CN107427557A - 用于包装和表达变体因子viii以治疗血友病的改良表达组件 - Google Patents

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Abstract

公开了因子FVIII变体和使用方法。在具体实施方式中，通过细胞因子VIII变体表达效率比野生型因子VIII蛋白更高，细胞分泌水平比野生型因子VIII蛋白更高，并展示出比野生型因子VIII更强的活性，能更高效的包装进病毒载体。

Description

用于包装和表达变体因子VIII以治疗血友病的改良表达组件
相关申请
本申请要求2014年8月13日提交的美国临时专利申请62/036,936的优先权。前述申请的整体内容，包括所有文本、表格、序列表和附图通过引用并入本文中。
技术领域
本发明技术领域涉及重组凝血因子制备和与异常止血有关的医学疾病的治疗。更具体的，本发明提供改进的表达组件，其更有效的包装本发明的因子VIII变体序列，该改进的变体也展现出比野生型因子VIII蛋白增强的活性。
背景技术
引用几篇出版物和专利文件的整个说明以描述本发明涉及的现有技术。每篇引文通过引用全部并入本文。
血友病是一种伴X染色体的出血性疾病，存在概率为全球每5000个男性存在1个。针对比常规增加1％凝血因子水平的治疗可显著改善该严重疾病表型。最近，针对B型血友病(HB)的AAV介导的转基因临床试验表明了IX因子(FIX)治疗水平的持续长期表达，但也确定了由于对AAV衣壳的抗AAV免疫反应，AAV载体剂量是限制性的。虽然这些数据涉及B型血友病，80％的血友病是FVIII缺陷，即A型血友病(HA)。
对于该疾病的目前治疗是蛋白替换疗法，其需要频繁输入因子VIII蛋白。迫切需要实现因子VIII表达的持续治疗水平使患者不再需要这种频繁的蛋白治疗。确实，持续的因子VIII表达会阻止流血发作，并可确保建立蛋白免疫耐受性。
总之，HA的基因疗法存在3个明显的挑战：(1)人FVIII(hFVIII)的固有性质使其相比其他类似大小的蛋白难以表达(2)FVIII cDNA的较大尺寸与序列特异性效果与重排相关，而重排会阻碍AAV生产和(3)在25％-30％严重(<1％FVIII)HA患者中出现了针对蛋白疗法的高比例的抗FVIII抗体(抑制剂)的形成。
本发明提供改进的因子VIII变体，其可用于需要其的患者治疗，例如HA患者。
发明内容
本发明提供密码子优化的编码因子VIII(FVIII)的核酸变体，其不同于编码野生型FVIII的野生型核酸。这类密码子优化的编码FVIII的核酸变体编码FVIII蛋白，优选没有B结构域，例如没有B结构域的FVIII蛋白(例如人FVIII蛋白)(例如见图1)。这类密码子优化的编码FVIII的核酸变体展示出增强的表达，针对特定密码子优化序列(CO/CO3)是4-5倍。当转移至细胞中(例如见图6B)，导致FVIII蛋白分泌增多并因此活性增强(例如见图7)。这类密码子优化的编码FVIII的核酸变体也可更有效地包装于不同的AAV载体血清型，导致AAV载体在AAV血清型的产量增加(例如见表3-5)。
令人惊讶的是，与编码野生型FVIII的野生型核酸的表达或者没有B结构域的野生型FVIII的表达相比，这些特征显著的提高了FVIII表达，也增加了包装进AAV载体的效率，导致更高的载体产量。密码子优化的编码FVIII的序列可展示出重排事件的减少，该重排事件在AAV包装后影响FVIII转基因的整合，其可在野生型FVIII和其他密码子优化的hFVIII转基因中观察到，例如CO/CO3优于CO1或CO2。另外，在PACE-furin剪切位点具有单个氨基酸变化或较小删除(1-4个氨基酸)的非密码子优化和密码子优化的FVIII变体可展示出FVIII蛋白的增强的体内分泌活性(非密码子优化，图3B；密码子优化，图6B)以及特异性活性。发明的编码FVIII的核酸变体编码具有或没有B结构域的FVIII，和/或具有或没有突变的PACE-furin剪切识别位点，该核酸变体能增加FVIII的表达，增加AAV载体的产量，以及通过提高FVIII循环水平实现低量FVIII的止血，从而在基因转移框架下提高效力，实现减小有效剂量并带来有益治疗结果。
在一种实施方式中，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体展示出比野生型FVIII表达更强的表达。在另一种实施方式中，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体删除了B结构域，其展示出比删除B结构域的野生型FVIII表达更强的表达。在另一实施方式中，编码FVIII的核酸变体更高效的包装进病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体。
在进一步的实施方式中，通过该核酸变体编码的FVIII展示出比野生型FVIII或删除B结构域的野生型FVIII更高的生物活性(例如，通过FVIII分析中或FVIII缺陷模型中的凝血分析或出血减少来确定)。
在进一步的实施方式中，密码子优化的编码FVIII的核酸变体编码具有PACE-furin剪切识别位点的FVIII蛋白，被称为变体FVIII或变体FVIII蛋白。这类密码子优化的FVIII核酸变体编码具有PACE-furin剪切识别位点，展示出增强的分泌和凝血活性(见图2、6和7)。在特定方面，编码FVIII的核酸变体的编码FVIII的PACE/furin剪切位点的1、2、3或全部4个密码子被取代或删除。在这些方面，通过这类FVIII核酸变体编码的FVIII蛋白具有1、2、3或全部4个FVIII取代或删除的PACE/furin剪切位点。在更特定的方面，编码表述为HHQR或RHQR、位置为1645-1648的PACE/furin剪切位点的1、2、3或全部4个密码子在编码FVIII的核酸变体中被删除。
在其他方面，编码FVIII的核酸变体具有一个或多个亮氨酸密码子变为CTG，对应的编码FVIII的野生型核酸为TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。在进一步的方面，编码FVIII的核酸变体具有2-5、5-10、10-20、20-50、50-100、100-250、250-500、500-750或750-850个CTG亮氨酸密码子，这些密码子通过修饰编码FVIII的野生型核酸的TTA、TTG、CTT、CTC或CTA亮氨酸密码子获得。在其他方面，编码FVIII的核酸变体85％以上的CTG亮氨酸密码子通过修饰编码FVIII的野生型核酸的TTA、TTG、CTT、CTC或CTA亮氨酸密码子获得。在进一步的方面，编码FVIII的核酸变体所有的CTG亮氨酸密码子通过修饰编码FVIII的野生型核酸的TTA、TTG、CTT、CTC或CTA亮氨酸密码子获得。在特定方面，编码FVIII的核酸变体具有约50-59％、或50-56％或50-53％的GC含量。在其他方面，编码FVIII的核酸变体具有一个或多个AAG赖氨酸密码子，对应的编码FVIII的野生型核酸为AAA赖氨酸密码子。
在另外方面，编码FVIII的核酸变体至少75％与野生型人FVIII核酸或删除B结构域的野生型人FVIII核酸相同。在更特定方面，编码FVIII的核酸变体约75-85％(例如约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％或85％)与野生型人FVIII核酸或删除B结构域的野生型人FVIII核酸相同。
在特定方面，编码FVIII的核酸变体表述于SEQ ID：1-7和9中任意一个。
在各种实施方式中，编码FVIII的核酸变体是哺乳动物的，例如人。这种编码哺乳动物FVIII的核酸变体包括人形式的，可基于野生型FVIII或删除B结构域的野生型FVIII。
本发明还提供包括本文所述的编码FVIII的核酸变体的表达载体。在特定方面，表达载体包含腺相关病毒(AAV)载体、反转录病毒载体、腺病毒载体、质粒或慢病毒载体。在特定方面，AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清型。
表达载体可包括额外的组件或元件。在特定的实施方式中，表达载体如AAV载体进一步包括内含子、表达控制元件、一个或多个AAV末端反向重复(ITR)(例如以下任意一个：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清型,或其组合)和/或填充多核苷酸序列。在特定方面，内含子位于编码FVIII的核酸变体的内部或两侧，和/或表达控制元件可操作的连接至编码FVIII的核酸变体，和/或一个或多个AAV ITR位于编码FVIII的核酸变体的5'或3’末端，和/或填充多核苷酸序列位于编码FVIII的核酸变体的5’或3’末端。
在特定方面，表达控制元件包含基本的或可调节的控制元件，或者组织特异性表达控制元件或启动子。在更特定方面，表达控制元件包含赋予在肝脏表达功能的元件。在其他特定方面，表达控制元件包含TTR启动子或突变TTR启动子，例如SEQ ID：8。
本发明还提供表达由本文所述的核酸变体编码的FVIII的宿主细胞。在特定实施方式中，宿主细胞包括编码FVIII的核酸变体或包含编码FVIII的核酸变体的表达载体。在特定方面，这些宿主细胞生产由核酸变体编码的FVIII蛋白，并对生产的FVIII蛋白进行回收。这类由细胞生产的FVIII蛋白，可选的经过分离和/或纯化，可给予给本文所列主体。
本发明进一步提供包括编码FVIII的核酸变体的病毒载体或包含编码FVIII的核酸变体的表达载体。在特定方面，病毒载体包括AAV载体。在特定方面，AAV载体包含VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8VP1、VP2和/或VP3序列具有75％以上的序列一致性(例如,80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％等)。在更特定方面，AAV载体包括选自以下任意一种的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74和AAV-2i8AAV血清型。
本发明还提供包括本文所述的编码FVIII的核酸变体的组合物。在特定实施方式中，药物组合物在生物相容载体或赋形剂中包含表达载体、或病毒或AAV载体。这类药物组合物可选的包括空衣壳AAV(例如，缺少包含编码FVIII的核酸变体的载体基因组)。在另外的特定实施方式中，编码FVIII的核酸变体、表达载体、或病毒或AAV载体包裹于脂质体或与磷脂或微胶粒混合。
本发明进一步提供递送或转移编码FVIII的核酸变体至哺乳动物或哺乳动物细胞的方法。在一种实施方式中，方法包括给予编码FVIII的核酸变体、包含编码FVIII的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的核酸变体的病毒或AAV载体给哺乳动物或哺乳动物细胞，或使其相互接触，从而递送或转移核酸序列至哺乳动物或哺乳动物细胞。这类方法将编码FVIII的核酸变体引入培养的哺乳动物细胞或主体(例如患者)。
本发明方法还包括治疗需要因子VIII的主体(例如患者)例如人(人不能产生足够因子VIII蛋白或者因子VIII缺陷或异常)。在一种实施方式中，治疗需要因子VIII的哺乳动物的方法包括：提供编码FVIII的核酸变体、或包含编码FVIII的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的核酸变体的病毒或AAV载体；以及给予一定量的编码FVIII的核酸变体、或包含编码FVIII的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的核酸变体的病毒或AAV载体给哺乳动物主体，使得由编码FVIII的核酸变体编码的因子VIII在哺乳动物主体中表达。
在另一实施方式中，用于治疗需要该物质的止血相关疾病的患者(例如患者不能产生足量的因子VIII蛋白，或因子VIII蛋白缺陷或异常)的方法包括给予包含在生物可接受载体中的治疗有效量的编码FVIII的核酸变体、或包含编码FVIII的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的核酸变体的病毒或AAV载体给患者。
在本发明方法的特定方面，因子VIII表达水平有利于治疗哺乳动物；和/或因子VIII表达于哺乳动物的细胞、组织或器官中。这些方面包括将编码FVIII的核酸变体引入组织或器官例如肝脏中。这些方面还包括将编码FVIII的核酸变体引入分泌细胞中。这些方面还包括将编码FVIII的核酸变体引入内分泌细胞或内皮细胞中。这些方面还包括将编码FVIII的核酸变体引入肝细胞、肝窦内皮细胞、巨核细胞、血小板或造血干细胞。
给予(或递送)编码FVIII的核酸变体、或包含编码FVIII的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的核酸变体的病毒或AAV载体的候选主体(例如患者)和哺乳动物(例如人)包括患有以下疾病或具有患以下疾病风险的那些：A型血友病、血管性血友病、创伤相关出血、受伤、血栓症、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)或过度抗凝作用治疗疾病。
给予(或递送)编码FVIII的核酸变体、或包含编码FVIII的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的核酸变体的病毒或AAV载体的候选主体(例如患者)和哺乳动物(例如人)包括那些对AVV抗体呈血清反应阴性的，以及那些产生AVV抗体或具有产生AVV抗体风险的。这类主体(例如患者)和哺乳动物(例如人)对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-Rh10或AAV-Rh74血清型呈血清反应阴性或血清反应阳性。
本发明的方法因此进一步包括给予空衣壳AAV给该哺乳动物或患者。在特定实施方式中，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-12、AAV-Rh10和/或AAV-Rh74血清型的衣壳进一步给予给哺乳动物或患者。
本发明给予(例如递送)方法包括体外或体内的任意模式的接触或递送。特定的给予(例如递送)实施方式是：静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下给药、腔内给药、通过插管法或通过导管。
本发明还提供用于测试小和大动物模型中的改进FVIII变体的方法，该模型对人FVIII耐受以评估变体剂量和监控免疫原性。HB狗模型对于预测人FIX基因治疗所需的有效剂量是表现优秀的。而且，使用该模型提供一环境，允许评估对这类变体可能产生免疫反应的人，而这些人目前在没有证据表明抗hFVIII抗体响应的情形下接受hFVIII-BDD蛋白替换疗法。
附图说明
图1显示了因子VIII的蛋白酶切。FVIII具有由3个A结构域(A1、A2和A3)、两个C结构域(C1和C2)和由基因外显子14编码的大的B结构域组成的域结构，该B结构域对于实现FVIII是非必需的。FVIII作为因子IXa催化的反应中激活因子X至Xa的辅因子。FVIII作为由FVIII重链和轻链组成的异质二聚体分泌，该重链和轻链通过血管性血友病因子(vWF)稳定于循环中。经过凝血酶剪切，FVIII形成被激活的异质二聚体。
图2显示了AAV递送密码子优化的因子VIII后因子VIII的表达。在腺相关病毒载体血清型8中的密码子优化的人因子VIII基因(CO)被递送至A型血友病/CD4基因敲除小鼠。递送1x1011载体基因组(vg)/小鼠的hFVIII-SQ(野生型因子VIII cDNA)、TTR-hFVIII-SQ-CO、TTRmut-hFVIII-SQ-CO或TTRmut-hFVIII-SQ-CO-delP/F给小鼠。在载体给予后第2、4、6、8和12周收集等离子体进行ELISA，确定循环中的因子VIII蛋白水平。
图3A显示了非密码子优化的AAV-hFVIII构建体。AAV-hFVIII载体具有删除野生型B结构域(BDD)的人因子VIII cDNA。增强子/启动子元件是最低限度的肝控制区域-人α-1抗胰蛋白酶增强子/启动子(HCR-hAAT)，其具有缩短版本的人脱辅基蛋白ExxC-1基因座的肝控制区域(Nathwani,et al.2006,Sabatino et al.2011)。还包括65bp的SV40内含子和134bp的SV40聚腺苷酸化。这些构建体的唯一区别是一个利用了野生型hFVIII-BDD(顶部构建体)，另一个利用了删除PACE-furin的野生型hFVIII-BDD的变体(底部构建体)。所有的5个P/F删除变体(表1)被引入表达组件。
图3B显示了AAV8递送删除PACE-furin的hFVIII变体后FVIII的表达。AAV(5x1011vg/小鼠)被递送至A型血友病/CD4基因敲除(免疫缺陷的)小鼠。在给予AAV后12周hFVIII表达(抗原和活性)在等离子体中。*p＜0.05。
图4A显示了人野生型和密码子优化FVIII转基因构建体。TTR启动子驱动密码子优化的FVIII的表达。SQ，删除B结构域形式，其在接合点具有S743和Q1638；ITR，将转基因包装进AAV载体所需的末端反向重复序列。
图4B显示了hFVIII的密码子优化导致更高的表达水平。在AAV载体给予后4周和8周，比较了AVV递送的CO1FVIII、CO2FVIII、和野生型FVIII的FVIII表达和活性水平。
图4C显示了hFVIII的密码子优化导致更高的表达水平。在AAV载体给予后4周和8周，比较了AVV递送的CO1FVIII、CO3/CO FVIII、和野生型FVIII的FVIII表达和活性水平。
图5A显示了AAV递送CO3后FVIII的表达。比较了TTR启动子和TTR变体(TTRm)启动子与FVIII-CO3。删除PACE-furinΔ4(delP/F)的TTR变体启动子被引入CO3。
图5B显示了数据表明TTR变体启动子导致AAV递送后FVIII-CO3表达增加。
图6A显示了人FVIII转基因构建体。转基因构建体利用经修饰的甲状腺素运载蛋白启动子(TTRm)、合成内含子(Intron)、和多腺苷酸化信号(Poly A)。因子VIII转基因是删除B结构域的野生型人因子VIII cDNA(WT FVIII)或删除B结构域的密码子优化的人因子VIII cDNA(CO FVIII)。删除PACE-furin的变体Δ3或Δ4被引入hFVIII转基因。Δ3，删除PACE-furin剪切识别位点的三个残基(氨基酸1645-1647)。Δ4，删除PACE-furin剪切识别位点的四个残基(氨基酸1645-1648)。SQ，删除B结构域形式，其在接合点具有S743和Q1638；ITR，将转基因包装进AAV载体所需的末端反向重复序列。
图6B显示了AAV递送野生型和密码子优化的FVIII构建体后因子VIII的表达。通过人FVIII特异性ELISA(Affinity Biologicals)确定hFVIII抗原水平。通过Coatest分析确定的FVIII活性与FVIII抗原水平相关。在2周和4周的时间点，这些呈现的数据与TTRmut-hFVIII-wtSQ具有倍数差异。
图7显示了在AAV递送野生型和密码子优化的hFVIII构建体后小鼠体内止血挑战。在载体给予((1x1011vg/小鼠)6周后，用AAV-hFVIII构建体处理的小鼠使用尾夹分析进行挑战(Ivanciu L et al.Nature Biotech 2011,29(11):1028-1033)。小鼠用异氟烷麻醉，尾巴在37℃预加温，然后将尾巴横切成直径为3mm。在37℃下收集血液10min于14ml生理盐水中。在红细胞裂解后，通过在575nm吸光度测定总血红蛋白来确定总失血量(μl)。用AAV-hFVIII构建体处理的A型血友病小鼠的失血量与未处理的A型血友病小鼠以及野生型小鼠的失血量进行比较。
具体实施方式
先前报道已经显示犬类FVIII(cFVIII)的AAV肝脏基因疗法导致FVIII在先天HA狗中进行长期的治疗水平的表达(Sabatino et al.Mol Ther 19,442-449,2011)。该策略用预先存在的中和cFVIII抗体消除了HA狗中cFVIII的抑制剂(Finn,J.D.et al.,Blood 116,5842-5848,2010)。这些数据显示AAV-FVIII能显著改善疾病表型并清除FVIII抑制剂。有趣的是，cFVIII天生比人FVIII(hFVIII)更稳定，导致生物活性提高(Sabatino,D.E.etal.Blood 114,4562-4565,2009)。因此，cFVIII的AAV剂量并不能预测hFVIII的治疗剂量。这与因子IX形成对比，该因子在两个物种中具有相似的生物活性，并能预测人中的治疗性AAV剂量。显然，对于HB而言，血友病狗模型是肝脏和肌肉中转基因效力和免疫反应的出色的预测者。
为了理解cFVIII的改进功能的生化基础，我们确定了FVIII中的PACE-furin剪切识别位点，与所有其他物种包括hFVIII相比，该位点在cFVIII是独特的。hFVIII中该位点单个氨基酸改变的引入赋予了hFVIII更高的稳定性和更高的生物活性(Siner,J.I.,etal.Blood 121,4396-4403,2013)。
本文公开的是编码人FVIII的核酸变体，其与编码FVIII的野生型核酸不同。这类编码人FVIII的核酸变体在细胞和/或动物中表达水平较高，因而能提供较高的体内FVIII蛋白水平。本文还公开了编码人FVIII的核酸变体，该变体可更高效的包装进不同血清型的AAV。进一步公开的是编码人FVIII蛋白变体的核酸变体，其在体外和/或体内具有更高的稳定性和/或生物活性。
进一步公开的是AAV递送几种人FVIII变体至A型血友病动物模型的效力和安全性。具体的，例如在细胞内蛋白酶切识别位点具有或没有删除的编码人FVIII的密码子优化的核酸展示出一下一种或多种性状：1)在细胞和/或动物中表达水平提高；2)活性提高，其通过例如凝血增强反映；3)稳定性提高；和4)与天然hFVIII相比，低AAV剂量实现治疗效果，与现有的删除B结构域的FVIII构建体相比没有明显的免疫原性增加。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中交换使用，指所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、剪接或未剪接mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸包括天然产生的、合成的以及人工修饰或改造的多核苷酸(例如变体核酸)。多核苷酸可以是单链、双链或三链，线性或环状，并可以是任意长度。在讨论多核苷酸时，根据惯例，在本文中描述特定多核苷酸的序列和结构时会提供序列的5’至3’方向。
如本文使用的，术语“修饰”或“变体”及其语法上的变形，是指由参考序列衍生的核酸、多肽或其序列。因此，与参考序列相比，修饰或变异序列可具有实质相同、大于或小于的表达水平、活性或功能，但至少保留参考序列的部分活性或功能。修饰或变体的一特定实例是编码FVIII的密码子优化的核酸序列。
“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已发生基因改变的修饰序列。该序列可以是发生基因改变而未改变编码的蛋白序列。或者，序列可发生基因改变编码变体蛋白。核酸或多核苷酸变体可指结合序列，其发生密码子修饰以编码蛋白，但其保留至少部分序列与参考序列相同，例如野生型蛋白序列，其还发生密码子修饰以编码变体蛋白。例如，该核酸变体的一些密码子将发生改变但不改变由其编码的蛋白(FVIII)的氨基酸，该核酸变体的一些密码子将发生改变从而改变其编码的蛋白质(FVIII)的氨基酸。
术语“变体因子VIII(FVIII)”是指发生基因改变的经修饰的FVIII，使得编码的蛋白与未经修饰的野生型FVIII或FVIII-BDD相比表达水平提高。这类变体可以指“编码因子VIII(FVIII)的核酸变体”。与HCR/hAAT启动子驱动的野生型hFVIII(图2)相比，TTRmut-hFVIII-SQ-CO delP/F表达组件提高至少30倍。这类FVIII修饰的特定实例是编码FVIII的密码子优化的变体，与非密码子优化的野生型FVIII或FVIII-BDD相比，其展示出提高的表达活性和/或提高的AAV载体包装效率，且这样做不会改变编码的FVIII蛋白的氨基酸。当比较表达水平时，如果变体FVIII蛋白保留了B结构域，其适合与野生型FVIII表达水平进行比较；如果该变体FVIII蛋白删除了B结构域，其适合与同样删除了B结构域的野生型FVIII进行表达水平比较。
“变体因子VIII(FVIII)”也指经修饰的FVIII蛋白，该修饰蛋白与野生型FVIII相比氨基酸发生了改变，其与野生型FVIII相比展示出提高的活性和/或稳定性。这类特定FVIII蛋白修饰的实例是导致FVIII蛋白中的PACE-furin剪切识别位点突变、删除或取代的基因修饰，在此是指变体FVIII蛋白。当比较活性和/或稳定性时，如果变体FVIII蛋白保留了B结构域，其适合与野生型FVIII进行比较；如果该变体FVIII蛋白删除了B结构域，其适合与同样删除了B结构域的野生型FVIII进行比较。
本文描述的核苷酸序列可容易的从GenBank获得。人FVIII，见登录号NG-011403.1。犬FVIII，见登录号NM-001003212-1。FVIII-BDD、hFVIII-BDD、cFVIII-BDD等是指缺少B结构域的FVIII变体(见例如图1)。
由“核酸”或“多核苷酸”序列编码的“多肽”、“蛋白”和“肽”，包括全长天然(FVIII)序列，如天然产生的野生型蛋白，以及功能子序列、修饰形式或序列变体，只要该子序列、修饰形式或变体保留天然全长蛋白的部分功能。例如，FVIII蛋白可删除本文所称的B结构域并保留凝血功能。在本发明方法和用途中，这类由核酸序列编码的多肽、蛋白和肽可以是但非必须是与一内生蛋白相同，该内生蛋白是有缺陷的，或其表达不足或在治疗动物中不足。
修饰的非限制性实例包括一个或多个核苷酸或氨基酸取代(例如1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-500、500-750、750-850或更多核苷酸或残基)。核酸修饰的实例是密码子优化，例如将非CTG的亮氨酸密码子修饰成CTG，或者将非AAG的赖氨酸密码子修饰成AAG。核酸密码子优化修饰的另一实例是增加GC含量。在特定方面，编码人FVIII蛋白的变体核酸序列具有比编码人因子FVIII的天然序列多1-5％的GC含量(例如多1％、2％、3％、4％或5％GC含量)；或者比编码人因子FVIII的天然(野生型)序列多5-10％的GC含量(例如多5％、6％、7％、8％、9％或10％的GC含量)；或者具有比编码人因子FVIII的天然(野生型)序列多10-15％的GC含量(例如多10％、11％、12％、13％、14％、或15％GC含量)。
氨基酸修饰的实例是参考序列如FVIII的保守氨基酸取代或删除(例如子序列或片段，或者PACE/furin剪切位点的删除)。在特定实施方式中，修饰或变体序列保留至少一部分非修饰序列的功能或活性。
所有已知或未知的编码蛋白的哺乳动物和非哺乳动物形式的核酸，包括本文公开的其他哺乳动物形式的FVIII核酸和FVIII蛋白都清楚的包含于本发明中。因此，本发明包括非哺乳动物、除了人的哺乳动物，和人的基因、蛋白，该基因和蛋白功能与本文描述的FVIII(例如人)基因和蛋白实质相似。
术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)、或其他能够进行***或结合核酸操作的载体。这类载体可用于基因操作(即“克隆载体”)，以引入/转移多核苷酸进细胞，并在细胞中转录或翻译该***的多核苷酸。“表达载体”是包含基因或核酸序列的特定载体，该基因或核酸序列具有在宿主细胞表达所需的必要调控区域。载体核酸序列通常包含至少一个复制起点，用于在细胞中增殖，以及可选的额外组件，例如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、ITR、选择性标记(例如抗生素抗性)、多腺苷酸化信号。
病毒载体源于或基于包含病毒基因的一种或多种核酸元件。特定的病毒载体包括慢病毒、假性慢病毒和细小病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体。还提供包含编码变体FVIII多肽的核酸序列。
术语“重组”作为载体修饰物，例如重组病毒，例如慢病毒或细小病毒(例如AAV)载体，以及序列修饰物例如重组多核苷酸或多肽，是指以自然界通常不会发生的方式操作(例如基因工程)的组合物。重组载体的特定实例，例如AAV载体，是指将通常不会存在于野生型病毒(例如AAV)基因组的多核苷酸***病毒基因组。重组多核苷酸的实例是编码FVIII蛋白的核酸(例如基因)克隆进载体，具有或没有5’、3’和/或内含子区域，该基因通常与病毒(例如AAV)基因组内关联。尽管术语“重组”并非一直用于指载体，例如病毒和AAV载体，以及序列例如多核苷酸，不管出现何种省略，包括多核苷酸的重组形式清楚的包含于本发明。
重组病毒“载体”或“AAV载体”源于病毒的野生型基因组，例如AAV，其通过使用分子方法从病毒(例如AAV)除去野生型基因组，然后用非天然核酸取代，例如编码FVIII的核酸变体序列。通常对于AAV而言，AAV基因组的一种或两种末端反向重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”病毒载体(例如AAV)区别于病毒(例如AAV)基因组，因为与病毒(例如AAV)基因组核酸相关的所有或部分病毒基因组被非天然序列取代，例如编码FVIII的核酸变体序列。结合非天然序列因此将病毒载体(例如AAV)限定为“重组”载体，其在AAV情形下可指“rAAV载体”。
重组载体(例如慢病毒、细小病毒、AAV)序列可包装为本文所称的“颗粒”用于后续体外或体内感染(转导)细胞。当重组载体序列封装或包装进AAV颗粒，该颗粒也可称为“rAAV”。这类颗粒包括封装或包装载体基因组的蛋白。特定实例包括病毒包膜蛋白、以及AAV情形下的衣壳蛋白。
载体“基因组”是指最终包装或封装以形成病毒(例如AAV)颗粒的重组质粒序列部分。在重组质粒被用于构建或制造重组载体的情形下，载体基因组不包括不与重组质粒的载体基因组序列相符的质粒部分。这种重组质粒的非载体基因组部分是指质粒骨架，其对于质粒的克隆和扩增是重要的，这对于增殖和重组病毒生产是必须的过程，但对其自身包装或封装进病毒(例如AAV)颗粒是不重要的。因此，载体“基因组”是指通过病毒(例如AAV)包装或封装的核酸。
本文使用的“转基因”便利的指意图或已经引入细胞或生物体的核酸。转基因包括任何核酸，例如编码多肽或蛋白(例如因子VIII)的基因。
在具有转基因的细胞中，转基因通过载体例如AAV、转导或转染细胞被引入/转入。术语“转换”和“转染”是指引入分子如核酸进细胞或宿主生物。转基因可以结合也可以不结合进受体细胞的基因组核酸。如果被引入的核酸整合进受体细胞或生物的核酸(基因组DNA),其可稳定保持在细胞或生物中并进一步传递至受体细胞或生物的后代细胞或生物或由其继承。最终，引入的核酸可存在于受体细胞或宿主生物的染色体外或仅短暂存在。
“转换”细胞是引入转基因的细胞。相应的，“转换”细胞(例如哺乳动物，例如细胞或组织或器官细胞)是指整合外源分子例如核酸(例如转基因)进细胞后细胞中的遗传改变。因此，“转换”细胞是指外源核酸引入的细胞或其后代细胞。细胞可增殖，引入的蛋白可表达，或核酸可转录。对于基因治疗用途和方法，转换细胞可以在主体中。
“表达调控元件”是指影响可操作连接核酸表达的核酸序列。调控元件，包括本文表述的表达调控元件例如启动子和增强子，和载体序列包括AAV载体，可包括一个或多个“表达调控元件”。通常的，包括这类元件有助于适当的异源多核苷酸转录和适当的翻译(如有)(例如启动子、增强子、内含子剪接信号、维持基因正确阅读框以允许mRNA框内翻译，以及终止密码子等)。这类元件通常顺式作用，称为“顺式作用”元件，但也可以是反式作用的。
表达调控可受转录、翻译、剪接、信息稳定性水平等的影响。通常的，调控转录的表达调控元件并列在转录的核酸的5’末端附近(即上游)。表达调控元件还可位于转录序列的3’末端(即下游)或转录子(例如内含子)内。表达调控元件可位于转录序列附近或与其具有一定距离(例如距离多核苷酸1-10、10-25、25-50、50-100、100-500或更多核苷酸)，甚至相隔相当远的距离。然而，由于某些载体例如AAV载体的长度限制，表达调控元件通常距离转录核酸1-1000个核苷酸。
功能上，可操作连接的核酸的表达至少部分通过元件(例如启动子)可控，使得元件调节核酸转录以及适当的转录子的翻译。表达调控元件的特定实例是启动子，其通常位于转录序列的5’，例如编码因子VIII(FVIII)的核酸变体。与没有启动子的表达量相比，启动子通常增加可操作连接核酸的表达。
本文使用的“增强子”能指位于异源多核苷酸附近的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也可作用并位于序列(例如编码因子VIII(FVIII)的核酸变体)的下游或位于序列内。因此，增强子元件可位于编码因子VIII(FVIII)核酸变体上游或下游100碱基对、200碱基对或300碱基对或更多碱基对处。增强子元件通常在启动子元件提供的表达之上增加可操作连接核酸的表达。
表达构建体可包括调节元件，用于驱动特定细胞或组织类型的表达。表达调控元件(例如启动子)包括那些在特定组织或细胞类型中具有活性的，本文是指“组织特异性表达调控元件/启动子”。组织特异性表达调控元件通常在特异性细胞或组织(例如肝脏)中是具有活性的。表达调控元件通常在特定细胞、组织或器官中具有活性，因为其由转录激活蛋白或其他转录调节子识别，其对特异性细胞、组织或器官是独特的。这类调节元件对于本领域技术人员是已知的(见例如，Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1992))。
本发明的表达构建体内的组织特异性调节元件的结合为变体FVIII或其功能片段提供至少部分组织特异性。在肝脏中具有活性的启动子实例是TTR启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子；白蛋白，Miyatake,et al.J.Virol.,71:5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子,Sandig,et al.,Gene Ther.3:1002-9(1996)；α-fetoprotein(AFP),Arbuthnot,etal.,Hum.Gene.Ther.,7:1503-14(1996)],等等。肝脏中具有活性的增强子的实例是载脂蛋白E(apoE)HCR-1和HCR-2(Allan et al.,J.Biol.Chem.,272:29113-19(1997))。
表达调控元件还可包括普遍存在的或混杂的启动子/增强子，其能够驱动许多不同细胞类型中的多核苷酸的表达。这类元件包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子序列，劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列和其他病毒启动子/增强子，其在各种哺乳动物细胞类型具有活性，或者自然界不存在的合成元件(见例如,Boshart etal,Cell,41:521-530(1985))，SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
表达调控元件也可使表达可调控，即信号或刺激可操作连接异源多核苷酸的表达升高或降低。响应于信号或刺激增加可操作连接多核苷酸的可调控元件也被称为“可诱导元件”(即通过信号诱导)。特定实例包括但不限于激素(例如类固醇)诱导启动子。通常，由该原件赋予的增加或降低量与存在的信号或刺激的量成比例；信号或刺激的量越大，表达增加或降低的量越大。特定的非限制性实例包括锌诱导羊金属硫蛋白(MT)启动子；类固醇激素诱导小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子；T7聚合酶启动子***(WO 98/10088)；四环素可抑制***(Gossen,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))；四环素诱导***(Gossen,et al.,Science.268:1766-1769(1995)；还可见Harvey,et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518(1998))；RU486-诱导***(Wang,et al.,Nat.Biotech.15:239-243(1997)以及Wang,et al.,Gene Ther.4:432-441(1997)]；以及雷帕霉素诱导***(Magari,et al.,J.Clin.Invest.100:2865-2872(1997)；Rivera,et al.,Nat.Medicine.2:1028-1032(1996))。其他可用于本发明的可调节控制元件是那些通过特异性生理状态例如温度、急性期、发育调节的。
表达控制元件还包括异源多核苷酸的天然元件。当需要使异源多核苷酸模仿天然表达时，可使用天然控制元件(例如启动子)。当异源多核苷酸的表达受暂时或发育调控，或以组织特异性方式调控，或通过响应特异性转录刺激调控，可使用天然元件。其他天然表达控制元件如内含子、聚腺苷酸化位点或Kozak一致性序列也可使用。
术语“可操作连接”是指表达编码序列必须的调节序列置于相对于编码序列合适的位置，从而产生编码序列的表达。相同定义应用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子、和终止元件)的排列。该定义有时也应用于第一和第二核酸分子核酸序列的排列，其中生成杂交核酸分子。
在表达控制元件与核酸可操作连接的实例中，其关系使得控制元件调节核酸表达。更具体的，例如，两个DNA序列可操作的连接是指两个DNA以这样一种关系排列(顺式或反式)使得至少一个DNA能够对另一序列施以生理影响。
相应的，载体的另外元件，包括，不受限制的，表达控制(例如启动子/增强子)元件，转录终止信号或终止密码子，5’或3’未翻译区域(例如聚腺苷酸化(polyA)序列)其位于序列两侧，例如AAV、ITR序列或内含子的一个或多个副本。
进一步的元件包括，例如，填充物或填充多核苷酸序列，例如以改进包装并减少污染核酸的存在。AAV载体通常接受DNA***，该DNA具有的尺寸范围通常为约4kb至约5.2kb，或者稍微更大一些。因此，对于较短序列，包括填充片段或填充物以调节长度至接近或达到AAV载体包装进病毒颗粒所能接受的病毒基因组序列的正常大小。在各种实施方式中，填充物/填充核酸序列是未翻译(非编码蛋白)的核酸片段。对于小于4.7Kb的核酸序列，填充物或填充多核苷酸序列具有一长度，当与序列结合(例如***载体)时，具有的总长度为约3.0-5.5Kb，或约4.0-5.0Kb，或约4.3-4.8Kb。
内含子也可作为填充物或填充多核苷酸序列，以达到AAV包装进病毒颗粒的长度。作为填充物或填充多核苷酸序列的内含子和内含子片段也可增强表达。
术语“止血相关疾病”是指出血疾病，例如A型血友病，具有抑制性抗体、缺少凝血因子VII、VIII、IX和X、XI、V、XII、II,缺少血管性血友病因子，FV/FVIII综合缺陷，维他命K环氧化物还原酶C1缺陷，γ羧化酶缺陷的A型血友病患者；与创伤、受伤、血栓症、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)；肝素相关过度抗凝作用、低分子量肝素、戊多糖、华法令阻凝剂、小分子抗血栓形成物(即FXa抑制剂)；以及血小板病例如巨大血小板综合征、血小板无力症和存储池缺陷。
术语“分离”当用于修饰组合物时，是指组合物由人手制造或者完全或至少部分从天然产生的体内环境分离。通常，分离的组合物缺少一种或多种在自然界中与其关联的材料，例如，一种或多种蛋白、核酸、脂质、糖类、细胞膜。
对于本发明核酸，术语“分离”是指从一种或多种在起源生物自然产生基因组(基因组DNA)中与其立即连接(在5’和3’方向)的序列中分离的核酸分子。例如，“分离的核苷酸”可包含***在载体，如质粒或病毒载体，或整合在原核细胞或真核细胞DNA中的DNA或cDNA分子。
关于本发明的RNA分子，术语“分离”主要指由上面定义的分离的DNA所编码的RNA分子。或者，术语可指从多种RNA分子中充分分离的RNA分子，在其自然状态(即细胞或组织)，该RNA分子会与该多种RNA分子联合，使得其以“实质纯净”形式存在(术语“实质纯净”如下文所定义)。
关于蛋白，术语“分离蛋白”或“分离并纯化的蛋白”有时会用于本文。术语主要指由分离的核酸分子表达产生的蛋白。或者，该术语指与其他蛋白充分分离的蛋白，二者自然产生联系，使得其以“实质纯净”形式存在。
术语“分离的”并不排除由人手制造的组合，例如重组载体(例如rAAV)序列，或者包装或封装载体基因组和药物制剂的病毒颗粒。术语“分离的”并不排除组合物的可替换的物理形式，例如杂交/嵌合体，多聚体/寡聚物，修饰(例如磷酸化、糖基化、脂化)或衍生形式，或由人工生产的宿主细胞中表达的形式。
术语“实质纯净”是指制备包含至少50-60％重量的目标化合物(例如核酸、寡核苷酸、蛋白等)。该制备可包含至少75％重量或约90-99％重量的目标化合物。通过适当的方法来测量目标化合物的纯度(例如层析法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等等)。
术语“主要由...组成”当涉及特定核苷酸序列或氨基酸序列时是指具有给定SEQID号的性能的序列。例如，当用于指氨基酸序列，术语包括自身序列和分子修饰，该分子修饰不会影响序列的基本和新特性。
术语“寡核苷酸”在此是指引物和探针，定义为包含两个或多个核苷酸或脱氧核苷酸，例如多于3个。寡核苷酸的精确大小取决于各种因素并取决于其特定应用。
术语“探针”在此是指寡核苷酸、多核苷酸或核酸，DNA或RNA，不管是天然产生用纯限制性酶消化或者合成产生的，其通过与探针互补的序列，能够与核酸退火或与核酸特异性杂交。探针可以是单链或双链的。探针的精确长度将取决于多种因素，包括温度、探针源和使用方法。例如，对于诊断应用，取决于目标序列的复杂性，寡核苷酸探针通常包含15-25或更多核苷酸，但其可以包含更少核苷酸。
在此探针选择与特定目标核酸序列的不同链“实质性”互补。这意味着探针必须足够互补以能够在一系列预定条件下与它们各自的目标链“特异性杂交”或退火。因此，探针序列无需反映目标的精准互补序列。例如，非互补核苷酸片段可结合至探针的5’或3’末端，探针序列的剩余部分与目标链互补。或者，非互补碱基或更长序列散布进探针，如果探针序列具有与目标核酸序列足够的互补性以特异地与其退火。
术语“特异性杂交”是指足够互补序列的两个单链核酸分子之间的联合以允许在本领域常用的预定条件下的杂交(有时称为“实质性互补”)。特别的，术语是指寡核苷酸与包含在本发明单链DNA或RNA分子中的实质互补序列杂交，实质性排除寡核苷酸与非互补序列的单链核酸的杂交。
术语“引物”是指寡核苷酸，是RNA或DNA，是单链或双链，是源于生物***通过限制性酶消化或置于合适环境合成产生并能够在功能上作为模板依赖性核酸合成的引发剂。当与合适核酸模板一起陈述，核酸的合适的核苷三磷酸前体物、聚合酶、合适的辅因子和条件例如合适温度和pH，通过添加核苷酸通过聚合酶作用或相似活动，引物在其3’延伸产生引物延伸产物。
引物长度可变，取决于特定条件和应用要求。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物通常为15-25个核苷酸长度或更长。引物必须与目标具有足够互补性，以引发目标延伸产物的合成，即，以足够合适的并列提供3’羟基部分的方式，能够与目标模板链退火，用于通过聚合酶或相似酶启动合成。引物序列无需代表目标模板的精确互补物。例如，非互补核苷酸序列可结合至与其他互补的引物的5’末端。或者，非互补碱基可散布于寡核苷酸引物序列，如果引物序列与目标链序列具有足够的互补性，以功能上提供模板-引物复合物用于延伸产物的合成。
术语“一致性”、“同源性”及其语法变形，是指两种或更多种所列实体当其是“对齐”序列时是相同的。因此，通过举例，当两种多肽序列是一致的，他们具有相同氨基酸序列，至少在指定区域或部分。当两种多核苷酸序列是一致的，他们具有相同多核苷酸序列，至少在指定区域或部分。一致性能在序列的限定区域(区或结构域)。一致性的“区域”或“区”是指两个或多个相同参考实体的部分。因此，当两个蛋白或核酸序列在一个或多个序列区域或区一致，它们在该区共享一致性。“对齐”序列指多个核苷酸或蛋白(氨基酸)序列，经常包含针对与参考序列相比出现的碱基或氨基酸(缺口)的缺失或添加的校正。
一致性可延伸至序列的整个长度或部分。在特定方面，共享部分一致性的序列长度是2、3、4、5或更多连续核酸或氨基酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等的连续核酸或氨基酸。在另外的特定方面，共享一致性的序列长度是21个或更多连续核酸或氨基酸，例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个等的连续核酸或氨基酸。在进一步的特定方面，共享一致性的序列长度是41个或更多连续核酸或氨基酸，例如42、43、44、45、45、47、48、49、50个等的连续核酸或氨基酸。在另外的特定方面，共享一致性的序列长度是50个或更多连续核酸或氨基酸，例如50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-110个等的连续核酸或氨基酸。
如本文所述，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体与编码FVIII的野生型核酸不同(例如是非野生型)但展示与其的序列一致性。在编码FVIII的密码子优化的核酸变体中，指示的CO1、CO2和CO/CO3，在核苷酸序列水平，在编码FVIII的密码子优化的核酸变体将通常至少约70％，更典型的约75％，甚至约80％-85％与编码FVIII的野生型核酸是一致的。因此，例如，编码FVIII的密码子优化的核酸变体可具有与编码FVIII的野生型基因75％-85％的一致性，或者相互具有该比例的一致性，即CO1vs.CO2,CO1vs.CO3,CO2vs.CO3等，如本文所述。
在氨基酸水平，变体如变体FVIII蛋白将至少具有约70％的一致性，更典型的具有80％甚至约90％或更多的一致性。在其他实施方式中，变体例如变体FVIII蛋白与参考序列如具有或没有B结构域的野生型FVIII蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的一致性。
为了确定一致性，如果变体FVIII(编码FVIII的核酸变体或FVIII蛋白)保留了B结构域，其适合与野生型FVIII比较一致性。如果变体FVIII(编码FVIII的核酸变体或FVIII蛋白)删除了B结构域，其适合与同样删除了B结构域的野生型FVIII比较一致性。
术语“同源的”或“同源性”是指两个或多个涉及的实体在给定区域或部分共享至少部分一致性。“区域、区或结构域”同源性或一致性是指两个或多个涉及的实体分享同源性或是相同的。因此，当两个序列在一个或多个序列区域一致，它们在这些区域共享一致性。“实质性同源”是指分子结构或功能上保守使得其已经或预测将具有参考分子或分享同源性的参考分子的相关/对应区域或部分的一种或多种结构或功能(例如生物功能或活性)的至少部分结构或功能。
两个序列之间的一致性(同源性)的程度或“同源性部分”可使用电脑程序和/或数学算法确定。针对本发明目的，核酸序列的比较使用GCG Wisconsin Package version 9.1进行，其可售于威斯康星州麦迪逊市的Genetics Computer Group。为了方便，由该程序指定的自定义参数(缺口产生惩罚＝12，缺口延伸惩罚＝4)用于本文比较序列一致性。或者，可使用由美国生物技术信息中心提供的Blastn 2.0程序(可访问网址ncbi.nlm.nih.gov/blast/；Altschul et al.,1990,J Mol Biol 215:403-410)，使用自定义参数进行缺口比对，以确定核酸序列和氨基酸序列的一致性和相似性水平。针对多肽序列比较，通常用BLASTP算法结合打分矩阵，例如PAM100,PAM 250,BLOSUM 62或BLOSUM 50。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比对程序也可用于定量一致性程度(Pearson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；Pearson,Methods Mol Biol.132:185(2000)；和Smith et al.,J.Mol.Biol.147:195(1981))。使用Delaunay基拓扑结构制图(Delaunay-based topological mapping)的定量蛋白结构相似性的程序已被开发出来(Bostick etal.,Biochem Biophys Res Commun.304:320(2003))。
核酸分子、表达载体(例如载体基因组)、质粒，包括本发明编码因子VIII(FVIII)的核酸变体可通过重组DNA技术方法制备。核苷酸序列的可获得性使得通过多种方式制备本发明的分离核酸分子成为可能。例如，编码VIII(FVIII)的核酸变体可使用各种标准克隆、重组DNA技术，通过必报表达或体内翻译以及化学合成技术制得。多核苷酸的纯度可通过测序、凝胶电泳法等确定。例如，核酸可使用杂交或基于计算机数据库筛选技术进行分离。这类技术包括单不限于：(1)基因组DNA或cDNA文库杂交，用探针检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛选以检测具有共享机构特征的多肽，例如使用表达库；(3)使用能够与目标核酸序列退火的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)；(4)计算机在序列库搜索相关序列；以及(5)消减核酸库的差异化筛选。
本发明核酸在任何方便的克隆载体上可保持为DNA。在一种实施方式中，克隆保持在质粒克隆/表达载体上，例如pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)，其在合适的大肠杆菌宿主细胞内增殖。或者，核酸可保持在适合在哺乳动物细胞中表达的载体上。在后转录修饰影响凝固功能的情形下，核酸分子可在哺乳动物中表达。
本发明编码因子VIII(FVIII)的核酸变体包括cDNA、基因组DNA、RNA，及其片段，其可为单链或双链。因此，本发明提供寡核苷酸(DNA的正义链或反义链或RNA)具有能够与本发明核酸的至少一个序列杂交的序列。这类寡核苷酸可用于检测FVIII表达的探针。
删除B结构域，本发明的编码FVIII的密码子优化的核酸变体或本文描述的功能片段，可通过已知的各种方式制备，该核酸变体可选的编码具有或不含PACE/Furin剪切位点突变、删除或取代的FVIII多肽。可用表达工程FVIII的合适资源例如转换细菌或动物培养细胞或组织通过免疫亲和纯化法纯化蛋白。
本发明编码FVIII的变体核酸分子或本文描述的功能片段的可获得性使得使用本领域已知体外表达方法生产FVIII成为可能，该变体核酸分子可选的编码具有或不含PACE/Furin剪切位点突变、删除或取代的FVIII多肽。例如，cDNA或基因可克隆进合适的体外转录载体，例如用于体外转录的pSP64或pSP65，随后通过在合适的无细胞翻译***如小麦胚芽或兔网织红细胞裂解物中进行无细胞翻译。体外转录和翻译***是市售的，例如从威斯康星州的麦迪逊市的Promega Biotech,或者马里兰州罗克韦尔市的BRL。
或者，根据实施方式，可通过在合适原核或真核表达***中的表达产生大量FVIII。例如，部分或全部编码因子VIII(FVIII)的核酸变体，例如可以***质粒载体适于在细菌细胞如大肠杆菌或哺乳动物细胞系如幼仓鼠肾(BHK)、CHO或Hela细胞中表达。或者，在实施方式中，可产生包含FVIII的标记融合蛋白。这类FVIII标记融合蛋白是由部分或所有DNA分子编码，绑定于编码部分或全部所需多肽标签的核苷酸序列正确的密码子阅读框，该多肽标签***质粒载体，适于在细菌细胞如大肠杆菌或真核细胞例如但不限于酵母或哺乳动物细胞中表达。
载体例如那些本文描述的，包括在宿主细胞中DNA表达所需的调节元件，以一种方式放置从而允许宿主细胞编码蛋白的表达。表达所需的这类调节元件包括但不限于启动子序列、增强子序列和转录起始序列，如文本所述的和本领域技术人员已知的。
编码因子VIII(FVIII)的核酸变体可选的编码本文所述的变体FVIII蛋白，其由重组原核或真核***中的基因表达产生，可通过本领域已知方法纯化。在实施方式中，可用市售的表达/分泌***，重组蛋白由其表达并随后从宿主细胞分泌，可容易的从周围培养基纯化。如果不使用表达/分泌载体，可替换的方法涉及通过亲和分离纯化重组蛋白，例如通过抗体免疫学作用，该抗体特异性结合至重组蛋白或镍柱用于分离用6-8个组氨酸残基在其N末端或C末端标记的重组蛋白。其他标签可包括FLAG表位、GST或者血细胞凝集素表位。有经验的实践者通常使用这类方法。
由前述方法制备的FVIII蛋白，可使用标准程序进行分析。例如，这类蛋白可根据已知方法评估改变的凝固性能。
如本文公开的，生产本发明多肽的便利方法是通过表达***中的核酸表达编码该多肽的核酸。实用于本发明方法的多种表达***对于本领域技术人员是已知的。
相应的，本发明还提供制造多肽(如所公开的)的方法，该方法包括编码多肽的核酸(通常是核酸)的表达。该方法通过在引起或允许多肽生产的合适条件下培养包含载体的宿主细胞可方便的实现。多肽也可在体外***中生产。
本发明的方法和用途包括递送(转换)核酸(转基因)进宿主细胞，包括***的和/或未***的细胞。本发明的核酸、重组载体(例如eAAV)、方法、用途和药物制剂在递送、给予或提供蛋白给需要其的主体的方法(作为治疗方法)是非常有用的。以该方式，在主体体内转录核酸并生产蛋白。作为一种治疗方法或其他方式，该主体可能需要该蛋白或受益于该蛋白，因为主体具有蛋白缺陷，或者因为主体内的蛋白生产可给予一些治疗效果。
包括慢病毒、细小病毒(例如AAV)序列的载体、重组病毒颗粒、方法和用途可用于递送具有生物效果的编码因子VIII(FVIII)的核酸变体以治疗或减轻一种或多种与FVIII缺陷或异常有关的症状。重组慢病毒或细小病毒载体(例如AAV)序列、质粒、重组病毒颗粒、方法和用途可用于提供治疗涉及或因FVIII缺陷或异常引起的各种疾病状态。
本发明核酸、载体、重组载体(例如rAAV)和重组病毒颗粒、方法和用途允许治疗遗传疾病，例如FVIII缺陷。针对缺陷症状疾病，可使用基因导入将正常基因转入受影响组织用于替代治疗，以及用反义突变创造该疾病的动物模型。针对不平衡疾病状态，基因导入可用于创造模型***的疾病状态，其可用于抵消疾病状态的努力中。使用核酸序列的位点特异性整合以纠正缺陷也是有可能的。
在特定实施方式中，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其功能片段，可用于例如治疗和/或预防剂(蛋白或核酸)，其调节凝血级联***或作为基因中的转基因。例如，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体可具有与野生型FVIII相似的凝固活性，或者与野生型FVIII相比具有改变的凝固活性，例如在变体FVIII蛋白情形下(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)，或者是功能性片段。基于细胞的策略允许编码因子VIII(FVIII)的核酸变体或FVIII蛋白变体在A型血友患者体内持续表达。如本文所述，FVIII分子(核酸和蛋白)的某些修饰引起核酸水平的表达提高，病毒(如AAV)载体包装效率的提高，以及蛋白水平的凝固活性和稳定性的提高，从而有效改善血友病。
编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其功能片段，可用于本发明的多种目的。在一种实施方式中，提供用于调节血液凝固的核酸递送载体(即表达载体)，其中表达载体包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者如本文所述的其功能片段。将编码FVIII的表达载体给予给患者引起FVIII蛋白的表达从而用于改变凝血级联。根据本发明，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体可编码本文的FVIII多肽(例如具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白)，或者其功能片段，其表达增加止血。在一种实施方式中，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体编码FVIII多肽，例如具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白，或者其功能片段。
在本发明另一种实施方式中，提供组合物和方法用于给予包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其任一功能片段的病毒载体。在一种实施方式中，包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其任一功能片段的表达载体是病毒载体。
包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其任一功能片段的表达载体可单独给药或与其他可用于止血的分子组合给药。根据本发明，表达载体或治疗剂的组合可单独给予给患者或以药学上可接受的或生物相容的组合物形式给药。
病毒载体如慢病毒和细小病毒载体，包括AAV血清型和其变体，提供离体、体内、体外递送核酸进细胞的方式，其编码蛋白使得细胞表达编码的蛋白。AAV是可用于基因治疗载体的病毒，因为其可渗透细胞并将核酸/遗传材料引入，使得该核酸/遗传材料可稳定保持在细胞中。另外，这些病毒可将核酸/遗传材料引入例如特定位点。因为AAV与人体内病原性疾病无关，其能够递送异源性多核苷酸序列(例如治疗蛋白或治疗剂)给患者而不会造成实质的AAV病原或疾病。
可用于本发明的病毒载体包括但不限于多种血清型的腺相关病毒(AAV)载体(例如AAV-1至AAV-12以及其他)和杂交/嵌合AAV载体，慢病毒和假型慢病毒载体[例如埃博拉病毒、水泡性口炎病毒载体(VSV)，以及猫免疫缺陷病毒(FIV)]，单纯疱疹病毒载体，腺病毒载体(具有或没有组织特异性启动子/增强子)、牛痘病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、非病毒载体以及其他。
AAV和慢病毒颗粒用于载体有效递送基因是有利的。这类病毒拥有用于该类应用的多个所需特征，包括***和非***细胞趋性。这些载体的早期的临床实践也表明没有持续毒性，且免疫反应是最小的或未检测到的。已知AAV可通过受体调节内吞或通过转包吞作用体内或体外感染多种细胞类型。这些载体***已针对视网膜上皮细胞、肝脏、骨骼肌、呼吸道、脑、关节和造血干细胞经过人测试。对于大基因，例如编码FVIII的基因，例如质粒DNA或微环DNA的非病毒载体，也是合适的基因导入载体。
也可引入可提供例如所需基因的多个副本的载体，使得产生更大量的该基因产物。用于这些载体的改进的AAV和慢病毒载体和方法详细描述于多种参考文献、专利、专利申请中，包括：Wright J.F.(Hum Gene Ther 20:698-706,2009)a technology used forthe production of clinical grade vector at Children’s Hospital ofPhiladelphia。慢病毒载体还可在CHOP产生，并且其他载体通过NHLBI Gene TherapyResource Program(GTRP)-Lentivirus Vector Production Core Laboratory的慢病毒载体生产核心实验室获得。
相应的，在本发明各种实施方式中，载体包括慢病毒或细小病毒载体，例如腺病毒载体。在特定方面，重组载体是细小病毒载体。细小病毒载体是具有单链DNA基因组的小病毒。“腺相关病毒”(AAV)是细小病毒家族。
相应的，本发明提供包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其任一功能片段的病毒载体。例如，重组AAV载体可包括编码所需蛋白(例如因子VIII)的核酸，例如编码因子VIII(FVIII)的密码子优化的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)，其中编码的FVIII蛋白可选的删除B结构域，编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)，或其任一功能片段。载体递送或给予给主体(例如哺乳动物)因此提供FVIII(通过例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其任一功能片段给主体例如哺乳动物(例如人)。
直接递送载体或离体转导人细胞，然后融合进体内将引起FVIII表达从而发挥治疗血友病的有利效果。在本发明因子VIII的背景下，这种给予方式增强了前凝血活性。
AAV载体和慢病毒载体通常不包括与病原体相关的病毒基因。这类载体通常具有一个或多个整体或部分删除的野生型AAV基因，例如，rep和/或cap基因，但保留至少一个功能侧翼ITR序列，其是救援、复制和包装重组载体进AAV载体颗粒所必须的。例如，仅分别包括载体的必要部分，例如ITR和LTR元件。AAV载体基因组将因此包括顺式复制和包装所需的序列(例如功能ITR序列)。
重组AAV载体及其使用方法和用途包括任意病毒株或血清表型。作为非限制性实例，重组AAV载体可基于任何AAV基因组，例如AAV-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-rh74、-rh10或AAV-2i8。这类载体可基于相同株或血清表型(或亚型或变体)，或互不相同。作为非限制性实例，基于一种血清表型基因组的重组AAV载体可以与包装载体的一种或多种衣壳蛋白相同。另外，重组AAV载体基因组可基于AAV(例如AAV2)血清表型基因组，其不同于包装载体的一种或多种AAV衣壳蛋白。例如，AAV载体基因组可基于AAV2，其中三个衣壳蛋白中的至少一个可以是AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8，或其变体。
在特定实施方式中，腺相关病毒(AAV)载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8，及其变体(例如衣壳变体，例如氨基酸***、添加和替换)，其描述于WO 2013/158879(国际申请PCT/US2013/037170)和WO 2015/013313(国际申请PCT/US2014/047670)。AAV变体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8变体。相应的，提供AAV载体和AAV变体(例如衣壳变体)包括(封装或包装)编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其任一功能片段。
AAV和AAV变体(例如衣壳变体)血清表型(例如VP1、VP2、和/或VP3序列)可相同或不同于其他AAV血清表型，包括例如AAV1-AAV12、Rh74或Rh10(例如不同于任意AAV1-AAV12、Rh74或Rh10血清表型的VP1、VP2、和/或VP3序列)。
如本文所述的，术语“血清型”是一区别，用于指具有血清学上不同于其他AVV血清型的衣壳的一AVV。血清学区别性基于与另一种AVV相比，一种AAV的抗体之间没有交叉反应。这种交叉反应区别通常由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的不同引起(例如由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。尽管包含衣壳变体的AAV变体可能在血清学上无法与参考AAV或其他AAV血清型区分，他们至少与参考或其他AAV血清型具有一个核苷酸或氨基酸残基的差异。
在传统定义下，血清型是指目标病毒已经过对所有现存的和特征化的血清型具有特异性的血清测试中和活性，没有发现中和目标病毒的抗体。因为更多自然产生的病毒分离物是被发现的和/或衣壳突变产生的，他们与任意现存的血清型可具有也可没有血清学差异。因此，当新病毒(例如AAV)没有血清学差异，该新病毒(例如AAV)可能是相应血清型的亚型或变体。在许多情形下，用于中和活性的血清学测试需要在衣壳序列修饰的突变病毒上进行，以确定其是否是传统血清型定义中的另一种血清型。相应的，为了便利和避免重复，术语“血清型”广泛的指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及血清学上并非不同的属于特定血清型的亚型或变体的病毒(例如AAV)。
AAV载体因此包括的基因/蛋白序列可与特定血清型基因/蛋白序列特征相同。如本文使用的，“与AAV1相关的AAV载体”是指一种或多种AAV蛋白(例如VP1、VP2、和/或VP3序列)与一种或多种多核苷酸或包含AAV1的多肽序列具有实质的序列一致性。相似的，“与AAV8相关的AAV载体”是指一种或多种AAV蛋白(例如VP1、VP2、和/或VP3序列)与一种或多种多核苷酸或包含AAV8的多肽序列具有实质的序列一致性。“与AAV-Rh74相关的AAV载体”是指一种或多种AAV蛋白(例如VP1、VP2、和/或VP3序列)与一种或多种多核苷酸或包含AAV-Rh74的多肽序列具有实质的序列一致性。这类与另一血清型相关的AAV载体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8，可因此具有一个或多个序列不同于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8，但能展示出与一种或多种基因和/或蛋白实质的序列一致性，和/或具有AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8的一个或多个功能特征(例如细胞/组织特异性)。示例性非限制性AAV变体包括VP1、VP2、和/或VP3的衣壳变体。
在各种示例性实施方式中，与参考血清型相关的AAV载体具有的多核苷酸、多肽或其序列包括一序列或由其组成，该序列至少80％或以上(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、等)与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8中的一种或多种相同(例如VP1、VP2、和/或VP3序列)。
本发明的组合物、方法和用途包括AAV序列(多肽和核苷酸)和其子序列，该子序列展示出与参考AAV血清型如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8小于100％的序列一致性，但区别于或不同于已知的AAV基因或蛋白，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8，基因或蛋白等。在一种实施方式中，AAV多肽或其子序列包括一序列或由其组成，该序列至少75％或更多，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等直至100％与任意参考AAV序列或其子序列如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8(例如VP1、VP2和/或VP3)相同。在特定方面，AAV变体具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多氨基酸取代。
重组AAV载体，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8和变体，相关的，杂交和嵌合序列，可使用本领域技术人员已知的重组技术构建，以包括一个或多个核酸序列(转基因)两侧具有一个或多个功能AAV ITR序列。
在本发明一种实施方式中，FVIII多肽变体，例如具有PACE-furin剪切识别位点突变、删除或替换的人FVIII变体，可通过融合进生物学相容的载体通过静脉注射给予给患者。FVIII多肽变体，例如本发明具有PACE-furin剪切识别位点突变、删除或替换的人FVIII变体，可选的可封装进脂质体或与其他磷脂或微胶粒混合以增加分子的稳定性。具有PACE/Furin剪切位点突变、删除或替换的FVIII变体或功能性片段，可单独给药或与其他已知的调节止血的试剂(例如因子V、因子Va或其衍生物)组合给药。
递送FVIII多肽变体(例如具有PACE-furin剪切识别位点突变、删除或替换的人FVIII变体)的合适的组合物可通过医师考虑多种生理学变量进行确定，包括但不限于患者的症状和血液动力学状态。多种组合物非常适于不同的应用和给药途径，其在本领域中是已知的并在下文进行描述。
制备包含纯化FVIII蛋白，例如具有PACE-furin剪切识别位点突变、删除或替换的FVIII变体，或功能性片段，可包含生理学上可接受的基质和作为药物制剂进行制备。该制剂可使用实质已知的现有技术方法制备，其可与包含盐类例如NaCl、CaCl2和氨基酸例如甘氨酸和/或赖氨酸的缓冲液混合，pH为7-8。直到需要时，纯化的包含FVIII的制剂可以最终溶液或冻干或超低温冷冻形式储存。
制剂可以冻干形式储存，并使用合适的重构溶液溶解于视觉清澈的溶液。或者，本发明的制剂可制备为液体制剂或超低温冷冻液体。本发明的制剂可选的非常稳定，即允许其在给药或递送前的持久时间内以不溶形式放置。
本发明的制剂可制备为具有FVIII活性的药物制剂，其为单组份制剂或与其他因子组合制备为多组分制剂。将纯化蛋白处理为药物制剂之前，纯化蛋白进行常规质量控制并塑造成展示疗效形式。特别的，在重组物制造中，纯化制剂经过测试，不含细胞核酸和来自表达载体的核酸，例如EP0714987所描述的。
药物蛋白制剂可使用的剂量为单次日注射剂量为30-100IU/kg(一个IU是100ng/ml)，或者多达3次/日，注射几天。患者可在临床出血出现时立即进行治疗。或者，患者可每个8小时-12小时接收大剂量注射，或者如果观察到足够好转，每天注射一次变体FVIII，如本文所述。
本发明还提供组合物，例如包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、和其功能片段的组合物，具有以下一种或多种特性：1)展示出细胞或动物中的表达增强；2)展示出增强的细胞分泌；3)展示出增强的活性，例如由凝血增加反映；4)展示出增强的稳定性；以及5)展示出AAV载体增强的包装率。
相应的，本发明核酸、载体、重组载体(例如rAAV)、和重组病毒颗粒和其他组分、试剂、药物、生物制剂(蛋白)可结合进药物组合物中。这类药物组合物可用于体内或体外给药或递送给主体。
在特定实施方式中，药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。这类赋形剂包括任何自身接收组分后不会引起对个体有害的免疫反应的药物制剂，并且其给予后没有过度毒性。
如本文所使用的，“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指生物学可接受剂型、气态、液体或固态，或其混合物，其适合于一种或多种给药途径、体内递送或接触。“药学上可接受的”或“生理学上课接受的”组合物是非生物排斥或其他方式排斥的材料，例如，将该材料给予给主体不会引起实质性的不良生物效果。因此，这种药物组合物可用于例如给予核酸、载体、病毒颗粒或蛋白给主体。
药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体例如水、生理盐水、甘油、糖类和乙醇。药学上可接受的盐也可包括在其中，例如无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯酸盐等。另外，辅助物例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物等可存在于该载体中。
药物组合物可以盐的形式提供，可与许多酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸盐等。相比对应的游离碱形式，盐倾向于更可溶于水溶液或其他质子溶剂中。在其他情形下，制剂可以是冻干粉末其可含以下任意一种或所有：1-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖、以及2-7％甘露醇，pH范围为4.5-5.5，其在使用前与缓冲液结合。
药物组合物包括溶剂(水或非水)、溶液(水或非水)、乳液(例如油的水溶液或水的油溶液)、悬浮液、糖浆剂、万能药、分散和悬浮介质、涂层、等渗和吸收促进或延迟剂，其与药物给药或体内接触或递送相容。水或非水溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。这类药学上可接受的载体包括片剂(涂覆或未涂覆)、胶囊(硬或软)、微珠、粉末、颗粒和晶体。补充活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒和抗真菌剂)也可结合进组合物中。
药物组合物可制成与特定给药途径或递送途径相容，如本文所述或本领域技术人员已知的。因此，药物组合物包括适合各种给药途径的载体、稀释剂或赋形剂。
适合肠胃外给药的组合物包含水溶液和非水溶液，活性化合物的悬浮液或乳液，该制剂通常是无菌的并可以与目标受体的血液等渗。非限制性示例性实例包括水、缓冲盐溶液、Hanks溶液、Ringer溶液、右旋糖、果糖、乙醇、动物、蔬菜或合成油。水性注射悬浮液可包含增加悬浮物粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或右旋糖酐。
另外，活性物质的悬浮液可制备成合适的油注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油例如香油、或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。可选的，悬浮液还可包括合适的稳定剂或试剂，其增加化合物稳定性以允许制备高浓缩溶液。
共溶剂和助剂也可添加至制剂。共溶剂的非限制性实例包含羟基或其他极性基团，例如醇，例如异丙醇；乙二醇，例如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚；丙三醇；聚乙二醇醇类和聚乙二醇脂肪酸酯。助剂包括例如表面活性剂如大豆磷脂和油酸；脱水山梨糖醇酯例如山梨坦三油酸酯；以及聚乙烯吡咯烷酮。
在制备药物组合物后，其可置于合适的容器或被标记用于治疗。为了给予含FVIII的载体或多肽，这类标记可包括给药用量、频率和方法。
本发明药物组合物和适合该组合物的递送***、方法和用途在本领域是已知的(见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)20th ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；The Merck Index(1996)12th ed.,Merck PublishingGroup,Whitehouse,NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993),Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel and Stoklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)11th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD；以及Poznansky et al.,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.,pp.253-315)。
本发明还提供方法将编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、和其任一功能片段引入细胞或动物。在特定实施方式中，本发明提供调节止血的方法。在一种实施方式中，方法包括在FVIII在个体中表达的条件下，使个体(患者或主体例如哺乳动物)接触或给予其核酸递送载体(例如AAV载体)，该载体包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、或编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或其任一功能片段。在另一种实施方式中，方法包括在FVIII在个体中表达的条件下，为个体(患者或主体例如哺乳动物)细胞提供核酸递送载体(例如AAV载体)，该载体包含编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、或编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或其任一功能片段。
从上所述可见，编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其功能片段，可用于治疗与缺陷性、不充分或异常凝血有关的疾病。
编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其功能片段的组合物，包括载体、重组载体(例如rAAV)和重组病毒颗粒可进行给药，可提供本发明方法和用途，以足够或有效量提供给需要其的主体。“有效量”或“足够量”是指以单剂量或多剂量，单独或与一种或多种其他组分(治疗剂如药物)、治疗物、方案、或最佳治疗方案试剂结合，提供任意时间长度(长或短期)的可检测响应，预期或需要的结果或益处给主体所需的任意可测量或可检测度或用于任意时间长度(例如几分钟、几小时、几天、几个月、几年或治愈)的量。
剂量可根据治疗针对的疾病类型、开始、进展、严重性、频率、持续时间或可能性，所需临床终点，预先或同时治疗，通常的健康，年龄，性别，种族或主体的免疫能力以及其他本领域技术人员理解的因素的不同而变化。剂量、次数、频率和持续时间可按比例增加或降低，其通过任何副作用、并发症或其他治疗风险因素和主体状态表现。本领域技术人员将重视可影响所需剂量和时间的因素，以提供足够量从而提供治疗或预防益处。
实现治疗效果的剂量，例如载体基因组的剂量/kg体重(vg/kg)，基于几种不同因素而变化，包括但不限于：给药途径、实现治疗效果所需的异源多核苷酸表达水平，治疗的特异性疾病，针对病毒载体的任何宿主免疫响应，针对异源多核苷酸或表达产物(蛋白)的宿主免疫响应，以及表达的蛋白的稳定性。本领域技术人员能确定rAAV/载体基因组剂量范围，以基于上述因素和其他因素治疗具有特定疾病或失调的患者。通常而言，剂量范围是至少1X108或更多，例如1X109,1X1010,1X1011,1X1012,1X1013或1X1014或更多的载体基因组每千克主体体重(vg/kg)，以实现治疗效果。AAV在小鼠的有效剂量范围是1X1010-1X1011，在狗中是1X1012-1X1013。
使用B型血友病为例，通常而言，认为为了实现治疗效果，需要血凝因子浓度大于正常个体因子浓度的1％，以改变严重疾病表型为温和表型。严重表型特征为关节损伤和致命流血。为了将温和疾病表型转变成轻微表型，认为血凝因子浓度需要大于正常浓度的5％。关于治疗这类血友病主体，通常剂量至少为1X1010载体基因组(vg)每千克(vg/kg)宿主体重，或者约1X1010至1X1011vg/kg宿主体重，或者约1X1011至1X1012vg/kg宿主体重，或者约1X1012至1X1013vg/kg宿主体重，以实现所需的治疗效果。
治疗“有效量”或“足够量”(例如减轻或提供治疗益处或改善)的剂量通常以可测量程度有效响应于一种、多种或全部不利疾病症状、后果或并发症，一种或多种不利症状、失调、疾病、病理学或并发症，例如由疾病引起或与其相关，但降低、减少、抑制、制止、限制或控制疾病发展或恶化是满意的结果。
有效量或足够量能够以单次给药提供，但不是必须的，其可需要多次给药以及能够单独或与其他组分(例如治疗剂)、治疗物、方案或治疗方案组合，但这也不是必须的。例如，数量可随着主体、类型、治疗疾病的状态和严重性或治疗副反应(如果有)的需要按比例增加。另外，有效量或足够量如果以单或多剂量给药而没有第二种组合物(例如另一种药物或试剂)、治疗物、方案或治疗方案，其无需是有效的或足量的，因为可包括另外在该剂量之上和超过该剂量的剂量、数量或持续时间，或者可包括另外的组分(例如药物或试剂)、治疗物、方案或治疗方案，以考虑对给定主体有效或足够量。认为有效的量也包括导致其他治疗物、治疗方案或方案减少的量，例如给予用于治疗凝血疾病(例如A型友病)的重组凝血因子蛋白(例如FVIII)。
相应的，本发明方法和用途包括导致其他化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗方案、过程或补救减少需要或使用的方法和用途等。例如，对于凝血疾病，如果在给定主体中，更少频率或减少剂量或停止给予重组凝血因子蛋白以补充宿主内生凝血因子的不足或缺陷(异常或突变)，本发明方法或用途具有治疗益处。因此，根据本发明，提供减少需求或使用另一种治疗物或治疗的方法或用途。
有效量或足够量无需在每个或所有治疗主体中有效，也非在给定群体和人口的治疗主体的大多数有效。有效量或足够量是指在特定主体而非群体或一代人口中有效或足量。这类方法典型是，一些主体针对给定治疗方法或用途展示出更大的响应或更小的或没有响应。
术语“改善”是指在主体内的疾病或其症状或者潜在的细胞响应具有可检测或可测量的改进。可检测或可测量的改进包括主观或客观的降低、减少、抑制、制止、限制或控制疾病或由疾病引起或与其相关的并发症的发生、频率、严重性、发展或持续时间，或者症状或根本病因或疾病结果或疾病逆转。对于A型血友病，有效量是减少主体内急性流血发作的频率或严重性的量，例如，或是减少凝血分析测得的凝血时间的量。
相应的，本发明药物组合物包括多种组分，其中包含有效量的活性组分以实现预期的治疗目标。确定治疗有效量是本领域医师使用本发明技术和指导可实现的。
治疗剂量取决于主体年龄和一般情况、异常血凝固表型的严重性，以及调节以下表达水平的控制序列强度：编码因子VIII(FVIII)的核酸变体(例如密码子优化的编码FVIII的变体)、编码变体FVIII蛋白的核酸变体(例如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体)、或者其任一功能片段。因此，人体中的治疗有效量落入相对较宽的范围，其可通过医师基于个体患者与基于载体的FVIII治疗响应确定。
组合物例如药物组合物，可递送至主体，以允许生产生物活性蛋白(例如由核酸变体如密码子优化的编码FVIII的变体编码的因子VIII(FVIII)或由核酸变体如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体编码的变体FVIII蛋白、或其功能片段的组合物)或者通过基因和/或基于细胞治疗或通过体外修饰患者或供体细胞诱导FVIII转基因的连续表达。在特定实施方式中，包含足够遗传材料以使受体产生治疗有效量的FVIII多肽的药物组合物能影响主体内的止血。或者，如本文所公开的，变体因子VIII多肽的有效量，例如在细胞内蛋白酶切识别区(PACE/Furin)具有一个或多个突变、删除或替换的FVIII可直接注射至需要其的患者。
组合物可单独给药或与至少一种试剂组合给药，例如稳定化合物，其可通过任何无菌、生物相容药物载体给药，包括但不限于生理盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。组合物可单独给药给患者，或者与其他影响止血的试剂组合给药(例如辅助因子)。
变体因子VIII多肽，在本文描述的合适生物载体中，可单独或与其他试剂组合给药或者接触或直接注射给患者。本发明表达载体包含编码FVIII的核酸序列，例如密码子优化的编码FVIII的变体，或由核酸变体如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体编码的变体FVIII蛋白，或其任一功能片段，可通过多种方式给予给患者，以实现预防和/或治疗有效水平的FVIII多肽并可选的维持一段时间。本领域技术人员能容易的确定使用本发明编码FVIII的表达载体用于治疗特定患者的特定方案。
产生腺病毒载体并给予给患者的方案已描述于美国专利5,998,205；6,228,646；6,093,699；6,100,242中；以及国际专利申请WO 94/17810和WO 94/23744中，其通过引用整体并入本发明。特别的，例如，应用AAV载体递送由核酸变体如密码子优化的编码FVIII的变体编码的因子VIII(FVIII)，或由核酸变体如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体编码的变体FVIII蛋白、或其任一功能片段给需要其的患者。
由核酸变体如密码子优化的编码FVIII的变体编码的因子VIII(FVIII)，或由核酸变体如编码具有PAVE/Furin剪切位点突变、删除或替换的变体FVIII蛋白的密码子优化的核酸变体编码的变体FVIII蛋白、或其任一功能片段通过本发明AAV载体递送，可以任意已知方式给药给患者。
本发明方法和用途包括全身性、区域性或局部性，或通过任意途径，例如注射或输入进行递送和给药。药物组合物的体内递送通常通过注射使用传统针头完成，但是可想到其他递送方法例如增强对流输注(见例如美国专利5,720,720)。例如，组合物可通过以下途径递送：皮下地、表皮地、皮内地、鞘内注射、眶内地、粘膜内地、腹腔内地、静脉注射地、胸膜内地、动脉注射、口服、肝内地、通过门静脉，或肌肉注射。其他给药模式包括口服和肺内给药、栓剂、和经皮给药。擅长治疗血凝固疾病患者的临床医生可根据一些标准决定包含FVIII核酸序列的腺相关病毒的最佳给药途径，包括但不限于患者症状和治疗目的(例如增加或减少血液凝固)。
本发明方法和用途可与具有所需治疗、有益的、添加的、协同的或补充的活性或效果的任意化合物、试剂、治疗物或其他治疗方案或协议。示例性组合的组合物和治疗物包括第二活性物，例如生物制剂(蛋白)、试剂和药物。这类生物制剂(蛋白)、试剂、药物、治疗物和治疗方法可在本发明任意其他方法和用途之前、实质同时或之后给予或进行，例如，治疗主体血液凝固疾病如A型血友病的治疗方法。
该化合物、试剂、药物、治疗物或其他治疗方案或协议可作为组合组分或单独给药，例如同时或连续的或按顺序的(之前或之后)递送或给予核酸、载体、重组载体(例如rAAVA)，或重组病毒颗粒。本发明因此提供组合，其中本发明方法或用途与任意化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、补救或组分结合使用，如本文所列的或本领域技术人员已知的。该化合物、试剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、补救或组分可在本发明核酸、载体、重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒之前、实质同时或之后给予给主体。
本发明对动物有效，包括人和兽医学应用。因此合适的主体包括哺乳动物，例如人，以及非人的哺乳动物。术语“主体”是指动物，通常是哺乳动物，例如人、非人的灵长类(类人猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)，家养动物(狗和猫等)，家畜(家禽如鸡鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)，以及实验动物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。人类主体包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成年主体。主体包括动物疾病模型，例如。小鼠和其他动物模型，其患有血液凝固病，如A型血友病和其他本领域技术人员已知的。
根据本发明，适合治疗的主体包括那些不能产生足够量的功能基因产物(例如FVIII蛋白)或具有该风险或具有生产功能基因产物(例如FVIII蛋白)缺陷的，或者生产异常的、部分功能的或无功能的基因产物(例如FVIII蛋白)，其可导致疾病。根据本发明，适合治疗的主体还包括那些生产导致疾病的异常的或缺陷(突变)基因产物(蛋白)或具有该风险的，从而减少异常的量、异常的功能表达、或缺陷(突变)基因产物(蛋白)将导致治疗的治疗或减轻一种或多种症状或缓解该疾病。因此，目标主体包括具有血凝固因子生产异常、不足或缺失的主体，例如血友病患者(例如A型血友病)。
根据本发明，适合治疗的主体还包括那些生产对抗AAV的抗体或具有该风险的主体。使用一些技术可将AAV载体给予或递送给这类主体。例如，可给予空衣壳AAV(即缺乏FVIII核酸的AAV)以结合主体内的AAV抗体，从而允许载有FVIII核酸的AAV载体改造主体细胞。给予的空衣壳AAV的量可根据特定主体产生的AAV抗体量进行校准。空衣壳可以是任意AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8。
作为选择的或另外的，AAV载体可通过直接肌肉注射(例如肌肉的一种或多种慢收缩纤维)递送。在另一种选择中，可使用引入股动脉的导管通过肝动脉递送AAV载体至肝脏。也可使用非手术装置，例如内镜逆行胰胆管造影(ERCP)，将AAV载体直接递送至肝脏，从而绕过血流和AAV抗体。其他导管***，例如颌下腺管道，也可用作递送AAV载体至产生或预先存在抗AAV抗体的主体的入口。
可在由疾病引起或与疾病相关的不利症状、状况、并发症等发展之前给予或体内递送给主体。例如，可使用筛选(例如基因的)以鉴定该主体为本发明组合物、方法和用途的候选者。这类主体因此包括那些在功能基因产物(例如FVIII蛋白)不足量或缺陷，或产生异常、部分功能或无功能的基因产物(例如FVIII)中筛选为阳性的。
根据本文公开的本发明方法和用途，在主体被鉴定为具有需治疗的疾病、具有一个或多个疾病症状、或尽管主体未具有一种或多种疾病症状但被筛选并鉴定为如前所述的阳性后的1-2、2-4、4-12、12-24或24-27小时内开展给药或体内递送给主体。当然，本发明的方法和用途可在主体被鉴定为具有需治疗的疾病、具有一个或多个疾病症状、或被筛选并鉴定为如前所述的阳性的1-7、7-14、14-21、21-48或更多天、几个月或几年后实行。
本文“单位剂量形式”指适合作为治疗主体单一剂量的生理离散单位；每个单位包含预定量，可选与药物载体(赋形剂、稀释剂、载体或填料剂)相关，当单剂量或多剂量给药时，计算其以获得所需效果(例如预防或治疗效果)。单位剂量形式可以是例如安瓿或小瓶，其可包括液体组分，或冻干或冷冻干燥状态的组分；无菌液体载体，例如可在给药或体内运输前添加。单独单元剂量形式可包含在多剂量试剂盒或容器中。重组载体(例如rAAV)序列、重组病毒颗粒，及其药物组合物可被包装在单个或多单元剂量形式，以便于给药和剂量均匀性。
本发明提供具有包装材料和在其中的一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装说明书，包括组分说明或其中的组分的离体、体内或体外使用的说明。试剂盒包含许多这种组分，例如核酸、重组载体、病毒(例如AAV)载体、或病毒颗粒和可选的第二活性物如另一种化合物、试剂、药物或组分。
试剂盒是指包裹试剂盒的一种或多种组分的物理结构。包装材料可维持组分无菌，并可由通常用于该目的的材料制成(例如纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)。
标签或说说明书可包括一种或多种其中组分、剂量、活性组分的临床药理学包括作用机理、药物动力学和药效学的识别信息。标签或说明可包括识别制造商、批号、制造地和日期、有效期的信息。标签或说明可包括识别制造商、批号、制造商位置和日期的信息。标签或说明可包括可使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或说明书可包括给医生或主体说明在一种方法、用途或治疗协议或治疗方案中使用试剂盒组分的一种或多种。说明书可包括本文描述的剂量数量、频率或持续时间，以及实践任意本方法、用途、治疗协议或预防或治疗方案的说明。
标签或说明书可包括组分可提供的任意益处，例如预防或治疗益处。标签或说明书可包括潜在的不利副反应、并发症或反应的信息，例如警告主体或医生关于不适合使用特定组分的情形。不利副反应或并发症可发生于主体将来或现在已经服用一种或多种治疗剂，其可能与该组分不兼容，或者发生于主体将来或现在已经经受另一种治疗协议或治疗方案，该方法与该组分不兼容，因此，说明书可包括这类不兼容信息。
标签或说明书包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独的或贴到组分、试剂盒或包装材料(例如盒子)上，或者粘附到包含试剂盒组件的安瓿、管道或小瓶上。标签或说明书可另外包括计算机可读介质，例如条码打印标签、磁盘、光碟如CD或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带或电子储存介质如RAM和ROM，或这些磁/光存储介质、闪存介质或内存卡的混合。
除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本领域技术人员所理解的一般含义。虽然与本文描述相似或相等的方法和材料可以在实际或本发明试验中使用，但现在对合适的方法和材料进行描述。
所有的专利、专利申请、公开物或其他参考文献、GenBank引文和ATCC引文通过引用整体并入本文。如果发生冲突，由本说明书，包括定义进行约束。
与本发明生物分子相关的各种术语用于上文以及整个说明书和权利要求中。
本文公开的所有特征可以任意组合方式结合。在本说明书中公开的每个特征可用用于相同、等价或相似目标的替代特征取代。因此，除非另有表述，公开的特征(例如核酸变体、载体、质粒、重组载体(例如rAAV)序列、或重组病毒颗粒)是等同或相似特征类的示例。
如本文所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的指代物，除非文中另有明确说明。因此，例如，提及“一核酸”，包括多种该类核酸，提及“一载体”包括多个该载体，以及提及“一病毒”或“一颗粒”包括多个该病毒/颗粒。
如本文所用，所有数值范围包括该范围内的整数和小数值或范围内的整数，除非文中另有明确说明。因此，举例而言，提及80％或更多一致性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％、等,82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等，等等。
提及大于或小于一整数，分别包括大于或小于该参考值的所有数值。因此，例如，提及少于100，包括99、98、97等一直降到1(1)；以及小于10包括9、8、7等一直降到数字1(1)。
如本文所用，所有数值或范围包括该范围内的数值的小数和整数，以及该范围内的整数的小数，除非本文另有明确说明。因此，举例而言，提及数值范围，例如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，等等。提及1-50的范围因此包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，直至并包括50,以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，等等。
提及一系列范围包括结合该系列内的不同范围的边界值的范围。因此，举例而言，一系列范围，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850包括范围1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500,等。
本发明在本文中通常使用肯定性语言描述多个实施方式和方面。本发明也特别包括部分或全部特定主题物被排除的实施方式，例如物质或材料、方法步骤和条件、协议或程序。例如，在本发明某些实施方式或方面，排除材料和/或方法步骤。因此，即使本发明通常没有表明本发明不包括的方面，但本发明那些没有被明确排除的方面公开在此。
已经描述了本发明多个实施方式。然而，在不脱离本发明精神和范围的的情形下，本领域技术人员可对本发明进行各种改变和修饰使其适应与各种用途和条件。因此，下述实例仅用于解释但不以任何声称的方式限制本发明范围。
实例1
A型血友病(HA)是伴X染色体的出血性疾病，特征是缺乏因子VIII(FVIII)，一种凝血级联的关键组件(Kazazian,H.H.,et al.Hemophilia A:Deficiency of coagulationfactor VIII.in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease(eds.Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.&Valle,D.)4367-4392(McCraw-Hill,NewYork,2001)。FVIII基因包含26个外显子，跨度186kn，并合成为大的前体分子(2332个氨基酸)(图1)(Kaufman,R.J.,et al.,The biology and genetics of factor VIIIdeficiency in hemophilia A.in Hemostasis and Thrombosis:Basic principles andclinical practice(eds.Colman,R.W.,Hirsch,J.,Mander,V.J.,Clowes,A.W.&George,J.N.)(Lippincott-Raven,Philadelphia,1998)。
受累者通常患有关节、肌肉以及颅内和腹膜内出血，其可能是致命的。正常的血浆FVIII水平是100-200ng/ml，但小量的循环FVIII(约1-2ng/ml)不足以对患有严重疾病的患者的临床发病产生实质效果。对A型血友病(HA)患者现有的治疗是使用重组或血浆源FVIII进行蛋白替换。然而，这些产物仅可用于全球约20％的HA群体。该治疗的主要并发症是FVIII中和抗体(抑制剂)的产生，其发生于25-30％的患有严重HA的患者中。因为抑制剂致使FVIII蛋白治疗失效，使用旁路剂(FVIIa)实现止血，然而，这些产物是非常昂贵的替换物。
本文公开的是用于治疗血友病的基因治疗方法的基因构建物。另外，这些因子VIII(FVIII)基因构建物也可用于体内放置蛋白表达***。每个基因构建物可选的包括一种或多种表达控制(例如启动子)元件、因子VIII基因和基因表达所需的其他调节特征，例如内含子、ITR、终止密码子、多腺苷酸信号等。
实例2
因子VIII DNA序列的密码子优化
之前已经描述了DNA序列的密码子优化能改善基因治疗情形下的因子VIII表达(Ward et al.2011,Blood 117(3):798-807)。DNA序列的密码子优化基于以下事实：DNA密码子是一系列的三个核苷酸，其在蛋白合成中编码蛋白链中的特定氨基酸残基。有64种不同密码子但只有20种氨基酸，因此，许多密码子编码相同氨基酸。在不同物种中存在密码子使用偏好，其反映了优化翻译过程的选择性过程。更重要的，尽管DNA序列在密码子优化中被修饰，蛋白序列与野生型序列是相同的。
密码子优化是为了获得删除B结构域的因子VIII(hFVIII-SQ)cDNA序列。在表达分析中评估了不同的密码子优化的因子VIII cDNA的四种版本，令人惊奇的是，几种DNA序列表达更高水平的因子VIII。
一种序列不仅表达更高水平的因子VIII，还具有独特的特性(SEQ ID NO:1)。相比其他的密码子优化序列或野生型序列，该序列能够更好的包装进腺相关病毒(AAV)载体。即，因子VIII基因及其调节元件两侧具有末端反向重复(ITR)，其提供包装序列进AAV病毒衣壳所需的信号。数据表明，各ITR之间的DNA序列的大小必须与正常病毒基因组大小(4.7Kb)相似以优化包装效率。在因子VIII的情形下，我们具有的基因序列是5.0Kb长度，但似乎其仍能够被包装，然而，包装效率不如完整基因。
另外可有助于包装特定基因的因子是DNA序列本身。一些DNA序列可能更倾向于重排，或具有基于电荷的折叠结构，其影响包装进病毒衣壳的能力。即，似乎不仅大小，DNA序列也影响转基因构建体的包装能力。在我们的研究中，我们认定自然界没有的新因子VIIIDNA序列表达更高水平的因子VIII(见例如图2、4A和6A)，而且更高效的包装进AAV载体。该改进的包装特征在不同血清型中产生了更高的载体产量(表3-5)，并将允许产生用于人类基因治疗的符合严格质量控制标准的同质AAV载体。
为了进一步改善表达水平，用甲状腺素运载蛋白(TTR)或突变TTR启动子(如下所述)和删除1645-1648氨基酸位置的PACE-furin剪切识别位点的因子VIII变体(TTRmut-hFVIII-SQ-CO-delP/F))(见下文对FVIII变体的描述)生产密码子优化的人FVIII cDNA构建体。这些FVIII转基因构建体被包装进腺相关病毒(AAV)载体并递送至A型血友病/CD4敲除(KO)小鼠。FVIII表达水平比野生型fFVIII-SQ高，具体如下：TTR-hFVIII-SQ-CO是5倍，TTRmut-hFVIII-SQ-CO是16倍以及TTRmut-hFVIII-SQ-CO-delP/F是33倍。
实例3
因子VIII变体
引入修饰至因子VIII的蛋白序列。进入密码子优化的DNA序列的修饰改变了PACE-furin剪切识别位点。该位点的修饰提高了蛋白的稳定性和生物活性。引入密码子优化因子VIII的PACE-furin剪切识别位点的氨基酸修饰见表1。
在氨基酸位置1645-1648的PACE-furin(P/F)剪切识别位点的删除变体引入野生型的删除B结构域的人因子VIII(hFVIII)基因。产生稳定的幼仓鼠肾(BHK)细胞系，其表达每种变体，纯化重组蛋白用于分析。
cFVIII、犬因子VIII；hFVIII-RH，在1645氨基酸位置具有精氨酸(R)至组氨酸(H)的单个氨基酸取代的变体产生P/F位点与cFVIII序列一致；Δ1645，删除残基R1645，Δ2删除残基R1645和H1646；Δ3，删除残基R1645、H1646和Q1647；Δ4，删除残基R1645、R1646、Q1647和R1648；以及Δ1648，删除残基R1648。
表1：PACE-Furin识别位点的人因子VIII变体
将重组变体蛋白纯化并在体外和体内的不同分子中进行比较，以表征促凝血功能。在体外，P/F变体比野生型hFVIII具有更高的生物活性，Δ3具有最高的生物活性，其次是Δ4和Δ2变体。
在体内，所有这些变体hFVIII蛋白在尾夹挑战分析中注入A型血友病小鼠，以测量受伤后的失血量。在该挑战模型中，Δ3和Δ4变体显示出减少失血的改进能力。
所有5种P/F删除变体被引入包含野生型因子VIII基因的腺相关病毒(AAV)载体表达组件(图3A)。AAV-hFVIII递送至A型血友病/CD4KO小鼠(5x1011vg/小鼠)，通过抗原和活性确定FVIII的表达(图3B)。Δ3的表达水平是野生型FVIII-BDD的4倍，而Δ4和Δ1645分别是2和3倍。Δ2和Δ1648与野生型FVIII相似。这些结果证明引入了Δ3和Δ4PACE-furin删除变体进改良的密码子优化的FVIII构建体。
实例4
TTR启动子
在这些研究中利用的改良启动子元件是具有核苷酸改变的甲状腺运载蛋白(TTR)启动子，其提高了因子VIII表达。该启动子的特性最初描述于Costa and Grayson 1991,Nucleic Acids Research 19(15):4139-4145。这些体外研究表明四种核苷酸修饰增加了肝细胞核因子(HNF)转录因子与DNA序列中的结合位点的亲和性。因此，在新型合成启动子中，我们引入了未得知能自然产生的TTR启动子序列的核苷酸67开始的核苷酸改变。其从TAmGTGTAG修饰为TATTGACTTAG(SEQ ID NO：8)。
实例5
野生型和密码子优化(CO)转基因的比较
生成AAV转基因构建体以阐明每个FVIII序列或序列变体对提高FVIII表达的贡献。这些构建体包含与图2所述的构建体相同的调节元件；但是，它们的FVIII序列是不同的。基于上述研究，表现最佳的PACE-furin删除变体(Δ3和Δ4)被引入这些hFVIII转基因。所有这些FVIII转基因也是删除B结构域(BDD)的形式。本研究中的所有AAV载体在CCMT的Research Vector Core生产并一起通过定量PCR和银染色测定效价。
表2A显示了野生型(WT)hFVIII和3个密码子优化变体，表示为CO1、CO2和CO3，之间的hFVIII序列一致性。
hFVIII 4374核苷酸
序列1 序列2 ％一致性 #核苷酸一致性 #核苷酸差异
野生型 CO3 77.34％ 3386 992
野生型 CO1 77.14％ 3374 1000
野生型 CO2 75.74％ 3315 1062
CO3 CO1 82.20％ 3597 779
CO3 CO2 81.91％ 3590 793
表2B显示了表示为CO1、CO2和CO3的每个密码子优化的hFVIII的核苷酸频率。
在该研究中，该五种人FVIII转基因是：(1)野生型人FVIII-BDD(hFVIIIwtSQ)；(2)在PACE-furin识别序列中删除4个残基的野生型人FVIII-BDD(hFVIIIwtSQ)；(3)密码子优化的(CO)hFVIII-BDD(hFVIIICO)；(4)删除了PACE-furin识别位点的3个残基的密码子优化的(hFVIIICOΔ3)；以及(5)删除了PACE-furin识别位点的4个残基的密码子优化的hFVIII(hFVIIICOΔ4)(图6)。
该数据是图2中数据的改进，其中野生型FVIII构建体使用了不同启动子(HCR-hAAT)并不在相同的表达组件中，因为密码子优化(CO)构建体使得难于阐明每个FVIII转基因的单独贡献。另外，具有删除了该位点的4个氨基酸残基的PACE-furin变体的野生型FVIII(hFVIIIwtSQΔ4)被包括在内，以阐明野生型hFVIII范围内PACE-furin删除的贡献。
如上所述，AAV-hFVIII被递送至A型血友病/CD4KO小鼠(1x1011vg/小鼠)。但是，基于AAV变体开发的不同AAV血清型，表示为Rh74vv。前述数据是根据AAV血清型8(AAV8)产生。
通过抗原水平(ELISA)以及活性(Coatest分析)测量hFVIII表达。对于Rh74VV，hFVIII表达水平在载体给药后4周是：hFVIIIwtSQ：9.4+1.5ng/ml(正常FVIII水平的6.3％)，hFVIIIwtSQΔ4：32.4+13.0ng/ml(21.6％),hFVIIICO：42.2+7.1ng/ml(28.1％),hFVIIICOΔ3：177.8+8.5ng/ml(118.5％)以及hFVIIICOΔ4：114.3+60.2ng/ml(76.2％)(图6)。
在载体给药后6周，在AAV递送野生型和密码子优化的hFVIII构建体后的小鼠通过体内止血挑战进行分析。结果(图7)显示在A型血友病小鼠中的凝固活性(通过失血减少反映)大于CO优化的具有或不含P/F删除的FVIII，并可比得上野生型小鼠。
因为用AAV变体(Rh74VV)获得的FVIII蛋白表达水平低于AAV8的FVIII水平，该数据用于野生型FVIII构建体相比的倍数差异呈现。重要的是，整体结论是相同的。引入Δ4P/F变体的表达水平是单纯野生型的约2-4倍。CO转基因导致表达是野生型hFVIII(hFVIII-wtSQ)的5倍。P/F删除变体引入密码子优化的hFVIII(hFVIII-CO)导致表达是单纯CO转基因的3-4倍(Δ3)或2-3倍(Δ4)。因此，hFVIIICOΔ3构建体好于hFVIIIwtSQ16-19倍，其实质性高于单纯P/F删除变体或密码子优化。
显著的是，P/F删除的贡献与野生型和密码子优化的hFVIII序列一致(图4)。而且，该贡献使用另一表达组件也可观察到(图3)。即，Δ3P/F变体引起3-4倍的表达水平，Δ4引起2-3倍的表达水平，不管他们处于野生型DNA序列或是密码子优化的DNA序列。尽管不希望收到任何特定理论限制，该结合的协同效果被认为是由于负责密码子优化(提高RNA序列翻译)和PACE-furin变体(增强蛋白分泌和更高的蛋白活性)的不同机制。
如所公开的(图2)，TTRm启动子表达与单纯TTR启动子相比是2倍。尽管没有包含在该研究中，基于其他研究的合理判断，优化的构建体TTRm-hFVIIICOΔ3好于TTR-hFVIIIwtSQ约30-40倍。
实例6
密码子优化和无密码子优化的构建体的载体产量
用于人因子VIII制备的腺相关病毒(AAV)载体产量见表3-5。显示了用于野生型人FVIII-SQ(hFVIII)(3个制备，表示为Prep1-Prep3)和密码子优化的人FVIII(hFVIII-CO、也称为CO3)(5个分别的CO3制备，表示为Prep1-Prep5)的每摇瓶的腺相关病毒(AAV)载体基因组。所有FVIII-CO3的载体制备使用相同生产协议和纯化方案制备。AAV8-hFVIII-SQ-CO的平均产量是4.60x1012vg/摇瓶(13个载体制备)，相比的，AAV8-hFVIII-SQ的平均产量为2.77x1012vg/摇瓶(3个载体制备)。与野生型FVIII序列相比，CO FVIII序列产量是其两倍。
表3：用于人因子FVIII制备的AAV8载体产量
所有FVIII载体制备的平均产量和标准偏差显示于表4和5。再次，尽管观察到通过不同载体核心产生的AAV制备具有更低产量，不同血清型的野生型载体和CO载体(Rh74VV)的比较显示了产率恒定为2倍。这表明了FVIII载体制备的产量不依赖于载体核心和AAV血清型。
表4：用于人因子FVIII制备的AAV8载体产量与标准偏差
表5：用于人因子FVIII制备的Rh74VV AAV载体产量与标准偏差
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO/CO3(SEQ ID NO:1)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGAGGCACCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO/CO3,具有R1645H变体(SEQ ID NO:2)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCACCACCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO/CO3,具有氨基酸1645-1648删除变体，Δ 4(SEQ ID NO:3)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO/CO3,具有氨基酸1645删除变体，Δ1645 (SEQ ID NO:4)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCACCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO/CO3,具有氨基酸1645和1646删除变体， Δ2(SEQ ID NO:5)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO/CO3,具有氨基酸1645-1647删除变体，Δ 3(SEQ ID NO:6)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
密码子优化的FVIII cDNA，又称为CO/CO3,具有氨基酸1648删除变体，Δ1648(SEQ ID NO:7)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGAGGCACCAGGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
具有4个核苷酸突变的TTR启动子(TTRm)，SEQ ID NO:8
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTGAC TTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCT
提供整个全长因子VIII构建体的DNA序列，包括具有4个核苷酸突变的TTR启动子、合成内含子、密码子优化因子VIII cDNA和多腺苷酸化(Poly A)信号序列(SEQ ID NO:9)。SEQ ID NO:9中突出的是编码4个氨基酸PACE/furin剪切位点的密码子，其中可选的1、2、3或全部4个氨基酸被删除。
包括具有4个核苷酸突变的TTR启动子(TTRm)、合成内含子、密码子优化因子VIII cDNA((PACE/furin标下划线)、poly A的全长构建体(SEQ ID NO:9)
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTgactTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGCAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTGACACTGACATCCACTTTTTCTTTTTCTCCACAGGTTTAAACGCCACCATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGAGGCACCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGAGCGGCCGCAATAAAAGATCAGAGCTCTAGAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGT
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO1(SEQ ID NO:10)
ATGCAGATCGAGCTGTCTACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGCGGTTCTGCTTCAGCGCCACCAGACGGTACTATCTGGGCGCCGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAGCTGCCCGTGGATGCCAGATTCCCTCCAAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTGTTCGTGGAATTCACCGACCACCTGTTCAATATCGCCAAGCCCAGACCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGACCTACAATTCAGGCCGAGGTGTACGACACCGTCGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCCGTGTCTCTGCATGCCGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGCGCCGAGTACGACGATCAGACCAGCCAGCGCGAGAAAGAGGACGACAAGGTGTTCCCTGGCGGCAGCCACACCTACGTGTGGCAGGTGCTGAAAGAAAACGGCCCCATGGCCTCCGACCCTCTGTGCCTGACATACAGCTACCTGAGCCACGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGCCTGATCGGAGCCCTGCTCGTGTGTAGAGAGGGCAGCCTGGCCAAAGAGAAAACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTCGCCGTGTTCGACGAGGGCAAGAGCTGGCACAGCGAGACAAAGAACAGCCTGATGCAGGACCGGGACGCCGCCTCTGCTAGAGCCTGGCCCAAAATGCACACCGTGAACGGCTACGTGAACAGAAGCCTGCCCGGACTGATCGGCTGCCACCGGAAGTCTGTGTACTGGCACGTGATCGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTTCTGGAAGGACACACCTTTCTCGTGCGGAACCACCGGCAGGCCAGCCTGGAAATCAGCCCTATCACCTTCCTGACCGCCCAGACACTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTTCTGCTGTTCTGCCACATCAGCTCCCACCAGCACGACGGCATGGAAGCCTACGTGAAGGTGGACAGCTGCCCCGAGGAACCCCAGCTGCGGATGAAGAACAACGAGGAAGCCGAGGACTACGACGACGACCTGACCGACAGCGAGATGGACGTGGTGCGCTTCGACGACGATAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGAAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTATATCGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTACGCCCCTCTGGTGCTGGCCCCCGACGACAGAAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGCGGATCGGCCGGAAGTATAAGAAAGTGCGGTTCATGGCCTACACCGACGAGACATTCAAGACCAGAGAGGCCATCCAGCACGAGAGCGGCATCCTGGGCCCTCTGCTGTATGGCGAAGTGGGCGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGACCCTACAACATCTACCCTCACGGCATCACCGACGTGCGGCCCCTGTACTCTAGAAGGCTGCCCAAGGGCGTGAAACACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCCGGCGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACCGTGGAAGATGGCCCCACCAAGAGCGACCCCAGATGCCTGACACGGTACTACAGCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCCTCCGGCCTGATTGGCCCACTGCTGATCTGCTACAAAGAAAGCGTGGACCAGCGGGGCAACCAGATCATGAGCGACAAGCGGAACGTGATCCTGTTTAGCGTGTTCGATGAGAACCGGTCCTGGTATCTGACCGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCTGCCGGCGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTCCAGGCCTCCAACATCATGCACTCCATCAATGGCTATGTGTTCGACAGCCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTGCACGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATCGGGGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTACGAGGATACCCTGACCCTGTTCCCCTTTAGCGGCGAAACCGTGTTCATGAGCATGGAAAACCCCGGCCTGTGGATCCTGGGCTGCCACAACAGCGACTTCCGGAACAGAGGCATGACCGCCCTGCTGAAGGTGTCCAGCTGCGACAAGAACACCGGCGACTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCAGCGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATCGAGCCCAGAAGCTTCAGCCAGAACCCCCCCGTGCTGAAGCGGCACCAGAGAGAGATCACCCGGACCACCCTGCAGTCCGACCAGGAAGAGATCGATTACGACGACACCATCAGCGTGGAAATGAAGAAAGAAGATTTCGACATCTACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCCGGTCCTTTCAGAAAAAGACCCGGCACTACTTCATTGCCGCTGTGGAACGGCTGTGGGACTACGGCATGAGCAGCAGCCCTCACGTGCTGAGAAACAGGGCCCAGAGCGGCAGCGTGCCCCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAATTCACAGACGGCAGCTTCACCCAGCCTCTGTACCGCGGCGAGCTGAATGAGCACCTGGGACTGCTGGGCCCCTATATCAGAGCCGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGGAATCAGGCCTCCCGGCCCTACAGCTTCTACAGCTCCCTGATCAGCTACGAAGAGGACCAGAGACAGGGCGCTGAGCCCCGGAAGAACTTCGTGAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCTACAAAGGACGAGTTCGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAAAAGGACGTGCACTCTGGGCTGATCGGCCCCCTGCTCGTGTGCCACACCAACACCCTGAATCCCGCCCACGGCAGACAAGTGACAGTGCAGGAATTCGCCCTGTTCTTCACCATCTTCGACGAAACAAAGAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAAAGAAACTGCCGGGCTCCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAAGAGAACTACCGGTTCCACGCCATCAACGGCTACATCATGGACACACTGCCCGGCCTCGTGATGGCTCAGGATCAGCGGATCCGGTGGTATCTGCTGTCCATGGGCTCCAACGAGAACATCCACAGCATCCACTTCAGCGGCCACGTGTTCACCGTGCGGAAAAAAGAAGAGTACAAAATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTCGAGACAGTGGAAATGCTGCCCAGCAAGGCCGGCATCTGGCGGGTGGAATGTCTGATCGGCGAGCATCTGCACGCTGGGATGAGCACACTGTTTCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACACCTCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCCGGGACTTTCAGATCACAGCCAGCGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCAAAACTGGCCAGACTGCACTACAGCGGCAGCATCAACGCCTGGTCCACCAAAGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCTCCCATGATCATCCACGGAATCAAGACCCAGGGCGCCAGACAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGCAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGCAATAGCACCGGCACCCTGATGGTGTTCTTCGGCAACGTGGACTCCAGCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCCGGTACATCCGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGAGAATGGAACTGATGGGCTGCGACCTGAACTCCTGCAGCATGCCCCTGGGGATGGAAAGCAAGGCCATCTCCGACGCCCAGATCACCGCCTCCAGCTACTTCACCAACATGTTCGCCACCTGGTCCCCATCCAAGGCCCGGCTGCATCTGCAGGGCAGAAGCAATGCTTGGAGGCCCCAAGTGAACAACCCCAAAGAATGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAAACCATGAAAGTGACCGGCGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCTCTGCTGACCTCTATGTACGTGAAAGAGTTCCTGATCTCCAGCAGCCAGGACGGCCACCAGTGGACCCTGTTTTTCCAGAACGGCAAAGTGAAAGTGTTTCAGGGGAACCAGGACTCCTTCACCCCCGTCGTGAATAGCCTGGACCCTCCACTGCTGACCAGATACCTGCGGATCCACCCTCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCTCTGCGGATGGAAGTGCTGGGATGCGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
密码子优化的因子VIII cDNA，又称为CO2(SEQ ID NO:11)
ATGCAGATCGAGCTGTCTACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGCGGTTCTGCTTTAGCGCTACTAGACGCTACTACCTGGGCGCCGTGGAACTGAGCTGGGACTATATGCAGTCAGACCTGGGCGAGCTGCCCGTGGACGCTAGATTCCCACCTAGAGTGCCTAAGAGCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTCTATAAGAAAACCCTGTTCGTCGAGTTCACCGATCACCTGTTTAATATCGCTAAGCCTAGACCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCTACTATTCAGGCCGAGGTCTACGACACCGTCGTGATCACCCTGAAGAATATGGCTAGTCACCCCGTCAGCCTGCACGCCGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTAGCGAGGGCGCCGAGTACGACGATCAGACTAGTCAGCGCGAGAAAGAGGACGACAAAGTCTTTCCTGGCGGCTCTCACACCTACGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAAAACGGCCCTATGGCTAGCGACCCCCTGTGCCTGACCTATAGCTACCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGACCTGAATAGCGGCCTGATCGGCGCCCTGCTCGTGTGTAGAGAGGGCTCACTGGCTAAAGAGAAAACTCAGACCCTGCACAAGTTTATCCTGCTGTTCGCCGTGTTCGACGAGGGCAAGAGCTGGCACTCAGAGACTAAGAATAGCCTGATGCAGGATAGGGACGCCGCTAGCGCTAGAGCCTGGCCTAAGATGCACACCGTGAACGGCTACGTGAACAGATCACTGCCCGGACTGATCGGCTGTCACCGGAAGTCCGTCTACTGGCACGTGATCGGAATGGGCACTACCCCCGAGGTGCACTCTATCTTTCTGGAAGGCCACACCTTCCTCGTCAGAAATCACCGGCAGGCTAGCCTCGAGATTAGCCCTATCACCTTCCTGACCGCTCAGACACTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTTTGTCACATTAGCTCTCACCAGCACGACGGGATGGAAGCCTACGTGAAAGTGGATAGCTGCCCCGAGGAACCTCAGCTGAGAATGAAGAACAACGAGGAAGCCGAGGATTACGACGACGACCTGACCGATAGCGAGATGGACGTCGTCAGATTCGACGACGATAACTCACCTAGCTTTATTCAGATTAGATCAGTGGCTAAGAAGCACCCTAAGACCTGGGTGCACTATATCGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCCCCTCTGGTGCTGGCCCCCGACGATAGAAGCTATAAGTCTCAGTACCTGAACAACGGCCCTCAGCGGATCGGCCGGAAGTATAAGAAAGTGCGGTTTATGGCCTACACCGACGAAACCTTCAAGACTAGAGAGGCTATTCAGCACGAGTCAGGGATCCTGGGCCCCCTGCTCTACGGCGAAGTGGGCGACACCCTGCTGATTATCTTTAAGAATCAGGCTAGTAGGCCCTATAATATCTACCCCCACGGAATCACCGACGTGCGGCCCCTCTACTCTAGACGGCTGCCTAAGGGCGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCTATTCTGCCCGGCGAGATCTTTAAGTACAAGTGGACCGTGACCGTCGAGGACGGCCCTACTAAGTCCGACCCTCGGTGCCTGACTAGGTACTACTCTAGCTTCGTGAATATGGAACGGGACCTGGCTAGCGGACTGATTGGCCCTCTGCTGATCTGCTACAAAGAATCAGTGGATCAGCGGGGCAATCAGATTATGAGCGATAAGCGGAACGTGATCCTGTTTAGTGTGTTTGACGAGAATAGGTCCTGGTATCTGACCGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCTAACCCTGCCGGCGTGCAGCTGGAAGATCCCGAGTTTCAGGCTAGCAATATTATGCACTCTATTAACGGATACGTGTTCGATAGCCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTGCACGAGGTGGCCTACTGGTATATCCTGTCTATCGGCGCTCAGACCGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTAGCGGCTACACCTTTAAGCACAAGATGGTCTACGAGGATACCCTGACCCTGTTCCCCTTTAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCTATGGAAAACCCCGGCCTGTGGATCCTGGGGTGTCACAATAGCGACTTTAGGAATAGAGGAATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCTAGCTGCGATAAGAACACCGGCGACTATTACGAGGACTCTTACGAGGATATTAGCGCCTACCTGCTGTCTAAGAACAACGCTATCGAGCCTAGAAGCTTCAGTCAGAACCCCCCCGTGCTGAAGCGGCACCAGAGAGAGATCACTAGAACTACCCTGCAGAGCGACCAGGAAGAGATCGACTACGACGACACTATTAGCGTCGAGATGAAGAAAGAGGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAGAACCAGTCACCTAGATCCTTCCAGAAGAAAACTAGGCACTACTTTATTGCCGCCGTCGAGCGGCTGTGGGACTACGGAATGAGTTCTAGCCCTCACGTGCTGAGAAATAGGGCTCAGTCAGGCTCAGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAATTCACCGACGGCAGCTTCACTCAGCCCCTCTATAGGGGCGAGCTGAACGAGCACCTGGGACTGCTGGGACCTTATATTAGAGCCGAAGTCGAGGACAATATTATGGTCACCTTTAGGAACCAGGCCTCTAGGCCCTACAGCTTCTACTCTAGCCTGATCAGCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGGGCCGAACCTAGAAAGAACTTCGTGAAGCCTAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCTACTAAGGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTTAGCGACGTGGACCTCGAGAAGGACGTGCACTCAGGGCTGATCGGACCTCTGCTCGTCTGTCACACTAACACCCTGAACCCCGCTCACGGCCGGCAGGTCACAGTGCAGGAATTCGCCCTGTTCTTCACTATCTTCGACGAAACTAAGAGCTGGTACTTCACAGAGAATATGGAAAGAAACTGTAGGGCCCCCTGTAATATTCAGATGGAAGATCCTACCTTTAAAGAGAACTATAGGTTTCACGCTATTAACGGCTATATTATGGACACCCTGCCCGGCCTCGTGATGGCTCAGGATCAGCGGATTAGGTGGTATCTGCTGTCTATGGGCTCTAACGAGAATATTCACTCTATTCACTTTAGCGGCCACGTGTTCACCGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAGATGGCCCTCTATAACCTCTACCCCGGCGTGTTCGAGACAGTGGAAATGCTGCCTAGTAAAGCCGGAATCTGGCGGGTCGAGTGTCTGATCGGCGAGCACCTCCACGCCGGAATGAGCACCCTGTTTCTGGTCTACTCTAACAAGTGTCAGACCCCTCTGGGAATGGCTAGCGGCCACATTAGAGACTTTCAGATCACCGCTAGCGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATAGCGGATCTATCAACGCCTGGTCTACCAAAGAGCCCTTTAGCTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCCCCTATGATTATTCACGGGATTAAGACTCAGGGCGCTAGGCAGAAGTTTAGTAGCCTCTATATTAGTCAGTTTATCATTATGTATAGCCTGGACGGCAAGAAGTGGCAGACCTATAGAGGCAATAGCACCGGCACCCTGATGGTGTTCTTCGGCAACGTGGACTCTAGCGGGATCAAGCACAATATCTTTAACCCCCCTATTATCGCTAGATATATTAGGCTGCACCCTACTCACTACTCTATTAGGTCTACCCTGAGGATGGAACTGATGGGCTGCGATCTGAATAGCTGCTCTATGCCCCTGGGGATGGAATCTAAGGCTATTAGCGACGCTCAGATCACAGCCTCTAGCTACTTCACTAATATGTTCGCTACCTGGTCCCCTAGCAAGGCCCGGCTGCACCTCCAGGGCAGATCTAACGCTTGGCGGCCTCAGGTCAACAACCCTAAAGAGTGGCTGCAGGTCGACTTTCAGAAAACTATGAAGGTCACCGGCGTGACCACTCAGGGCGTGAAATCACTGCTGACCTCTATGTACGTGAAAGAGTTCCTGATTAGCTCTAGCCAGGACGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAACGGCAAAGTGAAAGTGTTTCAGGGCAATCAGGATAGCTTCACCCCCGTGGTCAATAGCCTGGATCCCCCACTGCTGACTAGATACCTGAGAATTCACCCTCAGTCTTGGGTGCACCAGATCGCCCTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGTGAAGCTCAGGACCTCTACTAA
使用的某些定义/简称
SQ和BDD:删除B结构域的FVIII
TTRm:具有从TAmGTGTAG突变成TATTGACTTAG的4个突变的TTR启动子
CO和CO3：密码子优化FVIII核酸变体，如SEQ ID NO:1所述。
CO1：密码子优化FVIII核酸变体，如SEQ ID NO:10所述。
CO2：密码子优化FVIII核酸变体，如SEQ ID NO:11所述。
表3的制备指定是指CO/CO3的5个独立的载体制备。
hFVIII-RH:在人FVIII位置1645的Arg取代为His
Δ4:删除FVIII氨基酸1645-1648
Δ1645:删除FVIII氨基酸1645(Arg)
Δ2:删除FVIII氨基酸1645和1646
Δ3:删除FVIII氨基酸1645-1647
Δ1648:删除FVIII氨基酸1648
尽管本发明的某些实施方案已在上文描述和具体示例，其并不意图将本发明限于这些实施方式。在不超出本发明范围和精神的情形下，可做出各种修饰，如权利要求所陈述的。

Claims (54)

1.一种编码因子VIII(FVIII)的核酸变体，其中由所述核酸变体编码的FVIII展示出比野生型FVIII更强的表达。
2.一种编码因子VIII(FVIII)的核酸变体，其中由所述核酸变体编码的FVIII删除B结构域并展示出比删除B结构域的野生型FVIII更强的表达。
3.根据权利要求1或2所述的变体FVIII，其中所述核酸变体更有效的包装进腺相关病毒(AAV)载体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体FVIII，其中由所述核酸变体编码的FVIII展示出比野生型FVIII或删除B结构域的野生型FVIII更高的生物活性。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的变体FVIII，其中生物活性由FVIII分析中或FVIII缺陷模型中的凝血分析或出血减少进行确定。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的变体FVIII，其中所述核酸变体具有一个或多个亮氨酸密码子变成CTG，相对于野生型FVIII中的TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的变体FVIII，其中所述核酸变体具有2-5、5-10、10-20、20-50、50-100、100-250、250-500、500-750或750-850个CTG亮氨酸密码子，所述CTG亮氨酸密码子通过修饰野生型FVIII中的TTA、TTG、CTT、CTC或CTA亮氨酸密码子获得。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的变体FVIII，其中所述核酸变体的CTG亮氨酸密码子85％以上通过修饰野生型FVIII中的TTA、TTG、CTT、CTC或CTA获得。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的变体FVIII，其中所述核酸变体的所有CTG亮氨酸密码子通过修饰野生型FVIII中的TTA、TTG、CTT、CTC或CTA获得。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的变体FVIII，其中所述核酸变体具有一个或多个AAG赖氨酸密码子，相对于野生型FVIII中的AAA赖氨酸密码子。
11.根据权利要求1所述的变体FVIII，其中所述核酸变体具有约50-59％、或50-56％或50-53％的GC含量。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的变体FVIII，其中所述核酸变体至少75％与野生型人FVIII核酸或删除B结构域的野生型人FVIII核酸相同。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的变体FVIII，其中所述核酸变体是人FVIII和/或其中所述野生型FVIII或删除B结构域的野生型FVIII是人FVIII。
14.根据权利要求1所述的变体FVIII，其中所述核酸变体包含SEQ ID NO:1-7和SEQ IDNO:9中的任一项。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的变体FVIII，其中编码PACE/furin剪切位点的密码子中的1、2、3或全部4个被删除。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的变体FVIII，其中编码表述为HHQR或RHQR、位置为1645-1648的PACE/furin剪切位点的密码子中的1、2、3或全部4个被删除。
17.一种包含权利要求1-16中任一项所述的变体FVIII的表达载体。
18.根据权利要求17所述的表达载体，选自以下组：腺相关病毒(AAV)载体、反转录病毒载体、腺病毒载体、质粒或慢病毒载体。
19.根据权利要求18所述的表达载体，其中所述AAV载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清型。
20.根据权利要求17所述的表达载体，进一步包含内含子、表达控制元件、一个或多个腺相关病毒(AAV)末端反向重复(ITR)和/或填充多核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的表达载体，其中内含子位于变体FVIII内部或两侧，或者其中表达控制元件可操作的连接至变体FVIII，或者其中AAV ITR位于变体FVIII的5’或3’末端，或者其中填充多核苷酸序列位于变体FVIII的5’或3’末端。
22.根据权利要求20所述的表达载体，其中表达控制元件包含基本的或可调节的控制元件、或者组织特异性表达控制元件或启动子。
23.根据权利要求20所述的表达载体，其中表达控制元件包含赋予肝脏中表达能力的元件。
24.根据权利要求20所述的表达载体，其中表达控制元件包含TTR启动子或突变TTR启动子。
25.根据权利要求24所述的表达载体，其中突变TTR启动子包含SEQ ID NO:8。
26.根据权利要求20所述的表达载体，其中ITR包含以下ITR中的任意一种或多种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清型，或其组合。
27.表达由权利要求1-16中任一项所述的核酸变体编码的FVIII的宿主细胞。
28.包含权利要求1-16中任一项所述的核酸变体或权利要求17-26中任一项所述的表达载体的宿主细胞。
29.包含权利要求1-16中任一项所述的核酸变体或权利要求17-26中任一项所述的表达载体的病毒载体。
30.包含权利要求1-16中任一项所述的核酸变体或权利要求17-26中任一项所述的表达载体的AAV载体。
31.根据权利要求30所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，所述衣壳序列与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8VP1、VP2和/或VP3序列具有75％或以上的序列一致性。
32.根据权利要求30所述的AAV载体，其中AAV载体包括选自以下任意一种的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74和AAV-2i8AAV血清型。
33.包含生物相容性载体或赋形剂中的权利要求1-16中任一项所述的核酸变体、权利要求17-26中任一项所述的表达载体或权利要求30-32中任一项所述的病毒或AAV载体的药物组合物，可选的包括空衣壳AAV。
34.封装于脂质体中或与磷脂或微胶粒混合的权利要求1-16中任一项所述的核酸变体、权利要求17-26中任一项所述的表达载体，或权利要求30-32中任一项所述的病毒或AAV载体。
35.用于递送或转移核酸序列进哺乳动物或哺乳动物细胞的方法，包含将权利要求1-16中任一项所述的核酸变体、权利要求17-26中任一项所述的表达载体，或权利要求30-32中任一项所述的病毒或AAV载体给予给哺乳动物或哺乳动物细胞或使其接触，从而递送或转移核酸序列至哺乳动物或哺乳动物细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述哺乳动物细胞在培养基中或存在于主体。
37.一种治疗需要因子VIII的哺乳动物的方法，包含：
(a)提供权利要求1-16中任一项所述的核酸变体、权利要求17-26中任意一项所述的表达载体，或权利要求30-32中任一项所述的病毒或AAV载体；以及
(b)给予一定量的权利要求1-16中任一项所述的核酸变体、权利要求17-26中任一项所述的表达载体，或权利要求30-32中任一项所述的病毒或AAV载体给哺乳动物，其中所述因子VIII在哺乳动物中表达。
38.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述因子VIII表达水平对哺乳动物有益或有疗效。
39.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述因子VIII表达于哺乳动物的细胞、组织或器官中。
40.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述细胞包含分泌细胞。
41.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述细胞包含内分泌细胞或内皮细胞。
42.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述细胞包含肝细胞、肝窦内皮细胞、巨核细胞、血小板或造血肝细胞。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述哺乳动物的组织或器官包含肝脏。
44.根据权利要求35或37所述的方法，其中哺乳动物产生不足量的因子VIII蛋白，或者缺陷型或异常因子VIII蛋白。
45.根据权利要求35或37所述的方法，其中所述哺乳动物患有A型血友病。
46.一种治疗患者止血相关疾病的方法，包含将生物可接受的载体中的治疗有效量的权利要求1-16中任一项所述的核酸变体、权利要求17-26中任一项所述的表达载体、或权利要求30-32中任一项所述的病毒或AAV载体给患者。
47.根据权利要求35、37或46所述的方法，其中所述哺乳动物或所述患者患有以下疾病：A型血友病、血管性血友病和相关创伤出血、受伤、血栓症、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)或过度抗凝作用治疗疾病。
48.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中将权利要求1-16中任一项所述的核酸变体、权利要求17-26中任一项所述的表达载体、或权利要求30-32中任一项所述的病毒或AAV载体，通过静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下给药、腔内给药、或通过插管法、或通过导管递送给所述哺乳动物或所述患者。
49.根据权利要求33-45中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物或所述患者是人。
50.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物或所述患者对AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-Rh10或AAV-Rh74血清型呈血清反应阳性或血清反应阴性。
51.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，进一步包含给予空衣壳AAV给哺乳动物或患者。
52.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，进一步包含给予AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-Rh10和/或AAV-Rh74血清型的空衣壳给哺乳动物或患者。
53.一种生产FVIII蛋白的方法，包含在细胞中表达权利要求1-16中任一项所述的变体FVIII或权利要求17所述的表达载体，以及回收细胞产生的FVIII蛋白。
54.根据权利要求53所述的方法，进一步包含纯化或分离由细胞产生的FVIII蛋白。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795986A (zh) * 2018-05-31 2018-11-13 深圳市免疫基因治疗研究院 一种a型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
WO2021128692A1 (en) * 2019-12-25 2021-07-01 Brainvta (Wuhan) Co., Ltd Liver-specific promoter and application thereof
CN116715752A (zh) * 2023-06-16 2023-09-08 苏州诺洁贝生物技术有限公司 凝血因子fviii蛋白变体、表达载体和用途
WO2024007978A1 (zh) * 2022-07-07 2024-01-11 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种连接肽、包含连接肽的凝血八因子蛋白或其变体及其用途
WO2024138833A1 (zh) * 2022-12-30 2024-07-04 福因医药科技(武汉)有限公司 一种改造的重组凝血因子viii及其应用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108093639B (zh) * 2015-04-16 2022-07-19 埃默里大学 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
WO2016183422A1 (en) * 2015-05-14 2016-11-17 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
CA3001594A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Audentes Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
PE20231949A1 (es) * 2015-10-30 2023-12-05 Spark Therapeutics Inc VARIANTES DEL FACTOR VIII REDUCIDO CON CpG, COMPOSICIONES Y METODOS Y USOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA
AU2016353353B2 (en) 2015-11-13 2020-07-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Viral vectors encoding recombinant FVIII variants with increased expression for gene therapy of hemophilia A
CA3005565A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Baxalta Incorporated Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
SG11202000650YA (en) * 2017-08-01 2020-02-27 Spark Therapeutics Inc Factor viii (fviii) gene therapy methods
AU2019270184A1 (en) 2018-05-18 2020-11-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia A
TW202039546A (zh) 2019-01-16 2020-11-01 美商巴克斯歐塔公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
WO2022241041A2 (en) * 2021-05-11 2022-11-17 City Of Hope Adeno-associated virus compositions and methods of use thereof
CN115948408A (zh) * 2022-09-23 2023-04-11 上海信致医药科技有限公司 改进的人凝血因子viii基因表达盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597616A (zh) * 2008-06-04 2009-12-09 上海同科生物科技有限公司 一种提高基因重组人凝血因子ⅷ表达量的方法
WO2011005968A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 Ucl Business Plc Codon-optimized factor vi i i variants and synthetic liver-specific promoter

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
US6924365B1 (en) * 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
US6221349B1 (en) * 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
ES2525143T3 (es) * 2005-04-07 2014-12-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cápsides de AAVrh.64 modificado, composiciones que las contienen y usos de las mismas
EP2037892B1 (en) * 2006-06-19 2015-03-18 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Modified factor viii and factor ix genes and vectors for gene therapy
US20120028900A1 (en) * 2006-06-30 2012-02-02 Kaufman Randal J Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
AU2013202564B2 (en) * 2008-06-24 2015-09-17 Csl Behring Gmbh Factor VIII, von Willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life
ES2717902T5 (es) * 2009-10-02 2022-11-29 Childrens Hospital Philadelphia Composiciones y procedimientos para mejorar la función del factor VIII de coagulación
EP3404105A1 (en) * 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
DK2911687T3 (da) 2012-10-26 2019-05-13 Univ Brussel Vrije Vektor til levermålrettet genterapi af hæmofili og fremgangsmåder og anvendelse deraf
DK3889173T3 (da) * 2013-02-15 2023-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597616A (zh) * 2008-06-04 2009-12-09 上海同科生物科技有限公司 一种提高基因重组人凝血因子ⅷ表达量的方法
WO2011005968A1 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 Ucl Business Plc Codon-optimized factor vi i i variants and synthetic liver-specific promoter

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MILLE PETERSEN KOLIND等: "The B-domain of Factor VIII reduces cell membrane attachment to host cells under serum free conditions", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795986A (zh) * 2018-05-31 2018-11-13 深圳市免疫基因治疗研究院 一种a型血友病慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用
WO2021128692A1 (en) * 2019-12-25 2021-07-01 Brainvta (Wuhan) Co., Ltd Liver-specific promoter and application thereof
WO2024007978A1 (zh) * 2022-07-07 2024-01-11 深圳新诺微环生物科技有限公司 一种连接肽、包含连接肽的凝血八因子蛋白或其变体及其用途
WO2024138833A1 (zh) * 2022-12-30 2024-07-04 福因医药科技(武汉)有限公司 一种改造的重组凝血因子viii及其应用
CN116715752A (zh) * 2023-06-16 2023-09-08 苏州诺洁贝生物技术有限公司 凝血因子fviii蛋白变体、表达载体和用途

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