和饱和NH4Cl之间分配。分离各相，并用DCM再萃取水性部分两次。将合并的有机物经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至残余物，然后通过制备型HPLC(Sunfire C18prep OBD柱19x100mm，溶剂A＝95％水，5％乙腈+0.1％TFA；溶剂B＝5％水，95％乙腈+0.1％TFA；梯度为0-100％，10分钟)纯化。将样品分成两次相等的注射。将含有产物的级分合并，并通过PL-HCO3-MP SPE500mg/6mL筒，用乙腈洗脱，得到游离碱产物溶液。通过旋转蒸发除去大部分有机溶剂，通过冻干除去水，得到白色粉末的二聚体(IIa-21)(5.18mg，58％产率)。LCMS M+H＝719.10.HRMS测定值：M+H＝719.2851，计算值：719.2864。
实施例22-二聚体IIa-22
该实施例和图20涉及二聚体(IIa-22)的制备。
将二醇100(0.25g，1.40mmol，按J.Med.Chem.2011，4350制备)和NEt3(0.58mL，4.19mmol)的DCM(5mL)悬浮液在冰水浴上冷却，并用MsCl(0.25mL，3.2mmol)处理。将反应混合物在相同温度下搅拌2小时，然后通过加入水猝灭。分离两相混合物的层，再次用一部分DCM萃取水相。合并的有机相用冷的稀HCl(0.05N)和盐水先后洗涤，然后用Na2SO4干燥。蒸发溶剂，得到甲磺酸酯101，为白色固体，不经进一步纯化即使用(0.425g，91％产率)1H NMR(400MHz，氯仿-d)δ7.25(s，1H)，7.11(s，2H)，5.29-5.18(m，4H)，3.05(s，6H)。
将酚72(94mg，0.18mmol)、甲磺酸酯101(30mg，0.089mmol)和Cs2CO3(73mg，0.22mmol)在丙酮(0.4ml)中的悬浮液升温至40℃达1小时。混合物用0.1M柠檬酸猝灭并用EtOAc萃取三次。合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。混合物通过硅胶色谱法纯化，用30-80％EtOAc/己烷梯度洗脱，得到二聚体102(82.6mg，77％产率)。LCMS M+H＝1192.15。
根据二聚体(IIa-21)的方法将二聚体102(41.3mg，0.035mmol)脱保护，得到白色粉末的二聚体(IIa-22)(7.08mg，26％产率)。LCMS M+H＝760.10.HRMS测定值：M+H＝760.2872，计算值：760.2878。
实施例23-二聚体-连接体IIIb-07和IIIb-08
该实施例和图21涉及二聚体连接体(IIIb-07)和(IIIb-08)的制备。
如下从酚80和单烷基化化合物99制备化合物104a。将酚80(18.6mg，0.022mmol)、化合物99(15.6mg，0.022mmol)和Cs2CO3(7.18mg，0.022mmol)悬浮于丙酮(0.11mL)中，并升温至40℃达1.5小时。将混合物用EtOAc稀释并用0.1M柠檬酸洗涤。将有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干。将粗物质通过硅胶色谱法纯化，用30-100％EtOAc/己烷洗脱，得到产物104a(23.3mg，72％产率)。LCMS M+H＝1472.20。
将二聚体104a(23.3mg，0.016mmol)溶于THF(0.4mL)中，加入TBAF的THF(0.035mL，1.0M，0.035mmol)溶液。将混合物搅拌0.5小时，并在EtOAc和饱和NH4Cl之间分配，分离各相，水性部分再用DCM萃取两次。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至残余物，然后通过硅胶色谱法纯化，用0-10％MeOH/DCM梯度洗脱，得到化合物105a(16.4mg，83％产率)。LCMS M+Na＝1265.25。
将二聚体105a(16.4mg，0.013mmol)溶于吡咯烷的DCM(0.042M，0.8ml，0.033mmol)溶液中，加入Pd(PPh3)4(1.2mg，1.04μmol)。将混合物搅拌1小时，在DCM和饱和NH4Cl之间分配，分离各相，水性部分再用DCM萃取两次。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并蒸发至残余物，得到胺106a，其不经进一步纯化即使用(推定定量产率)。
将胺106a(13.7mg，0.13mmol)溶于DIPEA的DMF(0.05M，0.31mL，0.016mmol)溶液中，加入化合物84(8mg，0.026mmol)。将混合物搅拌20小时，此时用DMF稀释，并通过制备型HPLC(Sunfire C18prep OBD柱19x100mm，溶剂A＝95％水，5％乙腈+0.1％TFA；溶剂B＝5％水，95％乙腈+0.1％TFA.梯度为0-100％，10分钟)纯化。将含有产物的级分合并，并通过PL-HCO3-MP SPE 500mg/6mL筒，用乙腈洗脱，得到游离碱产物溶液。通过旋转蒸发除去大部分有机溶剂，通过冻干除去水，得到白色粉末的二聚体-连接体(IIIb-07)(7.10mg，42％产率)。LCMS M+H＝1249.35。HRMS测定值：M+H＝1249.5221，计算值：1249.5241。
将双甲磺酸酯101(100mg，0.191mmol)以与化合物99的合成所述类似的方式与化合物72反应，得到单甲磺酸酯103(74.6mg，51％产率)。LCMS M+H＝764.10。
将单甲磺酸酯103(46.8mg，0.061mmol)以与化合物104a的合成所述类似的方式与化合物80反应，得到化合物104b(68.8mg，74％产率)。LCMS M+H＝1511.95。
化合物104b(68.8mg，0.046mmol)以类似于合成化合物105a所述的方式脱保护，得到化合物105b(51.4mg，88％产率)。
化合物105b(51.4mg，0.040mmol)以类似于合成化合物106a所述的方式脱保护，得到胺106b(44mg，100％产率，下一步使用的粗品)。
将胺106b(46.8mg，0.061mmol)以类似于合成二聚体-连接体(IIIb-07)所述的方式与化合物84反应，得到二聚体-连接体(IIIb-08)(13.5mg，25％产率)。HRMS测定值：M+H＝1290.5245，计算值：1290.5255。
实施例24-二聚体-连接体IIIb-04
该实施例和图22涉及二聚体-连接体(IIIb-09)的合成。
将二碘***(46mg，0.088mmol)以类似于合成化合物99所述的方式与化合物72反应，得到化合物107(29mg，46％产率)。LCMS M+H＝723.20。
将甲硅烷基醚78(431mg，0.486mmol)溶于DMF(2.0ml)和水(0.04ml)中，用乙酸锂(32mg，0.486mmol)处理。将混合物升温至40℃2.5小时，并在室温再搅拌1小时，然后在氮气流下除去溶剂(3天)。残余物用0.1M柠檬酸处理，并用EtOAc萃取三次。合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。混合物通过硅胶色谱法纯化，用0-10％MeOH/DCM梯度洗脱，得到酚108(297mg，84％产率)。LCMS M+H＝730.40。
将单碘化合物107(29mg，0.04mmol)以类似于合成化合物104a所述的方式与酚108反应，得到化合物109(18.8mg，35％产率)。LCMS M+Na＝1347.15。
化合物109(18.8mg，0.014mmol)以类似于合成化合物106a所述的方式脱保护，得到胺110(13mg，100％产率，下一步使用的粗品)。
以类似于二聚体-连接体(IIIb-07)合成所述的方式，将胺110(14mg，0.014mmol)与化合物84反应，得到二聚体-连接体(IIIb-09)(8.6mg，53％产率)。LCMS M+Na＝1239.75。
实施例25-二聚体-连接体IIIa-05、-06、-07和-08
该实施例和图23涉及二聚体-连接体IIIa-05、IIIa-06、IIIa-07和IIIa-08的制备。这些二聚体-连接体在连接体组分中具有烷基氨基，并且可以在转谷氨酰胺酶介导的缀合中用作胺供体以制备ADC。
向化合物54(850mg，0.869mmol)和化合物111(CAS Reg.No.863971-53-3，666mg，0.869mmol)的NMP(7mL)溶液中加入DIPEA(0.228mL，1.303mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜。LCMS显示产物形成。将粗反应物直接施加于120g硅胶柱上的COMBIFLASHTM色谱，用MeOH/DCM经45分钟洗脱。在18分钟的级分提供化合物112(0.8g，57％产率)，为白色固体。MS(m+1)＝1605.6。
向化合物112(0.7g，0.436mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入哌啶(0.5ml，5.05mmol)。将溶液在室温下搅拌30分钟。LCMS显示反应完成。浓缩并在80g COMBIFLASHTM硅胶柱上使用MeOH/DCM经40分钟纯化，得到在19-23分钟的30％MeOH/DCM级分，得到化合物113(0.475g，0.343mmol，79％产率)，为白色固体。MS(m+1)＝1383.6.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.11(s，2H)，8.13(s，2H)，7.57(d，J＝8.4Hz，2H)，7.23(m，14H)，5.96(t，J＝5.6Hz，2H)，5.76(s，1H).5.39(s，4H)，5.26(t，J＝6.0Hz，4H)，5.08(dd，J＝22.0，10.4Hz，4H)，5.01(s，2H)，4.92(d，J＝15.6Hz，4H)，4.47(m，2H)，4.31(m，5H)，4.21(m，5H)，4.10(q，J＝5.2Hz，2H)，3.76(m，10H)，3.18(d，J＝5.2Hz，2H)，3.03(m，6H)，2.68(m，2H)，2.34(m，2H)，1.93(m，3H)，1.50-1.70(m，6H)，1.39(m，5H)，0.88(d，J＝6.8Hz，3H)，0.78(d，J＝6.8Hz，3H)，0.74(m，9H)，0.09，0.10(m，9H)。
在-76℃向化合物113(975mg，0.705mmol)的THF(10mL)溶液中加入LiEt3BH(SUPERHYDRIDETM，3.52mL，3.52mmol)。将溶液搅拌1小时。LCMS显示反应完成。将反应用冷水(1mL)猝灭并浓缩。所得残余物用DCM/EtOH/水(1∶2∶1＝8mL)和硅胶(1g)处理3天。将该混合物通过烧结漏斗过滤，硅胶用DCM-MeOH(8∶2，100mL)洗涤。将滤液在高真空下浓缩并在24g硅胶柱上使用MeOH/DCM经15分钟纯化。20％MeOH/DCM级分提供化合物114(422mg，0.387mmol，54.9％产率)，为白色固体。MS(m+1)＝1091.6。
向化合物114(67mg，0.061mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺酯115(30.4mg，0.068mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入2，6-二甲基吡啶(0.014mL，0.123mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。LCMS显示几乎完全转化为产物116。加入哌啶(0.1mL，1.010mmol)，将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物注射到ISCO 150g C18柱上，用水/乙腈(0.05％甲酸)经30分钟洗脱。在27分钟的34％水/乙腈级分通过碱性树脂(PL-HCO3MP-树脂1.8mmol/g；Agilent Part#PL3540-#603)过滤，并用乙腈(5mL)洗涤。冻干提供二聚体-连接体IIIa-08(27.5mg，0.020mmol，产率33.1％)，为白色固体。MS(m+1)＝1204.6。
二聚体-连接体IIIa-05(MS(m+1)＝1338.5)、IIIa-06(MS(m+1)＝1514.06)和IIIa-07(MS(m+1)＝1250.2)使用相应的N-羟基琥珀酰亚胺酯类似地由化合物114制备。
实施例26-二聚体的生物活性
针对H226肺癌、786-O肾癌、N87胃癌和/或OVCAR3卵巢癌细胞系测试本发明二聚体的细胞毒素活性。二聚体抑制细胞增殖的能力可以通过ATP发光测定法或MTS细胞增殖测定法来测量。通常这两种方法产生可比的结果。
这是ATP发光测定法的一般程序：将细胞分别以1×103个细胞/孔接种在96孔板中3小时，用于ATP CellTiterGloTM测定。将化合物的系列稀释液(1∶3)加入孔中。将板温育72小时。来自Promega的CellTiterGloTM细胞活力试剂盒用于按照制造商的说明测量用试验化合物处理的细胞的ATP含量。ATP含量的降低是细胞活力降低的量度。EC50值，即药剂将细胞活力降低最大效应的50％的浓度，可以使用PRISMTM软件5.0版(GraphPad Software，LaJolla，CA，USA)计算。
如下进行MTS细胞增殖测定法：使用来自Promega(Madison，WI)的CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试剂盒来确定细胞增殖测定中活细胞的数量。肿瘤细胞以每孔40μL以一定的接种密度接种在无菌384孔黑色透明底部基质板中，并且在测定前在37℃下在5％CO2中温育过夜。第二天，使用一组细胞板(10个板)来确定零时间的细胞密度，并且将3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓以4μL/孔加入10个板中，然后在37℃，5％CO2中温育3小时。该四唑鎓试剂由肝细胞生物还原，形成可溶于水溶液的甲产物。在Envision读数器(Perkin Elmer，Boston，MA)上测量在490nm处的吸光度。在同一天，将化合物加入到剩余的细胞板(T72板)中，并在37℃下在5％CO2中温育。72小时后，再将4μL MTS试剂加入到这些细胞板中。将板在37℃下在5％CO2中进一步温育3小时，并在Envision读数器上测量A490处的吸光度值。
结果列于表IA中：
另外的结果，针对DMS79和H187小细胞肺癌细胞系的测试列于表IB。
实施例27-缀合物的生物活性
按照上述一般程序将二聚体-连接体化合物缀合到几种抗体：抗体4A6(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体；Terrett等人，US 8,680,247 B2(2014))；抗体1F4(抗CD70抗体；Coccia等人，US 2010/0150950 A1(2010))；和抗体6A4(抗间皮素抗体；Terrett等人，US 8,268,970 B2(2012))。这些抗体的CDR序列和其他序列和结构信息在上述参考文献中公开，并且这些信息通过引用并入本文。
针对N87胃癌细胞和Hep 3B肝癌细胞进行测试。使用3H-胸苷测定法(Cong等人，2014)测定活性。N87细胞表达间皮素但不表达CD70或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。Hep 3B细胞表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3但不表达间皮素。
结果列于表IIA和IIB。也提供了PBD-PBD二聚体-连接体化合物A的缀合物的对比数据：
另外的结果，针对表达抗原岩藻糖基GM1的DMS79和H187小细胞肺癌细胞系的试验，见表IIC。
针对N87、H226、786-O癌细胞系的另外的结果示于表IID中。使用转谷氨酰胺酶缀合具有N297A取代的抗体，如上所述。N297A突变使Q295作为转谷氨酰胺酶的胺受体可以获得，产生理论DAR为2的缀合物，尽管实际上获得了具有1.5至2范围内的DAR的缀合物。
N87是表达间皮素而不表达CD70或岩藻糖基GM1的胃(胃)癌细胞系。H226是表达间皮素而不表达CD70或岩藻糖基GM1的肺癌细胞系。786-O是表达CD70而不表达间皮素或岩藻糖基GM1的肾癌细胞系。
*抗体具有N297A取代。
在一个实施方案中，在本发明的缀合物中，抗体是抗间皮素、抗CD70、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3或抗岩藻糖基GM1抗体。
本发明的上述详细描述包括主要或全部涉及本发明的特定部分或方面的段落。应当理解，这是为了清楚和方便，特定特征可能不仅仅在其被公开的段落中相关，并且本文的公开内容包括在不同段落中发现的信息的所有合适组合。类似地，尽管这里的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应当理解，在具体特征公开于特定附图或实施方案的上下文中的情况下，这样的特征也可以在适当的情况下用于另一附图或实施方案的上下文中，与另一特征组合，或用于本发明的整体。
此外，虽然已经就某些优选实施方案特别地描述了本发明，但是本发明不限于这些优选实施方案。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。
参考文献
下面提供了本说明书中此前通过第一作者(或发明人)和日期以缩略的方式引用的以下参考文献的完整引用。为了所有目的，将这些参考文献的每一篇通过引用并入本文。
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Claims (25)

1.一种具有由式(I)表示的结构的苯并二氮杂二聚体或其药学上可接受的盐：
其中，
R1与式(Ia)或式(Ib)相符：
每个G和G’是C或N，条件是不超过两个G或两个G’是N；
每个R2独立地为H或C1-C5烷基；
每个R3和R4独立地是H、F、Cl、Br、OH、C1-C3烷基、O(C1-C3烷基)、氰基、(CH2)0-5NH2或NO2；
二氮杂环***中的每个双线独立地表示单键或双键；
如果到与R5连接、即与R5关联的N的双线是单键，则各R5为H，如果该双线是双键，则R5不存在；
如果到与R6连接、即与R6关联的C的双线是单键，则各R6是H、OH、SO3Na或SO3K，如果该双线是双键，则R6不存在；
R7、R8、R9和R10各自独立地是H、C1-C5烷基、C≡C(CH2)1-5X2、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、O(CH2)2-5X2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2- 5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基，
或当R7、R8、R9或R10连接到即关联到为N的G或G’时，该R7、R8、R9或R10不存在；
式(Ib)的环C中的虚线表示任选存在C1-C2、C2-C3或C2-R11双键；
R11是H、＝O、＝CH2、＝CH(C1-C5烷基)、CH＝CH(CH2)1-5X2、C≡C(CH2)1-5X2、C1-C5烷基、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、未取代或被(CH2)0- 5X2、O(CH2)2-5X2取代的4-至7-元芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基；
如果存在C1-C2、C2-C3或C2-R11双键，则不存在R11’，否则R11’为H；
X是
X1是CH2、O、NH、S(O)0-2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3至7元环亚烷基或杂环亚烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的6元亚芳基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5元杂亚芳基；
各X2独立地是H、F、Cl、Br、OH、O(C1-C3烷基)、O(C1-C3亚烷基)、CO2H、N3、CN、NO2、CO2(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C5烷基)、N(C1-C5烷基)2、SH、CHO、N(CH2CH2)2N(C1-C3烷基)、NHNH2或C(＝O)NHNH2；
x和y独立地为1、2或3；
各Y独立地是CH2、C＝O或CHR12；其中各R12独立地为F、Cl、Br或C1-C3烷基；和
Y’和Y”独立地是CH2、C＝O或CHR12；其中各R12独立地为F、Cl、Br或C1-C3烷基，条件是存在Y’和Y”中的至少一个(即，相关联的下标为1)。
2.根据权利要求1的苯并二氮杂二聚体，其具有由式(IIa)表示的结构：
3.根据权利要求2的苯并二氮杂二聚体，其具有由式(IIa’)表示的结构：
其中，
各R9独立地是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或且
X是
4.根据权利要求1的苯并二氮杂二聚体，其具有选自以下的结构：
5.根据权利要求1的苯并二氮杂二聚体，其具有由式(IIb)表示的结构：
6.根据权利要求5的苯并二氮杂二聚体，其具有由式(IIb’)表示的结构：
其中
R9是H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或
R11是H、＝CH2、CH＝CHMe、＝CHMe、C≡CCH2NH2、 且
X是
7.根据权利要求1的苯并二氮杂二聚体，其具有选自以下的结构：
8.根据权利要求1的苯并二氮杂二聚体，其具有由式(IIc)表示的结构：
其中
一个G’是N，其它G’是C。
9.根据权利要求1的苯并二氮杂二聚体，其具有由式(IIc-01)表示的结构：
10.一种苯并二氮杂二聚体-连接体化合物，具有式(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)或(IIIc”)表示的结构：
其中
R1与式(Ia)或式(Ib)相符：
各G和G’是C或N，条件是不超过两个G或两个G’是N；
各R2独立地为H或C1-C5烷基；
各R3和R4独立地是H、F、Cl、Br、OH、C1-C3烷基、O(C1-C3烷基)、氰基、(CH2)0-5NH2或NO2；
二氮杂环***中的每个双线独立地表示单键或双键；
如果到与R5连接的N的双线是单键，则各R5为H，如果该双线是双键，则R5不存在；
如果到与R6连接的C的双线是单键，则各R6是H、OH、SO3Na或SO3K，如果该双线是双键，则R6不存在；
R7、R8、R9和R10各自独立地是H、C1-C5烷基、C≡C(CH2)1-5X2、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、O(CH2)2-5X2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2- 5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基，
或当R7、R8、R9或R10连接至为N的G或G’时，该R7、R8、R9或R10不存在；
式(Ib)的环C中的虚线表示任选存在C1-C2、C2-C3或C2-R11双键；
R11是H、＝O、＝CH2、＝CH(C1-C5烷基)、CH＝CH(CH2)1-5X2、C≡C(CH2)1-5X2、C1-C5烷基、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、未取代或被(CH2)0- 5X2、O(CH2)2-5X2取代的4-至7-元芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基；
如果存在C1-C2、C2-C3或C2-R11双键，则不存在R11’，否则R11’为H；
各R50独立地为H、O(C1-C3烷基)、O(C2-C3亚烷基)、O(C2-C3炔基)、F、Cl、Br或CN；
X是
X1是CH2、O、NH、S(O)0-2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3至7元环亚烷基或杂环亚烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的6元亚芳基、或未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5元杂亚芳基；
各X2独立地是H、F、Cl、Br、OH、O(C1-C3烷基)、O(C1-C3亚烷基)、CO2H、N3、CN、NO2、CO2(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C5烷基)、N(C1-C5烷基)2、SH、CHO、N(CH2CH2)2N(C1-C3烷基)、NHNH2或C(＝O)NHNH2；
x和y独立地为1、2或3；
各Y独立地是CH2、C＝O或CHR12；其中各R12独立地为F、Cl、Br或C1-C3烷基；和
Y’和Y”独立地是CH2、C＝O或CHR12；其中各R12独立地为F、Cl、Br或C1-C3烷基，条件是存在Y’和Y”中的至少一个；
T为自分解基团；
t为0或1；
AAa和各AAb独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
u是0或1；
p是1、2、3或4；
q为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
r为1、2、3、4或5；
s为0或1；
R31是
XA是
其中每个x和y为1、2或3，条件是x与y之和为2或4；星号(*)表示每个XA与相邻O和R1的键合位置；如果T存在，波形线表示每个XA与T的键合位置，如果T不存在，波形线表示每个XA与AAa的键合位置。
11.根据权利要求10的苯并二氮杂二聚体-连接体化合物，其具有式(IIIa’)表示的结构：
其中
各R9独立地为H、O(CH2CH2O)1-4H、(CH2CH2O)1-4(C1-C3烷基)、OH、Cl、F或Br。
12.根据权利要求10的苯并二氮杂二聚体-连接体化合物，其具有选自以下的结构：
13.根据权利要求10的苯并二氮杂二聚体-连接体化合物，其具有式(IIIb’)表示的结构：
14.根据权利要求10的苯并二氮杂二聚体-连接体化合物，其具有选自以下的结构：
15.根据权利要求10的苯并二氮杂二聚体-连接体化合物，其具有式(IIIc’)表示的结构：
16.根据权利要求10的苯并二氮杂二聚体-连接体化合物，其具有选自以下的结构：
17.根据权利要求10的苯并二氮杂二聚体-连接体，其具有式(IIIc-08)表示的结构：
18.一种苯并二氮杂二聚体和抗体的缀合物，其具有根据式(IVa)、(IVb)、(IVc)或(IVc”)的结构：
其中
Ab是抗体；
T是自分解基团；
t为0或1；
AAa和各AAb独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
u是0或1；
p是1、2、3或4；
q为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
r为1、2、3、4或5；
s为0或1；
XA是
其中星号(*)表示XA与相邻的O’的键合位置，如果T存在，波形线表示XA与T的键合位置，如果T不存在，波形线表示XA与AAa的键合位置；
R40是
其中键合到Ab的R40的开放化合价由星号(*)表示，键合到(CH2)r的R40的开放化合价由波形线表示；
m为1、2、3或4；
R1与式(Ia)或式(Ib)相符：
各G和G’是C或N，条件是不超过两个G或两个G’是N；
各R2独立地为H或C1-C5烷基；
各R3和R4独立地是H、F、Cl、Br、OH、C1-C3烷基、O(C1-C3烷基)、氰基、(CH2)0-5NH2或NO2；
二氮杂环***中的每个双线独立地表示单键或双键；
如果到与R5连接的N的双线是单键，则各R5为H，如果该双线是双键，则R5不存在；
如果到与R6连接的C的双线是单键，则各R6是H、OH、SO3Na或SO3K，如果该双线是双键，则R6不存在；
R7、R8、R9和R10各自独立地是H、C1-C5烷基、C≡C(CH2)1-5X2、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、O(CH2)2-5X2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2- 5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基，
或当R7、R8、R9或R10连接至为N的G或G’时，该R7、R8、R9或R10不存在；
式(Ib)的环C中的虚线表示任选存在C1-C2、C2-C3或C2-R11双键；
R11是H、＝O、＝CH2、＝CH(C1-C5烷基)、CH＝CH(CH2)1-5X2、C≡C(CH2)1-5X2、C1-C5烷基、OH、O(C1-C5烷基)、氰基、NO2、F、Cl、Br、O(CH2CH2O)1-8(C1-3烷基)、(CH2)0-5X2、未取代或被(CH2)0- 5X2、O(CH2)2-5X2取代的4-至7-元芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3-至7-元环烷基或杂环烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5-至6-元芳基或杂芳基；
如果存在C1-C2、C2-C3或C2-R11双键，则不存在R11’，否则R11’为H；
各R50独立地为H、O(C1-C3烷基)、O(C2-C3亚烷基)、O(C2-C3炔基)、F、Cl、Br或CN；
X是
X1是CH2、O、NH、S(O)0-2、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的3至7元环亚烷基或杂环亚烷基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的6元亚芳基、未取代或被(CH2)0-5X2或O(CH2)2-5X2取代的5元杂亚芳基；
各X2独立地是H、F、Cl、Br、OH、O(C1-C3烷基)、O(C1-C3亚烷基)、CO2H、N3、CO2(C1-C3烷基)、NH2、NH(C1-C5烷基)、N(C1-C5烷基)2、SH、CHO、N(CH2CH2)2N(C1-C3烷基)、NHNH2或C(＝O)NHNH2；
x和y独立地为1、2或3；
各Y独立地是CH2、C＝O或CHR12；其中各R12独立地为F、Cl、Br或C1-C3烷基；和
Y’和Y”独立地是CH2、C＝O或CHR12；其中各R12独立地为F、Cl、Br或C1-C3烷基，条件是存在Y’和Y”中的至少一个。
19.根据权利要求18的缀合物，其具有式(IVa’)表示的结构：
其中
每个R9独立地为H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或
20.根据权利要求18的缀合物，其具有式(IVb’)表示的结构：
其中
R9为H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或且
X为
21.根据权利要求18的缀合物，其具有式(IVc’)表示的结构：
其中
R9为H、OH、OMe、NH2、NMe2、O(CH2CH2O)1-8Me、OCH2CH2OH或且
X为
22.根据权利要求18的缀合物，其中所述抗体是抗间皮素、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、抗CD70或抗岩藻糖基GM1抗体。
23.一种药物制剂，包含根据权利要求18的缀合物和药学上可接受的赋形剂。
24.一种治疗患有癌症的患者所患癌症的方法，包括给予该患者治疗有效量的根据权利要求18的缀合物。
25.根据权利要求24的方法，其中所述癌症是肺癌、卵巢癌、胃癌、肾癌或肝癌。
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