JP7499174B2 - 第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）遺伝子治療法 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
［関連出願］
[0001]この特許出願は、２０１７年８月１日に出願された米国特許仮出願第６２／５４０，０５３号；２０１７年１１月９日に出願された米国特許仮出願第６２／５８３，８９０号；２０１７年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６２／５９６，５３５号；及び２０１７年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６２／５９６，６７０号の利益を主張する。上記出願の内容全体は、全てのテキスト、表及び図面を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。
［発明の分野］
[0002]本発明は、組換え凝固因子の製造及び異常な止血と関連する医学的障害の治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質をコードする核酸を投与する方法、及び血友病Ａの治療方法を提供する。
［導入］
[0003]いくつかの刊行物及び特許文献が、本発明が関連する技術の状態を記載するために本明細書の全体を通じて引用される。これらの引用のそれぞれは、参照により、完全に記載されたかのように本明細書に組み込まれる。
[0004]血友病は、世界中で５，０００人の男性のうち１人に存在するＸ連鎖性の出血障害である。正常の１％だけ高くなるように凝固因子レベルを増加させることを目的とする療法は、重篤な疾患表現型の実質的な改善と関連する。血友病Ｂ（ＨＢ）に対するＡＡＶ媒介性の遺伝子移入の最近の臨床試験は、治療レベルの第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の持続的な長期発現を実証したが、ＡＡＶベクター投与はＡＡＶキャプシドへの抗ＡＡＶ免疫応答に起因して限定的であり得ることを確立した。これらのデータは血友病Ｂに関するが、全ての血友病の８０％はＦＶＩＩＩ欠損症、血友病Ａ（ＨＡ）に起因する。
[0005]この疾患のための現行の治療は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の頻繁な注入を必要とするタンパク質置換療法である。持続的な治療レベルの第ＶＩＩＩ因子発現を達成することにより、患者がそのような頻繁なタンパク質治療をもはや必要としないようにする目下の必要性が存在する。実際、連続的な第ＶＩＩＩ因子発現は出血症状を予防し、タンパク質に対する免疫寛容が確立されることを確実にし得る。
［概要］
[0006]本発明によれば、血友病Ａを有する又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を必要とするヒトを治療する方法が提供される。一実施形態では、方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与するステップを含み、ベクターゲノムは、Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸変種を含み、核酸変種は、配列番号７に対して９５％又はそれより高い同一性を有する。別の実施形態では、方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与するステップを含み、ベクターゲノムは、Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸変種を含み、核酸変種は、２つより多くのシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有しない。
[0007]さらなる実施形態では、血友病Ａを有する又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を必要とするヒトを治療する方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与するステップを含み、ベクターゲノムは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする又はＢドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸を含み、ヒトに投与されるｒＡＡＶベクターの用量は、１キログラム当たり６ｘ１０１２ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）未満である。
[0008]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約１ｘ１０９～約１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0009]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約６ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0010]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0011]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0012]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0013]ヒトに投与されるｒＡＡＶベクターの用量が、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１１～約１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
[0014]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約２ｘ１０１１～約９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0015]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約３ｘ１０１１～約８ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0016]１２．ヒトに投与されるｒＡＡＶベクターの用量が、下限及び上限を含めて約３ｘ１０１１～約７ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
[0017]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約３ｘ１０１１～約６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0018]方法及び使用の実施形態は、下限及び上限を含めて約４ｘ１０１１～約６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0019]方法及び使用の実施形態は、約５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ又は約１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの間のｒＡＡＶベクターの用量をヒトに投与するステップを含む。
[0020]方法及び使用の実施形態は、ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験から得られるデータに基づいてヒトにおいて予測される量より多くのＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤを提供するステップを含む。例えば、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験に由来する線形回帰曲線に基づいて予測される量よりも多いものであり得る。
[0021]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験から得られるデータに基づいて予測される量より多い。
[0022]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験に由来する線形回帰曲線に基づいて予測される発現より１～４倍多い。
[0023]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験に由来する線形回帰曲線に基づいて予測される量より２～４倍多い。
[0024]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験に由来する線形回帰曲線に基づいて予測される量より２～３倍多い。
[0025]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験に由来する線形回帰曲線に基づいて予測される量より１～２倍多い。
[0026]非ヒト霊長動物としては、マカク属（Ｍａｃａｃａ）が挙げられる。特定の実施形態では、非ヒト霊長動物はカニクイザル（マカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））である。
[0027]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、短期、中期又は長期の止血の改善をもたらす期間にわたり発現される。ある特定の実施形態では、期間は、止血を維持するために捕捉的なＦＶＩＩＩタンパク質又は組換えＦＶＩＩＩタンパク質をヒトに投与する必要がないようなものである。
[0028]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約１４日にわたり発現される。
[0029]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約２１日にわたり発現される。
[0030]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約２８日にわたり発現される。
[0031]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約３５日にわたり発現される。
[0032]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約４２日にわたり発現される。
[0033]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約４９日にわたり発現される。
[0034]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約５６日にわたり発現される。
[0035]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約６３日にわたり発現される。
[0036]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約７０日にわたり発現される。
[0037]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約７７日にわたり発現される。
[0038]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約８４日にわたり発現される。
[0039]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約９１日にわたり発現される。
[0040]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約９８日にわたり発現される。
[0041]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約１０５日にわたり発現される。
[0042]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約１１２日にわたり発現される。
[0043]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約４カ月にわたり発現される。
[0044]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、少なくとも約１５４日にわたり発現される。
[0045]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、少なくとも約２１０日にわたり発現される。
[0046]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約６カ月にわたり発現される。
[0047]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約１２カ月にわたり発現される。
[0048]ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後のある期間にわたりある特定の量で発現され得る。ある特定の実施形態では、量は、検出可能なＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ、又は治療的利益をもたらす量のＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが存在するような量である。
[0049]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、ｒＡＡＶベクター投与後の１４日又はそれを超える日において約３％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において約４％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において約５％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において約６％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において約７％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２８日又はそれを超える日において約８％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与（ｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）後の２８日又はそれを超える日において約９％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の３５日又はそれを超える日において約１０％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の３５日又はそれを超える日において約１１％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の３５日又はそれを超える日において約１２％又はそれより多い。
[0050]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する１４日の期間にわたり、平均して約１０％であるか、又はそれより多い。
[0051]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する４週の期間にわたり、平均して約１０％であるか、又はそれより多い。
[0052]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する８週の期間にわたり、平均して約１０％であるか、又はそれより多い。
[0053]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する１２週の期間にわたり、平均して約１０％であるか、又はそれより多い。
[0054]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する１６週の期間にわたり、平均して約１０％であるか、又はそれより多い。
[0055]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する６カ月の期間にわたり、平均して約１０％であるか、又はそれより多い。
[0056]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する７カ月の期間にわたり、平均して約１０％であるか、又はそれより多い。
[0057]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する１４日の期間にわたり、平均して約１２％であるか、又はそれより多い。
[0058]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する４週の期間、連続する８週の期間、連続する１２週の期間、連続する１６週の期間、連続する６カ月の期間、連続する７カ月の期間、又は連続する１年の期間にわたり、平均して約１２％～約１００％である。
[0059]ある特定の実施形態では、凝固活性に反映される、ヒトにおいて発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量は、連続する４週の期間、連続する８週の期間、連続する１２週の期間、連続する１６週の期間、連続する６カ月の期間、又は連続する１年の期間にわたり、平均して約２０％～約８０％である。
[0060]定常状態のＦＶＩＩＩ発現もまた、ｒＡＡＶベクター投与からある特定の期間後、例えば、４～６、６～８又は６～１２週後又はそれより後、例えば、６～１２カ月後又は１年後以降にさえ達成され得る。
[0061]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ＦＶＩＩＩ活性が４、６、８又は１２の週又は月にわたり５～５０％より大きく変動しない定常状態で、ヒトにおいて産生される。
[0062]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ＦＶＩＩＩ活性が４、６、８又は１２の週又は月にわたり２５～１００％より大きく変動しない定常状態で、ヒトにおいて産生される。
[0063]ｒＡＡＶベクターは、ある特定の量のＦＶＩＩＩの発現をもたらすと予測される用量で、投与後に持続的な発現をもたらすある特定の期間にわたり投与され得る。
[0064]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約１ｘ１０９～約１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0065]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約５ｘ１０９～約６ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0066]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約６ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0067]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0068]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0069]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ未満の用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0070]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１０～約５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0071]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約１ｘ１０１１～約１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0072]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約２ｘ１０１１～約９ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0073]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約３ｘ１０１１～約８ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0074]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約３ｘ１０１１～約７ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0075]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約３ｘ１０１１～約６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0076]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、下限及び上限を含めて約４ｘ１０１１～約６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でヒトに投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0077]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、約５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ又は約１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で約１２％～約１００％の活性のレベルでヒトにおいて産生される。
[0078]方法及び使用によるヒトとしては、ＡＡＶ抗体について血清陰性であるか、又は検出可能なＡＡＶ抗体を有しないヒトが挙げられる。
[0079]ある特定の実施形態では、ヒトにおいてＡＡＶ抗体は、ｒＡＡＶベクター投与の前に検出されないか、又は前記ヒトはＡＡＶについて血清陰性である。
[0080]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤに対するＡＡＶ抗体は、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１月又はそれより長い期間にわたり検出されない。
[0081]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターに対するＡＡＶ抗体は、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約１４日、又は少なくとも約２１日、又は少なくとも約２８日、又は少なくとも約３５日、又は少なくとも約４２日、又は少なくとも約４９日、又は少なくとも約５６日、又は少なくとも約６３日、又は少なくとも約７０日、又は少なくとも約７７日、又は少なくとも約８４日、又は少なくとも約９１日、又は少なくとも約９８日、又は少なくとも約１０５日、又は少なくとも約１１２日にわたり検出されない。
[0082]方法及び使用によるヒトとしては、検出可能なＡＡＶ抗体を有するヒトが挙げられる。
[0083]ある特定の実施形態では、ヒトにおいてＡＡＶ抗体は、ｒＡＡＶベクター投与の前に約１：５であるか、又は約１：５未満である。
[0084]ある特定の実施形態では、ヒトにおいてＡＡＶ抗体は、ｒＡＡＶベクター投与の前に約１：３であるか、又は約１：３未満である。
[0085]ある特定の方法及び使用では、ｒＡＡＶベクターを投与されるヒトは、ｒＡＡＶベクターに対する細胞性免疫応答を生じない。
[0086]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを投与されるヒトは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する週又は月にわたりｒＡＡＶベクターに対する細胞性免疫応答を生じない。
[0087]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを投与されるヒトは、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの治療効果を減少させ又は遮断するために十分なｒＡＡＶベクターに対する液性免疫応答を発生させない。
[0088]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを投与されるヒトは、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも約１、２、３、４、５又は６カ月にわたりｒＡＡＶベクターに対する検出可能な抗体を産生しない。
[0089]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを投与されるヒトは、ｒＡＡＶベクター投与の前、間及び／又は後に免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｕｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅ ａｇｅｎｔ）を投与されない。
[0090]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤがヒトにおいて発現されるｒＡＡＶベクターを投与されるヒトは、免疫抑制剤を投与することなく達成される。
[0091]免疫応答が以前から存在するか、又はｒＡＡＶベクター投与後に発生する場合、ヒトは、ｒＡＡＶベクター投与の前又は後に免疫抑制剤を投与されてもよい。
[0092]ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶベクターの投与の前に免疫抑制剤を投与するステップを含む。
[0093]ある特定の実施形態では、方法又は使用は、ｒＡＡＶベクターの投与の後に免疫抑制剤を投与するステップを含む。
[0094]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、ｒＡＡＶベクターが投与された後の１時間から４５日までの期間に投与される。
[0095]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、ステロイド、サイクロスポリン（例えば、サイクロスポリンＡ）、ミコフェノール酸塩、リツキシマブ又はこれらの誘導体を含む。
[0096]ある特定の実施形態では、核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれより高い配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに対して９０～９５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに対して９５％～１００％の配列同一性を有する。
[0097]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸変種は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸と比較して低減したＣｐＧ含有量を有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸（配列番号１９）より少なくとも２０個少ないＣｐＧを有する。ある特定の実施形態では、核酸変種は、１０個より多くのＣｐＧ、９個より多くのＣｐＧ、８個より多くのＣｐＧ、７個より多くのＣｐＧ、６個より多くのＣＰＧ、５個より多くのＣｐＧ、４個より多くのＣｐＧ；３個より多くのＣｐＧ；２個より多くのＣｐＧ；又は１個より多くのＣｐＧを有しない。ある特定の実施形態では、核酸変種は、最大で４個のＣｐＧ；３個のＣｐＧ；２個のＣｐＧ；又は１個のＣｐＧを有する。ある特定の実施形態では、核酸変種はＣｐＧを有しない。
[0098]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸変種は、ＦＶＩＩＩをコードする野生型核酸と比較して低減したＣｐＧ含有量を有し、そのようなＣｐＧが低減した核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに対して９０％又はそれより高い配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＣｐＧが低減した核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに対して９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれより高い配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＣｐＧが低減した核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに対して９０～９５％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＣｐＧが低減した核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに対して９５％～１００％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種は、配列番号１～１８のいずれかに記載される。
[0099]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質をコードする核酸変種は、野生型ヒトＦＶＩＩＩ核酸又はＢドメイン欠失を含む野生型ヒトＦＶＩＩＩ核酸に対して少なくとも７５％同一である。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸変種は、野生型ヒトＦＶＩＩＩ核酸又はＢドメイン欠失を含む野生型ヒトＦＶＩＩＩ核酸に対して約７５～９５％同一（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％同一）である。
[0100]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸及び変種は、ヒトのような哺乳動物のものである。ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするそのような哺乳動物の核酸及び核酸変種としては、ヒト型が挙げられ、これは、ヒト野生型ＦＶＩＩＩ又はＢドメイン欠失を含むヒト野生型ＦＶＩＩＩに基づいてもよい。
[0101]ある特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスウイルス（ｓＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ血清型又はＡＡＶシュードタイプ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶを含むＡＡＶベクターを含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１～１８のいずれかを含むか、又は配列番号２３若しくは２４を含む。
[0102]ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、構成的若しくは調節可能な制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、肝臓における発現を付与するエレメントを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、ＴＴＲプロモーター又は変異体ＴＴＲプロモーター、例えば配列番号２２を含む。さらなる特定の態様では、発現制御エレメントは、ＰＣＴ国際公開第２０１６／１６８７２８（米国特許出願第６２／１４８，６９６号；同第６２／２０２，１３３号；及び同第６２／２１２，６３４号）（参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーターを含む。
[0103]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＩＴＲ血清型とは異なるＡＡＶキャプシド血清型を含むＡＡＶ血清型又はＡＡＶシュードタイプを含む。追加の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶ血清型のいずれかに対して７５％又はそれより高い配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％など）を有するＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシド配列を含む。
[0104]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、任意の配列番号２７又は配列番号２８に対して７５％又はそれより高い配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％など）を有するＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシド配列を含む。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号２７又は配列番号２８に対して１００％同一のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシドを含む。
[0105]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶ血清型、又はこれらの組合せのいずれか）、フィラーポリヌクレオチド配列及び／又はポリＡシグナルをさらに含む。
[0106]ある特定の実施形態では、イントロンは、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸若しくは核酸変種内にあるか若しくはそれに隣接し、及び／又は、発現制御エレメントは、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸若しくは核酸変種に作動可能に連結されており、及び／又は、（１つ若しくは複数の）ＡＡＶ ＩＴＲは、ＦＶＩＩＩをコードする核酸若しくは核酸変種の５’若しくは３’端に隣接しており、及び／又は、フィラーポリヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸若しくは核酸変種の５’若しくは３’端に隣接している。
[0107]特定の実施形態では、発現制御エレメントは、構成的若しくは調節可能な制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、発現制御エレメントは、肝臓における発現を付与するエレメント（例えば、ＴＴＲプロモーター又は変異体ＴＴＲプロモーター）を含む。
[0108]ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶは医薬組成物を構成する。そのような医薬組成物は、任意選択で、空キャプシドＡＡＶ（例えば、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を含むベクターゲノムを欠いている）を含む。
[0109]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質をコードする核酸若しくは核酸変種、ベクター、発現ベクター、又はウイルス若しくはＡＡＶベクターは、リポソームに封入されているか、又はリン脂質若しくはミセルと混合されている。
[0110]本発明の方法はまた、ＦＶＩＩＩを必要とするか（ヒトは、不十分な量のＦＶＩＩＩタンパク質、又は欠陥のある若しくは異常なＦＶＩＩＩタンパク質を産生する）、又は血友病Ａを有するヒトのような哺乳動物対象（例えば、ヒト）を治療するステップを含む。
[0111]一実施形態では、ヒトは、不十分な量のＦＶＩＩＩタンパク質、又は欠陥のある若しくは異常なＦＶＩＩＩタンパク質を産生する。別の実施形態では、ヒトは、軽度、中等度又は重度の血友病Ａを有する。
[0112]ある特定の実施形態では、投与されるｒＡＡＶベクターにより発現されるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、哺乳動物において有益な又は治療上の効果を有するレベルで発現される。
[0113]ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を含むｒＡＡＶの投与（例えば、送達）のための対象（例えば、患者）及び哺乳動物（例えば、ヒト）の候補としては、血友病Ａ、フォンウィルブランド病及び外傷に関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、凝固障害、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）又は過剰抗凝固治療障害のような障害を有するか又は該障害を有するリスクがある対象（例えば、患者）及び哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。
[0114]ＦＶＩＩＩをコードする核酸又は核酸変種の投与（例えば、送達）のための対象（例えば、患者）及び哺乳動物（例えば、ヒト）の候補としては、ＡＡＶ抗体について血清陰性である対象（例えば、患者）及び哺乳動物（例えば、ヒト）の他に、ＡＡＶ抗体を有する（血清陽性）又はそれを発生するリスクがある対象（例えば、患者）及び哺乳動物（例えば、ヒト）が挙げられる。そのような対象（例えば、患者）及び哺乳動物（例えば、ヒト）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ－Ｒｈ１０又はＡＡＶ－Ｒｈ７４血清型について血清陰性又は血清陽性であってもよい。
[0115]ある特定の実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－Ｒｈ１０及び／又はＡＡＶ－Ｒｈ７４血清型の空キャプシドが、単独で又はＦＶＩＩＩをコードする核酸若しくは核酸変種を含むｒＡＡＶベクターとの組合せで哺乳動物又は患者にさらに投与される。
[0116]本発明による投与（例えば、送達）の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの任意の様式の接触又は送達を含む。特定の実施形態では、投与（例えば、送達）は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、体腔内、挿管、又はカテーテルを介したものである。
[0117]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、血栓症のリスクを実質的に増加させないレベルで発現される。
[0118]ある特定の実施形態では、血栓症リスクは、フィブリン分解生成物を測定することにより決定される。
[0119]ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの活性は、ヒトにおいて少なくとも１、２、３若しくは４週、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１カ月、又は少なくとも１年にわたり検出可能である。
[0120]ある特定の実施形態では、ヒトは、以下：ＡＡＶ抗体の存在若しくは量、ＡＡＶに対する免疫応答、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ抗体、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤに対する免疫応答、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの活性、１つ若しくは複数の肝臓酵素の量若しくはレベル又は出血症状の頻度、及び／若しくは重篤度若しくは継続期間のうちの１つ又は複数についてさらに分析又はモニターされる。
図１は、ＮＨＰ試験の設計を示す。 図２Ａ～２Ｃは、２×１０１２（Ａ）、５×１０１２（Ｂ）又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（Ｃ）のＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５の静脈内投与後のＮＨＰにおけるｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを示す。線は個々の動物を表す。ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルをＥＬＩＳＡによりアッセイし、該レベルは、試験の経過中の同じ群の動物における連続出血により得られた反復測定を表す（ｎ＝２～３動物／コホート）。ビヒクル処置動物において測定されたヒトＦＶＩＩＩレベルを３つ全てのグラフにおいて白四角で示す。ε＝ＦＶＩＩＩに対する阻害物質の発生。 図３Ａ～３Ｃは、２×１０１２（Ａ）、５×１０１２（Ｂ）又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（Ｃ）のＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５でのＮＨＰにおけるＡＬＴレベルを示す。 図４Ａ～４Ｃは、ＮＨＰにおけるＤダイマーレベルを示す。２×１０１２（Ａ）、５×１０１２（Ｂ）又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（Ｃ）のいずれかのＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５の静脈内投与後のＮＨＰの血漿におけるＤダイマー抗原濃度。点線は、ヒトにおけるＤダイマーの正常値上限である５００ｎｇ／ｍｌを指し示す。 図５は、３つの用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５におけるＦＶＩＩＩレベルのデータの要約を示す。 図６Ａ～６Ｄは、２×１０１２（Ａ）、６×１０１２（Ｂ）又は２×１０１３（ｖｇ／ｋｇ）（Ｃ）のいずれかのＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）－ｈＦＶＩＩＩの静脈内投与後のカニクイザルの血漿におけるｈＦＶＩＩＩのレベルを示す（パイロット試験）。線は個々の動物を表す。ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルをＥＬＩＳＡによりアッセイし、該レベルは、試験の経過中の同じ群の動物における連続出血により得られた反復測定を表す（ｎ＝３動物／コホート）。ビヒクル処置動物において測定されたヒトＦＶＩＩＩレベルを白四角で示す（ｎ＝２）。ε＝ＦＶＩＩＩに対する阻害物質の発生が各個々の動物において検出された時間。 図７は、ＳＰＫ－８０１１の投与後のカニクイザルにおけるヒトＦＶＩＩＩ発現レベルを示す。パイロット試験（四角）及びＧＬＰ試験（丸）。 図８は、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８キャプシドを用いてＡＡＶベクターにより送達されたＦＶＩＩＩの報告されたレベルに対するＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）－ｈＦＶＩＩＩで達成されたＦＶＩＩＩレベルの比較を示す。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍａｒｉｎ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ＢｉｏＭａｒｉｎ＿Ｒ＆Ｄ＿Ｄａｙ＿４＿２０＿２０１６．ｐｄｆ， ｓｌｉｄｅ １６． ＡＡＶ８： ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２０１３； １２１（１７）：３３３５－４４。 図９は、非ヒト霊長動物の主に腎臓、脾臓及び肝臓におけるＡＡＶ－ＳＰＫ（配列番号２８）及びＡＡＶ－ＬＫ０３（配列番号２７）の組織体内分布（各組織につき第３のバー）を示す。 図１０は、マウスへのＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５の全身投与後の肝臓及び脾臓ＦＶＩＩＩ発現を示す。 図１１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分析したＡＡＶ－ＬＫ０３キャプシドの形質導入効率を示す。Ｘ軸、カニクイザル（左の鉛直バー）、ヒト（右の鉛直バー）。 図１２は、ＳＰＫ－８０１１の投与後のカニクイザルにおけるヒトＦＶＩＩＩ発現レベルが線形用量応答に従うことを示す。パネルＡ及びＢは線形スケールでのＳＰＫ－８０１１用量を示す一方、パネルＣ及びＤは対数Ｘ軸を使用する。 図１３は、低及び中用量コホートのみからのデータを使用した線形回帰解析を示す。パネルＡ及びＢは線形スケールでのＳＰＫ－８０１１用量を示す一方、パネルＣ及びＤは対数Ｘ軸を使用する。 図１４は、ＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された３人のヒト対象におけるＦＶＩＩＩ活性を示す。対象１及び２（菱形、丸）に５×１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入した。対象３（三角）に１×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入した。 図１５は、ＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された同じヒト対象（対象１及び２、図１４）における治療レベルのＦＶＩＩＩ活性の延長された発現を示す。対象１及び２（丸、四角）に５×１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入した。 図１６は、治療レベルのＦＶＩＩＩを呈する１０人のヒト対象（対象１～１０）を示す。対象１はＦＶＩＩＩの注入後６週目に緊急抜歯を行った。ＦＶＩＩＩはその後まもなく１９％の活性レベルを記録し、ＦＶＩＩＩ注入の近接性に起因してこのチャートから除外した。ＦＶＩＩＩ活性は、地域の試験室からのＦＶＩＩＩ：Ｃ値を指す。 図１７は、５×１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象１における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の反応に関するインターフェロン－γ酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図１８は、５×１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象２における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図１９は、１×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象３における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２０は、１×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象４における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２１は、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象５における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２２は、１×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象６における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２３は、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象７における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２４は、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象８における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２５は、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象９における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２６は、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象１０における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２７は、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象１１における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。 図２８は、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクターを注入された対象１２における治療レベルのＦＶＩＩＩを示す。下のグラフは、ＡＡＶキャプシドペプチド（立体バー）及びＦＶＩＩＩペプチド（白丸）への対象のＰＢＭＣの反応に関するインターフェロン－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。結果を１００万のＰＢＭＣ当たりのＳＦＵ数として示し、５０ＳＦＵより大きいか、又は培地対照（点線）より３倍高い値を陽性と考える。
［詳細な説明］
[0149]血友病Ａを有する又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を必要とするヒトを治療する方法が本明細書に開示され、提供される。そのような方法は、細胞及び／又はヒトにおいて発現されることができ、次いでｉｎ ｖｉｖｏで増加したＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質レベルをもたらすことができるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を含むゲノム（ｇｅｎｅｏｍｅ）を有するｒＡＡＶベクターを使用して達成することができる。ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする例示的な核酸変種は、参照野生型哺乳動物（例えば、ヒト）ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと比較して低減したＣｐＧ及び／又は参照野生型哺乳動物（例えば、ヒト）ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと１００％未満の配列同一性を有することができる。そのような方法はまた、１キログラム当たり６ｘ１０１２ｖｒＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）未満の量のｒＡＡＶベクター用量を投与することにより達成することができる。１キログラム当たり６ｘ１０１２ｖｒＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）未満の量の用量で投与されるｒＡＡＶベクターは、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を含むベクターゲノムを含むことができる。
[0150]「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は本明細書において交換可能に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む全ての形態の核酸、オリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライシング又は非スプライシングｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小若しくは短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小若しくは短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチドとしては、天然に存在する、合成の、及び意図的に改変された又は変化したポリヌクレオチド（例えば、変種核酸）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又はトリプレックス、直鎖状又は環状であってもよく、任意の長さであってもよい。ポリヌクレオチドの議論において、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’の方向に配列を記載する慣習に従って本明細書において記載されることがある。
[0151]本明細書において使用される場合、「改変する」又は「変種」という用語及びこれらの文法的な変形は、核酸、ポリペプチド又はこれらの部分配列が参照配列から逸脱していることを意味する。改変型及び変種配列は、したがって、参照配列と実質的に同じ、それより大きい又はそれより小さい発現、活性又は機能を有し得るが、少なくとも、参照配列の部分的な活性又は機能を保持し得る。改変又は変種の特定の例は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種である。
[0152]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」の変種は、野生型と比較して遺伝学的に変化した改変型配列を指す。配列は、コードされるタンパク質配列を変化させることなく遺伝学的に改変されたものであってもよい。或いは、配列は、変種タンパク質をコードするように遺伝学的に改変されたものであってもよい。核酸又はポリヌクレオチド変種はまた、野生型タンパク質配列のような参照配列と少なくとも部分的な配列同一性をなおも保持するタンパク質をコードするようにコドン改変されており、及びまた、変種タンパク質をコードするようにコドン改変されている組合せ配列を指すこともできる。例えば、そのような核酸変種の一部のコドンは、コードするタンパク質（ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸を変化させることなく変更され、さらに核酸変種の一部のコドンは、コードするタンパク質（ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸を変化させるように変更される。
[0153]「変種第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）」という用語は、非改変の野生型ＦＶＩＩＩ（例えば、配列番号１９）又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと比較して遺伝学的に変更された改変型ＦＶＩＩＩを指す。そのような変種は、「第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする核酸変種」と称することができる。変種の特定の例は、ＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質をコードするＣｐＧが低減した核酸である。「変種」という用語は、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸に言及する各事例において現れる必要はない。同様に、「ＣｐＧが低減した核酸」という用語又は同様の用語は、「変種」という用語を省略することがあるが、「ＣｐＧが低減した核酸」への言及は遺伝子レベルでの変種を含むことが意図される。
[0154]低減したＣｐＧ含有量を有するＦＶＩＩＩ及びｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ構築物は、ＣｐＧ含有量が低減されていない野生型ＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと比較して向上を呈することができ、コードされるＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質にアミノ酸変化を結果としてもたらす核酸への改変なしにそうすることができる。発現の比較において、ＣｐＧが低減した核酸が、Ｂドメインを保持するＦＶＩＩＩタンパク質をコードする場合、野生型ＦＶＩＩＩの発現との比較を行うことが適切であり、ＣｐＧが低減した核酸が、Ｂドメインを有しないＦＶＩＩＩタンパク質をコードする場合、これもまたＢドメイン欠失を有する野生型ＦＶＩＩＩの発現との比較が行われる。
[0155]「変種第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）」はまた、改変型タンパク質が野生型ＦＶＩＩＩと比較してアミノ酸の変更を有するような改変型ＦＶＩＩＩタンパク質を意味することができる。ここでもまた、活性及び／又は安定性の比較において、コードされる変種ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメインを保持する場合、野生型ＦＶＩＩＩとの比較を行うことが適切であり、コードされる変種ＦＶＩＩＩタンパク質がＢドメイン欠失を有する場合、これもまたＢドメイン欠失を有する野生型ＦＶＩＩＩとの比較が行われる。
[0156]変種ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインの部分を含むことができる。したがって、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、Ｂドメインの部分を含む。典型的に、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤにおいて、Ｂドメインのほとんどが欠失している。
[0157]変種ＦＶＩＩＩは、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号２９）として示される「ＳＱ」配列を含むことができる。典型的に、ＳＱを有するそのような変種ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ／ＳＱ）はＢＤＤを有し、例えば、ＢＤの少なくとも全体又は部分が欠失している。ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤのような変種ＦＶＩＩＩは、「ＳＱ」配列の全体又は部分、すなわち、配列番号２９の全体又は部分を有することができる。したがって、例えば、ＳＱ配列（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号２９）を有する変種ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲの全体又は部分のみを有することができる。例えば、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲに含まれる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３のアミノ酸残基を有することができる。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３の内部欠失の他に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３のアミノ又はカルボキシ末端欠失を有するＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲは、本明細書に記載される変種ＦＶＩＩＩタンパク質に含まれる。
[0158]「核酸」又は「ポリヌクレオチド」配列によりコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」には、天然に存在する野生型タンパク質のような全長の天然（ＦＶＩＩＩ）配列の他に、部分配列、改変型又は変種が天然の全長タンパク質のある程度の機能性を保持する限り、機能的な部分配列、改変型又は配列変種が含まれる。例えば、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質をコードするＣｐＧが低減した核酸は、本明細書に記載されるＢドメイン欠失を有し、凝固機能を保持することができる。本発明の方法及び使用において、核酸配列によりコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質及びペプチドは、欠陥があるか、又は治療される哺乳動物において発現が不十分若しくは欠損している内因性タンパク質と同一であり得るがその必要はない。
[0159]改変の非限定的な例としては、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸置換（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～５００、５００～７５０、７５０～８５０又はそれより多くのヌクレオチド又は残基）が挙げられる。核酸改変の例はＣｐＧ低減である。ある特定の実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質のようなＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸は、ヒト第ＦＶＩＩＩ因子をコードする野生型配列と比較して１０個若しくはそれより少ないＣｐＧを有し、又はヒト第ＦＶＩＩＩ因子をコードする野生型配列と比較して５個若しくはそれより少ないＣｐＧを有し、又はＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸において５個より多くのＣｐＧを有しない。
[0160]アミノ酸改変の例は、参照配列、例えば、Ｂドメイン欠失を有するＦＶＩＩＩのようなＦＶＩＩＩの保存的アミノ酸置換又は欠失（例えば、部分配列又は断片）である。特定の実施形態では、改変型又は変種配列は、非改変配列の機能又は活性の少なくとも部分を保持する。
[0161]本明細書に開示されるＦＶＩＩＩ及びｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする他の哺乳動物型のＣｐＧが低減した核酸などの、タンパク質をコードする全ての哺乳動物及び非哺乳動物型の核酸は、既知又は未知のいずれのものも明示的に含まれる。したがって、本発明は、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩ（例えば、ヒト）遺伝子及びタンパク質と実質的に類似の方式で機能する、非哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物、及びヒトからの遺伝子及びタンパク質を含む。
[0162]「ベクター」という用語は、小さいキャリア核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入若しくは組込みによりマニピュレートできる他のビヒクルを指す。そのようなベクターを遺伝子マニピュレーション（すなわち、「クローニングベクター」）のために使用して、ポリヌクレオチドを細胞に導入／移入し、及び挿入されたポリヌクレオチドを細胞中で転写又は翻訳させることができる。「発現ベクター」は、宿主細胞での発現のために必要とされる必要な調節領域と共に遺伝子又は核酸配列を含有する特殊なベクターである。ベクターの核酸配列は、一般に、細胞での繁殖のために少なくとも複製起点を含有し、任意選択で追加のエレメント、例えば、異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、（１つ又は複数の）ＩＴＲ、選択マーカー（例えば、抗生物質抵抗性）、ポリアデニル化シグナルを含有する。
[0163]ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを構成する１つ又は複数の核酸エレメントに由来するか、又はそれに基づく。特定のウイルスベクターとしては、レンチウイルス、シュード型レンチウイルス及びパルボウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
[0164]組換えウイルス、例えば、レンチ又はパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターのようなベクターの修飾語の他に、組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドのような配列の修飾語としての「組換え」という用語は、一般に天然で起こらない様式で組成物がマニピュレート（すなわち、操作）されていることを意味する。ＡＡＶベクターのような組換えベクターの特定の例は、野生型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムに通常存在しないポリヌクレオチドがウイルスゲノム内に挿入されている場合である。組換えポリヌクレオチドの例は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノム内で遺伝子に通常付随する５’、３’及び／又はイントロン領域のあり又はなしで、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質をコードするＣｐＧが低減した核酸がベクターにクローニングされている場合である。「組換え」という用語は、ウイルス及びＡＡＶベクターのようなベクターの他に、ポリヌクレオチドのような配列に関して本明細書において必ずしも使用されないが、ポリヌクレオチドを含む組換え型は、いかなるそのような省略があっても、明示的に含まれる。
[0165]組換えウイルス「ベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、分子的方法を使用してウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去し、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸のような非天然の核酸で置換することにより、ＡＡＶのようなウイルスの野生型ゲノムに由来する。典型的に、ＡＡＶについてＡＡＶゲノムの１つ又は両方の逆末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶベクター中で保持されている。ウイルスゲノムの全体又は部分がＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸のようなウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノム核酸に関して非天然の配列で置換されているので、「組換え」ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）はウイルス（例えば、ＡＡＶ）ゲノムから区別される。非天然配列の組込みは、したがって、ＡＡＶの場合に「ｒＡＡＶベクター」と称することができる「組換え」ベクターとしてウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を定義する。
[0166]組換えベクター（例えば、レンチ、パルボ、ＡＡＶ）配列は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの細胞のその後の感染（形質導入）のためにパッケージング（本明細書において「粒子」と称される）することができる。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子にキャプシド化又はパッケージングされる場合、粒子を「ｒＡＡＶ」と称することもできる。そのような粒子は、ベクターゲノムをキャプシド化又はパッケージングするタンパク質を含む。特定の例としては、ウイルスエンベロープタンパク質、及びＡＡＶの場合、キャプシドタンパク質が挙げられる。
[0167]ベクター「ゲノム」は、最終的にパッケージング又はキャプシド化されて、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えベクターを構築又は製造するために組換えプラスミドが使用される場合、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と称され、繁殖及び組換えウイルスの製造のために必要なプロセスであるプラスミドのクローニング及び増幅のために重要であるが、それ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にパッケージング又はキャプシド化されない。したがって、ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によりパッケージング又はキャプシド化される核酸を指す。
[0168]「導入遺伝子」は、意図されるか又は細胞若しくは生物に導入された核酸を簡便に指すために本明細書において使用される。導入遺伝子としては、ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子のような任意の核酸（例えば、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸）が挙げられる。
[0169]導入遺伝子を有する細胞において、導入遺伝子は、ＡＡＶのようなベクターにより導入／移入されており、細胞への「形質導入」又は「トランスフェクション」をされている。「形質導入する」及び「トランスフェクトする」という用語は、核酸のような分子の細胞又は宿主生物への導入を指す。導入遺伝子は、レシピエント細胞のゲノム核酸に組み込まれてもよいし、組み込まれなくてもよい。導入された核酸がレシピエント細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれる場合、該核酸はその細胞又は生物において安定的に維持されることができ、レシピエント細胞又は生物の子孫細胞又は生物にさらに伝えられ又は遺伝することができる。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞又は宿主生物において染色体外に存在してもよいし、一過的にのみ存在してもよい。
[0170]「形質導入細胞」は、導入遺伝子が導入された細胞である。したがって、「形質導入」細胞（例えば、哺乳動物中、例えば、細胞又は組織又は臓器細胞）は、外因性分子、例えば核酸（例えば、導入遺伝子）の細胞への組込み後の細胞中の遺伝子の変化を意味する。したがって、「形質導入」細胞は、外因性核酸が導入された細胞、又はその子孫である。（１つ又は複数の）細胞を繁殖させ、及び導入されたタンパク質を発現させ、又は核酸を転写させることができる。遺伝子療法の使用及び方法のために、形質導入細胞が対象中に存在することができる。
[0171]「発現制御エレメント」は、作動可能に連結された核酸の発現に影響を及ぼす（１つ又は複数の）核酸配列を指す。制御エレメントとしては、プロモーター及びエンハンサーのような本明細書に記載されるような発現制御エレメントが挙げられる。ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１つ又は複数の「発現制御エレメント」を含むことができる。典型的に、そのようなエレメントは、適切な異種ポリヌクレオチドの転写及び適切な場合は翻訳を促進するために含まれる（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン用のスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレームの翻訳を可能とするための遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、及び終止コドンなど）。そのようなエレメントは典型的にシスで作用し、「シス作用性」エレメントと称されるが、トランスで作用することもある。
[0172]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルであってもよい。典型的には、転写をモジュレートする発現制御エレメントは、転写される核酸の５’末端（すなわち、「上流」）付近に並置される。発現制御エレメントはまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン中）に位置することができる。発現制御エレメントは、隣接して位置するか、又は、かなりの距離であっても、転写される配列から離れて（例えば、ポリヌクレオチドから１～１０、１０～２５、２５～５０、５０～１００、１００～５００、又はそれより多くのヌクレオチド）位置することができる。それにもかかわらず、ＡＡＶベクターのようなある特定のベクターの長さの制限により、発現制御エレメントは、典型的に転写される核酸から１～１０００ヌクレオチド以内にある。
[0173]機能的に、作動可能に連結された核酸の発現は、エレメント（例えば、プロモーター）により少なくとも部分的に制御可能であり、それにより、エレメントは、核酸の転写及び適切な場合は転写物の翻訳をモジュレートする。発現制御エレメントの特定の例は、転写される配列、例えば、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸の５’に通常位置するプロモーターである。プロモーターは、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して典型的に作動可能に連結された核酸から発現される量を増加させる。
[0174]本明細書において使用される「エンハンサー」は、異種ポリヌクレオチドに隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは典型的にプロモーターエレメントの上流に位置して機能するが、配列（例えば、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸）の下流又は配列内に位置することができる。それゆえ、エンハンサーエレメントは、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸の１００塩基対、２００塩基対、又は３００又はそれより多くの塩基対だけ上流又は下流に位置することができる。エンハンサーエレメントは、典型的にプロモーターエレメントにより付与される発現より作動可能に連結された核酸の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）を増加させる。
[0175]発現構築物は、特定の細胞又は組織種において発現を推進するように働く調節エレメントを含んでもよい。発現制御エレメント（例えば、プロモーター）としては、特定の組織又は細胞種において活性のものが挙げられ、これは本明細書において「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と称される。組織特異的発現制御エレメントは、典型的に特定の細胞又は組織（例えば、肝臓）において活性である。発現制御エレメントは、典型的に特定の細胞、組織又は臓器において活性であり、その理由は、それらは、特定の細胞、組織又は臓器種に特有の転写活性化タンパク質、又は転写の他の調節因子により認識されるからである。そのような調節エレメントは当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）を参照）。
[0176]本発明の発現構築物中の組織特異的調節エレメントの組込みは、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸の発現について少なくとも部分的な組織指向性を提供する。肝臓において活性のプロモーターの例は、特に、ＴＴＲプロモーター、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター；アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７１：５１２４－３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：１００２－９（１９９６）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ．， ７：１５０３－１４（１９９６）］である。肝臓において活性のエンハンサーの例は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）ＨＣＲ－１及びＨＣＲ－２である（Ａｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：２９１１３－１９（１９９７））。
[0177]発現制御エレメントとしては、多くの異なる細胞種においてポリヌクレオチドの発現を推進することができる遍在又は***雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）プロモーター／エンハンサーも挙げられる。そのようなエレメントとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列及び様々な哺乳動物細胞種において活性の他のウイルスプロモーター／エンハンサー、又は天然に存在しない合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ４１：５２１－５３０（１９８５）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β－アクチンプロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
[0178]発現制御エレメントはまた、調節可能な方式で発現を付与することができ、すなわち、シグナル又は刺激が、作動可能に連結された異種ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させる。シグナル又は刺激に応答して作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を増加させる調節可能なエレメントはまた、「誘導性エレメント」（すなわち、シグナルにより誘導される）とも称される。特定の例としては、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモーターが挙げられるがこれに限定されない。典型的に、そのようなエレメントにより付与される増加又は減少の量は、存在するシグナル又は刺激の量に比例し、シグナル又は刺激の量が大きくなるほど、発現の増加又は減少は大きくなる。特定の非限定的な例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター；ステロイドホルモン誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（国際公開第９８／１００８８号）；テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：５５４７－５５５１（１９９２））；テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２６８：１７６６－１７６９（１９９５）；Ｈａｒｖｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：５１２－５１８（１９９８）も参照）；ＲＵ４８６誘導性システム（Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４３２－４４１（１９９７）］；及びラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００：２８６５－２８７２（１９９７）；Ｒｉｖｅｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２：１０２８－１０３２（１９９６））が挙げられる。この文脈において有用なことがある他の調節可能な制御エレメントは、特定の生理学的状態、例えば、温度、急性期、発生により調節されるものである。
[0179]発現制御エレメントはまた、異種ポリヌクレオチドのための（１つ又は複数の）天然のエレメントを含む。天然の制御エレメント（例えば、プロモーター）は、異種ポリヌクレオチドの発現が天然の発現を模倣することが所望される場合に使用されることがある。天然のエレメントは、異種ポリヌクレオチドの発現が、一時的に又は発生上で、又は組織特異的な方式で、又は特定の転写刺激に応答して調節されるべき場合に使用されることがある。イントロン、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋコンセンサス配列のような他の天然の発現制御エレメントもまた使用することができる。
[0180]「作動可能に連結される」という用語は、コーディング配列の発現のために必要な調節配列が、コーディング配列の発現をもたらすようにコーディング配列に対して適切な位置で置かれることを意味する。この同じ定義が、発現ベクター中のコーディング配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終止エレメント）の構成に適用されることがある。この定義はまた、ハイブリッド核酸分子が生成される第１及び第２の核酸分子の核酸配列の構成に適用されることがある。
[0181]核酸と作動可能に連結した発現制御エレメントの例において、関係性は、制御エレメントが核酸の発現をモジュレートするようなものである。より詳細には、例えば、作動可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の少なくとも１つが他の配列に対して生理学的効果を発揮できるような関係性で２つのＤＮＡが配置されている（シス又はトランス）ことを意味する。
[0182]したがって、ベクターのための追加のエレメントとしては、発現制御（例えば、プロモーター／エンハンサー）エレメント、転写終結シグナル若しくは終止コドン、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つ若しくは複数のコピーのような配列に隣接する５’若しくは３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）配列）、又はイントロンが挙げられるがこれらに限定されない。
[0183]さらなるエレメントとしては、例えば、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列、例えば、パッケージングを向上させ及び汚染性核酸の存在を低減させるためのフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が挙げられる。ＡＡＶベクターは、一般に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ、又はわずかにより大きいサイズ範囲を有するＤＮＡのインサートを典型的に許容する。したがって、より短い配列について、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングのために許容されるウイルスゲノム配列の正常なサイズの近く又は該サイズまで長さを調整するためにスタッファー又はフィラーが含められる。様々な実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コーディング）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列について、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わせられた（例えば、ベクターに挿入された）場合に約３．０～５．５Ｋｂ、又は約４．０～５．０Ｋｂ、又は約４．３～４．８Ｋｂの合計の長さを有する。
[0184]イントロンはまた、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターのパッケージングのための長さを達成するためにフィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列として機能することができる。フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列として機能するイントロン及びイントロン断片はまた、発現を増進させることができる。
[0185]「止血に関連する障害」という語句は、血友病Ａ、阻害抗体を有する血友病Ａ患者、凝固因子：ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォンウィルブランド因子の欠損症、ＦＶ／ＦＶＩＩＩ合併欠損症、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、ガンマ－カルボキシラーゼ欠損症のような出血障害；外傷に関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、凝固障害、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、小分子抗血栓剤（すなわち、ＦＸａ阻害剤）に関連する過剰抗凝固；並びに血小板障害、例えば、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症（ｔｈｒｏｍｂｌａｓｔｅｍｉａ）、及び貯蔵プール欠乏症を指す。
[0186]組成物の修飾語として使用された場合の「単離された」という用語は、組成物が人工的に作られたか、又はそれが天然に存在するｉｎ ｖｉｖｏ環境から完全に又は少なくとも部分的に分離されていることを意味する。一般的に、単離された組成物は、それが天然で通常一緒に存在する１つ又は複数の材料、例えば、１つ又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。
[0187]本発明の核酸に関して、「単離された」という用語は、核酸分子の起源となる生物の天然に存在するゲノム（ゲノムＤＮＡ）において直ちに連続する（５’及び３’方向における）１つ又は複数の配列から分離された核酸分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミド若しくはウイルスベクターのようなベクターに挿入されているか、又は原核生物若しくは真核生物のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子を含むことができる。
[0188]本発明のＲＮＡ分子に関して、「単離された」という用語は主に、上記に定義されるような単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を指す。或いは、該用語は、「実質的に純粋な」形態（「実質的に純粋な」という用語は以下で定義される）で存在するようにその天然の状態（すなわち、細胞又は組織中）で一緒にあるＲＮＡ分子から十分に分離されているＲＮＡ分子を指すことができる。
[0189]タンパク質に関して、「単離されたタンパク質」又は「単離及び精製されたタンパク質」という用語が本明細書において使用されることがある。この用語は主に、単離された核酸分子の発現により産生されるタンパク質を指す。或いは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように天然で一緒にある他のタンパク質から十分に分離されているタンパク質を指すことができる。
[0190]「単離された」という用語は、人工的に製造された組合せ、例えば、組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、又はベクターゲノム及び医薬配合物をパッケージング若しくはキャプシド化するウイルス粒子を除外しない。「単離された」という用語はまた、組成物の代替的な物理的形態、例えば、ハイブリッド／キメラ、マルチマー／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）又は誘導化形態、又は人工的に製造された宿主細胞で発現される形態を除外しない。
[0191]「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０～６０質量％の目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物を指す。調製物は、少なくとも７５質量％、又は約９０～９９質量％の目的の化合物を含むことができる。純度は、目的の化合物のために適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）により測定される。
[0192]特定のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を指す場合の「から本質的になる」という語句は、配列が所与の配列番号の特性を有することを意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、該語句は、配列自体並びに配列の基本的な及び新規の特徴に影響しない分子修飾を含む。
[0193]本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー及びプローブを指し、２つ又はそれより多く、例えば３つより多くのリボ又はデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因及びオリゴヌクレオチドが使用される特定の応用に依存する。
[0194]本明細書において使用される「プローブ」という用語は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸であって、精製された制限酵素消化で天然に存在するものであっても、又は合成により製造されたものであってもよく、プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリング又は特異的にハイブリダイズできるものを指す。プローブは、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよい。プローブの正確な長さは多くの要因に依存し、該要因としては、温度、プローブの供給元及び使用方法が挙げられる。例えば、診断応用について、標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、１５～２５又はそれより多くのヌクレオチドを典型的に含有するが、それより少ないヌクレオチドを含有してもよい。
[0195]本発明においてプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に「実質的に」相補的となるように選択される。これは、プローブが、予め決定された条件のセットの下で各々の標的鎖と「特異的にハイブリダイズ」又はアニールできるように十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は、標的の正確な相補的配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片をプローブの５’又は３’末端に取り付けてもよく、プローブ配列の残りの部分は標的鎖に相補的である。或いは、特異的にアニールする標的核酸の配列と十分な相補性をプローブ配列が有する限り、非相補的な塩基又はより長い配列をプローブに散在させることができる。
[0196]「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当該技術分野において一般に使用される予め決定された条件下でのそのようなハイブリダイゼーションを可能とするために十分に相補的（「実質的に相補的」と称されることがある）な配列の２つの一本鎖核酸分子の間の会合を指す。特に、該用語は、非相補的配列の一本鎖核酸を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除するまでの、本発明の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを指す。
[0197]本明細書において使用される「プライマー」という用語は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの、一本鎖又は二本鎖のいずれかの、生物学的システムに由来するか、制限酵素消化により生成されたか、又は合成により製造されたかのいずれかである、オリゴヌクレオチドであって、適切な環境に置かれた時に、鋳型依存的な核酸合成の開始剤として機能的に作用することができるものを指す。適切な核酸鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補因子並びに好適な温度及びｐＨのような条件と共に与えられた場合、プライマーは、ヌクレオチドの添加により、ポリメラーゼの作用又は類似の活性によりその３’末端において伸長されてプライマー伸長産物をもたらすことができる。
[0198]プライマーは、特定の条件及び応用の必要性に応じて長さが変わり得る。例えば、診断応用において、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１５～２５又はそれより多くのヌクレオチドの長さである。プライマーは、所望の伸長産物の合成を開始させるため、すなわち、ポリメラーゼ又は類似の酵素による合成の開始において使用するための適切な並置でプライマーの３’ヒドロキシル部分を提供するために十分な方式で所望の鋳型鎖とアニールできるために所望の鋳型に対して十分な相補性を有しなければならない。プライマー配列が所望の鋳型の正確な相補体であることは必要とされない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列をそれ以外は相補的なプライマーの５’末端に取り付けてもよい。或いは、プライマー配列が所望の鋳型鎖の配列と十分な相補性を有して、伸長産物の合成のための鋳型－プライマー複合体を機能的にもたらす限り、非相補的な塩基をオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在させてもよい。
[0199]「同一性」、「相同性」及びこれらの文法的変形の用語は、２つ又はそれより多くの参照される実体が、それらが「アライメントされた」配列である場合に同じであることを意味する。したがって、例として、２つのポリペプチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照される領域又は部分内において、同じアミノ酸配列を有する。２つのポリヌクレオチド配列が同一である場合、それらは、少なくとも参照される領域又は部分内において、同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、配列の定義された区画（領域又はドメイン）にわたるものであってもよい。同一性の「区画」又は「領域」は、２つ又はそれより多くの参照される実体の同じ部分を指す。したがって、２つのタンパク質又は核酸配列が１つ又は複数の配列区画又は領域にわたり同一である場合、それらはその領域内で同一性を共有する。「アライメントされた」配列は、多くの場合に参照配列と比較して欠失又は追加の塩基若しくはアミノ酸（ギャップ）の訂正を含有する複数のポリヌクレオチド又はタンパク質（アミノ酸）配列を指す。
[0200]同一性は、配列の全長又は部分にわたる広がりを持つものであってもよい。ある特定の実施形態では、同一性パーセントを共有する配列の長さは、２、３、４、５又はそれより多くの連続する核酸又はアミノ酸、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などの連続する核酸又はアミノ酸である。追加の実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、２１又はそれより多くの連続する核酸又はアミノ酸、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０などの連続する核酸又はアミノ酸である。さらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、４１又はそれより多くの連続する核酸又はアミノ酸、例えば、４２、４３、４４、４５、４５、４７、４８、４９、５０などの連続する核酸又はアミノ酸である。いっそうさらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、５０又はそれより多くの連続する核酸又はアミノ酸、例えば、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～５００、５００～１，０００などの連続する核酸又はアミノ酸である。
[0201]本明細書に記載されるように、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した変種のような核酸変種は、野生型とは別個であるが、Ｂドメインあり、又はなしの野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と配列同一性を呈し得る。ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸変種において、ヌクレオチド配列レベルで、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸は、野生型ＦＶＩＩＩをコードする核酸と典型的には少なくとも約７０％同一であり、より典型的には約７５％同一であり、いっそうより典型的には約８０％～８５％同一である。したがって、例えば、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸は、野生型ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子に対して、又は互いに、すなわち、本明細書に記載されるＸ０１対Ｘ０２、Ｘ０３対Ｘ０４などにおいて、７５％～８５％の同一性を有し得る。
[0202]アミノ酸配列レベルで、変種ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質のような変種は、少なくとも約７０％同一、より典型的には約７５％同一、又は８０％同一、いっそうより典型的には約８５の同一性、又は９０％又はよりそれ高い同一性である。他の実施形態では、変種ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質のような変種は、参照配列、例えば、Ｂドメインあり又はなしの野生型ＦＶＩＩＩタンパク質に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれより高い同一性を有する。
[0203]同一性を決定するために、ＦＶＩＩＩ（例えば、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸）がＢドメインを保持する場合、野生型ＦＶＩＩＩに対して同一性を比較することが適切である。ＦＶＩＩＩ（例えば、ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸）がＢドメイン欠失を有する場合、これもまたＢドメイン欠失を有する野生型ＦＶＩＩＩに対して同一性を比較することが適切である。
[0204]「相同的」又は「相同性」という用語は、２つ又はそれより多くの参照される実体が、所与の領域又は部分にわたり少なくとも部分的な同一性を共有することを意味する。相同性又は同一性の「区画、領域又はドメイン」は、２つ又はそれより多くの参照される実体の部分が、相同性を共有するか、又は同じであることを意味する。したがって、２つの配列が１つ又は複数の配列領域にわたり同一である場合、これらの配列は、これらの領域において同一性を共有する。「実質的な相同性」は、分子が、参照分子、又は該分子が相同性を共有する参照分子の関連／対応する領域若しくは部分の構造又は機能（例えば、生物学的機能又は活性）のうちの１つ又は複数の少なくとも部分的な構造又は機能を有するか、又は有するように予測されるように、構造的又は機能的に保存されていることを意味する。
[0205]２つの配列間の同一性（相同性）又は「同一性パーセント」の程度は、コンピュータープログラム及び／又は数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。本発明の目的のために、核酸配列の比較は、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．１を使用して行われる。簡便のために、プログラムにより指定されるデフォルトのパラメーター（ギャップ生成ペナルティ＝１２、ギャップエクステンションペナルティ＝４）が、配列同一性を比較するために本発明において使用されることが意図される。或いは、デフォルトのパラメーターを用いるギャップアライメントを使用する米国国立生物工学情報センターにより提供されるＢｌａｓｔｎ ２．０プログラム（ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／に見出される；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－４１０）を使用して、核酸配列間及びアミノ酸配列間の同一性及び類似性のレベルを決定してもよい。ポリペプチド配列比較のために、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ ２５０、ＢＬＯＳＵＭ ６２又はＢＬＯＳＵＭ ５０のようなスコアリングマトリックスと組み合わせて典型的に使用される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）及びＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムもまた同一性の程度を定量化するために使用される（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）；Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １３２：１８５（２０００）；及びＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４７：１９５（１９８１））。ドロネーベースのトポロジカルマッピングを使用してタンパク質構造類似性を定量化するためのプログラムもまた開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ３０４：３２０（２００３））。
[0206]本発明のＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸及び核酸変種を含む、核酸分子、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）、プラスミドは、組換えＤＮＡ技術の方法を使用することにより調製することができる。ヌクレオチド配列情報が利用可能であることにより、様々な手段による本発明の単離された核酸分子の調製が可能となる。例えば、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードするＣｐＧが低減した核酸変種は、細胞発現又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳及び化学合成技術を介して様々な標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。ポリヌクレオチドの純度は、シークエンシング及びゲル電気泳動などを通じて決定することができる。例えば、ハイブリダイゼーション又はコンピューターベースのデータベーススクリーニング技術を使用して核酸を単離することができる。そのような技術としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブを用いたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション；（２）例えば発現ライブラリーを使用して、共有された構造的特徴を有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列にアニーリングすることができるプライマーを使用するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連配列のための配列データベースのコンピューターサーチ；及び（５）サブトラクト核酸ライブラリーの差次的なスクリーニング。
[0207]本発明の核酸は、任意の簡便なクローニングベクター中にＤＮＡとして維持されてもよい。一実施形態では、好適な大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主細胞で繁殖するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のようなプラスミドクローニング／発現ベクター中にクローンを維持する。或いは、哺乳動物細胞での発現のために好適なベクター中に核酸を維持してもよい。翻訳後修飾が凝固機能に影響する場合、核酸分子を哺乳動物細胞中で発現させることができる。
[0208]ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸及び核酸変種としては、一本鎖又は二本鎖であってもよいｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの断片が挙げられる。したがって、本発明は、本発明の核酸の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの発現を検出するためのプローブとして有用である。
[0209]本明細書に記載されるもののようなベクター（ｒＡＡＶ）は、宿主細胞でのコードされたタンパク質の発現を可能とするような方式で配置された宿主細胞でのＤＮＡの発現のために必要な調節エレメントを任意選択で含む。発現のために必要とされるそのような調節エレメントとしては、本明細書に記載される及び当業者に公知のプロモーター配列、エンハンサー配列及び転写開始配列が挙げられるがこれらに限定されない。
[0210]本発明の方法及び使用は、***及び／又は非***細胞を含む宿主細胞に核酸（導入遺伝子）を送達（導入）することを含む。本発明の核酸、ｒＡＡＶベクター、方法、使用及び医薬配合物は追加的に、治療方法として、それを必要とする対象にＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤを送達、投与又は提供する方法において有用である。この方式では、核酸が転写され、及びタンパク質は対象においてｉｎ ｖｉｖｏで産生されてもよい。対象は、ＦＶＩＩＩの欠乏を抱えているか、又は対象におけるＦＶＩＩＩの産生は、治療方法として何らかの治療効果を付与することがあるか、又はそれ以外を理由として、対象は、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤから利益を受けるか、又はそれを必要とすることがある。
[0211]ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を有するゲノムを含むｒＡＡＶベクターは、遺伝性疾患、例えばＦＶＩＩＩ欠損症の治療を可能とする。欠乏状態疾患について、遺伝子移入を使用して、影響された組織に正常な遺伝子を置換療法のために運ぶことができる他に、アンチセンス突然変異を使用して疾患のための動物モデルを作製することができる。均衡が崩れた病態について、遺伝子移入を使用して、モデルシステムにおいて病態を作製することができ、次にそれを、病態に対抗する努力において使用することができる。欠陥を訂正するための核酸配列の部位特異的組込みの使用もまた可能である。
[0212]特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を有するゲノムを含むｒＡＡＶベクターは、例えば、血液凝固カスケードをモジュレートする治療及び／若しくは予防剤（タンパク質若しくは核酸）として又は遺伝子中の導入遺伝子として使用されてもよい。例えば、コードされたＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤは、野生型ＦＶＩＩＩと類似の凝固活性を有してもよく、又は野生型ＦＶＩＩと比較して変化した凝固活性を有してもよい。細胞ベースの戦略は、血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの連続的な発現を可能とする。本明細書に開示されるように、ＦＶＩＩＩ分子（核酸及びタンパク質）のある特定の改変は、核酸レベルでの発現の増加、凝固活性の増加を結果としてもたらし、それにより、止血を効果的に向上させる。
[0213]患者へのＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコーディングｒＡＡＶベクターの投与は、凝固カスケードを変化させるために働くＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質の発現を結果としてもたらす。本発明によれば、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤタンパク質、又は機能的断片の発現は、止血を増加させる。
[0214]ｒＡＡＶベクターは、単独で、又は止血のモジュレートのために有用な他の分子と組み合わせて投与されてもよい。本発明によれば、ｒＡＡＶベクター又は治療剤の組合せを単独で又は薬学的に許容できる若しくは生物学的に適合性の組成物中で患者に投与することができる。
[0215]「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）はパルボウイルスファミリーに含まれる。ＡＡＶは、細胞を透過して核酸／遺伝材料を導入し、それにより、核酸／遺伝材料が細胞中で安定的に維持され得るようにすることができるので、遺伝子療法ベクターとして有用なウイルスである。加えて、これらのウイルスは、例えば特定の部位に核酸／遺伝材料を導入することができる。ＡＡＶはヒトにおいて病原性疾患と関連しないので、ｒＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶ病理発生又は疾患を引き起こすことなくヒト患者に異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質及び剤）を送達することができる。
[0216]ｒＡＡＶベクターは、***細胞及び非***細胞のための指向性を含むそのような応用のために多数の望ましい特徴を持つ。これらのベクターを用いた初期の臨床経験はまた、持続的な毒性がないこと及び免疫応答が最小又は検出不可能であったことを実証した。ＡＡＶは、受容体媒介性のエンドサイトーシス又はトランスサイトーシスによりｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで多様な細胞種に感染することが公知である。これらのベクター系は、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節及び造血幹細胞を標的化してヒトにおいて試験されてきた。
[0217]例えば、所望の遺伝子の複数のコピー、それゆえより多くの量のその遺伝子の産物をもたらすことができるｒＡＡＶベクターを導入することが望ましいことがある。これらのベクターを製造するための改善されたｒＡＡＶベクター及び方法は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａにおいて臨床グレードのベクターの製造のために使用された技術であるＷｒｉｇｈｔ Ｊ．Ｆ．（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０：６９８－７０６，２００９）などの、いくつかの参考文献、特許、及び特許出願において詳細に記載されている。
[0218]したがって、本発明は、ｒＡＡＶベクターによるＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの送達のための方法を提供する。例えば、組換えＡＡＶベクターは、ＦＶＩＩＩをコードする核酸変種を含むことができ、コードされたＦＶＩＩＩタンパク質は、任意選択でＢドメイン欠失を有する。対象（例えば、哺乳動物）へのｒＡＡＶベクターの送達又は投与は、したがって、哺乳動物（例えば、ヒト）のような対象にＦＶＩＩＩを提供する。
[0219]ベクターの直接送達又はヒト細胞のｅｘ－ｖｉｖｏでの形質導入及びその後の身体への注入は、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ発現を結果としてもたらし、それにより、うっ血に対する有益な治療効果を発揮する。本明細書に記載される発明の第ＶＩＩＩ因子の文脈において、そのような投与は凝固促進活性を増進させる。
[0220]ＡＡＶベクターは、典型的に病理発生と関連するウイルス遺伝子を含まない。そのようなベクターは、例えば、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を全体的又は部分的に欠失した野生型ＡＡＶ遺伝子の１つ又は複数を典型的に有するが、組換えベクターのレスキュー、複製、及びＡＡＶベクター粒子へのパッケージングのための必要に応じて、少なくとも１つの機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持する。例えば、ベクターの必須部分のみ、例えばＩＴＲエレメントがそれぞれ含まれる。ＡＡＶベクターゲノムは、したがって、複製及びパッケージングのためにシスで必要とされる配列（例えば、機能的なＩＴＲ配列）を含む。
[0221]組換えＡＡＶベクターの他に、方法及びその使用は、任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、組換えＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－ｒｈ７４、－ｒｈ１０又はＡＡＶ－２ｉ８のような任意のＡＡＶゲノムに基づくことができる。そのようなベクターは、同じ株若しくは血清型（又は亜群若しくは変種）に基づいてもよく、又は互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく組換えＡＡＶベクターは、ベクターをパッケージングするキャプシドタンパク質のうちの１つ又は複数と同一であってもよい。加えて、組換えＡＡＶベクターゲノムは、ベクターをパッケージングするＡＡＶキャプシドタンパク質のうちの１つ又は複数とは別個のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づいてもよい。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ２に基づいてもよい一方、３つのキャプシドタンパク質の少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８又はこれらの変種であってもよい。
[0222]特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８の他に、例えば、国際公開第２０１３／１５８８７９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７１７０）、国際公開第２０１５／０１３３１３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４７６７０）及び米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号（米国特許第９，１６９，２９９号明細書；ＬＫ０１、ＬＫ０２、ＬＫ０３などを開示する）に記載されるようなその変種（例えば、キャプシド変種、例えば、アミノ酸の挿入、付加、置換及び欠失）を含む。
[0223]ＡＡＶ変種としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８キャプシドの変種及びキメラが挙げられる。したがって、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を含む（キャプシド化又はパッケージングする）ＡＡＶベクター及びＡＡＶ変種（例えば、キャプシド変種）。
[0224]ＡＡＶ及びＡＡＶ変種（例えば、キャプシド変種）血清型（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）は、例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４又はＲｈ１０などの他のＡＡＶ血清型とは別個（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２、Ｒｈ７４又はＲｈ１０血清型のいずれかのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列とは別個）であってもよいし、別個でなくてもよい。
[0225]本明細書において使用される場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に別個のキャプシドを有するＡＡＶを指すために使用される区別である。血清学的に別個であることは、別のＡＡＶと比較して１つのＡＡＶに対する抗体間に交差反応性がないことに基づいて決定される。そのような交差反応性の差異は、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基の差異に起因することが通常である（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の差異に起因する）。キャプシド変種を含むＡＡＶ変種が参照ＡＡＶ又は他のＡＡＶ血清型とは血清学的に別個でない可能性にかかわらず、該変種は、参照又は他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つのヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。
[0226]伝統的な定義の下では、血清型は、目的のウイルスが、全ての既存の及び特徴付けられた血清型に特異的な血清に対して中和活性について試験されており、及び目的のウイルスを中和する抗体が見出されていないことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス分離株が発見され及び／又はキャプシド突然変異体が生成されるにつれて、現行の既存の任意の血清型と血清学的な差異を有することもあるし、有しないこともある。したがって、新たなウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的な差異を有しない場合、この新たなウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型の亜群又は変種である。多くの場合、中和活性についての血清学試験は、血清型の伝統的な定義に従って別の血清型であるかどうかを決定するためにキャプシド配列改変を有する突然変異体ウイルスに対してまだ行われていない。したがって、簡便性及び繰返しの回避のために、「血清型」という用語は、血清学的に別個のウイルス（例えば、ＡＡＶ）の他に、所与の血清型の亜群又は変種に入る可能性がある血清学的に別個ではないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指す。
[0227]ＡＡＶベクターは、したがって、特定の血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。本明細書において使用される場合、「ＡＡＶ１に関するＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ１を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を指す。同様に、「ＡＡＶ８に関するＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ８を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を指す。「ＡＡＶ－Ｒｈ７４に関するＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ－Ｒｈ７４を含む１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して実質的な配列同一性を有する１つ又は複数のＡＡＶタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列）を指す。別の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８に関するそのようなＡＡＶベクターは、したがって、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４及びＡＡＶ－２ｉ８からの１つ又は複数の別個の配列を有することができるが、１つ又は複数の遺伝子及び／若しくはタンパク質に対して実質的な配列同一性を呈することができ、並びに／又は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８の１つ若しくは複数の機能的特徴（例えば、細胞／組織指向性など）を有することができる。例示的な非限定的なＡＡＶ変種としては、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３のいずれかのキャプシド変種が挙げられる。
[0228]様々な例示的な実施形態では、参照血清型に関するＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８に対して少なくとも８０％又はそれより高く（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など）同一の配列（例えば、ＩＴＲ、又はＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列など）を含むか、又は該配列からなるポリヌクレオチド、ポリペプチド又はこれらの部分配列を有する。
[0229]本発明の組成物、方法及び使用は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、又はＡＡＶ－２ｉ８のような参照ＡＡＶ血清型に対して１００％未満の配列同一性を呈するが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８の遺伝子又はタンパク質などのような公知のＡＡＶ遺伝子又はタンパク質とは別個であり同一ではないＡＡＶ配列（ポリペプチド及びヌクレオチド）、及びその部分配列を含む。一実施形態では、ＡＡＶポリペプチド又はその部分配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８のような任意の参照ＡＡＶ配列又はその部分配列（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３キャプシド又はＩＴＲ）に対して少なくとも７５％又はそれより高く同一の、例えば、８０％、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％など、最大１００％同一の、配列を含むか、又は該配列からなる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ変種は、１、２、３、４、５、５～１０、１０～１５、１５～２０又はそれより多くのアミノ酸置換を有する。
[0230]ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８並びに変種、関連、ハイブリッド及びキメラ配列を含む組換えＡＡＶベクターは、１つ又は複数の機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接した１つ又は複数の核酸配列（導入遺伝子）を含むように、当業者に公知の組換え技術を使用して構築することができる。
[0231]本発明の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は変種を含むｒＡＡＶベクターは、生物学的に適合性の担体中での注入を介して、例えば静脈注射を介して、患者に投与されてもよい。ｒＡＡＶベクターは、分子の安定性を増加させるために、任意選択で、リポソーム中にカプセル化されるか、又は他のリン脂質若しくはミセルと混合されてもよい。
[0232]本発明によれば、ｒＡＡＶベクターは、単独で、又は止血をモジュレートすることが公知の他の剤（例えば、第Ｖ因子、第Ｖａ因子又はこれらの誘導体）と組み合わせて投与されてもよい。
[0233]したがって、ｒＡＡＶベクター及び他の組成物、剤、薬物、生物学的製剤（タンパク質）は、医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、特に、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの対象への投与及び送達のために有用である。
[0234]特定の実施形態では、医薬組成物はまた、薬学的に許容できる担体又は賦形剤を含有する。そのような賦形剤としては、組成物を与えられる個体に有害な免疫応答をそれ自体は誘導せず、過度の毒性なしに投与することができる任意の医薬物質が挙げられる。
[0235]本明細書において使用される場合、「薬学的に許容できる」及び「生理学的に許容できる」という用語は、１つ又は複数の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達又は接触のために好適な生物学的に許容できる配合物、気体、液体又は固体、又はこれらの混合物を意味する。「薬学的に許容できる」又は「生理学的に許容できる」組成物は、生物学的に又はそれ以外に望ましくないものではない材料であり、例えば、材料は、大きな望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、そのような医薬組成物は、例えば、核酸、ベクター、ウイルス粒子又はタンパク質の対象への投与において使用することができる。
[0236]薬学的に許容できる賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、糖及びエタノールのような液体が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容できる塩としてはまた、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩などのような鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩などのような有機酸の塩を挙げることができる。さらに、助剤物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、及びｐＨ緩衝物質などがそのようなビヒクル中に存在してもよい。
[0237]医薬組成物は、塩として提供されてもよく、多くの酸と共に形成されることができ、塩としては、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの塩が挙げられるがこれらに限定されない。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性又は他のプロトン溶媒中でより可溶性な傾向がある。他の場合には、調製物は、以下：１～５０ｍＭのヒスチジン、０．１％～２％のスクロース、及び２～７％のマンニトールのいずれか又は全てを含有してもよい４．５～５．５のｐＨ範囲の凍結乾燥粉末であってもよく、これは使用前に緩衝液と合わせられる。
[0238]医薬組成物は、医薬投与又はｉｎ ｖｉｖｏでの接触若しくは送達と適合性の、溶媒（水性又は非水性）、溶液（水性又は非水性）、エマルション（例えば、水中油又は油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散液及び懸濁媒体、コーティング、等張剤及び吸収促進又は遅延剤を含む。水性及び非水性の溶媒、溶液及び懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい。そのような薬学的に許容できる担体としては、錠剤（コーティング又は非コーティング）、カプセル（硬質又は軟質）、マイクロビーズ、粉末、顆粒及び結晶が挙げられる。補助活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）もまた組成物中に組み込むことができる。
[0239]医薬組成物は、本明細書に記載されるか、又は当業者に公知のように、特定の投与又は送達の経路と適合するように配合することができる。したがって、医薬組成物は、様々な経路による投与のために好適な担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
[0240]非経口投与のために好適な組成物は、活性化合物の水性及び非水性溶液、懸濁液又はエマルションを含み、この調製物は典型的に無菌であり、意図するレシピエントの血液と等張であってもよい。非限定的な実例としては、水、緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンガー溶液、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランのような懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。
[0241]さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油のような脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。任意選択で、懸濁液はまた、好適な安定化剤、又は化合物の溶解度を増加させて高度に濃縮された溶液の調製を可能とする剤を含有してもよい。
[0242]共溶媒及びアジュバントを配合物に加えてもよい。共溶媒の非限定的な例は、ヒドロキシル基又は他の極性基、例えば、イソプロピルアルコールのようなアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルのようなグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール及びポリオキシエチレン脂肪酸エステルを含有する。アジュバントとしては、例えば、ソーヤレシチン及びオレイン酸のような界面活性剤；ソルビタントリオレエートのようなソルビタンエステル；及びポリビニルピロリドンが挙げられる。
[0243]医薬組成物が調製された後、それらを適切な容器中に入れて処理のために標識することができる。そのような標識化としては、投与の量、頻度、及び方法を挙げることができる。
[0244]本発明の組成物、方法及び使用のために適切な医薬組成物及び送達システムは当該技術分野において公知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ；Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．， Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ， ＮＪ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３）， Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ及びＳｔｏｋｌｏｓａ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０）， Ｒ． Ｌ． Ｊｕｌｉａｎｏ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．２５３－３１５を参照）。
[0245]「有効量」又は「十分量」は、単独で又は１つ若しくは複数の他の組成物（薬物のような治療剤又は免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｏｓｉｖｅ）剤）、治療、プロトコール、又は治療レジメン剤との組合せで、任意の継続期間（長期又は短期）の検出可能な応答、任意の測定可能若しくは検出可能な程度の又は任意の継続期間（例えば、分、時間、日、月、年、又は治癒の間）の対象における期待若しくは所望されるアウトカム又は対象にとっての利益を単回又は複数回用量で提供する量を指す。
[0246]用量は変動することがあり、治療が為される疾患の種類、発症、進行、重篤度、頻度、継続期間、又は確率、対象の所望される臨床的なエンドポイント、先行する若しくは同時の治療、全般的健康状態、年齢、性別、人種又は免疫学的適格性、及び当業者により理解される他の要因に依存する。用量、回数、頻度又は継続期間は、治療又は療法の任意の有害な副作用、合併症又は他のリスク因子及び対象の状態により指し示されるように、比例的に増加又は低減させてもよい。当業者は、治療又は予防上の利益をもたらすために十分な量を提供するために必要とされる投与量及びタイミングに影響を及ぼすことがある要因を理解する。
[0247]治療効果を達成するための用量、例えば、体重１キログラム当たりのベクターゲノムの用量（ｖｇ／ｋｇ）は、いくつもの要因に基づいて変化し、該要因としては、投与経路、治療効果を達成するために必要とされる異種ポリヌクレオチド発現のレベル、治療される特定の疾患、ウイルスベクターへの任意の宿主免疫応答、異種ポリヌクレオチド又は発現産物（タンパク質）への宿主免疫応答、及び発現されるタンパク質の安定性が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、上述の要因の他に、他の要因に基づいて特定の疾患又は障害を有する患者を治療するためのｒＡＡＶ／ベクターゲノムの用量範囲を決定することができる。
[0248]一般に、用量は、治療効果を達成するために、対象の体重１キログラム当たり少なくとも１×１０８、又はそれより多く、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３又は１×１０１４、又はそれより多くのベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲内である。マウスにおいて１×１０１０～１×１０１１、イヌにおいて１×１０１２～１×１０１３の範囲内のＡＡＶ用量は効果的であった。用量は、より低いもの、例えば、１キログラム当たり６×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）未満の用量であり得る。より詳細には、５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ又は１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量である。
[0249]一例として血友病Ｂを使用すると、一般的に言えば、治療効果を達成するために、正常な個体において見られる因子濃度の１％より高い血液凝固因子濃度が、重篤な疾患表現型を中等度の表現型に変化させるために必要とされると考えられる。重篤な表現型は、関節損傷及び生命を脅かす出血により特徴付けられる。中等度の疾患表現型を軽度の表現型に変換するために、正常の５％より高い血液凝固因子濃度が必要とされると考えられる。
[0250]正常なヒトにおけるＦＶＩＩＩレベルは血漿１ｍｌ当たり約１５０～２００ｎｇであるが、それより低い（例えば、約１００～１５０ｎｇ／ｍｌの範囲）又はそれより高い（例えば、約２００～３００ｎｇ／ｍｌの範囲）ことがあり、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固１段アッセイにより決定されるような機能性凝固に起因して正常であると依然として考えられる。したがって、治療効果は、対象／ヒトにおけるＦＶＩＩＩの総量が正常な対象／ヒトにおいて存在するＦＶＩＩＩの１％、例えば、１００～３００ｎｇ／ｍｌの１％より高いようなＦＶＩＩＩ又はｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの発現により達成することができる。
[0251]ｒＡＡＶベクター用量は、ＦＶＩＩＩ又はＡＡＶベクターに対して大きな免疫応答がないように、典型的には用量スペクトルの下端のレベルであってもよい。より特には、最大６×１０１２ｖｇ／ｋｇであるがそれ未満、例えば、約５×１０１１～約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、又はより特には、約５×１０１１ｖｇ／ｋｇ又は約１×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量である。
[0252]治療のための「有効量」又は「十分量」の用量（例えば、寛解のため又は治療的利益若しくは改善をもたらすため）は、典型的に、測定可能な程度まで、疾患の１つ、複数又は全ての有害な症状、帰結又は合併症、例えば、疾患により引き起こされるか、又は疾患に関連する、１つ又は複数の有害な症状、障害、病気、病状、又は合併症に対して応答をもたらすために効果的であるが、疾患の進行又は悪化を減少させ、低減させ、阻害し、抑制し、制限し又は制御することは満足のいくアウトカムである。
[0253]有効量又は十分量は、単回投与で提供されてもよいがその必要はなく、複数回投与を必要とすることがあり、単独で又は別の組成物（例えば、剤）、治療、プロトコール若しくは治療レジメンと組み合わせて提供されてもよいがその必要はない。例えば、量は、対象の必要性、治療されている疾患の種類、状態及び重篤度又は治療の副作用（それがある場合）により指し示されるように比例的に増加させてもよい。加えて、有効量又は十分量は、第２の組成物（例えば、別の薬物又は剤）、治療、プロトコール又は治療レジメンなしで単回又は複数回用量で与えられた場合に効果的又は十分なものである必要はなく、その理由は、所与の対象において効果的又は十分であると考えるために、そのような用量を上回るように追加の用量、量若しくは継続期間、又は追加の組成物（例えば、薬物若しくは剤）、治療、プロトコール若しくは治療レジメンを含めてもよいからである。効果的と考えられる量としてはまた、凝固障害（例えば、血友病Ａ）の治療のための組換え凝固因子タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩ）の投与のような別の治療、治療レジメン又はプロトコールの使用の低減を結果としてもたらす量が挙げられる。
[0254]したがって、本発明の方法及び使用はまた、特に、別の化合物、剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、方法、又は治療薬の必要性又は使用の低減を結果としてもたらす方法及び使用を含む。例えば、血液凝固疾患について、本発明の方法又は使用は、所与の対象において、対象における欠損した又は欠陥のある（異常な若しくは変異体の）内因性凝固因子を補足するための組換え凝固因子タンパク質のより低い頻度若しくは低下させた用量又は該タンパク質の投与の除去がある場合に、治療的利益を有する。したがって、本発明によれば、別の治療又は療法の必要性又は使用を低減させる方法及び使用が提供される。
[0255]有効量又は十分量は、治療される各々及びあらゆる対象において効果的である必要はなく、所与の群又は集団内の治療される対象の大部分において効果的である必要もない。有効量又は十分量は、群又は一般集団ではなく特定の対象における有効性又は十分性を意味する。そのような方法について典型的であるように、一部の対象は、所与の治療方法又は使用に対してより大きな応答、又はより小さい応答を呈し、又は応答を呈さない。
[0256]「寛解させる」という用語は、対象の疾患又はその症状、又はこれらの背景となる細胞応答における検出可能又は測定可能な改善を意味する。検出可能又は測定可能な改善としては、疾患、若しくは疾患により引き起こされるか若しくは疾患に関連する合併症の存在、頻度、重篤度、進行、若しくは継続期間の主観的若しくは客観的な減少、低減、阻害、抑制、制限若しくは制御、又は疾患の症状若しくは背景となる原因若しくは帰結の改善、又は疾患の後退が挙げられる。ＨｅｍＡについて、有効量は、例えば、対象における急性出血発生の頻度若しくは重篤度を低減させる量、又は、例えば、凝固アッセイにより測定される凝固時間を低減させる量である。
[0257]したがって、本発明の医薬組成物は、意図する治療目的を達成するための有効量で活性成分が含有される組成物を含む。治療的に効果的な用量の決定は、本発明において提供される技術及びガイダンスを使用して熟練した医師の能力の十分に範囲内である。
[0258]治療用量は、他の要因の中でも特に、対象の年齢及び全般的状態、異常な血液凝固表現型の重篤度、及びＦＶＩＩＩの発現レベルを調節する制御配列の強度に依存する。したがって、ヒトにおける治療有効量は、ベクターベースのＦＶＩＩＩ治療に対する個々の患者の応答に基づいて医師により決定され得る比較的広範な範囲に入る。そのような用量は、単独で又は免疫抑制剤若しくは薬物との組み合わせであり得る。
[0259]医薬組成物のような組成物は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の産生を可能とするように、対象に送達されてもよい。特定の実施形態では、レシピエントが治療有効量のＦＶＩＩＩポリペプチドを産生することを可能とするために十分な遺伝材料を含む医薬組成物は、対象において止血に影響を及ぼすことができる。
[0260]組成物は、単独で投与されてもよい。ある特定の実施形態では、組換えＡＡＶ粒子は、免疫抑制剤なしで治療効果をもたらす。ＦＶＩＩＩの治療効果は、任意選択で、免疫抑制剤を投与することなく、例えば、２～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１４、１４～２０、２０～２５、２５～３０、又は３０～５０日又はそれより長い期間、例えば、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００日又はそれより長い期間にわたり持続する。したがって、ある特定の実施形態では、ＣｐＧ ｒＡＡＶウイルス粒子は、ある期間にわたり免疫抑制剤を投与することなく治療効果をもたらす。
[0261]組成物は、少なくとも１つの他の剤と組み合わせて投与されてもよい。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクターの投与の前に、実質的に同時に又は後に１つ又は複数の免疫抑制剤と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターの投与後、例えば、１～１２、１２～２４又は２４～４８時間、又は２～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１４、１４～２０、２０～２５、２５～３０、３０～５０日、又は５０日より後である。ｒＡＡＶベクターを投与した後のある期間後の免疫抑制剤のそのような投与は、ｒＡＡＶベクター後のある期間、例えば、２０～２５、２５～３０、３０～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００日、又は２００日より後にわたり初期発現レベル後のＦＶＩＩＩの減少がある場合。
[0262]ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は抗炎症剤である。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤はステロイドである。ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、サイクロスポリン（例えば、サイクロスポリンＡ）、ミコフェノレート、リツキシマブ又はこれらの誘導体である。追加の特定の剤としては、安定化化合物が挙げられる。
[0263]組成物は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水が挙げられるがこれらに限定されない任意の無菌の、生体適合性の薬学的担体中で投与することができる。組成物は、単独で、又はうっ血に影響を及ぼす他の剤（例えば、補因子）と組み合わせて患者に投与することができる。
[0264]アデノウイルスベクターの生成及び患者への投与のためのプロトコールは、米国特許第５，９９８，２０５号；同第６，２２８，６４６号；同第６，０９３，６９９号；同第６，１００，２４２号；並びに国際特許出願国際公開第９４／１７８１０号及び同国際公開第９４／２３７４４号（これらは、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。特に、例えば、ＣｐＧが低減した核酸変種によりコードされる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をそれを必要とする患者に送達するためにＡＡＶベクターが用いられる。
[0265]本発明の方法及び使用は、全身、限局的若しくは局所的に、又は任意の経路、例えば注射若しくは注入により送達及び投与することを含む。ｉｎ ｖｉｖｏでの医薬組成物の送達は、一般に、従来のシリンジを使用する注射を介して達成することができるが、対流強化送達法のような他の送達方法もまた想定される（例えば、米国特許第５，７２０，７２０号明細書を参照）。例えば、組成物は、皮下に、表皮に、皮内に、髄腔内に、眼窩内に、粘膜内に、腹腔内に、静脈内に、胸膜内に、動脈内に、経口的に、肝臓内に、門脈を介して、又は筋肉内に送達されてもよい。投与の他の様式としては、経口及び肺投与、坐剤、及び経皮塗布が挙げられる。血液凝固障害を有する患者の治療を専門とする臨床医は、いくつかの基準に基づいてアデノ随伴ウイルスベクターの投与のための最適な経路を決定することができ、該基準としては、患者の状態及び治療の目的（例えば、血液凝固の増進又は低減）が挙げられるがこれらに限定されない。
[0266]本発明の方法及び使用は、所望の治療的、有益、付加的、相乗的又は相補的な活性又は効果を有する任意の化合物、剤、薬物、治療又は他の治療レジメン又はプロトコールと組み合わせることができる。例示的な組合せ組成物及び治療は、生物学的製剤（タンパク質）、剤（例えば、免疫抑制剤）及び薬物のような第２の活性剤を含む。そのような生物学的製剤（タンパク質）、剤、薬物、治療及び療法は、本発明の任意の他の方法又は使用、例えば、ＨｅｍＡのような血液凝固疾患について対象を治療する治療方法の前に、実質的に同期間に又は後に投与又は行うことができる。
[0267]化合物、剤、薬物、治療又は他の治療レジメン又はプロトコールは、組合せ組成物として投与するか、又は別々に投与することができ、例えば、核酸、ベクター、組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子の送達又は投与と並行して又は連続して又は逐次的（前又は後）に投与することができる。本発明は、したがって、本発明の方法又は使用が、本明細書に記載される又は当業者に公知の任意の化合物、剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、方法、治療薬又は組成物と組み合わせられた組合せを提供する。化合物、剤、薬物、治療レジメン、治療プロトコール、方法、治療薬又は組成物は、本発明の核酸、ベクター、組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、又は組換えウイルス粒子の投与の前に、それと実質的に同期間に又はその後に対象に投与又は行うことができる。
[0268]本発明は、ヒトを含む動物及び獣医学的応用において有用である。好適な対象としては、したがって、ヒトの他に、非ヒト哺乳動物のような哺乳動物が挙げられる。「対象」という用語は、動物、典型的には哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜動物（イヌ及びネコ）、農用動物（家禽、例えば、ニワトリ及びカモ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。ヒト対象としては、胎児、新生児、乳児、若年児及び成人対象が挙げられる。対象としては、ＨｅｍＡのような血液凝固疾患及び当業者に公知の他のものの動物疾患モデル、例えばマウス及び他の動物モデルが挙げられる。
[0269]本発明による治療のために適切な対象としては、不十分な量の機能的な遺伝子産物（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）を産生するか若しくは該遺伝子産物に欠損を有するか、若しくはこれらのリスクがあるか、又は疾患に繋がることがある異常な、部分的に機能的若しくは非機能的な遺伝子産物（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）を産生する対象が挙げられる。本発明による治療のために適切な対象としてはまた、疾患に繋がる異常な、又は欠陥のある（突然変異体）遺伝子産物（タンパク質）を有するか、又はそれを産生するリスクがあり、それにより、異常な、又は欠陥のある（突然変異体）遺伝子産物（タンパク質）の量、発現又は機能の低減が、疾患の治療に繋がるか、又は１つ若しくは複数の症状を低減させるか、又は疾患を寛解させるような対象が挙げられる。標的対象としては、したがって、血友病患者（例えば、血友病Ａ）のような異常な、不十分な又は非存在の血液凝固因子産生を有する対象が挙げられる。
[0270]免疫応答、例えば、ＡＡＶに対する抗体について対象を試験することができる。したがって、本発明の方法による治療の前に血友病対象の候補をスクリーニングすることができる。治療後のＡＡＶに対する抗体について対象を試験することもでき、及び任意選択で、治療後の期間にわたり対象をモニターすることができる。抗体を発生する対象を免疫抑制剤で治療することができ、又は該対象に１つ若しくは複数の追加の量のＡＡＶベクターを投与することができる。
[0271]本発明による治療のために適切な対象としてはまた、ＡＡＶに対する抗体を有するか、又は該抗体を産生するリスクがある対象が挙げられる。いくつもの技術を使用してそのような対象にｒＡＡＶベクターを投与又は送達することができる。例えば、空キャプシドＡＡＶ（すなわち、ＦＶＩＩＩ核酸を欠いたＡＡＶ）を対象中のＡＡＶ抗体に結合するように送達し、それにより、ＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤをコードする核酸又は核酸変種を有するＡＡＶベクターが対象の細胞を形質転換することを可能とすることができる。
[0272]空キャプシド対ｒＡＡＶベクターの比は、約２：１～約５０：１、又は約２：１～約２５：１、又は約２：１～約２０：１、又は約２：１～約１５：１、又は約２：１～約１０：１であってもよい。比はまた、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１であってもよい。
[0273]投与すべき空キャプシドＡＡＶの量は、特定の対象中で産生されるＡＡＶ抗体の量（力価）に基づいて軟正されてもよい。空キャプシドは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４又はＡＡＶ－２ｉ８であってもよい。
[0274]代替的又は追加的に、ＡＡＶベクターは、直接的な筋肉内注射（例えば、１つ又は複数の遅筋線維）により送達されてもよい。別の代替手段では、大腿動脈中に導入されたカテーテルを使用して、肝動脈を介してＡＡＶベクターを肝臓に送達することができる。ＡＡＶベクターを肝臓に直接的に送達し、それにより血流及びＡＡＶ抗体をバイパスするために、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）のような非外科的手段もまた用いることができる。顎下腺管のような他の管系もまた、抗ＡＡＶ抗体を発生するか、又は既存の抗ＡＡＶ抗体を有する対象にＡＡＶベクターを送達するためのポータルとして使用することができる。
[0275]疾患により引き起こされるか又は疾患に関連する有害な症状、条件、合併症などの発症の前に対象への投与又はｉｎ ｖｉｖｏ送達を行うことができる。例えば、スクリーニング（例えば、遺伝子スクリーニング）を使用して、本発明の組成物、方法及び使用の候補としてそのような対象を同定することができる。そのような対象としては、したがって、機能的な遺伝子産物（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）において不十分な量若しくは欠乏について陽性とスクリーニングされたか、又は異常な、部分的に機能的若しくは非機能的な遺伝子産物（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質）を産生する対象が挙げられる。
[0276]本明細書に開示されるような本発明の方法及び使用による対象への投与又はｉｎ ｖｉｖｏ送達は、対象が、治療のために標的化された疾患を有すると同定され、疾患の１つ若しくは複数の症状を有し、又はスクリーニングされて、対象は疾患の１つ若しくは複数の症状を有しないが本明細書に記載されるように陽性であると同定された後、１～２、２～４、４～１２、１２～２４又は２４～７２時間以内に実施することができる。当然、本発明の方法及び使用は、対象が、治療のために標的化された疾患を有すると同定され、疾患の１つ若しくは複数の症状を有し、又はスクリーニングされて、対象は疾患の１つ若しくは複数の症状を有しないが本明細書に記載されるように陽性であると同定された後、１～７、７～１４、１４～２１、２１～４８又はそれより後の日、月又は年に実施することができる。
[0277]本明細書において使用される「単位剤形」は、治療すべき対象のための単位投与量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、１つ又は複数の用量で投与された時に所望の効果（例えば、予防又は治療効果）を生じさせると算出される薬学的担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル又は充填剤）と任意選択で組み合わせた予め決定された量を含有する。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよく、アンプル及びバイアルは、液体組成物、又はフリーズドライ若しくは凍結乾燥状態の組成物を含んでもよく、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与又は送達の前に無菌の液体担体を加えることができる。個々の単位剤形は、複数用量のキット又は容器に含まれてもよい。組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、組換えウイルス粒子、及びその医薬組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするために単一又は複数の単位剤形中にパッケージングすることができる。
[0278]対象をＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ量又はＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ活性について試験して、そのような対象が本発明の方法による治療のために適切かどうかを決定することができる。血友病対象の候補を、本発明の方法による治療の前にＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量又は活性について試験することができる。対象を本発明の方法による治療後にＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量又はＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ活性について試験することもできる。そのような治療される対象を、治療後に定期的に、例えば、１～４週毎又は１～６カ月毎にＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ量又はＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ活性についてモニターすることができる。
[0279]有害な応答について対象を１つ又は複数の肝臓酵素について試験して、そのような対象が本発明の方法による治療のために適切かどうかを決定することができる。したがって、本発明の方法による治療の前に血友病対象の候補を１つ又は複数の肝臓酵素の量についてスクリーニングすることができる。本発明の方法による治療後に対象を１つ又は複数の肝臓酵素の量について試験することもできる。そのような治療される対象を肝臓酵素の上昇について定期的に、例えば、１～４週毎又は１～６カ月毎に治療後にモニターすることができる。
[0280]例示的な肝臓酵素としては、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）が挙げられるが、肝臓損傷の指標となる他の酵素もまたモニターすることができる。循環中のこれらの酵素の正常レベルは、典型的に上限レベルを有する範囲として定義され、該上限レベルより高い酵素レベルは上昇しており、したがって肝臓損傷の指標となると考えられる。正常範囲は、部分的に、アッセイを実行する臨床試験室により使用される基準に基づく。
[0281]対象を出血症状についてモニターして、そのような対象が治療について適格かどうか若しくは治療に応答するかどうか、及び／又は応答性の量若しくは期間を決定することができる。対象を出血症状についてモニターして、そのような対象が追加の治療、例えば、その後のＡＡＶベクター投与若しくは免疫抑制剤の投与、又はより頻繁なモニタリングを必要とするかどうかを決定することができる。したがって、血友病対象を本発明の方法による治療の前及び後に出血エピソードについてモニターすることができる。対象を本発明の方法による治療の間又は後に出血症状の頻度及び重篤度について試験することもできる。
[0282]本発明は、包装材料及びその中に１つ又は複数の成分を有するキットを提供する。キットは、成分の説明又は成分のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、若しくはｅｘ ｖｉｖｏでの使用についての説明を含むラベル又は添付文書を典型的に含む。キットは、そのような成分、例えば、核酸、組換えベクター、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクター、又はウイルス粒子及び任意選択で第２の活性剤、例えば、別の化合物、剤、薬物又は組成物の集合物を含有することができる。
[0283]キットは、キットの１つ又は複数の成分を収容する物理的構造物を指す。包装材料は成分を無菌に維持することができ、そのような目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、コルゲートファイバー、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）で作ることができる。
[0284]ラベル又は添付文書は、その中の１つ又は複数の成分の同定情報、用量、作用機序、薬物動態及び薬力学などの（１つ又は複数の）活性成分の臨床薬理学を含むことができる。ラベル又は添付文書は、製造業者、ロット番号、製造場所及び製造日、有効期限を識別する情報を含むことができる。ラベル又は挿入物は、製造者情報、ロット番号、製造者の場所及び日を識別する情報を含むことができる。ラベル又は添付文書は、キットの成分を使用することができる疾患に関する情報を含むことができる。ラベル又は添付文書は、方法、使用、又は治療プロトコール若しくは治療レジメンにおいてキットの成分の１つ又は複数を使用するための臨床医又は対象のための説明を含むことができる。説明は、投与の量、頻度又は期間、及び本明細書に記載される方法、使用、治療プロトコール又は予防若しくは治療的なレジームのいずれかを実施するための説明を含むことができる。
[0285]ラベル又は添付文書は、予防又は治療的利益のような成分がもたらし得る任意の利益に関する情報を含むことができる。ラベル又は添付文書は、潜在的な有害な副作用、合併症又は反応に関する情報、例えば、特定の組成物の使用が適切でない状況に関する対象又は臨床医への警告を含むことができる。有害な副作用又は合併症はまた、対象が、組成物と不適合性であり得る１つ若しくは複数の他の医薬を有する、摂取するであろう若しくは現在摂取している場合、又は対象が、組成物と不適合性である別の治療プロトコール若しくは治療レジメンを有する、受けるであろう若しくは現在受けている場合に起こる可能性があり、したがって、説明は、そのような不適合性に関する情報を含み得る。
[0286]ラベル又は添付文書は、「印刷物」、例えば、紙又は厚紙を含み、これは、別々であるか、又は成分、キット、若しくは包装材料（例えば、箱）に付属しており、又はキットの成分を含有するアンプル、チューブ若しくはバイアルに付属している。ラベル又は添付文書は、コンピューター可読媒体、例えば、バーコード印刷ラベル、ディスク、光学ディスク、例えば、ＣＤ－若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、又は電気的ストレージ媒体、例えば、ＲＡＭ及びＲＯＭ若しくはこれらのハイブリッド、例えば、磁気／光学ストレージ媒体、フラッシュ媒体若しくはメモリー型カードを追加的に含むことができる。
[0287]別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。
[0288]本明細書で引用する全ての特許、特許出願、刊行物、及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、参照により全体が組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書の記載が優先される。
[0289]本発明の生物学的分子に関する様々な用語が、上記、並びに本明細書の全体及び特許請求の範囲において使用される。
[0290]本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴を、同じ、同等、又は類似の目的を果たす代替的な特徴により置換することができる。したがって、別段の明示的な記載がなければ、開示される特徴（例えば、ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種、ベクター、プラスミド、発現／組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ）配列、又は組換えウイルス粒子）は、同等又は類似の特徴の属の例である。
[0291]本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないことを文脈が明確に指し示さなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「核酸」（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）への言及は複数のそのような核酸を含み、「ベクター」（ａ ｖｅｃｔｏｒ）への言及は複数のそのようなベクターを含み、「ウイルス」（ａ ｖｉｒｕｓ）又は「粒子」（ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ）への言及は複数のそのようなウイルス／粒子を含む。
[0292]本明細書において使用される場合、全ての数値又は数値範囲は、そうでないことを文脈が明確に指し示さなければ、そのような範囲内の整数及び値又は範囲内の整数の小数を含む。したがって、実例を示すと、８０％又はそれより高い同一性への言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％などの他に、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％など、及び以下同様のものを含む。
[0293]より大きい（超）又はより小さいを伴う整数への言及は、それぞれ、参照数より大きい又は小さい任意の数を含む。したがって、例えば、１００未満への言及は、９９、９８、９７など、さらに減少して数１までの全てを含み、１０未満は、９、８、７など、さらに減少して数１までの全てを含む。
[0294]本明細書において使用される場合、全ての数値又は範囲は、そうでないことを文脈が明確に指し示さなければ、値の小数及びそのような範囲内の整数及びそのような範囲内の整数の小数を含む。したがって、実例を示すと、１～１０のような数値範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の他に、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、及び以下同様のものを含む。１～５０の範囲への言及は、したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０など、５０を含めて５０までの他に、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５など、及び以下同様のものを含む。
[0295]範囲のシリーズへの言及は、シリーズ内の異なる範囲の境界の値を合わせた範囲を含む。したがって、実例を示すと、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～８５０の範囲のシリーズへの言及は、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、５０～７５、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～５００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００などの範囲を含む。
[0296]本発明は、一般に、多数の実施形態及び態様を記載するために肯定的な表現を使用して本明細書に開示される。本発明はまた、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順のような特定の主題が全体的又は部分的に除外された実施形態を特に含む。例えば、本発明のある特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップが除外される。したがって、本発明は、一般に、本発明が何を含まないのかの点で本明細書中に表現されないが、それにもかかわらず、本発明において明示的に除外されない態様が本明細書に開示される。
[0297]本発明のいくつかの実施形態を記載してきた。それにもかかわらず、当業者は、本発明の精神及び範囲から離れることなく、本発明を様々な使用法及び条件に適合させるために本発明に様々な変更及び改良を行うことができる。したがって、以下の実施例は、実例を示すことを意図したものであり、いかなる意味でも請求される発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１
ＣｐＧが低減した第ＶＩＩＩ因子ＤＮＡ配列並びに細胞株を製造するある特定のベクター構築物、プラスミド構築物及びＡＡＶベクター
[0298]ＦＶＩＩＩをコードする１８の異なるＣｐＧが低減した核酸変種（配列番号１～１８）を製造し、発現アッセイにおいて評価した。変異体トランスサイレチン（ＴＴＲｍｕｔ）プロモーター（配列番号２２）を用いてＣｐＧが低減したヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ構築物を生成した。
[0299]ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１発現カセットは、ＣｐＧが低減したＦＶＩＩＩ－Ｘ０７核酸配列及びパッケージング用のＬＫ０３キャプシドを有する。ＬＫ０３キャプシドは、非病原性の、天然に複製欠損した一本鎖ＤＮＡウイルスであるＡＡＶ３に対して実質的な相同性を有する。
[0300]パッケージングプラスミドｐＬＫ０３は、７，４８４ｂｐのプラスミド構築物であり、ＡＡＶ２ ｐ５プロモーターの制御下のＡＡＶ２ Ｒｅｐ及びＡＡＶ－ＬＫ０３ Ｃａｐ遺伝子、細菌複製起点並びに細菌細胞においてカナマイシンに抵抗性を付与する遺伝子を有する。この構築物において、ｐ５ ｒｅｐプロモーターは、野生型又はシュード野生型ＡＡＶ種の形成の可能性を低減させるため、及びベクターの収率を増加させるためにｃａｐ遺伝子の３’に移動されている。
[0301]遺伝子移入用のクローニングされたＤＮＡは、肝臓特異的なプロモーターの制御下でヒト凝固第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）をコードする一本鎖ゲノムとしてＡＡＶ－ＬＫ０３キャプシドにパッケージングされた遺伝子発現カセットである。発現プラスミドをｐＡＡＶ－ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７と称する。該発現プラスミドは、ＴＴＲプロモーターにおける４つの点変異の導入により改変されており、コーディング領域はヒトＦＶＩＩＩの発現を増加させるように最適化した。ＡＡＶ発現カセットは以下のエレメントを含有する：
ＡＡＶ２ ＩＴＲ
トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター：野生型プロモーターと比較して遺伝子発現を増加させる４つの点変異を有する肝臓特異的なトランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ． １９９１）
合成イントロン：ヒト伸長因子ＥＦ－１アルファ遺伝子に由来する
ＦＶＩＩＩコーディング配列：Ｂドメインが欠失した、コドン最適化ヒトＦＶＩＩＩコーディング配列
ウサギベータグロビンポリＡシグナル配列（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ． １９８９）
ＡＡＶ２ ＩＴＲ
[0302]３つのＤＮＡプラスミド構築物を使用してヒト胎児腎臓２９３細胞をトランスフェクトすることにより、ヘルパーウイルスフリーの方法によりＳＰＫ－８０１１ベクターを製造する（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ． １９９８）：
遺伝子カセット（ｈＦＶＩＩＩコーディング配列及び関連する調節エレメント）をプラスミドにクローニングしてベクタープラスミドｐＡＡＶ－ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７を得る。
ウイルスＩＴＲを欠いたＡＡＶウイルスゲノム（ｒｅｐ及びｃａｐ）をプラスミドにクローニングしてＡＡＶパッケージングプラスミドｐＬＫ０３を得て、ＡＡＶベクターパッケージング用のトランスの必要とされるＡＡＶ２ ｒｅｐ及びＡＡＶ－ＬＫ０３ ｃａｐ遺伝子を得る。非相同組換えによる複製コンピテントＡＡＶの形成を防止するためにｒｅｐ遺伝子用のウイルスプロモーター（ｐ５）をプラスミド中に再配置した。
アデノウイルス－２からの３つの遺伝子を第３のプラスミド（ｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰ）にクローニングして、ベクター製造のための必要なヘルパーウイルス遺伝子を得る。プラスミドｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰｖ２は１１，８３２ｂｐのプラスミド構築物であり、３つのアデノウイルス遺伝子であるＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡを有して、ＡＡＶベクターの複製及びキャプシド形成のために必要な「ヘルパー」機能を提供する。プラスミドｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰｖ２はｐＣＣＶＣ－ＡＤ２ＨＰの誘導体であり、ＡｍｐＲ遺伝子及びｐＵＣ ｏｒｉ配列の部分を含有するＤｒｄＩ－ＤｒｄＩ １８８２ｂｐ制限断片が除去され、ＫａｎＲ遺伝子全体及びｐＵＣ ｏｒｉ配列の部分を含有するプラスミドｐＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５ｖ２からのＤｒｄＩ－ＤｒｄＩ断片で置換されている。
[0303]ＡＡＶベクター製造のために使用される細胞基材は、初代ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）２９３の誘導体である。ＨＥＫ２９３細胞株は、せん断されたヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ＤＮＡにより形質転換された永久株である（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． １９７７）。ワーキングセルバンクは、Ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＣＨＯＰ）のｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＣＣＭＴ）からの特徴付けられたＨＥＫ２９３ Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋに由来する。
実施例２
非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）におけるＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５及びＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド、ＦＶＩＩＩ－Ｘ０７（配列番号７））ベクターの評価
[0304]アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにパッケージングされたＦＶＩＩＩ導入遺伝子構築物を非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）に送達した。パイロット試験及びＧＬＰ試験の両方を行った。
[0305]簡潔に述べれば、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５又はＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）の単回静脈内注入を投与された雄カニクイザルにおける用量範囲試験を行った。ｈＦＶＩＩＩの発現を８週にわたり評価した。動物群及び各ベクターの用量レベル（パイロット試験）を図１に示す。
[0306]校正した注入ポンプを使用して約３０分にわたり伏在静脈を介してＮＨＰに静脈内注入を行った。ＡＡＶキャプシドに対する中和抗体についてマカクを予めスクリーニングした。全ての処置された動物は、ベクター投与の前に＜１：３の力価を有すると最初に決定された。低い力価であっても全身性の送達後の肝細胞によるベクター取込みを阻害するので（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００６）、これは肝臓形質導入の成功を確実にするために行った。全ての動物はまた、遺伝子移入の前にＦＶＩＩＩに対する中和抗体の存在について陰性であった。
[0307]カニクイザルの内因性ＦＶＩＩＩを検出しないヒト特異的なＥＬＩＳＡによりｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを測定した。中用量コホートにおける１匹のマカクを除いて、試験における全ての動物は、ベクター送達後にｈＦＶＩＩＩを発現する。ヒト第ＶＩＩＩ因子抗原レベルは、ベクター投与の約１～２週後にピークであった。遺伝子移入の１週後、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５を形質導入したＮＨＰは１３．２±３％（平均±平均値の標準誤差）のｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを発現した。遺伝子移入の１週後、次の治療コホート（５×１０１２ｖｇ／ｋｇ）における３匹のうちの２匹の動物における平均ｈＦＶＩＩＩレベルは２７±０．２％であった。任意の時点においてそのコホート内の第３のマカクにおいてヒトＦＶＩＩＩは検出できなかった。ベースライン血漿試料の再試験により、この動物は実際には抗ＡＡＶ抗体の存在について陽性であること、及び最初に決定された＜１：３の力価は正しくないことが決定された。最後に、１×１０１３ｖｇ／ｋｇの最高の試験用量において、ＡＡＶ注入後に５４．１±１５．６％のピークｈＦＶＩＩＩ抗原レベルが観察された。
[0308]ヒトＦＶＩＩＩ発現は、約４週目に動物の約３分の１において低下し、これに付随して、これらの３匹のマカクにおいてｈＦＶＩＩＩへの阻害抗体が出現した（図２においてε記号により標識）。ｈＦＶＩＩＩに対する種特異的抗体の発生は非ヒト霊長動物において以前に報告されており、ヒト導入遺伝子生成物と内因性カニクイザルＦＶＩＩＩとの間のいくつものアミノ酸残基の差異に起因する可能性がある（ＭｃＩｎｔｏｓｈ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－４４ （２０１３））。
[0309]ヒトＦＶＩＩＩの連続的な発現に起因する血栓形成の可能性を評価するために、Ｄダイマー抗原レベルをこの試験において測定した。臨床的関連性に関する報告又はカニクイザルにおけるＤダイマー抗原レベルの正常な値でさえも報告は乏しいことに留意すべきであり、参考として、ヒトにおけるＤダイマーの正常な範囲は５００ｎｇ／ｍｌより低い。動物は内因性カニクイザルＦＶＩＩＩを発現するので、肝臓遺伝子移入の結果としてのｈＦＶＩＩＩの産生は、超生理学的レベルのＦＶＩＩＩ活性を結果としてもたらす。
[0310]５×１０１２ｖｇ／ｋｇを投与されたがヒトＦＶＩＩＩを発現しない動物は、ＡＡＶ注入の２週後に８６３ｎｇ／ｍｌのピークを有した。残りの動物は、ベースライン値と比較してＤダイマー抗原レベルのいかなる有意な増加も示さなかった。以上を合わせると、これらの結果は、この試験において標的化したレベルにおいて、ヒトＦＶＩＩＩの発現は血栓症のリスクの増加と関連しないことを示唆する。
[0311]ベクター投与の４週後、ベクターに関連する変化は見られなかった。肝臓機能試験は正常な値を示し、ほとんどの場合に投与前に存在したのでベクター用量と関係しないと思われる微小な変動があった（図３）。
[0312]５週目までのＤダイマーレベルを図４に示す。高用量コホートの１匹の動物は、ベクター投与の１週後にＤダイマーレベルのわずかな（５７７ｎｇ／ｍｌ）一過性の上昇を有し、この時に循環性ヒトＦＶＩＩＩは約１００％でピークとなり、この単回の上昇測定後にＤダイマーレベルは急速に正常に戻った。顕著なことに、ＤダイマーレベルとｈＦＶＩＩＩ抗原レベルとの間に相関はなかった（図４、下パネル）。
[0313]パイロット試験におけるＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）ベクターについて、カニクイザルの３コホート（ｎ＝３）を増加用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）（２×１０１２、６×１０１２及び２×１０１３（ｖｇ／ｋｇ）；図１）で処置した。ＧＬＰ試験において、３ｘ１０１２、６ｘ１０１２及び２ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ（ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド））ベクターの用量を使用した。
[0314]計１１のＮＨＰを各試験において使用した。パイロット試験には、免疫抑制の非存在下での１０週の観察期間を設けた。この後に１２週の免疫抑制期間を行い、該期間は、最初の１０週の試験中に生成された抗ｈＦＶＩＩＩ抗体を根絶させるために組み込んだ。その後に、動物を追加の２０週にわたり追跡した。
[0315]臨床的所見、体重 臨床病理（臨床化学、血液学、凝固、尿検査）について動物をモニターした。加えて、ｈＦＶＩＩＩ抗原レベル、ＦＶＩＩＩ阻害抗体及びＤダイマーレベルを試験の全体を通じて評価した。
[0316]ｈＦＶＩＩＩ抗原パイロット試験データを図６に示す。平均ｈＦＶＩＩＩ抗原レベルは約２～３週目にピークとなり、１００％の正常なｈＦＶＩＩＩ抗原レベルとして１５０ｎｇ／ｍｌを使用して、低用量コホートにおいて２２．３±６．２％のｈＦＶＩＩＩが見られ、中及び高用量コホートにおいて６１．６±１５．７％及び１５３±５８．１％がそれぞれ観察された（図６Ａ～６Ｄ）。
[0317]ＧＬＰ毒物学試験において、ＳＰＫ－８０１１の末梢静脈注入を介する肝臓遺伝子移入は、全ての動物において同様にｈＦＶＩＩＩ発現に繋がった。３ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの低用量において、ｈＦＶＩＩＩ抗原レベルは正常の５～４０％の範囲内であり、ＡＡＶ投与の約２週後に２０．３±１１％（平均±ＳＥＭ）の平均ピークレベルであった。６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇコホートにおける平均ｈＦＶＩＩＩ抗原レベルは正常の４０．７±４％であった。
[0318]したがって、ＬＫ０３ ＡＡＶキャプシド血清型は、マウス肝臓とは異なりｉｎ ｖｉｖｏにおいてＮＨＰ肝細胞への形質導入を効率的に行った。遺伝子移入の直後に観察された治療的なｈＦＶＩＩＩレベルにもかかわらず、ほとんどの動物においてレベルは約４週目に低下し始めた。
[0319]カニクイザルの血漿におけるｈＦＶＩＩＩへの液性応答をＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）の投与後に測定した。ベースライン及び指し示した時点においてＥＬＩＳＡにより抗ｈＦＶＩＩＩ ＩｇＧ抗体について動物を評価した。
[0320]パイロット試験及びＧＬＰ試験の両方においてベクター処置した動物のほとんどは抗ＦＶＩＩＩ中和抗体を発生させ、これは、前臨床カニクイザル試験の他に、他の者による報告（ＭｃＩｎｔｏｓｈ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５－４４ （２０１３））に基づいて予期されるアウトカムであった。マカクにおいてＡＡＶ注入の３週後から典型的に現れるヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する中和抗体は、循環性ｈＦＶＩＩＩ抗原の検出を不可能にする。結果として、約２～３週目（すなわち、ｈＦＶＩＩＩに対する阻害抗体が現れる前）のピークｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを使用して、ヒト対象における十分な開始ベクター用量を推定することができる。パイロット及びＧＬＰ ＮＨＰ試験におけるＳＰＫ－８０１１の用量応答曲線を図７に示す。
[0321]ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）で達成されたＦＶＩＩＩ発現レベルを、ＦＶＩＩＩの送達用のＡＡＶ５及びＡＡＶ８キャプシドベースのＡＡＶベクターで達成されたＦＶＩＩＩの報告されたレベルと比較した。比較（ｃｏｍｐａｒｓｉｏｎ）により、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）で達成されたＦＶＩＩＩのレベルは、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８キャプシドを有するＡＡＶベクターにより送達されたＦＶＩＩＩの報告されたレベルより大きいことが明らかになった（図８）。
実施例３
非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）におけるＡＡＶ－ＬＫ０３キャプシドの体内分布
[0322]非ヒト霊長動物におけるＡＡＶ－ＬＫ０３キャプシドの体内分布を非ＧＬＰ試験において評価した。ヒト凝固第ＩＸ因子をコードするＡＡＶ－ＬＫ０３－キャプシド形成ベクター（ＡＡＶ－ＬＫ０３－ｈＦＩＸ）の静脈内投与は、２つの主な標的組織は肝臓及び脾臓であることを示した（図９）。脾臓指向性はＡＡＶ－ＬＫ０３の特有の特徴ではない。例えば、高い安全性の記録と共にいくつもの肝臓指向性遺伝子療法試験（例えば、ＮＣＴ０２３９６３４２、ＮＣＴ０２０８２８６０、ＮＣＴ０２５７６７９５）において使用されているＡＡＶ５キャプシドは、非ヒト霊長動物の肝臓を標的化するよりも高い有効性ではないとしても肝臓と共に脾臓を標的化する（Ｐａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。ＳＰＫ－８０１１発現カセットでは、肝臓特異的であると考えられるマウストランスサイレチン又はＴＴＲプロモーターが使用される（Ｃｏｓｔａ、１９９１）。プロモーターの肝臓特異的な性質をさらにサポートするために、ＳＰＫ－８０１１と同じ発現カセット（すなわち、ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５）をパッケージングする異なるＡＡＶベクターの投与後にマウスの肝臓及び脾臓におけるベクター由来のＦＶＩＩＩ発現をＰＣＲベースの発現解析により測定した。図１０に示すように、脾臓におけるヒトＦＶＩＩＩ発現は、肝細胞に由来するヒトＦＶＩＩＩ発現と比較して数桁低い。
[0323]これはＡＡＶ－ＬＫ０３を使用する最初の臨床試験であるが、血友病Ｂ（ＮＣＴ０２３９６３４２、ＮＣＴ０１６２０８０１ ＮＣＴ０００７６５５７、ＮＣＴ０２４８４０９２、ＮＣＴ０２６１８９１５、ＮＣＴ００９７９２３８、ＮＣＴ０１６８７６０８）のためのいくつか及び血友病Ａ（ＮＣＴ０２５７６７９５）のための１つを含む試験が他のＡＡＶベクターを使用して実行されている。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎとの共同でＳｔ． Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより実行した試験では、コドン最適化ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡをコードする自己相補的ゲノムを有するＡＡＶ８ベクター、ｓｃＡＡＶ２／８－ＬＰ１－ｈＦＩＸｃｏを利用した。ベクターを与えた１０人の対象は、３．２年のメジアンを通じて１～６％の安定な第ＩＸ因子レベルを有しており、全ての参加者は、予防因子置換の使用を中止し又は低減させた（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。血友病Ａについての臨床試験では、ヒトＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶ５キャプシド形成ベクター（ＮＣＴ０２５７６７９５）が使用された。２０１６年に提示された予備データは、１６週までの追跡で２～６０％の範囲にわたる、数人の対象における遺伝子移入後のＦＶＩＩＩ活性の増加を実証している（ＢｉｏＭａｒｉｎ、２０１６年４月）。
実施例４
ｉｎ ｖｉｔｒｏの設定で分析されたＡＡＶ－ＬＫ０３キャプシドの形質導入効率
[0324]カニクイザル及びヒト起源の初代肝細胞に細胞１個当たり５００～６２，５００ベクターゲノムの範囲内の４つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）でルシフェラーゼを発現するＡＡＶ－ＬＫ０３ベクターを形質導入した。形質導入の７２時間後にルシフェラーゼ発現を分析した。
[0325]ＡＡＶ－ＬＫ０３キャプシドは、培養ヒト肝細胞への形質導入において有意により高い効率を唯一実証した。図１１に示す代表的な例において、ＬＫ０３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて非ヒト霊長動物肝細胞と比較してヒト肝細胞への形質導入において約５倍高い効率を実証した。重要なことに、これらの結果は、複数のＭＯＩ及び反復試験にわたり一貫している。
実施例５
ヒト臨床試験用量の算出
[0326]非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）において観察されたｈＦＶＩＩＩレベルに基づいて、ヒトにおいて提案される５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの開始用量における予測されるＦＶＩＩＩレベルの推定値を決定した。異なるベクターのロットはわずかに異なる肝臓形質導入有効性を有することがあるので、パイロット及びＧＬＰの両方の毒物学ＮＨＰ試験からのデータを使用して、５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの投与後のＦＶＩＩＩ濃度の範囲を補間した。この分析について、線形回帰モデル（図１２）を使用し、すなわち、ＡＡＶ用量と結果として得られるｈＦＶＩＩＩ発現レベルとの関係は、線形性から有意に逸脱しなかった（表２）。
Figure 0007499174000001
[0327]上記に示す線形回帰モデルを使用して、５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量でＳＰＫ－８０１１を注入した時の平均ＦＶＩＩＩレベルは正常の約２．６％～３．０％であると推定された。しかしながら、この線形回帰曲線は、２ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、３ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ及び６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇでの予測されるＦＶＩＩＩ発現の値を逆算するために表２の等式が使用される場合に、低及び中用量動物において観察される実際の値を低く見積もるようである（表３）。
Figure 0007499174000002
[0328]ｈＦＶＩＩＩ発現は、ＡＡＶベクター負荷の増加につれて飽和に達しながらある特定のベクター用量において線形用量応答に従う可能性がある。高用量コホートを先行する分析から除去して、線形回帰曲線を再計算し、決定された５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇのＳＰＫ－８０１１用量での予測されるｈＦＶＩＩＩ発現レベルを再評価した（表４及び図１３）。
Figure 0007499174000003
[0329]図１３に示す線形回帰曲線を用いて、５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量でＳＰＫ－８０１１を注入した時の平均ＦＶＩＩＩレベルは、正常の約３．４％～５．２％であると推定された。
実施例６
ヒト臨床試験の設計
[0330]適格性
試験のために適格の年齢：１８歳以上（成人、高齢者）
試験のために適格の性別：男性
健常ボランティアの受入れ：なし
[0331]基準：選択基準：
１８歳以上の男性
正常の≦２％の血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する病歴により立証される血友病Ａの確定診断
＞１５０の曝露日数（ＥＤ）のＦＶＩＩＩ濃縮物又はクリオプレシピテートを受けている
オンデマンド療法を受けている及び正常の１～２％のＦＶＩＩＩベースラインレベルを有する場合に限り先行する１２カ月にわたり＞１０の出血事象を経験している
いかなるＦＶＩＩＩ生成物に対してもアレルギー性反応の前歴を有しない
中央検査室による評価で第ＶＩＩＩ因子阻害剤に対する測定可能な阻害剤を有さず、及びＦＶＩＩＩタンパク質への阻害剤の前歴を有しない
信頼できるバリアー避妊法の使用への同意
[0332]基準：除外基準：
活動性Ｂ型又はＣ型肝炎の証拠
Ｂ型又はＣ型肝炎に対する抗ウイルス療法を現在受けている
重大な基礎肝疾患を有する
ＣＤ４数≦２００／ｍｍ３と共にＨＩＶ－１又はＨＩＶ－２の血清学的証拠＊を有する（＊ＨＩＶ＋であり、並びにＣＤ４数＞２００／ｍｍ３及び検出不可能なウイルス負荷を有して安定な参加者は登録のために適格である）
ＡＡＶ－Ｓｐａｒｋ２００キャプシドと反応性の検出可能な抗体を有する
直前の５２週以内に遺伝子移入試験に又は直前の１２週以内に治験製品を用いた臨床試験に参加した
実施例７
異なる用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）－ｈＦＶＩＩＩにおいて予測されるＦＶＩＩＩレベル
[0333]臨床試験ＮＣＴ０３００３５３３（「血友病Ａに対する遺伝子移入試験」）は、ＬＫ０３（配列番号２７）として公知のＡＡＶキャプシドのファースト・イン・ヒューマンの使用である。非ヒト霊長動物での試験により、増加用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）－ｈＦＶＩＩＩは、少なくとも一部の用量範囲について、線形性から有意に逸脱しないようである用量依存的な方式で循環性ヒトＦＶＩＩＩのレベルの増加を結果としてもたらすことが示される。第１のコホートにおける平均定常状態ＦＶＩＩＩレベル（±平均値の標準誤差）は、正常の約１１．７±２．３％であった。この用量コホートにおける２人の参加者というｎを考慮すると、観察されるＦＶＩＩＩレベルにおける比較的低いばらつきが、より多くの参加者が試験に組み入れられる時に維持されるかどうかを予測することは難しい。
[0334]血友病Ｂの治療のために治験製品ｒＡＡＶ－ＦＩＸを使用する、肝臓における凝固因子の発現を媒介するためにｒＡＡＶベクターを使用する最近の経験（ＮＣＴ０２４８４０９２）は、対象のより大きいコホートにおけるばらつきを推定するための有用な参照となり得る。ｒＡＡＶ－ＦＩＸベクター注入の１２週後までに定常状態ＦＩＸ発現に達し、約３３％の平均ＦＩＸ活性（ＦＩＸ：Ｃ）を結果としてもたらした。重要なことに、ＦＩＸ：Ｃの最も高いレベルは約７９％（対象９）であり、最も低いレベルは約１４％（対象７）であった。なお、対象７におけるベクター力価の解釈は、短期間のステロイドを開始する前にＦＩＸ発現の部分的な喪失を結果としてもたらす、ｒＡＡＶ－ＦＩＸベクターキャプシドに対する免疫応答の発生により交絡した。しかしながら、細胞性免疫応答が検出されなかった対象６は、約１８％の定常状態レベルを有していた。したがって、試験ＮＣＴ０２４８４０９２における最も高い及び最も低いＦＩＸ：Ｃレベルの間の差異は約４倍であった。血友病の治療のための他のＡＡＶ臨床試験は、有意により高いばらつきを示した。Ｐａｓｉ， ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． １１７（３）：５０８－５１８。表５は、線形用量応答を仮定して異なるＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）－ｈＦＶＩＩＩ用量での予測される平均ＦＶＩＩＩレベルを示す。血友病Ｂ試験において観察されたばらつきを血友病Ａ試験におけるばらつきを推定するための保存的アプローチとして使用した。
Figure 0007499174000004
実施例８
ヒト臨床試験の結果
[0335]重篤（Ｎ＝１１）又は中等度に重篤（Ｎ＝１）な血友病Ａを有する１２人の男性において用量漸増試験を行った。対象は１８～５２歳の範囲内であった。遺伝子療法の前に、１２人のうち８人の対象を予防により、及び１２人のうち４人の対象をエピソード治療で処置した。対象を３つの投与コホートのうちの１つに登録し、５×１０１１ｖｇ／ｋｇ（Ｎ＝２、対象１及び２）、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ（Ｎ＝３、対象３、４及び６）、又は２×１０１２ｖｇ／ｋｇ（Ｎ＝７、対象５及び７～１２）の用量でＳＰＫ－８０１１（ＡＡＶ－ｈＦＶＩＩＩ、ＬＫ０３キャプシド）を注入した。
[0336]図１４～２８は、３つの異なる用量のＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）－ｈＦＶＩＩＩを投与された１２人のヒト対象の用量応答試験データを示す。対象において決定されたＦＶＩＩＩ活性の値は、正常な血漿における１００％のＦＶＩＩＩと比べたものである。典型的に、血漿を多数（例えば、５０又は１００）の正常なボランティアからプールし、この「正常なプールされた血漿」におけるＦＶＩＩＩ活性を１００％と定義する。この血漿の希釈液を使用して、ＦＶＩＩＩ活性の標準曲線を作成し、どのようなアッセイに対してもこの標準曲線を使用してＦＩＸレベルを決定する。次に、この標準曲線を使用して、同じアッセイを使用する患者試料におけるＦＶＩＩＩの量又はパーセント（％）を定義する。
[0337]全てのベクター用量は、出血を予防し、予防の中止を可能とするために十分なレベルのＦＶＩＩＩの発現に繋がった。３つの用量における１２人の対象にわたり、年間出血率（ＡＢＲ）の９７％の低減、及び年間補充率（ａｎｎｕａｌｉｚｅｄ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ）の９７％の低減があった。全体的な速度論は、ＦＶＩＩＩの持続的なプラトーへの漸進的な上昇を示すことがデータにより指し示される。
[0338]第１の用量コホートにおいて、ＦＶＩＩＩレベルは６６週及び５１週時に１４％及び１５％であり、出血事象はなく、トランスアミナーゼレベルの上昇はなく、ステロイドの使用はない。ＦＶＩＩＩ発現は観察期間にわたり安定なままであった。この低用量コホートからのデータは、１５％の範囲内の控えめなＦＶＩＩＩレベルであっても、６６週までの追跡期間にわたり出血を予防するために十分であり得ることを指し示す。
[0339]第２の用量コホートにおいて、ＦＶＩＩＩレベルは、注入後３３、４６、及び３１週時に９％、２６％、及び１７％である。この用量コホートにおける第１の対象（対象３）は、１５９日目に突発性関節出血のために単回用量の因子濃縮物を注入され、この用量コホートにおける第２の対象（対象４）は、１９５日目に開始して外傷性出血のために複数の注入を与えられた。これらの対象は共に、ＦＶＩＩＩレベルの低下により誘発される、ベクター注入の１２及び７週後に始められた漸減的なステロイドを与えられ、ＦＶＩＩＩレベルの安定化が結果としてもたらされた。この用量コホートにおける第３の対象（対象６）は出血がなく、因子の注入もステロイドも与えられなかった。
[0340]第３の用量コホート（Ｎ＝７）において、７人のうち５人の対象は現行で≧１２％のＦＶＩＩＩレベルを有し、１６～４９％の範囲であり、これらの対象について、ベクター注入の１２週後に開始する平均ＦＶＩＩＩレベルは３０％でありメジアンは２２％である。ベクター注入の４週後に開始してこれらの対象では出血が報告されなかった。
[0341]以上とは別に、２×１０１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＬＫ０３（ＦＶＩＩＩ）ベクター用量の７人のうち５人は、以下：ＦＶＩＩＩレベルの低下、対象ベースラインより高くへのＡＬＴの上昇、又はＡＡＶキャプシドへのＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴの上昇のうちの１つ又は複数のために、ベクター注入の６～１１週後の範囲内の時点に開始して一連のステロイドを与えられた。ステロイドの開始は、全ての症例において正常な範囲へのＡＬＴの低減、及びＥＬＩＳＰＯＴシグナルの消失と関連し、７人のうち２人の対象は、ＦＶＩＩＩレベルの安定化において限定的な成功を示し、これは恐らく免疫応答に起因して＜５％であった。これらの対象の１人について、１２週間の追跡を通じて出血は報告されず、他の対象は３７週間の観察を通じて４回の出血を有した。
[0342]全体的に、好都合な安全性プロファイルが観察され、２人の対象のみが正常値上限より高いＡＬＴの上昇を経験した。対象の９１％は現在まで、ベクター注入から≦１のＡＢＲを経験している。全ての対象は、ベクター注入後にＦＶＩＩＩレベルの上昇を経験したが、２人の対象におけるＦＶＩＩＩレベルの低下の予防の限定的な成功は、予防的ステロイドの添加が正当であり得ることを示唆する。
[0343]非ＮＨＰにおいて見られたｈＦＶＩＩＩレベルに基づいて、及び異なるベクターのロットはわずかに異なる力価を有し得ることを考慮に入れて、５ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇの用量のＳＰＫ－８０１１を注入されたヒトにおける平均ＦＶＩＩＩレベルは、線形外挿を仮定して約３．４％～５．８％である可能性が推定された。第１の対象におけるＦＶＩＩＩ活性は正常の約９．１５±０．５３％でプラトーとなり、第２の対象においては１３．５０±０．５０％であった。したがって、低用量コホートにおける平均ＦＶＩＩＩ活性は約１１．３％であり、これは、非ヒト霊長動物における試験に基づいて予測されるより２～４倍高い。
[0344]マカクのような系統発生的に近い種を使用した前臨床試験及びヒト対象における実際の結果に基づいて予測されるＦＶＩＩＩレベルの間の低用量コホートにおける（線形回帰曲線の使用に応じた）実質的な２～４倍の差異は、ヒトのためのＡＡＶベクター投与量の決定における現行の動物モデルの限界を強調する。ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１（ＬＫ０３キャプシド）－ｈＦＶＩＩＩを投与されたＮＨＰにおけるＦＶＩＩＩ活性に基づいて予測されるよりもヒトにおいてはるかに高いＦＶＩＩＩ活性があることを指し示すデータは予想されなかった。
[0345]ヒトにおけるＡＡＶ投与量を決定するための普遍的な前臨床モデルは存在しないが、凝固第ＩＸ因子の肝臓由来の発現を媒介するためにＡＡＶ２、ＡＡＶ８及びＡＡＶ－Ｓｐｋベクターを使用した非ヒト霊長動物における先行する経験により、マカクは、ヒトにおけるＡＡＶベクターの有効性の良好であるが完璧ではない予測因子であることが指し示される。より最近では、ヒト肝細胞を部分的に再配置させた肝臓を有するキメラ「ヒト化」マウスは、異なるウイルスキャプシドの肝臓形質導入有効性を決定するための価値のあるツールとなっている。このマウスモデルの利点を活かしてヒト肝細胞における形質導入を測定した２つの独立した試験が報告されている。ＬＫ０３とＡＡＶ８との間で形質導入されるヒト肝細胞のパーセントの約１０倍の差異（ＬＫ０３及びＡＡＶ８ベクター注入でそれぞれ４３．３±１１％及び３．６±１．１％が観察された（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ５０６：３８２－６ （２０１４））。
[0346]以上を合わせると、重篤又は中等度に重篤な血友病Ａを有する１２人の患者におけるＳＰＫ－８０１１の注入は、遺伝子移入の６６週後までの期間にわたりＡＢＲにおいて９７％及び組換えＦＶＩＩＩの使用において９７％の低減と関連する、安全な、永続性のある、用量依存的なＦＶＩＩＩ活性を結果としてもたらした。
実施例９
ＴＴＲプロモーター
[0347]トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターの特徴付けは元々、Ｃｏｓｔａ ａｎｄ Ｇｒａｙｓｏｎ １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９（１５）：４１３９－４１４５に記載された。ＴＴＲプロモーター配列は、ＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧからＴＡＴＴＧＡＣＴＴＡＧに改変された配列であった。
４つのヌクレオチド変異（ＴＴＲｍｕｔ）を有するＴＴＲプロモーター、配列番号２２
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCT
実施例１０
ＣｐＧが低減したＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子構築物及び例示的なＡＡＶキャプシド
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０１（配列番号１）
atgcagattg agctgtctac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgct
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgcccaagagctt ccccttcaat
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttcactgatcatct gttcaacatt
gctaaaccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccctaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcactct gaagaacatg gctagccatcctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatgatgatcagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggctctcacacctatgtctg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgatcct ctgtgtctgacctatagcta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgtagggag
gggagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagttcattctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcattctgaa accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt caataggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
accacccctg aggtgcacag catctttctg gagggccacaccttcctggt gaggaatcac
agacaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agtttctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaataatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gagatttgat
gatgacaatt ctcccagctt cattcagatc aggtctgtggccaagaagca tcccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggactatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctataa gagccagtac ctgaataatggcccccagag gattgggagg
aagtataaga aggtgaggtt catggcctat actgatgaaaccttcaagac cagagaggcc
atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatctaccctca tggcatcact
gatgtgaggc ctctgtacag cagaaggctg cccaagggggtgaagcatct gaaggacttc
cccattctgc ctggggagat tttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggccca
accaagtctg accctaggtg cctgactagg tactacagcagctttgtgaa tatggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg accctgaatt ccaggcctct aacatcatgcacagcattaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta cattctgagc
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacctt taagcacaag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttt cctttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaactctgacttcag gaacaggggg
atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatctctgc ctatctgctg agcaagaataatgctattga gcccaggagc
ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag aactactctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gattttgata tttatgatga ggatgaaaac cagagccccaggagctttca gaagaagact
aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgtc ttctagcccc
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccctta tatcagggct gaggtggaggataacatcat ggtgaccttc
aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tactctagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacttat
ttctggaagg tgcagcacca tatggccccc accaaggatgagtttgattg caaagcctgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaatatc cagatggaggaccccacctt taaggaaaat
tataggtttc atgccattaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggcagcaatgagaa cattcacagc
atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tataatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtgtattcta acaagtgtca gacccccctg ggcatggcctctggccatat cagggacttc
cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggcccccaagctggccag gctgcattac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagccattcagctggattaa ggtggacctg
ctggctccaa tgattatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gtttagcagc
ctgtacatct ctcagtttat catcatgtac tctctggatggcaaaaagtg gcagacctac
aggggcaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctgggatc
aagcacaaca tctttaaccc ccctatcatt gccaggtacattaggctgca ccccacccat
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgcagc
atgcccctgg gcatggagag caaggctatc tctgatgcccagattactgc cagcagctac
ttcaccaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccatcagtggac cctgttcttc
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aatcaggacagcttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０２（配列番号２）
atgcagattg agctgtctac ctgctttttc ctgtgtctgctgaggttctg cttctctgcc
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggattacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgcccaagtcttt ccccttcaat
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagtttactgatcacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctggggcccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcctctcaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg gggagccacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gcccaatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctattctta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggctctctgg ctaaggagaa gacccagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaaaatg cacactgtgaatggctatgt gaataggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtattggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcactc tatcttcctg gagggccatactttcctggt gaggaatcat
aggcaggcca gcctggagat tagccccatt acctttctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttttgccac atcagctctcaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgaaatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gcccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca tcctaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggactatgctcccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaacaatggcccccagag aattgggagg
aagtataaga aggtgagatt catggcttac actgatgagaccttcaagac tagggaggcc
atccagcatg agtctggcat tctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggcctctagg ccctacaatatttaccccca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcatct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga agatggcccc
accaagtctg accctaggtg cctgaccagg tactactcttcttttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
agggggaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgattctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggctc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctggctacacctt taagcataag
atggtgtatg aggacactct gaccctgttt cccttctctggggagactgt gtttatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaactctgatttcag gaacaggggc
atgactgctc tgctgaaggt gtcttcttgt gacaagaacactggggacta ttatgaggac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgctattga gcccagatct
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcactag gaccaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagtctcccaggagcttcca gaaaaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgtc ttctagcccc
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccctta tattagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgactttc
aggaatcagg cctctaggcc ctatagcttc tacagctctctgatcagcta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggctcct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctactttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgtc ataccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagagctggtactttac tgagaacatg
gagaggaatt gcagagcccc ttgcaacatc cagatggaggacccaacctt caaagagaac
tacaggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggcagcaatgagaa tatccatagc
attcacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tataacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgccaagcaa ggctgggatt
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtactcca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagggacttc
cagatcactg cctctggcca gtatgggcag tgggccccaaagctggccag gctgcactat
tctgggagca tcaatgcttg gagcaccaag gagcctttcagctggattaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcattca tggcatcaaa acccagggggctagacagaa gttttctagc
ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacttac
aggggcaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggcaatgtggacag ctctggcatc
aagcacaaca tctttaaccc ccccattatt gccaggtatatcaggctgca tcccacccac
tattctatta ggtctactct gagaatggag ctgatgggctgtgacctgaa cagctgtagc
atgcccctgg ggatggagag caaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttat
ttcaccaata tgtttgccac ctggtctccc tctaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgctt ggaggcccca ggtgaataac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagtctctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatgggcatcagtggac tctgttcttc
cagaatggca aggtgaaggt cttccagggg aaccaggatagcttcactcc tgtggtgaac
tctctggacc cccccctgct gactaggtat ctgaggatccacccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０３（配列番号３）
atgcagattg aactgtctac ttgtttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttctctgct
actaggaggt actatctggg ggctgtggag ctgtcttgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc taggtttccc cccagggtgcccaagagctt cccctttaac
acctctgtgg tgtataagaa gactctgttt gtggagttcactgaccatct gttcaacatt
gccaagccaa ggcccccctg gatgggcctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattactct gaagaacatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac ctctcagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggctctcatacctatgtgtg gcaggtcctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctactctta tctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ctaaggagaa gacccagact ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaacaggagc
ctgccaggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtattggcatgtgat tgggatgggg
actacccctg aggtccacag cattttcctg gaggggcatacctttctggt gaggaaccac
aggcaggcct ctctggagat ctctcccatt actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa aaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgataaca gccccagctt catccagatt aggtctgtggccaagaagca tcccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgctcctct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaataatggcccccagag gattggcagg
aagtataaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggcc
atccagcatg aatctgggat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgattatct ttaagaacca ggctagcagg ccctacaacatttaccccca tggcattact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcacct gaaggatttc
cccattctgc ctggggagat ctttaagtac aaatggactgtgactgtgga ggatggccct
actaagtctg atcccaggtg tctgaccaga tactacagcagctttgtgaa tatggagagg
gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaatc agattatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacagaagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggctagc aatatcatgcacagcattaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctattggta cattctgagc
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggatactct gaccctgttt cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgtcacaactctgacttcag gaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagctcttgt gataagaacactggggacta ctatgaggac
tcttatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgctattga gcccaggagc
ttctctcaga atccccctgt gctgaagagg catcagagggagatcactag gactaccctg
cagtctgacc aggaagagat tgactatgat gacaccatctctgtggaaat gaagaaggag
gactttgata tctatgatga ggatgaaaac cagagccccaggagcttcca gaagaagacc
aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatgggatgag ctcttctccc
catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtcccacagttcaagaa ggtggtgttt
caggagttca ctgatggcag cttcactcag cccctgtacaggggggagct gaatgagcat
ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggaggataacattat ggtgactttc
aggaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac taagacctat
ttctggaagg tgcagcatca catggctccc actaaagatgagtttgactg caaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcattctgggctgat tggccctctg
ctggtctgcc atactaacac cctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tctttaccat ctttgatgag accaagtcttggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgtaacatc cagatggaggaccccacctt taaggagaac
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacactctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggctctaatgagaa cattcattct
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaatctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgctgccctctaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtctatagca ataagtgcca gacccccctg gggatggcctctgggcatat cagagacttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctggcagca ttaatgcctg gagcaccaag gagcccttctcttggatcaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcatcca tgggatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaata gcactgggac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctggcatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatt gccaggtacatcagactgca ccccactcat
tacagcatca ggagcactct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa tagctgctct
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ttcactaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcatct gcaggggagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggcaccagtggac cctgtttttc
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggacagctttactcc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gactaggtac ctgaggattcacccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０４（配列番号４）
atgcagattg agctgtctac ctgcttcttt ctgtgcctgctgaggttctg tttctctgcc
actaggaggt attatctggg ggctgtggag ctgtcctgggactacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttccct cccagggtgcccaagtcttt ccctttcaat
acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagtttactgatcacct gtttaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattactct gaagaatatg gcttctcaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gcccaatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctacagcta tctgagccat
gtggatctgg tgaaggatct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggctctctgg ccaaggagaa gactcagact ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaactctctgatgca ggatagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaataggagc
ctgcctgggc tgattgggtg tcacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accactcctg aggtgcacag catctttctg gagggccacacttttctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctgggcc agttcctgct gttttgccat atcagcagccatcagcatga tgggatggag
gcttatgtga aggtggactc ttgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaataatgaa
gaggctgagg actatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gccccagctt tatccagatt aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcatt acattgctgc tgaggaagag gattgggactatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctacaa gtctcagtac ctgaacaatggccctcagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
attcagcatg aatctgggat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgattattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatttatcctca tggcattact
gatgtgagac ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgactagg tactactccagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagaga aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttctgcctaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggcctct aacattatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttctctggctacacctt taagcataag
atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaacc caggcctgtg gatcctgggc tgccacaactctgatttcag gaataggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaacactggggacta ttatgaggat
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga atcctcctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagagccccaggagcttcca gaagaagact
agacactact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctcttctccc
catgtgctga gaaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtcttc
caggagttca ctgatggctc tttcacccag cctctgtatagaggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccctta catcagggct gaggtggaggacaatatcat ggtgaccttc
aggaaccagg ctagcaggcc ctactctttc tacagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaat tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctactttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcattctggcctgat tggccccctg
ctggtctgcc acaccaatac tctgaaccct gctcatgggagacaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagtcctggtactttac tgagaacatg
gagaggaatt gcagggcccc ttgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggaaaat
tataggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg tctatgggctctaatgagaa catccacagc
atccatttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtataa gatggctctg
tacaacctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatt
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctgggatgagcac cctgttcctg
gtgtactcta acaagtgcca gaccccactg ggcatggcttctggccacat cagggatttc
cagattactg cctctggcca gtatggccag tgggctcccaagctggctag gctgcactac
tctgggagca tcaatgcctg gtctactaag gagcctttctcttggatcaa agtggacctg
ctggccccta tgatcatcca tgggatcaag actcagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatct ctcagttcat cattatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctgggatt
aagcacaaca tctttaaccc ccccatcatt gccaggtatatcaggctgca ccctacccac
tacagcatta ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa cagctgcagc
atgcccctgg ggatggagag caaggccatt tctgatgctcagatcactgc ttctagctac
ttcactaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggctagactgcacct gcaggggagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaataat cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aaaaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagtctctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatgggcatcagtggac cctgttcttt
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggacagcttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０５（配列番号５）
atgcagattg agctgtctac ttgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
actaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgcctaagagctt ccccttcaac
acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagtttactgatcatct gttcaacatt
gccaagccca ggcctccttg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattaccct gaagaatatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct attggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg gggagccatacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgaccct ctgtgcctgacttatagcta cctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagtcctg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcctaagatg cacactgtgaatggctatgt gaataggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
accacccctg aggtgcactc tattttcctg gagggccatactttcctggt gaggaaccat
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc actttcctgactgcccagac tctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccatcagcatga tggcatggag
gcttatgtga aggtggacag ctgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaataatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaact ctccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccctaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgcccccct ggtgctggcc
ccagatgaca ggagctacaa gtcccagtac ctgaacaatggcccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttat actgatgagactttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggccct ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgattatct tcaagaacca ggcttctagg ccctacaatatctaccctca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcatct gaaggatttc
cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagcagctttgtgaa catggagagg
gatctggctt ctgggctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt tcaggcctct aatatcatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctattggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg tttttttctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggatactct gactctgttc cctttttctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaattctgacttcag gaacagaggc
atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaacactggggacta ctatgaggac
tcttatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccagaagc
ttttctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gatactatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagccccaggtctttcca gaagaagact
aggcactact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatgggatgtc tagctctcct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagtttaaaaa ggtggtgttc
caggaattca ctgatggcag ctttacccag cctctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tggggcctta cattagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgaccttc
aggaatcagg ccagcaggcc ctactctttc tacagcagcctgatctctta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgaacc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc accaaggatgagtttgattg caaggcctgg
gcttacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggcagacaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag actaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaatt gcagggcccc ttgcaacatc cagatggaggaccccacctt taaggagaac
tacaggtttc atgccattaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatggggagcaatgagaa catccacagc
attcacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgagcac cctgttcctg
gtgtatagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagagacttt
cagattactg cctctggcca gtatgggcag tgggcccccaagctggccag gctgcactat
tctggctcta ttaatgcctg gagcactaag gagcccttcagctggattaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcatcca tggcatcaag actcagggggccaggcagaa gttctcttct
ctgtacatca gccagttcat tatcatgtac tccctggatggcaagaagtg gcagacctat
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctggcatc
aagcataata tcttcaatcc ccccatcatt gctaggtacatcaggctgca ccccacccac
tactctatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa cagctgcagc
atgcctctgg gcatggagag caaagccatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
tttaccaaca tgtttgctac ttggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcaggggagg
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagagcctgct gacctctatg
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatggccaccagtggac cctgtttttc
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggg aaccaggacagcttcactcc tgtggtgaac
tctctggacc cccccctgct gaccaggtat ctgaggatccaccctcagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０６（配列番号６）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttctctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttccct cccagggtgcccaagtcttt ccccttcaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagtttactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcctccctg gatgggcctg ctgggccccaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcatcaccct gaaaaatatg gctagccaccctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaagagaatg gccccatggc ttctgatccc ctgtgtctgacctatagcta cctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ctaaggagaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtctattggcatgtgat tggcatgggc
actactcctg aggtgcacag catctttctg gagggccacaccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcca gcctggagat ctctcccatc actttcctgactgctcagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgtcac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gaaccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaatt ctcctagctt cattcagatc agatctgtggccaaaaagca tcctaagact
tgggtgcatt atattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccccct ggtgctggct
cctgatgata ggagctacaa gtctcagtac ctgaataatgggccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
attcagcatg agtctgggat tctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatctaccccca tgggattact
gatgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggatttt
cctatcctgc ctggggaaat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg atcccaggtg tctgaccagg tattatagctcttttgtgaa catggagagg
gatctggcct ctgggctgat tggccctctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgtctg catgaggtggcctactggta tatcctgtct
attggggccc agactgactt cctgtctgtg tttttttctgggtatacttt taagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cccttctctggggagactgt gtttatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaattctgacttcag gaataggggg
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gataagaatactggggacta ctatgaggac
tcttatgagg acatttctgc ctatctgctg tctaagaacaatgccattga acccaggagc
ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggaaatcaccag aactactctg
cagtctgatc aggaggaaat tgactatgat gacactatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagcccaaggagcttcca gaagaagact
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagcagcccc
catgtgctga gaaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta tattagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgaccttc
aggaatcagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcctgattagcta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgaacc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctat
ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gctcatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagtcttggtacttcac tgagaatatg
gagaggaatt gcagggcccc ctgcaatatt cagatggaagaccccacctt caaggagaat
tacaggttcc atgccattaa tggctacatc atggataccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggcagcaatgagaa catccactct
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggagtataa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgctgccttctaa ggctggcatt
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtacagca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcctctgggcatat cagggatttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccaaagctggctag gctgcactac
tctgggagca tcaatgcctg gagcactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgattatcca tgggattaag actcagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagttcat tatcatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacctat
aggggcaact ctactgggac cctgatggtg ttctttgggaatgtggatag ctctgggatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatt gccaggtatatcaggctgca ccccacccac
tacagcatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgtagc
atgcctctgg gcatggagtc taaggccatt tctgatgcccagattactgc tagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggccaggctgcatct gcagggcagg
tctaatgctt ggaggcccca ggtgaacaac ccaaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagtctctgct gacctctatg
tatgtgaagg agttcctgat ctctagcagc caggatggccatcagtggac cctgttcttc
cagaatggca aggtgaaagt gttccagggc aatcaggatagcttcactcc agtggtgaac
agcctggatc cccctctgct gactaggtac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０７（配列番号７）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgtctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc taggttcccc cccagggtgcccaagagctt cccctttaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggcccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgagtatgatgaccagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gtttcctggg ggcagccatacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctacagcta cctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgtagggag
ggcagcctgg ctaaggaaaa gacccagacc ctgcataagtttatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcttg gcctaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaataggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
accacccctg aggtccatag catcttcctg gagggccacactttcctggt gaggaaccac
agacaggcct ctctggagat ctctcccatc accttcctgactgctcagac tctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttttgccat attagcagccaccagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgaag actatgatga tgacctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gccccagctt cattcagatc aggtctgtggccaagaaaca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaagag gactgggactatgctcccct ggtgctggcc
cctgatgata ggtcttataa gagccagtac ctgaacaatgggccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgaaaccttcaaaac cagggaggcc
attcagcatg agtctggcat cctgggccct ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatctatcctca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcacct gaaagacttc
cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggccct
accaagtctg accccaggtg tctgaccagg tactattctagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tgggcccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgag
aataggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aatatcatgcatagcatcaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttttctggctatacctt caagcacaag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaatc ctgggctgtg gatcctgggg tgccacaactctgattttag gaacaggggg
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatttctgc ttatctgctg tctaagaataatgccattga gcccagaagc
ttcagccaga atccccctgt gctgaagaga catcagagggagatcaccag aactaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagctttca gaagaagacc
agacattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagccct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggaattca ctgatggcag cttcacccag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tggggcctta tatcagggct gaggtggaggataatattat ggtgactttc
aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tatagcagcctgatctctta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagcccaatgagac taagacctac
ttctggaagg tccagcacca catggcccct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctatttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtccattctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtccaggag
tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag accaagagctggtactttac tgagaacatg
gagaggaact gcagagctcc ttgcaatatt cagatggaggaccccacctt caaggagaat
tacaggttcc atgccattaa tgggtacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggctctaatgagaa tatccacagc
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tataatctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgctgccctctaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagggacttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactat
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcattca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagctct
ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatgggaagaagtg gcagacctac
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttgggaatgtggactc ttctggcatc
aagcacaaca tcttcaatcc ccccatcatt gctaggtatattaggctgca tcccacccac
tacagcatca ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgcagc
atgcccctgg gcatggagtc taaggccatc tctgatgcccagattactgc cagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc tctaaggccaggctgcatct gcaggggagg
agcaatgcct ggaggcctca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtcaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccaccagtggac tctgttcttt
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggactctttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatccacccccagtc ttgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggctcaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０８（配列番号８）
atgcagattg agctgagcac ttgctttttt ctgtgcctgctgaggttttg tttttctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagtcttt tcccttcaac
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gctaagccta ggcccccctg gatgggcctg ctgggccctaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtctctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagaga
gagaaggagg atgacaaggt cttccctggg ggctctcacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggaaaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctacagcta tctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaattctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagtttatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctgggc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcacag catcttcctg gaaggccacactttcctggt gaggaaccat
aggcaggcca gcctggagat cagccctatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctggggc agttcctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgcccagag gagcctcagctgaggatgaa aaacaatgaa
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gagatttgat
gatgacaata gccctagctt tattcagatc aggtctgtggctaagaagca ccccaagacc
tgggtgcatt acattgctgc tgaggaggag gactgggattatgctcctct ggtgctggcc
cctgatgata ggagctacaa gagccagtac ctgaataatggccctcagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgagaccttcaagac tagggaggcc
atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggctagcagg ccttacaacatctatcccca tgggatcact
gatgtgagac ctctgtacag caggaggctg cccaagggggtcaagcatct gaaagacttc
cccatcctgc ctggggagat ctttaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatgggccc
accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagcagctttgtgaa catggagagg
gatctggcct ctgggctgat tggccccctg ctgatctgttacaaggaatc tgtggatcag
aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggtctt ggtacctgac tgaaaacatc cagaggttcctgcccaaccc tgctggggtc
cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgtct
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt ctttatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaactctgatttcag gaataggggc
atgactgctc tgctgaaggt gagctcttgt gacaagaacactggggatta ctatgaggac
agctatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcctaggagc
tttagccaga atcctcctgt cctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gataccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagcttcca gaagaagacc
aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagctctcct
catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtgccccagttcaagaa agtggtgttt
caggagttca ctgatggctc tttcacccag cctctgtataggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccccta tatcagggct gaggtggaggataacatcat ggtgaccttc
aggaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tatagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacttac
ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatgagtttgactg taaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc ataccaatac tctgaaccct gctcatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgctctgt tcttcactat ctttgatgag accaagtcttggtatttcac tgagaatatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt taaggagaac
tataggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggtctaatgagaa catccacagc
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg agaaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tacaatctgt accctggggt ctttgagact gtggagatgctgcctagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacat ctgcatgctgggatgtctac tctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcttctggccatat cagggacttt
cagattactg cctctgggca gtatggccag tgggcccccaagctggctag gctgcattat
tctggcagca tcaatgcctg gtctactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gtttagctct
ctgtacatta gccagttcat catcatgtac agcctggatgggaagaagtg gcagacctac
aggggcaatt ctactggcac cctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctggcatc
aagcacaaca tctttaaccc ccctatcatt gctaggtacatcaggctgca tcccacccat
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgcagc
atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgcccagattactgc cagcagctac
ttcactaaca tgtttgccac ctggtctccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagctctagc caggatggccaccagtggac tctgtttttc
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggactctttcactcc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtat ctgaggattcacccccagtc ttgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ０９（配列番号９）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgtctgctgagattttg cttttctgcc
actaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgtcttgggactacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttccca cctagggtgcctaagagctt tcccttcaat
acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccta ggcccccctg gatgggcctg ctgggccctaccatccaggc tgaagtgtat
gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac cagccagagg
gagaaggaag atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtctg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctactctta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggatct gaattctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgaag ggaagagctg gcactctgag actaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaatagaagc
ctgcctggcc tgattgggtg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tgggatgggc
actacccctg aggtgcatag catcttcctg gaaggccataccttcctggt gaggaatcat
aggcaggctt ctctggaaat ttctcccatc actttcctgactgctcagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagctctcaccagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgtcctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt caggtttgat
gatgacaata gcccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagact
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccctct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctataa gtctcagtac ctgaataatggcccccagag gattgggagg
aagtataaga aggtgaggtt tatggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggcctctagg ccctacaatatctaccctca tggcatcact
gatgtgagac ccctgtatag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagctcttttgtgaa catggagagg
gatctggcct ctgggctgat tggcccactg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgaa
aataggtctt ggtatctgac tgagaacatc cagaggtttctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt tcaggcctct aatatcatgcattctatcaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggctc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctggctatacttt caagcacaag
atggtgtatg aggacactct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgtct
atggaaaatc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaattctgacttcag gaataggggg
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaacactggggatta ctatgaggac
tcttatgaag atatctctgc ctatctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccactctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggagat gaagaaggag
gattttgaca tttatgatga ggatgagaac cagtctcccaggagcttcca gaagaagacc
aggcattact ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatgggatgag cagctctcct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgaccttc
aggaaccagg ctagcaggcc ttacagcttt tacagcagcctgatctctta tgaagaagac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaat tttgtgaagcctaatgagac caagacttat
ttttggaagg tgcagcatca catggctcct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcctactttt ctgatgtgga tctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccctctg
ctggtgtgcc atactaacac tctgaaccct gcccatgggaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcactat ttttgatgag accaagtcttggtatttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggctcc ctgcaacatc cagatggaagaccccacctt caaggagaac
tataggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggctctaatgagaa catccacagc
atccatttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tacaacctgt atcctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac tctgttcctg
gtgtatagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccatat cagggatttc
cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactat
tctggcagca tcaatgcctg gagcactaag gagcctttttcttggatcaa ggtggacctg
ctggccccta tgattattca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttctctagc
ctgtacatct ctcagttcat cattatgtat agcctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaata gcactggcac cctgatggtg ttttttgggaatgtggactc ttctgggatc
aagcacaaca tctttaaccc ccccatcatt gccaggtatattaggctgca ccccacccac
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa ttcttgctct
atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctcct agcaaggccaggctgcatct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gacctctatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccaccagtggac tctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aaccaggatagctttacccc tgtggtgaac
agcctggacc ctcctctgct gaccagatac ctgaggatccatcctcagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１０（配列番号１０）
atgcagattg agctgagcac ttgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttttctgct
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagtcttt tcctttcaac
acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggcccaccatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattaccct gaagaacatg gctagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct attggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac cagccagagg
gaaaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccatacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacttacagcta tctgagccat
gtggacctgg tgaaggatct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ctaaggagaa gactcagact ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgaag gcaagagctg gcactctgag accaagaactctctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcttg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattgggtg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcacag cattttcctg gagggccacaccttcctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctggggc agtttctgct gttctgccac atcagcagccatcagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ttgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gccccagctt catccagatt aggtctgtggccaagaagca ccctaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccccct ggtgctggct
cctgatgaca ggtcttataa gagccagtac ctgaacaatgggccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcttac actgatgagaccttcaagac tagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaacatttaccctca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggagactg cccaagggggtgaagcacct gaaggatttt
cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
accaagtctg atcccaggtg cctgactagg tactactcttcttttgtgaa tatggagagg
gatctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggagct ggtacctgac tgagaatatc cagaggttcctgcctaatcc tgctggggtc
cagctggagg atcctgagtt ccaggctagc aacattatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgattctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta catcctgtct
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttctctggctacacttt caagcataag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgtcataactctgacttcag aaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg atatctctgc ttatctgctg agcaagaataatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcactag gactaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagtcccccaggtctttcca gaagaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagcccc
catgtgctga ggaacagggc tcagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtcttc
caggagttca ctgatggctc ttttacccag cctctgtacagaggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgaccttc
agaaaccagg cctctaggcc ctacagcttc tacagcagcctgatctctta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca tatggcccct actaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcttattttt ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcactat ctttgatgag accaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagagaaatt gtagggctcc ctgcaatatc cagatggaggaccccacctt caaagaaaat
tacagattcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccctgcctgggct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggtctaatgagaa catccactct
atccatttct ctggccatgt gttcactgtg agaaagaaggaggagtataa gatggctctg
tacaacctgt acccaggggt gtttgagact gtggaaatgctgcccagcaa agctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gactcccctg ggcatggcctctgggcacat cagggatttt
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctggcagca ttaatgcttg gagcactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttctctagc
ctgtacattt ctcagttcat catcatgtac agcctggatgggaagaagtg gcagacctac
agggggaaca gcactgggac cctgatggtg ttctttggcaatgtggatag ctctggcatc
aagcacaata tcttcaatcc ccccattatt gccaggtacattaggctgca tcctactcac
tactctatta ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgacctgaa cagctgttct
atgcccctgg gcatggagtc taaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
ttcactaata tgtttgccac ctggagccct agcaaggccagactgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggccaccagtggac cctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aaccaggactctttcacccc tgtggtgaac
agcctggatc ctcccctgct gaccaggtac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcac
cagattgctc tgaggatgga agtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１１（配列番号１１）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttctctgct
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc taggttccct cccagggtgcccaagagctt cccctttaat
acctctgtgg tgtacaagaa aaccctgttt gtggagttcactgaccatct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctgggccccaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcattaccct gaagaacatg gcttctcaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctactctta tctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgcagggag
ggctctctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagtttattctgct gtttgctgtc
tttgatgagg gcaagagctg gcattctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaaaatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccacacctttctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat tagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa aaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaata gccccagctt tattcagatt aggtctgtggctaagaagca ccccaagact
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgcccctct ggtcctggcc
cctgatgata ggtcttacaa gagccagtat ctgaacaatggcccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggcc
attcagcatg agtctgggat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacactctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccttataacatctaccctca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtactc tagaaggctg cccaagggggtcaagcacct gaaggatttt
cccatcctgc ctggggagat tttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
accaagtctg accctaggtg cctgaccagg tactacagctcttttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccctctg ctgatttgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgag
aacaggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcctaaccc agctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aatattatgcatagcattaa tggctatgtg
tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg ttcttctctggctacacctt caagcataag
atggtgtatg aggacaccct gactctgttc cctttttctggggagactgt gtttatgagc
atggagaatc ctggcctgtg gatcctgggc tgccataattctgacttcag gaacaggggc
atgactgccc tgctgaaagt gagcagctgt gacaagaatactggggacta ctatgaagac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttcagccaga accccccagt gctgaagagg caccagagagagatcaccag gactaccctg
cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tttatgatga ggatgagaat cagagccccaggagcttcca gaagaagact
aggcactatt ttattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagctctccc
catgtgctga ggaatagggc ccagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatggcag ctttacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta tatcagggct gaggtggaggacaatattat ggtgaccttt
aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tatagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaat tttgtgaagcctaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcatca catggccccc accaaggatgagtttgactg caaggcttgg
gcctatttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag accaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggatcccacctt caaggagaac
tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacactctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggctctaatgagaa tatccatagc
atccacttct ctggccatgt gttcactgtc aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tataatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgagcac cctgtttctg
gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctgggcacat cagggatttc
cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctggcagca tcaatgcctg gtctaccaag gagcccttttcttggattaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatggcaaaaagtg gcagacctac
aggggcaata gcactgggac tctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctgggatc
aagcacaata tcttcaaccc tcccatcatt gctaggtacatcaggctgca ccccacccac
tatagcatca ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgcagc
atgcccctgg gcatggagtc caaagctatc tctgatgcccagattactgc cagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggtctccc tctaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aaaactatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaagtctctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggccaccagtggac tctgttcttc
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggacagcttcacccc tgtggtgaac
tctctggatc cccccctgct gaccaggtac ctgaggattcatccccagag ctgggtgcac
cagattgctc tgagaatgga ggtgctgggg tgtgaggctcaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１２（配列番号１２）
atgcagattg agctgtctac ttgttttttt ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt attacctggg ggctgtggag ctgagctgggattacatgca gtctgatctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagagctt ccccttcaac
acctctgtgg tgtataagaa gaccctgttt gtggagttcactgatcatct gtttaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaactatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcatcaccct gaagaatatg gccagccatcctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacttatagcta cctgtctcat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt ctgtagggaa
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagtttattctgct gtttgctgtg
tttgatgaag gcaagagctg gcactctgag accaagaattctctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg catactgtgaatggctatgt gaacagaagc
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtattggcatgtgat tgggatgggc
actacccctg aagtgcacag cattttcctg gagggccacactttcctggt gaggaaccac
aggcaggcct ctctggagat cagccccatt actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctgggcc agttcctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaataatgag
gaggctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgataata gccccagctt catccagatc aggtctgtggccaagaagca tcccaagacc
tgggtgcact atattgctgc tgaagaggag gactgggactatgcccctct ggtgctggct
cctgatgaca ggagctataa gagccagtat ctgaacaatgggccccagag gattgggagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat tctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacactctg
ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctacaatatttaccccca tggcatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggccct
accaagtctg accctaggtg tctgactagg tactacagcagctttgtgaa catggagaga
gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaacc agattatgtc tgataagagg aatgtcatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtatctgac tgagaacatt cagaggttcctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgcattctattaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta catcctgagc
attggggccc agactgactt tctgtctgtg tttttctctgggtacacctt caagcacaag
atggtctatg aggacaccct gaccctgttc cccttttctggggaaactgt gtttatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaactctgactttag gaataggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaatactggggatta ctatgaggac
agctatgagg atatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcctaggagc
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgata tttatgatga ggatgagaac cagagccccaggagcttcca gaagaagacc
aggcactatt tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagcccc
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggaattta ctgatggcag ctttacccag cccctgtacagaggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgaccttt
aggaaccagg cctctaggcc ctattctttt tacagcagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttttggaaag tgcagcacca catggccccc actaaggatgagtttgattg caaggcctgg
gcctatttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac tctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tctttaccat ctttgatgag actaagagctggtatttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagagcccc ttgcaacatc cagatggaggaccctacctt caaggagaac
tataggttcc atgccatcaa tgggtacatc atggataccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatggggagcaatgagaa cattcatagc
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtataa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac tctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagggacttc
cagattactg cctctgggca gtatgggcag tgggcccccaagctggccag gctgcactac
tctgggtcta tcaatgcttg gagcaccaag gagcctttcagctggatcaa ggtggatctg
ctggccccca tgatcattca tgggatcaag acccagggggccaggcagaa gttcagcagc
ctgtatattt ctcagttcat catcatgtat tctctggatggcaaaaagtg gcagacctat
agagggaaca gcactgggac cctgatggtg ttttttggcaatgtggatag ctctggcatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccattatt gccaggtacatcaggctgca ccccacccac
tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgctct
atgcctctgg ggatggaaag caaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctat
ttcaccaata tgtttgccac ttggagccct agcaaggctaggctgcatct gcagggcagg
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aagtgactgg ggtgaccacc cagggggtgaaaagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatggccaccagtggac cctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gtttcagggc aatcaggatagcttcacccc agtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccacccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１３（配列番号１３）
atgcagattg agctgagcac ctgctttttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgct
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttccc cccagggtgcccaagtcttt cccctttaac
acctctgtgg tgtataagaa gactctgttt gtggagttcactgatcacct gttcaatatt
gccaagccca ggcccccttg gatgggcctg ctgggccccactatccaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttcccaggg gggtctcacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgaccct ctgtgcctgacttatagcta cctgtctcat
gtggatctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
gggagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaatagcctgatgca ggacagggat
gctgcttctg ctagggcctg gcctaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattgggtg tcacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggg
actactccag aagtgcacag catcttcctg gaggggcacaccttcctggt gaggaatcac
aggcaggcca gcctggagat ttctcccatc actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctggggc agttcctgct gttctgccac atcagcagccatcagcatga tgggatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagcctcagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaact ctcccagctt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgctcccct ggtgctggct
cctgatgata ggagctacaa gagccagtat ctgaataatgggccccagag gattggcagg
aagtataaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagacctttaagac cagggaggct
attcagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctataacatctatcccca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cccaagggggtcaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgactagg tactacagcagctttgtgaa catggagaga
gatctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaagagtc tgtggatcag
aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacagaagct ggtacctgac tgagaacatt cagaggtttctgcccaaccc tgctggggtc
cagctggagg accctgagtt tcaggccagc aacatcatgcacagcatcaa tgggtatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctactggta tatcctgagc
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttctctggctacacttt caagcacaag
atggtgtatg aggataccct gaccctgttc cctttctctggggaaactgt gttcatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggg tgccacaattctgatttcag gaacagaggc
atgactgctc tgctgaaggt gtctagctgt gacaagaacactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaacaatgctattga acccaggtct
ttcagccaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcactag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatctctgtggagat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagcttcca gaagaagact
aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagccct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttt
caggagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtacaggggggagct gaatgagcat
ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggaggacaacatcat ggtgaccttc
agaaatcagg ctagcaggcc ctacagcttc tacagcagcctgatctctta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctat
ttctggaagg tgcagcacca catggccccc accaaggatgagtttgattg caaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcattctgggctgat tggccctctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaatcct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tctttactat ctttgatgag accaagtcttggtattttac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggagaac
tacagattcc atgccatcaa tggctacatt atggacactctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg tctatgggcagcaatgagaa cattcactct
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcctagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcctctggccacat cagagatttt
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggctcctaagctggccag gctgcactac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag actcagggggccaggcagaa gttctctagc
ctgtacatta gccagttcat catcatgtat agcctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaaca gcactgggac cctgatggtg ttctttgggaatgtggacag ctctgggatc
aagcacaata tcttcaaccc ccccattatt gccaggtatattaggctgca ccccactcac
tacagcatta ggagcaccct gaggatggag ctgatgggctgtgatctgaa cagctgcagc
atgcccctgg gcatggagtc taaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttac
ttcaccaaca tgtttgccac ttggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggatttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat cagctctagc caggatggccaccagtggac cctgttcttt
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggactctttcacccc tgtggtgaat
tctctggacc ctcccctgct gactaggtat ctgaggattcatccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１４（配列番号１４）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttttg cttttctgcc
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggattacatgca gtctgacctg
ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc ccaagggtgcccaagtcttt tcccttcaat
acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagtttactgatcatct gtttaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgattaccct gaagaatatg gccagccatcctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgtctt attggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac cagccagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggctctcacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcctatggc ctctgaccca ctgtgcctgacttacagcta tctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggg ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagacc ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
accacccctg aggtgcatag cattttcctg gagggccacaccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcta gcctggagat cagccccatc actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atctctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ttgtcctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gattctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gcccctcttt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggattatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggagctataa gtctcagtac ctgaacaatggcccccagag aattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctat actgatgagaccttcaaaac cagggaggcc
attcagcatg agtctggcat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggctagcagg ccttacaacatctaccccca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttt
cccattctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatgggccc
accaagtctg accccaggtg cctgactagg tactactctagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctgggctgat tggccccctg ctgatctgttacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaacc agatcatgtc tgataagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagagattcctgcccaaccc tgctggggtg
cagctggagg atcctgagtt ccaggccagc aacatcatgcattctatcaa tgggtatgtg
tttgatagcc tgcagctgtc tgtgtgtctg catgaggtggcctactggta cattctgagc
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacttt caaacacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gtttatgagc
atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgccacaactctgacttcag aaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gtcttcttgt gataagaacactggggacta ttatgaagac
agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaataatgctattga gcccaggtct
ttctctcaga acccccctgt gctgaagagg caccagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatttctgtggagat gaagaaggaa
gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagagccctaggagcttcca gaagaagact
aggcattact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag cagcagcccc
catgtgctga ggaatagggc tcagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtgttc
caggaattca ctgatggcag cttcactcag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctggggctgc tgggccctta catcagggct gaggtggaggacaatatcat ggtgaccttt
aggaaccagg cctctaggcc ttacagcttc tactctagcctgatctctta tgaagaggac
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac taagacttac
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc accaaggatgagtttgactg caaggcttgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctgggctgat tgggcccctg
ctggtgtgcc acactaacac tctgaatcct gcccatggcagacaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tttttaccat ctttgatgag actaagtcttggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggatcccacctt caaggagaac
tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggct
caggaccaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggcagcaatgagaa tatccactct
atccacttct ctgggcatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tataacctgt atcctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctggcatc
tggagagtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac tctgtttctg
gtgtatagca acaagtgtca gacccctctg ggcatggcctctgggcacat tagggacttt
cagatcactg cttctggcca gtatgggcag tgggctcccaagctggccag gctgcactat
tctggcagca ttaatgcctg gagcaccaag gagcctttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcatcca tgggatcaag acccagggggctaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagtttat catcatgtat tctctggatggcaagaagtg gcagacctac
aggggcaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttgggaatgtggatag ctctgggatc
aagcataata tcttcaatcc ccccattatt gctaggtatatcaggctgca ccccacccac
tatagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgacctgaa cagctgcagc
atgcccctgg gcatggagag caaggctatt tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
tttactaata tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccagactgcacct gcagggcagg
tctaatgcct ggaggcctca ggtgaataac cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aaaaccatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagtctctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggccaccagtggac cctgttcttt
cagaatggga aggtgaaggt cttccagggc aaccaggatagcttcacccc tgtggtgaat
agcctggatc ctcctctgct gaccaggtat ctgaggatccacccccagag ctgggtgcat
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggctcaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１５（配列番号１５）
atgcagattg agctgagcac ctgtttcttc ctgtgcctgctgaggttctg tttctctgcc
actaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcctaagagctt ccccttcaat
acttctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagtttactgaccacct gttcaacatt
gctaagccca ggcctccctg gatggggctg ctgggccccaccatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgattaccct gaagaacatg gcctctcatccagtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ctctgaaggg gctgagtatgatgaccagac cagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gcccaatggc ctctgacccc ctgtgcctgacttatagcta cctgagccat
gtggatctgg tgaaggacct gaattctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagagag
ggctctctgg ctaaggagaa gacccagact ctgcacaagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag actaagaatagcctgatgca ggacagggat
gctgcttctg ccagggcctg gcccaagatg catactgtgaatggctatgt gaacaggagc
ctgcctggcc tgattggctg tcacaggaaa tctgtctactggcatgtgat tgggatgggc
actacccctg aggtgcactc tatcttcctg gagggccataccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcca gcctggagat ctctcccatt accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gatctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagccaccagcatga tgggatggag
gcttatgtga aggtggatag ctgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaact ctcccagctt tattcagatc aggtctgtggctaagaagca ccccaagact
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggactatgcccctct ggtgctggct
cctgatgaca ggtcttacaa gtctcagtac ctgaataatggccctcagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgatcatct tcaagaatca ggccagcagg ccctacaacatctaccccca tggcatcact
gatgtgaggc cactgtacag caggaggctg cccaagggggtgaagcatct gaaggacttc
cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aaatggactgtgactgtgga ggatggccct
accaagtctg accccaggtg tctgaccagg tactacagcagctttgtgaa tatggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggagtc tgtggaccag
aggggcaatc agatcatgtc tgataagagg aatgtgattctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aatatcatgcacagcatcaa tggctatgtc
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta tattctgagc
attggggccc agactgattt cctgtctgtg ttcttttctggctatacctt taagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctgggctgtg gatcctgggc tgccacaactctgacttcag gaacaggggg
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gataagaacactggggacta ttatgaggac
agctatgagg acatctctgc ttacctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggtct
ttcagccaga atccccctgt gctgaagagg catcagagggagatcaccag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgattatgat gacactatctctgtggaaat gaagaaggag
gactttgaca tctatgatga ggatgagaac cagagccccaggagcttcca gaagaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggattatggcatgag cagctctccc
catgtgctga ggaacagagc ccagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtcttc
caggagttca ctgatggctc tttcacccag cccctgtacaggggggagct gaatgagcac
ctgggcctgc tggggcccta cattagggct gaggtggaggataacatcat ggtgactttc
agaaaccagg ccagcaggcc ttacagcttt tactcttctctgattagcta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctat
ttctggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatgagtttgactg caaggcttgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tgggcccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggagaat
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatt atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggatcaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggctctaatgagaa catccacagc
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggaatacaa gatggctctg
tataacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgagcac cctgttcctg
gtgtatagca ataagtgcca gacccccctg ggcatggcttctggccacat cagggatttc
cagatcactg cttctggcca gtatggccag tgggctcccaagctggctag gctgcattac
tctgggtcta tcaatgcctg gagcactaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccca tgatcattca tggcatcaag acccagggggctaggcagaa gttcagcagc
ctgtacatca gccagttcat cattatgtac agcctggatggcaagaagtg gcagacttac
aggggcaata gcactgggac tctgatggtg ttctttggcaatgtggactc ttctggcatc
aagcacaaca tcttcaaccc tcccatcatt gccaggtacattaggctgca ccctacccac
tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgatctgaa ctcttgcagc
atgcctctgg gcatggaaag caaagccatc tctgatgcccagatcactgc ctctagctat
ttcaccaata tgtttgccac ctggagccct agcaaggccaggctgcacct gcagggcaga
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatggccaccagtggac cctgttcttc
cagaatggca aggtgaaagt gttccagggc aaccaggatagcttcactcc tgtggtgaac
tctctggacc ctcccctgct gactaggtac ctgaggattcatccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggatctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１６（配列番号１６）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggag ctgtcttgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc cagtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagagctt tcctttcaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaatatt
gctaagccca ggccaccctg gatgggcctg ctgggccctaccattcaggc tgaggtgtat
gacactgtgg tgattactct gaagaatatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgtctt actggaaggc ctctgagggg gctgagtatgatgatcagac ttctcagagg
gagaaggagg atgataaggt gttccctggg ggctctcacacttatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ttctgatcca ctgtgcctgacctactctta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg ggaagagctg gcactctgag accaagaattctctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcctaagatg cacactgtgaatggctatgt gaacaggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
actacccctg aggtgcacag cattttcctg gagggccacaccttcctggt caggaaccat
aggcaggcct ctctggagat cagccccatc actttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac attagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggactc ttgccctgag gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaagctgagg attatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gattgggactatgctcccct ggtgctggct
cctgatgata ggagctacaa gtctcagtac ctgaataatggcccccagag gattggcagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagagaggct
atccagcatg agtctgggat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcaga ccctacaacatctaccccca tgggatcact
gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatgggccc
accaagtctg accctaggtg cctgactagg tactactctagctttgtgaa catggagagg
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatttgctacaaggagtc tgtggatcag
aggggcaatc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttctctgt gtttgatgag
aataggtctt ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcctgcctaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt tcaggccagc aacatcatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta tatcctgagc
attggggctc agactgactt cctgtctgtg ttcttttctggctacacttt taagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttttctggggagactgt gttcatgtct
atggagaacc ctgggctgtg gattctgggc tgtcacaactctgacttcag aaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gtctagctgt gacaagaatactggggacta ctatgaggac
agctatgagg acatttctgc ctatctgctg agcaagaacaatgccattga gcccaggagc
ttttctcaga atccccctgt gctgaagagg caccagagagagatcaccag gaccactctg
cagtctgatc aggaggagat tgattatgat gacactatctctgtggagat gaagaaagag
gactttgata tctatgatga ggatgagaat cagtctcccaggagcttcca gaagaagact
agacactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgag ctctagccct
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggg tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatggcag ctttacccag cccctgtataggggggagct gaatgagcat
ctgggcctgc tgggccccta tattagggct gaagtggaggacaacatcat ggtgaccttt
aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttt tacagcagcctgattagcta tgaggaggat
cagagacagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagcccaatgagac caagacctac
ttctggaagg tgcagcacca catggcccct accaaggatgagtttgactg caaggcctgg
gcttacttct ctgatgtgga cctggagaaa gatgtgcactctggcctgat tgggcccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatgggaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt ttttcaccat ctttgatgag accaagagctggtacttcac tgagaacatg
gagaggaact gcagggcccc ctgtaacatc cagatggaggatcctacttt caaggagaac
tacaggttcc atgccattaa tgggtacatc atggacaccctgcctgggct ggtgatggcc
caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg tctatgggctctaatgagaa catccactct
atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggccctg
tacaacctgt accctggggt gtttgaaact gtggagatgctgccctctaa agctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctggcatgagcac cctgttcctg
gtgtacagca ataagtgcca gactcccctg ggcatggcttctgggcacat cagggatttc
cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggcccccaagctggctag gctgcactac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttctcttggattaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcattca tggcatcaag acccagggggccaggcagaa gttttctagc
ctgtatatta gccagttcat catcatgtat agcctggatgggaagaagtg gcagacctac
agggggaata gcactggcac cctgatggtg ttttttggcaatgtggattc ttctggcatc
aagcataaca tcttcaatcc ccctatcatt gccaggtacattaggctgca tcccacccat
tactctatca ggagcaccct gaggatggag ctgatggggtgtgatctgaa cagctgtagc
atgcccctgg gcatggagtc caaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
tctaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat ctcttctagc caggatgggcatcagtggac cctgtttttt
cagaatggca aagtgaaggt gtttcagggg aatcaggacagctttacccc tgtggtgaac
agcctggatc ctcctctgct gactagatac ctgaggatccacccccagag ctgggtccac
cagattgctc tgaggatgga ggtgctgggg tgtgaggctcaggacctgta ctga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１７（配列番号１７）
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttt ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgcc
accaggaggt actacctggg ggctgtggaa ctgagctgggactatatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagggtgcccaagtcttt cccctttaac
acttctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagtttactgaccacct gttcaatatt
gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccaaccatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccaccctgtgagcct gcatgctgtg
ggggtgagct attggaaggc ttctgagggg gctgagtatgatgaccagac tagccagagg
gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg gggtctcatacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctgacctattctta cctgagccat
gtggacctgg tcaaggacct gaactctggc ctgattggggctctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggagaa gactcagact ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagagctg gcactctgag accaagaactctctgatgca ggatagggat
gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatggctatgt gaataggtct
ctgcctggcc tgattggctg ccataggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggc
actacccctg aggtgcactc tatcttcctg gaggggcacaccttcctggt gaggaaccac
aggcaggcca gcctggagat ctctcccatc accttcctgactgcccagac tctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccat atcagcagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggacag ctgcccagag gaaccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gccccagctt tattcagatc aggtctgtggccaagaagca ccccaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggattatgcccccct ggtgctggcc
cctgatgaca ggtcttacaa gtctcagtac ctgaacaatggcccccagag gattgggagg
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac actgatgagaccttcaagac cagggaggcc
atccagcatg agtctggcat cctggggccc ctgctgtatggggaggtggg ggataccctg
ctgattatct tcaagaacca ggctagcagg ccctataacatctaccccca tggcattact
gatgtgaggc ccctgtactc taggagactg cccaagggggtgaagcacct gaaagacttc
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
actaagtctg accccaggtg cctgaccagg tattacagcagctttgtgaa tatggagagg
gatctggctt ctggcctgat tgggcctctg ctgatttgctacaaggagtc tgtggatcag
agggggaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgattctgttctctgt gtttgatgag
aacaggagct ggtacctgac tgagaatatc cagaggttcctgcctaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggctagc aacattatgcacagcatcaa tggctatgtg
tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcttactggta cattctgtct
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggacactct gaccctgttc cccttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaatc ctgggctgtg gattctgggg tgccacaactctgatttcag gaacaggggc
atgactgccc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaacactggggatta ttatgaggac
agctatgagg acatttctgc ctacctgctg agcaagaacaatgccattga gcctaggagc
ttcagccaga atccccctgt gctgaagaga caccagagggagatcactag gaccactctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacaccatttctgtggagat gaagaaggag
gactttgata tttatgatga ggatgagaac cagagccccagaagcttcca gaagaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggattatggcatgtc ttctagcccc
catgtgctga ggaacagggc tcagtctggc tctgtgcctcagttcaagaa ggtggtgttc
caggagttca ctgatgggag cttcacccag cctctgtacaggggggagct gaatgaacat
ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggaggataatatcat ggtgactttc
aggaatcagg cctctaggcc ctacagcttc tactctagcctgatcagcta tgaggaggac
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaat tttgtgaaacccaatgagac caagacctac
ttttggaagg tgcagcacca catggcccct accaaggatgagtttgactg taaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcattctgggctgat tggccccctg
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtgac tgtgcaggag
tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgag actaagagctggtatttcac tgagaacatg
gagaggaact gtagggctcc ctgcaacatc cagatggaggatccaacttt caaggagaac
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggcc
caggaccaga ggattaggtg gtacctgctg agcatgggctctaatgagaa catccactct
atccacttct ctggccatgt gtttactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcctagcaa ggctggcatt
tggagagtgg agtgtctgat tggggagcac ctgcatgctgggatgtctac cctgttcctg
gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg gggatggcttctgggcacat cagagatttt
cagattactg cttctgggca gtatggccag tgggctcccaagctggccag actgcattac
tctggctcta ttaatgcttg gagcaccaag gagcctttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggctccca tgatcatcca tggcattaag actcagggggctaggcagaa gttcagcagc
ctgtatattt ctcagtttat tatcatgtat tctctggatggcaagaagtg gcagacttac
aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggcaatgtggacag ctctgggatc
aagcataaca tcttcaaccc ccccattatt gccaggtacatcaggctgca ccccacccac
tattctatca ggagcactct gaggatggag ctgatggggtgtgacctgaa cagctgctct
atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgcccagatcactgc cagctcttat
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcaga
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaat cctaaggagtggctgcaggt ggacttccag
aagactatga aggtgactgg ggtgactacc cagggggtgaagagcctgct gaccagcatg
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggatgggcatcagtggac cctgttcttc
cagaatggga aggtgaaggt gttccagggc aatcaggacagcttcacccc tgtggtgaac
agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccatccccagag ctgggtgcac
cagattgctc tgagaatgga ggtgctgggc tgtgaggcccaggacctgta ttga
ＦＶＩＩＩをコードするＣｐＧが低減した核酸変種Ｘ１８（配列番号１８）
atgcagattg agctgtctac ctgttttttt ctgtgcctgctgaggttctg cttctctgct
accaggaggt attatctggg ggctgtggag ctgagctgggactacatgca gtctgacctg
ggggagctgc ctgtggatgc caggtttcct cccagggtgcctaagagctt ccccttcaac
acctctgtgg tgtacaagaa gactctgttt gtggagttcactgaccacct gttcaacatt
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctgggccccactatccaggc tgaggtgtat
gatactgtgg tgattaccct gaagaacatg gcctctcaccctgtgtctct gcatgctgtg
ggggtgagct actggaaggc ttctgagggg gctgaatatgatgatcagac ctctcagagg
gagaaggagg atgacaaggt gtttcctggg ggcagccacacctatgtgtg gcaggtgctg
aaggagaatg ggcccatggc ctctgatccc ctgtgcctgacctacagcta cctgagccat
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattggggccctgctggt gtgcagggag
ggcagcctgg ccaaggaaaa gacccagacc ctgcataagttcatcctgct gtttgctgtg
tttgatgagg gcaagtcttg gcactctgag accaagaacagcctgatgca ggacagggat
gctgcctctg ctagggcctg gcccaagatg cacactgtgaatgggtatgt gaacagatct
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtactggcatgtgat tggcatgggg
accacccctg aggtgcatag catcttcctg gaggggcacaccttcctggt gagaaatcat
aggcaggcca gcctggagat tagccccatc accttcctgactgcccagac cctgctgatg
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atttctagccaccagcatga tggcatggag
gcctatgtga aggtggatag ctgccctgaa gagccccagctgaggatgaa gaacaatgag
gaggctgagg attatgatga tgatctgact gactctgagatggatgtggt gaggtttgat
gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtggccaagaagca ccctaagacc
tgggtgcact acattgctgc tgaagaggag gactgggactatgcccccct ggtgctggcc
ccagatgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaataatggcccccagag gattgggagg
aagtataaga aagtgaggtt catggcttac actgatgagacctttaagac tagggaggcc
attcagcatg agtctgggat tctgggccct ctgctgtatggggaggtggg ggacaccctg
ctgatcattt tcaagaacca ggccagcagg ccctataatatttatcccca tgggattact
gatgtcaggc ccctgtacag caggaggctg cctaagggggtgaagcacct gaaggacttc
cccattctgc ctggggagat cttcaagtat aagtggactgtgactgtgga ggatggcccc
accaagtctg atcctaggtg cctgaccagg tactatagcagctttgtgaa catggagagg
gacctggctt ctggcctgat tggccccctg ctgatctgctacaaggaatc tgtggaccag
aggggcaacc agattatgtc tgacaagagg aatgtgatcctgttttctgt gtttgatgag
aataggagct ggtatctgac tgagaacatc cagaggttcctgcccaatcc tgctggggtg
cagctggagg accctgagtt ccaggcttct aacatcatgcatagcatcaa tgggtatgtg
tttgactctc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtggcctattggta catcctgagc
attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctggctacacctt caagcacaag
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cctttctctggggagactgt gttcatgagc
atggagaacc ctggcctgtg gattctgggc tgccataattctgacttcag aaacaggggc
atgactgctc tgctgaaggt gagcagctgt gacaagaatactggggacta ctatgaggac
tcttatgagg atatttctgc ctacctgctg agcaagaacaatgctattga gcccaggagc
ttcagccaga acccccctgt cctgaagagg catcagagggagatcactag gaccaccctg
cagtctgatc aggaggagat tgactatgat gacactatctctgtggaaat gaagaaggag
gactttgata tctatgatga ggatgagaac cagagccccaggtctttcca gaagaagacc
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggactatggcatgtc tagcagcccc
catgtgctga ggaacagagc ccagtctggc tctgtgccccagttcaagaa ggtggtgttt
caggagttca ctgatgggag cttcactcag cccctgtataggggggagct gaatgagcat
ctgggcctgc tggggcccta catcagggct gaggtggaggataacatcat ggtgaccttc
aggaaccagg ccagcaggcc ctactctttc tactcttctctgatcagcta tgaggaggat
cagaggcagg gggctgagcc taggaagaac tttgtcaagcctaatgagac taagacctac
ttttggaagg tgcagcacca catggctccc actaaggatgagtttgattg caaggcctgg
gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcactctggcctgat tggccccctg
ctggtgtgtc acaccaatac cctgaaccct gcccatggcaggcaggtcac tgtgcaggag
tttgccctgt ttttcactat ctttgatgag actaagtcttggtacttcac tgagaacatg
gaaaggaatt gcagggctcc ctgcaacatc cagatggaggaccccacctt caaggagaac
tacaggtttc atgccatcaa tggctacatc atggacaccctgcctggcct ggtgatggct
caggatcaga ggattaggtg gtatctgctg agcatgggcagcaatgagaa catccacagc
atccactttt ctggccatgt gttcactgtg aggaagaaggaggagtacaa gatggctctg
tacaatctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgctgcccagcaa ggctgggatc
tggagggtgg agtgcctgat tggggaacac ctgcatgctggcatgtctac cctgttcctg
gtgtactcta acaagtgcca gactcccctg ggcatggcctctgggcacat cagggacttc
cagatcactg cctctgggca gtatggccag tgggcccctaagctggctag gctgcattac
tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttcagctggatcaa ggtggacctg
ctggccccta tgatcatcca tggcatcaag acccagggggccagacagaa gttctcttct
ctgtacatct ctcagttcat catcatgtac tctctggatggcaagaagtg gcagacctac
agggggaatt ctactggcac tctgatggtg ttctttgggaatgtggatag ctctgggatc
aagcataata ttttcaaccc ccccattatt gctaggtacatcaggctgca cccaacccac
tactctatta ggtctaccct gaggatggag ctgatgggctgtgacctgaa ctcttgtagc
atgcccctgg gcatggagag caaggctatc tctgatgcccagatcactgc cagcagctac
tttaccaaca tgtttgctac ttggagcccc agcaaggccaggctgcacct gcagggcagg
agcaatgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagtggctgcaggt ggattttcag
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccact cagggggtgaaaagcctgct gactagcatg
tatgtgaagg agtttctgat cagcagctct caggatggccatcagtggac cctgttcttc
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggatagcttcacccc tgtggtgaat
agcctggacc cccccctgct gaccaggtac ctgaggatccatccccagag ctgggtgcac
cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaagcccaggacctgta ctga
野生型第ＶＩＩＩ因子－ＢＤＤ ｃＤＮＡ（配列番号１９）
ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTTTGCGATTCTG CTTTAGTGCC
ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGGACTATATGCA AAGTGATCTC
GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT CCTAGAGTGCCAAAATCTTT TCCATTCAAC
ACCTCAGTCG TGTACAAAAA GACTCTGTTT GTAGAATTCACGGATCACCT TTTCAACATC
GCTAAGCCAA GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTACCATCCAGGC TGAGGTTTAT
GATACAGTGG TCATTACACT TAAGAACATG GCTTCCCATCCTGTCAGTCT TCATGCTGTT
GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATGATGATCAGAC CAGTCAAAGG
GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT GGAAGCCATACATATGTCTG GCAGGTCCTG
AAAGAGAATG GTCCAATGGC CTCTGACCCA CTGTGCCTTACCTACTCATA TCTTTCTCAT
GTGGACCTGG TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAGCCCTACTAGT ATGTAGAGAA
GGGAGTCTGG CCAAGGAAAA GACACAGACC TTGCACAAATTTATACTACT TTTTGCTGTA
TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACTCCTTGATGCA GGATAGGGAT
GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG CACACAGTCAATGGTTATGT AAACAGGTCT
CTGCCAGGTC TGATTGGATG CCACAGGAAA TCAGTCTATTGGCATGTGAT TGGAATGGGC
ACCACTCCTG AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACACATTTCTTGT GAGGAACCAT
CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTACTGCTCAAAC ACTCTTGATG
GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCCACCAACATGA TGGCATGGAA
GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG GAACCCCAACTACGAATGAA AAATAATGAA
GAAGCGGAAG ACTATGATGA TGATCTTACT GATTCTGAAATGGATGTGGT CAGGTTTGAT
GATGACAACT CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTGCCAAGAAGCA TCCTAAAACT
TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACTATGCTCCCTT AGTCCTCGCC
CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATGGCCCTCAGCG GATTGGTAGG
AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC ACAGATGAAACCTTTAAGAC TCGTGAAGCT
ATTCAGCATG AATCAGGAAT CTTGGGACCT TTACTTTATGGGGAAGTTGG AGACACACTG
TTGATTATAT TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CCATATAACATCTACCCTCA CGGAATCACT
GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTGTAAAACATTT GAAGGATTTT
CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAGTGACTGTAGA AGATGGGCCA
ACTAAATCAG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC TATTACTCTAGTTTCGTTAA TATGGAGAGA
GATCTAGCTT CAGGACTCAT TGGCCCTCTC CTCATCTGCTACAAAGAATC TGTAGATCAA
AGAGGAAACC AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCCTGTTTTCTGT ATTTGATGAG
AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTCTCCCCAATCC AGCTGGAGTG
CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGCACAGCATCAA TGGCTATGTT
TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG CATGAGGTGGCATACTGGTA CATTCTAAGC
ATTGGAGCAC AGACTGACTT CCTTTCTGTC TTCTTCTCTGGATATACCTT CAAACACAAA
ATGGTCTATG AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAGGAGAAACTGT CTTCATGTCG
ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACTCAGACTTTCG GAACAGAGGC
ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACACTGGTGATTA TTACGAGGAC
AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG AGTAAAAACAATGCCATTGA ACCAAGAAGC
TTCTCCCAAA ACCCACCAGT CTTGAAACGC CATCAACGGGAAATAACTCG TACTACTCTT
CAGTCAGATC AAGAGGAAAT TGACTATGAT GATACCATATCAGTTGAAAT GAAGAAGGAA
GATTTTGACA TTTATGATGA GGATGAAAAT CAGAGCCCCCGCAGCTTTCA AAAGAAAACA
CGACACTATT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG CTCTGGGATTATGGGATGAG TAGCTCCCCA
CATGTTCTAA GAAACAGGGC TCAGAGTGGC AGTGTCCCTCAGTTCAAGAA AGTTGTTTTC
CAGGAATTTA CTGATGGCTC CTTTACTCAG CCCTTATACCGTGGAGAACT AAATGAACAT
TTGGGACTCC TGGGGCCATA TATAAGAGCA GAAGTTGAAGATAATATCAT GGTAACTTTC
AGAAATCAGG CCTCTCGTCC CTATTCCTTC TATTCTAGCCTTATTTCTTA TGAGGAAGAT
CAGAGGCAAG GAGCAGAACC TAGAAAAAAC TTTGTCAAGCCTAATGAAAC CAAAACTTAC
TTTTGGAAAG TGCAACATCA TATGGCACCC ACTAAAGATGAGTTTGACTG CAAAGCCTGG
GCTTATTTCT CTGATGTTGA CCTGGAAAAA GATGTGCACTCAGGCCTGAT TGGACCCCTT
CTGGTCTGCC ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGAGACAAGTGAC AGTACAGGAA
TTTGCTCTGT TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCTGGTACTTCAC TGAAAATATG
GAAAGAAACT GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAGATCCCACTTT TAAAGAGAAT
TATCGCTTCC ATGCAATCAA TGGCTACATA ATGGATACACTACCTGGCTT AGTAATGGCT
CAGGATCAAA GGATTCGATG GTATCTGCTC AGCATGGGCAGCAATGAAAA CATCCATTCT
ATTCATTTCA GTGGACATGT GTTCACCGTA CGAAAAAAAGAGGAGTATAA AATGGCACTG
TACAATCTCT ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGTTACCATCCAA AGCTGGAATT
TGGCGGGTGG AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTGGGATGAGCAC ACTTTTTCTG
GTGTACAGCA ATAAGTGTCA GACTCCCCTG GGAATGGCTTCTGGACACAT TAGAGATTTT
CAGATTACAG CTTCAGGACA ATATGGACAG TGGGCCCCAAAGCTGGCCAG ACTTCATTAT
TCCGGATCAA TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTTCTTGGATCAA GGTGGATCTG
TTGGCACCAA TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTGCCCGTCAGAA GTTCTCCAGC
CTCTACATCT CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATGGGAAGAAGTG GCAGACTTAT
CGAGGAAATT CCACTGGAAC CTTAATGGTC TTCTTTGGCAATGTGGATTC ATCTGGGATA
AAACACAATA TTTTTAACCC TCCAATTATT GCTCGATACATCCGTTTGCA CCCAACTCAT
TATAGCATTC GCAGCACTCT TCGCATGGAG TTGATGGGCTGTGATTTAAA TAGTTGCAGC
ATGCCATTGG GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCACAGATTACTGC TTCATCCTAC
TTTACCAATA TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTCGACTTCACCT CCAAGGGAGG
AGTAATGCCT GGAGACCTCA GGTGAATAAT CCAAAAGAGTGGCTGCAAGT GGACTTCCAG
AAGACAATGA AAGTCACAGG AGTAACTACT CAGGGAGTAAAATCTCTGCT TACCAGCATG
TATGTGAAGG AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCCATCAGTGGAC TCTCTTTTTT
CAGAATGGCA AAGTAAAGGT TTTTCAGGGA AATCAAGACTCCTTCACACC TGTGGTGAAC
TCTCTAGACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTCACCCCCAGAG TTGGGTGCAC
CAGATTGCCC TGAGGATGGA GGTTCTGGGC TGCGAGGCACAGGACCTCTA CTGA
Ｖ３第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ（配列番号２０）
ATGCAGATTGAGCTGAGCACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGAGGTTCTGCTTCTCTGCCACCAGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCTGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCCTGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTCTTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTATGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAACAGCAGGCACCCCAGCACCAGGCAGAAGCAGTTCAATGCCACCACCATCCCTGAGAATGACATAGAGAAGACAGACCCATGGTTTGCCCACCGGACCCCCATGCCCAAGATCCAGAATGTGAGCAGCTCTGACCTGCTGATGCTGCTGAGGCAGAGCCCCACCCCCCATGGCCTGAGCCTGTCTGACCTGCAGGAGGCCAAGTATGAAACCTTCTCTGATGACCCCAGCCCTGGGGCCATTGACAGCAACAACAGCCTGTCTGAGATGACCCACTTCAGGCCCCAGCTGCACCACTCTGGGGACATGGTGTTCACCCCTGAGTCTGGCCTGCAGCTGAGGCTGAATGAGAAGCTGGGCACCACTGCTGCCACTGAGCTGAAGAAGCTGGACTTCAAAGTCTCCAGCACCAGCAACAACCTGATCAGCACCATCCCCTCTGACAACCTGGCTGCTGGCACTGACAACACCAGCAGCCTGGGCCCCCCCAGCATGCCTGTGCACTATGACAGCCAGCTGGACACCACCCTGTTTGGCAAGAAGAGCAGCCCCCTGACTGAGTCTGGGGGCCCCCTGAGCCTGTCTGAGGAGAACAATGACAGCAAGCTGCTGGAGTCTGGCCTGATGAACAGCCAGGAGAGCAGCTGGGGCAAGAATGTGAGCACCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCAGACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCATGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCACCTGCAGGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
ＣＯ３第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ（配列番号２１）
atgcagattg agctgtcaac ttgctttttc ctgtgcctgctgagattttg tttttccgct
actagaagat actacctggg ggctgtggaa ctgtcttgggattacatgca gagtgacctg
ggagagctgc cagtggacgc acgatttcca cctagagtccctaaatcatt ccccttcaac
accagcgtgg tctataagaa aacactgttc gtggagtttactgatcacct gttcaacatc
gctaagcctc ggccaccctg gatgggactg ctgggaccaacaatccaggc agaggtgtac
gacaccgtgg tcattacact gaaaaacatg gcctcacaccccgtgagcct gcatgctgtg
ggcgtcagct actggaaggc ttccgaaggg gcagagtatgacgatcagac ttcccagaga
gaaaaagagg acgataaggt gtttcctggc gggtctcatacctatgtgtg gcaggtcctg
aaagagaatg gccccatggc ttccgaccct ctgtgcctgacctactctta tctgagtcac
gtggacctgg tcaaggatct gaacagcgga ctgatcggagcactgctggt gtgtagggaa
gggagcctgg ctaaggagaa aacccagaca ctgcataagttcattctgct gttcgccgtg
tttgacgaag gaaaatcatg gcacagcgag acaaagaatagtctgatgca ggaccgggat
gccgcttcag ccagagcttg gcccaaaatg cacactgtgaacggctacgt caatcgctca
ctgcctggac tgatcggctg ccaccgaaag agcgtgtattggcatgtcat cggaatgggc
accacacctg aagtgcactc cattttcctg gaggggcatacctttctggt ccgcaaccac
cgacaggcct ccctggagat ctctccaatt accttcctgacagctcagac tctgctgatg
gatctgggac agttcctgct gttttgccac atcagctcccaccagcatga tggcatggag
gcctacgtga aagtggacag ctgtcccgag gaacctcagctgaggatgaa gaacaatgag
gaagctgaag actatgacga tgacctgacc gactccgagatggatgtggt ccgattcgat
gacgataaca gcccctcctt tatccagatt agatctgtggccaagaaaca ccctaagaca
tgggtccatt acatcgcagc cgaggaagag gactgggattatgcaccact ggtgctggca
ccagacgatc gatcctacaa atctcagtat ctgaacaatggaccacagcg gattggcaga
aagtacaaga aagtgaggtt catggcttat accgatgaaaccttcaagac tcgcgaagca
atccagcacg agagcgggat tctgggacca ctgctgtacggagaagtggg ggacaccctg
ctgatcattt ttaagaacca ggccagcagg ccttacaatatctatccaca tggaattaca
gatgtgcgcc ctctgtacag ccggagactg ccaaagggcgtcaaacacct gaaggacttc
ccaatcctgc ccggggaaat ttttaagtat aaatggactgtcaccgtcga ggatggcccc
actaagagcg accctaggtg cctgacccgc tactattctagtttcgtgaa tatggaaagg
gatctggcca gcggactgat cggcccactg ctgatttgttacaaagagag cgtggatcag
agaggcaacc agatcatgtc cgacaagagg aatgtgattctgttcagtgt ctttgacgaa
aaccggtcat ggtatctgac cgagaacatc cagagattcctgcctaatcc agccggagtg
cagctggaag atcctgagtt tcaggcttct aacatcatgcatagtattaa tggctacgtg
ttcgacagtc tgcagctgtc agtgtgtctg cacgaggtcgcttactggta tatcctgagc
attggagcac agacagattt cctgagcgtg ttcttttccggctacacttt taagcataaa
atggtgtatg aggacacact gactctgttc cccttcagcggcgaaaccgt gtttatgtcc
atggagaatc ccgggctgtg gatcctggga tgccacaacagcgatttcag gaatcgcggg
atgactgccc tgctgaaagt gtcaagctgt gacaagaacaccggagacta ctatgaagat
tcatacgagg acatcagcgc atatctgctg tccaaaaacaatgccattga acccaggtct
tttagtcaga atcctccagt gctgaagagg caccagcgcgagatcacccg cactaccctg
cagagtgatc aggaagagat cgactacgac gatacaatttctgtggaaat gaagaaagag
gacttcgata tctatgacga agatgagaac cagagtcctcgatcattcca gaagaaaacc
cggcattact ttattgctgc agtggagcgc ctgtgggattatggcatgtc ctctagtcct
cacgtgctgc gaaatcgggc ccagtcaggg agcgtcccacagttcaagaa agtggtcttc
caggagttta cagacggatc ctttactcag ccactgtaccggggcgaact gaacgagcac
ctggggctgc tgggacccta tatcagagct gaagtggaggataacattat ggtcaccttc
agaaatcagg catctaggcc ttacagtttt tattcaagcctgatctctta cgaagaggac
cagaggcagg gagcagaacc acgaaaaaac ttcgtgaagcctaatgagac caaaacatac
ttttggaagg tgcagcacca tatggcccca acaaaagacgaattcgattg caaggcatgg
gcctattttt ctgacgtgga tctggagaag gacgtccacagtggcctgat cgggccactg
ctggtgtgtc atactaacac cctgaatccc gcacacggcaggcaggtcac tgtccaggaa
ttcgccctgt tctttaccat ctttgatgag acaaaaagctggtacttcac cgaaaacatg
gagcgaaatt gccgggctcc atgtaatatt cagatggaagaccccacatt caaggagaac
taccgctttc atgccatcaa tgggtatatt atggatactctgcccggact ggtcatggct
caggaccaga gaatcaggtg gtacctgctg agcatggggtccaacgagaa tatccactca
attcatttca gcggacacgt gtttactgtc cggaagaaagaagagtataa aatggccctg
tacaacctgt atcccggcgt gttcgaaacc gtcgagatgctgcctagcaa ggcagggatc
tggagagtgg aatgcctgat tggggagcac ctgcatgccggaatgtctac cctgtttctg
gtgtacagta ataagtgtca gacacccctg gggatggcttccggacatat ccgggatttc
cagattaccg catctggaca gtacggccag tgggcccctaagctggctag actgcactat
tccgggtcta tcaacgcttg gtccacaaaa gagcctttctcttggattaa ggtggacctg
ctggcaccaa tgatcattca tggcatcaaa actcagggggccaggcagaa gttctcctct
ctgtacatct cacagtttat catcatgtac agcctggatggcaagaaatg gcagacatac
cgcggcaata gcacagggac tctgatggtg ttctttggcaacgtggacag ttcagggatc
aagcacaaca ttttcaatcc ccctatcatt gctagatacatcaggctgca cccaacccat
tattctattc gaagtacact gcggatggaa ctgatggggtgcgatctgaa cagttgttca
atgcccctgg gaatggagtc caaggcaatc tctgacgcccagattaccgc tagctcctac
ttcactaata tgtttgctac ctggagcccc tccaaagcacgactgcatct gcagggacga
agcaacgcat ggcgaccaca ggtgaacaat cccaaggagtggctgcaggt cgattttcag
aaaactatga aggtgaccgg agtcacaact cagggcgtgaaaagtctgct gacctcaatg
tacgtcaagg agttcctgat ctctagttca caggacggccaccagtggac actgttcttt
cagaacggaa aggtgaaagt cttccagggc aatcaggattcctttacacc tgtggtcaac
tctctggacc cacccctgct gactcgctac ctgcgaatccacccacagtc ctgggtgcat
cagattgcac tgagaatgga agtcctgggc tgcgaggcccaggacctgta ttga
変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ＣｐＧが低減した第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、ポリＡ及びＩＴＲを含む全長カセット（配列番号２３）
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgcccgggcaaag cccgggcgtc
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagcgcgcagagag ggagtggcca
actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcacatttcgtagag cgagtgttcc
gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttaggttacttatt ctccttttgt
tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcagcttggcaggg atcagcagcc
tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccaggagaagccgtca cacagatcca
caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccgcgggcctggc ctctttacgg
gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacatccactttttc tttttctcca
caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctgcttcttcctg tgtctgctga
ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggctgtggagctg agctgggact
atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctaggttccccccc agggtgccca
agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagaccctgtttgtg gagttcactg
accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggatggggctgctg gggcccacca
tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaagaacatggcc agccaccctg
tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcttctgagggggct gagtatgatg
accagactag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtttcctgggggc agccatacct
atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctctgaccccctg tgcctgacct
acagctacct gtctcatgtg gacctggtga aggacctgaactctggcctg attggggctc
tgctggtgtg tagggagggc agcctggcta aggaaaagacccagaccctg cataagttta
tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggcactctgagacc aagaacagcc
tgatgcagga tagggatgct gcctctgcca gggcttggcctaagatgcac actgtgaatg
ggtatgtgaa taggagcctg cctggcctga ttggctgccacaggaagtct gtgtactggc
atgtgattgg gatgggcacc acccctgagg tccatagcatcttcctggag ggccacactt
tcctggtgag gaaccacaga caggcctctc tggagatctctcccatcacc ttcctgactg
ctcagactct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgttttgccatatt agcagccacc
agcatgatgg gatggaggcc tatgtgaagg tggatagctgccctgaggag cctcagctga
ggatgaagaa caatgaggag gctgaagact atgatgatgacctgactgat tctgagatgg
atgtggtgag gtttgatgat gacaatagcc ccagcttcattcagatcagg tctgtggcca
agaaacaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctgaggaagaggac tgggactatg
ctcccctggt gctggcccct gatgataggt cttataagagccagtacctg aacaatgggc
cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tgaggttcatggcctacact gatgaaacct
tcaaaaccag ggaggccatt cagcatgagt ctggcatcctgggccctctg ctgtatgggg
aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggccagcaggccc tacaacatct
atcctcatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcaggaggctgccc aagggggtga
agcacctgaa agacttcccc atcctgcctg gggagatctttaagtataag tggactgtga
ctgtggagga tggccctacc aagtctgacc ccaggtgtctgaccaggtac tattctagct
ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgggcccctgctg atctgctaca
aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctgacaagaggaat gtgatcctgt
tttctgtgtt tgatgagaat aggagctggt acctgactgagaacatccag aggtttctgc
ccaatcctgc tggggtgcag ctggaggatc ctgagttccaggccagcaat atcatgcata
gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgtgtgcctgcat gaggtggcct
actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgactttctgtctgtgttc ttttctggct
ataccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg ataccctgaccctgttcccc ttctctgggg
agactgtgtt catgagcatg gagaatcctg ggctgtggatcctggggtgc cacaactctg
attttaggaa cagggggatg actgccctgc tgaaggtgtctagctgtgat aagaacactg
gggactacta tgaggacagc tatgaggaca tttctgcttatctgctgtct aagaataatg
ccattgagcc cagaagcttc agccagaatc cccctgtgctgaagagacat cagagggaga
tcaccagaac taccctgcag tctgatcagg aggagattgactatgatgac actatctctg
tggagatgaa gaaggaggac tttgacatct atgatgaggatgagaatcag tctcccagga
gctttcagaa gaagaccaga cattacttca ttgctgctgtggagaggctg tgggactatg
gcatgagctc tagccctcat gtgctgagga acagggcccagtctggctct gtgccccagt
tcaagaaggt ggtgttccag gaattcactg atggcagcttcacccagccc ctgtacaggg
gggagctgaa tgagcacctg ggcctgctgg ggccttatatcagggctgag gtggaggata
atattatggt gactttcagg aaccaggcca gcaggccctactctttctat agcagcctga
tctcttatga ggaggatcag aggcaggggg ctgagcctaggaagaacttt gtgaagccca
atgagactaa gacctacttc tggaaggtcc agcaccacatggcccctacc aaggatgagt
ttgactgcaa ggcctgggcc tatttctctg atgtggatctggagaaggat gtccattctg
ggctgattgg ccccctgctg gtgtgccaca ctaacactctgaatcctgcc catggcaggc
aggtgactgt ccaggagttt gccctgttct tcactatctttgatgagacc aagagctggt
actttactga gaacatggag aggaactgca gagctccttgcaatattcag atggaggacc
ccaccttcaa ggagaattac aggttccatg ccattaatgggtacatcatg gacaccctgc
ctggcctggt gatggctcag gaccagagga tcaggtggtacctgctgagc atgggctcta
atgagaatat ccacagcatc cacttctctg ggcatgtgttcactgtgagg aagaaggagg
agtacaagat ggctctgtat aatctgtacc ctggggtgtttgaaactgtg gagatgctgc
cctctaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattggggagcacctg catgctggca
tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagacccccctgggc atggcctctg
gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagtatggccagtgg gcccccaagc
tggccaggct gcactattct ggcagcatca atgcctggagcaccaaggag cccttcagct
ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcattcatggcatcaagacc cagggggcca
ggcagaagtt cagctctctg tacatctctc agttcatcatcatgtactct ctggatggga
agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccctgatggtgttc tttgggaatg
tggactcttc tggcatcaag cacaacatct tcaatccccccatcattgct aggtatatta
ggctgcatcc cacccactac agcatcaggt ctaccctgaggatggagctg atgggctgtg
acctgaactc ttgcagcatg cccctgggca tggagtctaaggccatctct gatgcccaga
ttactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctggagcccctct aaggccaggc
tgcatctgca ggggaggagc aatgcctgga ggcctcaggtgaacaacccc aaggagtggc
tgcaggtgga tttccagaag accatgaagg tgactggggtgaccacccag ggggtcaaga
gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcagcagcagccag gatggccacc
agtggactct gttctttcag aatgggaagg tgaaggtgtttcagggcaat caggactctt
tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgaccagatacctg aggatccacc
cccagtcttg ggtgcatcag attgccctga ggatggaggtgctgggctgt gaggctcagg
atctgtactg agcggccgca ataaaagatc agagctctagagatctgtgt gttggttttt
tgtgtaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctctctgcgcgctc gctcgctcac
tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggctttgcccgggcgg cctcagtgag
cgagcgagcg cgcagctgcc tgcagg
変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ＣｐＧが低減した第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ、ポリＡ及びＩＴＲを含む全長プラスミド（配列番号２４）
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgcccgggcaaag cccgggcgtc
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagcgcgcagagag ggagtggcca
actccatcac taggggttcc tacgcgtgtc tgtctgcacatttcgtagag cgagtgttcc
gatactctaa tctccctagg caaggttcat attgacttaggttacttatt ctccttttgt
tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcagcttggcaggg atcagcagcc
tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccaggagaagccgtca cacagatcca
caagctcctg ctagcaggta agtgccgtgt gtggttcccgcgggcctggc ctctttacgg
gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactg acactgacatccactttttc tttttctcca
caggtttaaa cgccaccatg cagattgagc tgagcacctgcttcttcctg tgtctgctga
ggttctgctt ctctgccacc aggaggtatt acctgggggctgtggagctg agctgggact
atatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgctaggttccccccc agggtgccca
agagcttccc ctttaacact tctgtggtgt acaagaagaccctgtttgtg gagttcactg
accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggatggggctgctg gggcccacca
tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaagaacatggcc agccaccctg
tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcttctgagggggct gagtatgatg
accagactag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtttcctgggggc agccatacct
atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctctgaccccctg tgcctgacct
acagctacct gtctcatgtg gacctggtga aggacctgaactctggcctg attggggctc
tgctggtgtg tagggagggc agcctggcta aggaaaagacccagaccctg cataagttta
tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggcactctgagacc aagaacagcc
tgatgcagga tagggatgct gcctctgcca gggcttggcctaagatgcac actgtgaatg
ggtatgtgaa taggagcctg cctggcctga ttggctgccacaggaagtct gtgtactggc
atgtgattgg gatgggcacc acccctgagg tccatagcatcttcctggag ggccacactt
tcctggtgag gaaccacaga caggcctctc tggagatctctcccatcacc ttcctgactg
ctcagactct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgttttgccatatt agcagccacc
agcatgatgg gatggaggcc tatgtgaagg tggatagctgccctgaggag cctcagctga
ggatgaagaa caatgaggag gctgaagact atgatgatgacctgactgat tctgagatgg
atgtggtgag gtttgatgat gacaatagcc ccagcttcattcagatcagg tctgtggcca
agaaacaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctgaggaagaggac tgggactatg
ctcccctggt gctggcccct gatgataggt cttataagagccagtacctg aacaatgggc
cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tgaggttcatggcctacact gatgaaacct
tcaaaaccag ggaggccatt cagcatgagt ctggcatcctgggccctctg ctgtatgggg
aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggccagcaggccc tacaacatct
atcctcatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcaggaggctgccc aagggggtga
agcacctgaa agacttcccc atcctgcctg gggagatctttaagtataag tggactgtga
ctgtggagga tggccctacc aagtctgacc ccaggtgtctgaccaggtac tattctagct
ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgggcccctgctg atctgctaca
aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctgacaagaggaat gtgatcctgt
tttctgtgtt tgatgagaat aggagctggt acctgactgagaacatccag aggtttctgc
ccaatcctgc tggggtgcag ctggaggatc ctgagttccaggccagcaat atcatgcata
gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgtgtgcctgcat gaggtggcct
actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgactttctgtctgtgttc ttttctggct
ataccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg ataccctgaccctgttcccc ttctctgggg
agactgtgtt catgagcatg gagaatcctg ggctgtggatcctggggtgc cacaactctg
attttaggaa cagggggatg actgccctgc tgaaggtgtctagctgtgat aagaacactg
gggactacta tgaggacagc tatgaggaca tttctgcttatctgctgtct aagaataatg
ccattgagcc cagaagcttc agccagaatc cccctgtgctgaagagacat cagagggaga
tcaccagaac taccctgcag tctgatcagg aggagattgactatgatgac actatctctg
tggagatgaa gaaggaggac tttgacatct atgatgaggatgagaatcag tctcccagga
gctttcagaa gaagaccaga cattacttca ttgctgctgtggagaggctg tgggactatg
gcatgagctc tagccctcat gtgctgagga acagggcccagtctggctct gtgccccagt
tcaagaaggt ggtgttccag gaattcactg atggcagcttcacccagccc ctgtacaggg
gggagctgaa tgagcacctg ggcctgctgg ggccttatatcagggctgag gtggaggata
atattatggt gactttcagg aaccaggcca gcaggccctactctttctat agcagcctga
tctcttatga ggaggatcag aggcaggggg ctgagcctaggaagaacttt gtgaagccca
atgagactaa gacctacttc tggaaggtcc agcaccacatggcccctacc aaggatgagt
ttgactgcaa ggcctgggcc tatttctctg atgtggatctggagaaggat gtccattctg
ggctgattgg ccccctgctg gtgtgccaca ctaacactctgaatcctgcc catggcaggc
aggtgactgt ccaggagttt gccctgttct tcactatctttgatgagacc aagagctggt
actttactga gaacatggag aggaactgca gagctccttgcaatattcag atggaggacc
ccaccttcaa ggagaattac aggttccatg ccattaatgggtacatcatg gacaccctgc
ctggcctggt gatggctcag gaccagagga tcaggtggtacctgctgagc atgggctcta
atgagaatat ccacagcatc cacttctctg ggcatgtgttcactgtgagg aagaaggagg
agtacaagat ggctctgtat aatctgtacc ctggggtgtttgaaactgtg gagatgctgc
cctctaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattggggagcacctg catgctggca
tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagacccccctgggc atggcctctg
gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagtatggccagtgg gcccccaagc
tggccaggct gcactattct ggcagcatca atgcctggagcaccaaggag cccttcagct
ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcattcatggcatcaagacc cagggggcca
ggcagaagtt cagctctctg tacatctctc agttcatcatcatgtactct ctggatggga
agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccctgatggtgttc tttgggaatg
tggactcttc tggcatcaag cacaacatct tcaatccccccatcattgct aggtatatta
ggctgcatcc cacccactac agcatcaggt ctaccctgaggatggagctg atgggctgtg
acctgaactc ttgcagcatg cccctgggca tggagtctaaggccatctct gatgcccaga
ttactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctggagcccctct aaggccaggc
tgcatctgca ggggaggagc aatgcctgga ggcctcaggtgaacaacccc aaggagtggc
tgcaggtgga tttccagaag accatgaagg tgactggggtgaccacccag ggggtcaaga
gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcagcagcagccag gatggccacc
agtggactct gttctttcag aatgggaagg tgaaggtgtttcagggcaat caggactctt
tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgaccagatacctg aggatccacc
cccagtcttg ggtgcatcag attgccctga ggatggaggtgctgggctgt gaggctcagg
atctgtactg agcggccgca ataaaagatc agagctctagagatctgtgt gttggttttt
tgtgtaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctctctgcgcgctc gctcgctcac
tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggctttgcccgggcgg cctcagtgag
cgagcgagcg cgcagctgcc tgcaggggca gcttgaaggaaatactaagg caaaggtact
gcaagtgctc gcaacattcg cttatgcgga ttattgccgtagtgccgcga cgccgggggc
aagatgcaga gattgccatg gtacaggccg tgcggttgatattgccaaaa cagagctgtg
ggggagagtt gtcgagaaag agtgcggaag atgcaaaggcgtcggctatt caaggatgcc
agcaagcgca gcatatcgcg ctgtgacgat gctaatcccaaaccttaccc aacccacctg
gtcacgcact gttaagccgc tgtatgacgc tctggtggtgcaatgccaca aagaagagtc
aatcgcagac aacattttga atgcggtcac acgttagcagcatgattgcc acggatggca
acatattaac ggcatgatat tgacttattg aataaaattgggtaaatttg actcaacgat
gggttaattc gctcgttgtg gtagtgagat gaaaagaggcggcgcttact accgattccg
cctagttggt cacttcgacg tatcgtctgg aactccaaccatcgcaggca gagaggtctg
caaaatgcaa tcccgaaaca gttcgcaggt aatagttagagcctgcataa cggtttcggg
attttttata tctgcacaac aggtaagagc attgagtcgataatcgtgaa gagtcggcga
gcctggttag ccagtgctct ttccgttgtg ctgaattaagcgaataccgg aagcagaacc
ggatcaccaa atgcgtacag gcgtcatcgc cgcccagcaacagcacaacc caaactgagc
cgtagccact gtctgtcctg aattcattag taatagttacgctgcggcct tttacacatg
accttcgtga aagcgggtgg caggaggtcg cgctaacaacctcctgccgt tttgcccgtg
catatcggtc acgaacaaat ctgattacta aacacagtagcctggatttg ttctatcagt
aatcgacctt attcctaatt aaatagagca aatccccttattgggggtaa gacatgaaga
tgccagaaaa acatgacctg ttggccgcca ttctcgcggcaaaggaacaa ggcatcgggg
caatccttgc gtttgcaatg gcgtaccttc gcggcagatataatggcggt gcgtttacaa
aaacagtaat cgacgcaacg atgtgcgcca ttatcgcctagttcattcgt gaccttctcg
acttcgccgg actaagtagc aatctcgctt atataacgagcgtgtttatc ggctacatcg
gtactgactc gattggttcg cttatcaaac gcttcgctgctaaaaaagcc ggagtagaag
atggtagaaa tcaataatca acgtaaggcg ttcctcgatatgctggcgtg gtcggaggga
actgataacg gacgtcagaa aaccagaaat catggttatgacgtcattgt aggcggagag
ctatttactg attactccga tcaccctcgc aaacttgtcacgctaaaccc aaaactcaaa
tcaacaggcg ccggacgcta ccagcttctt tcccgttggtgggatgccta ccgcaagcag
cttggcctga aagacttctc tccgaaaagt caggacgctgtggcattgca gcagattaag
gagcgtggcg ctttacctat gattgatcgt ggtgatatccgtcaggcaat cgaccgttgc
agcaatatct gggcttcact gccgggcgct ggttatggtcagttcgagca taaggctgac
agcctgattg caaaattcaa agaagcgggc ggaacggtcagagagattga tgtatgagca
gagtcaccgc gattatctcc gctctggtta tctgcatcatcgtctgcctg tcatgggctg
ttaatcatta ccgtgataac gccattacct acaaagcccagcgcgacaaa aatgccagag
aactgaagct ggcgaacgcg gcaattactg acatgcagatgcgtcagcgt gatgttgctg
cgctcgatgc aaaatacacg aaggagttag ctgatgctaaagctgaaaat gatgctctgc
gtgatgatgt tgccgctggt cgtcgtcggt tgcacatcaaagcagtctgt cagtcagtgc
gtgaagccac caccgcctcc ggcgtggata atgcagcctccccccgactg gcagacaccg
ctgaacggga ttatttcacc ctcagagaga ggctgatcactatgcaaaaa caactggaag
gaacccagaa gtatattaat gagcagtgca gatagagttgcccatatcga tgggcaactc
atgcaattat tgtgagcaat acacacgcgc ttccagcggagtataaatgc ctaaagtaat
aaaaccgagc aatccattta cgaatgtttg ctgggtttctgttttaacaa cattttctgc
gccgccacaa attttggctg catcgacagt tttcttctgcccaattccag aaacgaagaa
atgatgggtg atggtttcct ttggtgctac tgctgccggtttgttttgaa cagtaaacgt
ctgttgagca catcctgtaa taagcagggc cagcgcagtagcgagtagca tttttttcat
ggtgttattc ccgatgcttt ttgaagttcg cagaatcgtatgtgtagaaa attaaacaaa
ccctaaacaa tgagttgaaa tttcatattg ttaatatttattaatgtatg tcaggtgcga
tgaatcgtca ttgtattccc ggattaacta tgtccacagccctgacgggg aacttctctg
cgggagtgtc cgggaataat taaaacgatg cacacagggtttagcgcgta cacgtattgc
attatgccaa cgccccggtg ctgacacgga agaaaccggacgttatgatt tagcgtggaa
agatttgtgt agtgttctga atgctctcag taaatagtaatgaattatca aaggtatagt
aatatctttt atgttcatgg atatttgtaa cccatcggaaaactcctgct ttagcaagat
tttccctgta ttgctgaaat gtgatttctc ttgatttcaacctatcatag gacgtttcta
taagatgcgt gtttcttgag aatttaacat ttacaacctttttaagtcct tttattaaca
cggtgttatc gttttctaac acgatgtgaa tattatctgtggctagatag taaatataat
gtgagacgtt gtgacgtttt agttcagaat aaaacaattcacagtctaaa tcttttcgca
cttgatcgaa tatttcttta aaaatggcaa cctgagccattggtaaaacc ttccatgtga
tacgagggcg cgtagtttgc attatcgttt ttatcgtttcaatctggtct gacctccttg
tgttttgttg atgatttatg tcaaatatta ggaatgttttcacttaatag tattggttgc
gtaacaaagt gcggtcctgc tggcattctg gagggaaatacaaccgacag atgtatgtaa
ggccaacgtg ctcaaatctt catacagaaa gatttgaagtaatattttaa ccgctagatg
aagagcaagc gcatggagcg acaaaatgaa taaagaacaatctgctgatg atccctccgt
ggatctgatt cgtgtaaaaa atatgcttaa tagcaccatttctatgagtt accctgatgt
tgtaattgca tgtatagaac ataaggtgtc tctggaagcattcagagcaa ttgaggcagc
gttggtgaag cacgataata atatgaagga ttattccctggtggttgact gatcaccata
actgctaatc attcaaacta tttagtctgt gacagagccaacacgcagtc tgtcactgtc
aggaaagtgg taaaactgca actcaattac tgcaatgccctcgtaattaa gtgaatttac
aatatcgtcc tgttcggagg gaagaacgcg ggatgttcattcttcatcac ttttaattga
tgtatatgct ctcttttctg acgttagtct ccgacggcaggcttcaatga cccaggctga
gaaattcccg gacccttttt gctcaagagc gatgttaatttgttcaatca tttggttagg
aaagcggatg ttgcgggttg ttgttctgcg ggttctgttcttcgttgaca tgaggttgcc
ccgtattcag tgtcgctgat ttgtattgtc tgaagttgtttttacgttaa gttgatgcag
atcaattaat acgatacctg cgtcataatt gattatttgacgtggtttga tggcctccac
gcacgttgtg atatgtagat gataatcatt atcactttacgggtcctttc cggtgatccg
acaggttacg gggcggcgac ctgcctgatg cggtattttctccttacgca tctgtgcggt
atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgccctgtagcggc gcattaagcg
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacacttgccagcgcc ttagcgcccg
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgccggctttccc cgtcaagctc
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgctttacggcacctc gaccccaaaa
aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgccctgatagacg gtttttcgcc
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactcttgttccaaact ggaacaacac
tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tagacctgcaggcatgcaag cttggcactg
gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcgttacccaact taatcgcctt
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaagaggcccgcac cgatcgccct
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgcgatttattcaacaaagc cgccgtcccg
tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaattaaccaattctg attagaaaaa
ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatcaggattatcaa taccatattt
ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccgaggcagttcc ataggatggc
aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaacatcaatacaac ctattaattt
cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcaccatgagtgacga ctgaatccgg
tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgttcaacaggcc agccattacg
ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattcattcgtgatt gcgcctgagc
gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaaacaggaatcg aatgcaaccg
gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacctgaatcaggat attcttctaa
tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagtaaccatgcat catcaggagt
acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattccgtcagccagt ttagtctgac
catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgccatgtttcagaa acaactctgg
cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacctgattgcccga cattatcgcg
agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaatttaatcgcg gcttcgagca
agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgtattactgttta tgtaagcaga
cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgcaatgtaacatc agagattttg
agacacaacg tggctttgtt gaataaatcg aacttttgctgagttgaagg atcagatcac
gcatcttccc gacaacgcag accgttccgt ggcaaagcaaaagttcaaaa tcaccaactg
gtccacctac aacaaagctc tcatcaaccg tggctccctcactttctggc tggatgatgg
ggcgattcag gcctggtatg agtcagcaac accttcttcacgaggcagac ctctcgacgg
agttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaaggatcttcttga gatccttttt
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccaccgctaccagcg gtggtttgtt
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaactggcttcagc agagcgcaga
taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggccaccacttcaag aactctgtag
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagtggctgctgcc agtggcgata
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttaccggataaggcg cagcggtcgg
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcgaacgacctac accgaactga
gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcccgaagggaga aaggcggaca
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcacgagggagctt ccagggggaa
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacctctgacttgag cgtcgatttt
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgccagcaacgcg gcctttttac
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt
Ｘ０１～Ｘ１８核酸配列によりコードされるＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ。ＳＱ配列を太字／下線とした（配列番号２５）
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
ＢＤＤを有する野生型ＦＶＩＩＩ（配列番号２６）
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
ＡＡＶ－ＬＫ０３ ＶＰ１キャプシド（配列番号２７）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５及びＡＡＶ－ＳＰＫ－ｈＦＩＸにおいて使用したＡＡＶ－ＳＰＫ ＶＰ１キャプシド（配列番号２８）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
Figure 0007499174000005
Figure 0007499174000006
使用したある特定の定義／略語
ＢＤＤ：Ｂドメイン（ＢＤ）の全体又は少なくとも部分の欠失
ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ：Ｂドメイン欠失を有するＦＶＩＩＩ
ＳＱ：ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号２９）
ＦＶＩＩＩ／ＳＱ：ＳＱを有するＦＶＩＩＩ
ＦＶＩＩＩＸ０１～Ｘ１８：ＣｐＧが低減したＦＶＩＩＩをコードする核酸変種、それぞれ配列番号１～１８として示す
ＴＴＲｍｕｔ：ＴＡｍＧＴＧＴＡＧからＴＡＴＴＧＡＣＴＴＡＧへの４つの変異を有するＴＴＲプロモーター
ＣＯ３：コドン最適化ＦＶＩＩＩ核酸変種、配列番号２１として示す
ＮＨＰ：非ヒト霊長動物
ＡＬＴ：アラニンアミノトランスフェラーゼ
Ｄダイマー：血餅の分解からのタンパク質断片
ＳＰＫ－８００５：ＡＡＶキャプシド（配列番号２８）＋ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７；ＡＡＶ－ＳＰＫ－８００５とも称する
ＳＰＫ－８０１１：ＡＡＶ ＬＫ０３キャプシド（配列番号２７）＋ＴＴＲｍｕｔ－ｈＦＶＩＩＩ－Ｘ０７；ＡＡＶ－ＳＰＫ－８０１１とも称する
[0348]本発明のある特定の実施形態を上記に記載し、詳細に例示したが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されない。以下の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲及び精神から離れることなく、本発明に様々な改変を行うことができる。

Claims (44)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む血友病Ａを有するヒトを治療するための組成物であって、前記ベクターのゲノムが、Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸変種を含み、前記核酸変種が、配列番号７で表される核酸配列を含み、前記ｒＡＡＶベクターが、ＬＫ０３キャプシド配列(配列番号２７）を含み、前記組成物は、前記ヒトが少なくとも１年にわたり突発的出血を呈しないために使用される、組成物。
  2. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む血友病Ａを有するヒトを治療するための組成物であって、前記ベクターのゲノムが、Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸変種を含み、前記核酸変種が、２つより多くのシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有さない配列番号７で表される核酸配列を含み、前記ｒＡＡＶベクターが、ＬＫ０３キャプシド配列(配列番号２７）を含み、前記組成物は、前記ヒトが少なくとも１年にわたり突発的出血を呈しないために使用される、組成物。
  3. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む血友病Ａを有するヒトを治療するための組成物であって、前記ベクターのゲノムが、Ｂドメイン欠失を有する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ）をコードする核酸変種を含み、前記核酸変種が、配列番号７で表される核酸配列を含み、前記ｒＡＡＶベクターが、ＬＫ０３キャプシド配列(配列番号２７）を含み、前記ヒトに投与されるｒＡＡＶベクターの用量が、１キログラム当たり６ｘ１０１２ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）未満であり、前記組成物は、前記ヒトが少なくとも１年にわたり突発的出血を呈しないために使用される、組成物。
  4. 前記ヒトに投与されるｒＡＡＶベクターの用量が、下限及び上限を含めて１ｘ１０９～１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇである、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ヒトに投与されるｒＡＡＶベクターの用量が、下限及び上限を含めて３ｘ１０１１～７ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇである、請求項１に記載の組成物。
  6. 凝固活性に反映される、前記ヒトにおいて発現されるｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量が、前記ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験から得られるデータに基づいて予測される量より多い、請求項１に記載の組成物。
  7. 凝固活性に反映される、前記ヒトにおいて発現されるｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量が、前記ｒＡＡＶベクターが投与される非ヒト霊長動物試験に由来する線形回帰曲線に基づいて予測される発現より１～４倍多い、請求項１に記載の組成物。
  8. 凝固活性に反映される、前記ヒトにおいて発現されるｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量が、ｒＡＡＶベクター投与後の１４日又はそれを超える日において３％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において４％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において５％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において６％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２１日又はそれを超える日において７％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２８日又はそれを超える日において８％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の２８日又はそれを超える日において９％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の３５日又はそれを超える日において１０％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の３５日又はそれを超える日において１１％又はそれより多い、ｒＡＡＶベクター投与後の３５日又はそれを超える日において１２％又はそれより多い、請求項１に記載の組成物。
  9. 凝固活性に反映される、前記ヒトにおいて発現されるｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量が、連続する１４日の期間にわたり、平均して１０％又はそれより多い、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記ｒＡＡＶベクターが、下限及び上限を含めて１ｘ１０９～１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で前記ヒトに投与され、前記ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する日、週又は月にわたり平均で１２％～１００％の活性のレベルで前記ヒトにおいて産生される、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、活性が４、６、８又は１２の週又は月にわたり５～５０％より大きく変動しない定常状態で、前記ヒトにおいて産生される、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、活性が４、６、８又は１２の週又は月にわたり２５～１００％より大きく変動しない定常状態で、前記ヒトにおいて産生される、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記ヒトにおいてＡＡＶ抗体が、ｒＡＡＶベクター投与の前に検出されないか、又は前記ヒトがＡＡＶについて血清陰性である、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記ヒトにおいてＡＡＶ抗体が、ｒＡＡＶベクター投与の前に１：５であるか、又は１：５未満である、請求項１に記載の組成物。
  15. 前記ヒトが、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４の連続する週又は月にわたり前記ｒＡＡＶベクターに対する細胞性免疫応答を生じない、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記ヒトが、前記ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの治療効果を減少させ又は遮断するために十分な前記ｒＡＡＶベクターに対する液性免疫応答を発生させない、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記ヒトが、ｒＡＡＶベクター投与後の少なくとも１、２、３、４、５又は６カ月にわたり前記ｒＡＡＶベクターに対する検出可能な抗体を産生しない、請求項１に記載の組成物。
  18. 免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  19. 前記ｒＡＡＶベクターが投与された後に免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  20. 前記ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ血清型又はＡＡＶシュードタイプを含み、前記ＡＡＶシュードタイプが、ＩＴＲ血清型とは異なるＡＡＶキャプシド血清型を含む、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記ベクターのゲノムが、イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆末端反復配列（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  22. 前記イントロンが、前記核酸変種内にあるか、又は前記核酸変種に隣接する、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記発現制御エレメントが、前記核酸変種に作動可能に連結されている、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記ＡＡＶ ＩＴＲが、前記核酸変種の５’又は３’末端に隣接している、請求項２１に記載の組成物。
  25. 前記フィラーポリヌクレオチド配列が、前記核酸変種の５’又は３’末端に隣接している、請求項２１に記載の組成物。
  26. 前記イントロン、発現制御エレメント、１つ若しくは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆末端反復配列（ＩＴＲ）及び／又はフィラーポリヌクレオチド配列が、低減したシトシン－グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を有するように改変されている、請求項２１に記載の組成物。
  27. 前記発現制御エレメントが、構成的若しくは調節可能な制御エレメント、又は組織特異的発現制御エレメント若しくはプロモーターを含む、請求項２１に記載の組成物。
  28. 前記発現制御エレメントが、肝臓における発現を付与するエレメントを含む、請求項２１に記載の組成物。
  29. 前記発現制御エレメントが、ＴＴＲプロモーター又は変異体ＴＴＲプロモーターを含む、請求項２１に記載の組成物。
  30. 前記変異体ＴＴＲプロモーターが配列番号２２を含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４若しくはＡＡＶ－２ｉ８ ＡＡＶ血清型のうちのいずれかの１つ又は複数のＩＴＲ、又はこれらの組合せを含む、請求項２１に記載の組成物。
  32. 前記ベクターのゲノムが、配列番号２３に記載されるＩＴＲ、プロモーター、ポリＡシグナル及び／又はイントロン配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  33. 前記ｒＡＡＶベクターが、前記核酸変種並びに配列番号２３における変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ポリＡ及びＩＴＲのうちの１つ又は複数を含む、請求項１に記載の組成物。
  34. 前記ｒＡＡＶベクターが、前記核酸変種並びに配列番号２３における変異型ＴＴＲプロモーター（ＴＴＲｍｕｔ）、合成イントロン、ポリＡ及びＩＴＲのうちの１つ又は複数を含む、請求項１に記載の組成物。
  35. 前記ｒＡＡＶベクターが医薬組成物を構成する、請求項１に記載の組成物。
  36. 前記医薬組成物が、生物学的に適合性の担体又は賦形剤を含む、請求項３５に記載の組成物。
  37. ＬＫ０３キャプシド（配列番号２７）を有する空キャプシドを投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  38. 前記空キャプシド対前記ｒＡＡＶベクターの比が２：１～５０：１である、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記核酸変種によりコードされる前記ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、哺乳動物の肝臓において発現される、請求項１に記載の組成物。
  40. 前記ｒＡＡＶベクターが、静脈内に、又は動脈内により、前記ヒトに送達される、請求項１に記載の組成物。
  41. 前記ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤが、血栓症のリスクを実質的に増加させないレベルで発現される、請求項１に記載の組成物。
  42. 前記ｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの活性が、少なくとも１、２、３若しくは４週、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１カ月、又は少なくとも１年にわたり検出可能である、請求項１に記載の組成物。
  43. 前記ヒトが、少なくとも１、２、３若しくは４週、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１カ月、又は少なくとも１年にわたりＦＶＩＩＩタンパク質の予防を必要としない、請求項１に記載の組成物。
  44. ＡＡＶ抗体の存在若しくは量、ＡＡＶに対する免疫応答、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ抗体、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤに対する免疫応答、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの量、ＦＶＩＩＩ若しくはｈＦＶＩＩＩ－ＢＤＤの活性、１つ若しくは複数の肝臓酵素の量若しくはレベル又は出血症状の頻度、及び／若しくは重篤度若しくは継続期間について前記ヒトを分析又はモニターするステップをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
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