CN108368164A - CpG减少的因子VIII变体、组合物和方法以及用于治疗止血障碍的用途 - Google Patents

CpG减少的因子VIII变体、组合物和方法以及用于治疗止血障碍的用途 Download PDF

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Abstract

公开了编码FVIII蛋白质的CpG减少的核酸变体及其使用方法。在特定的实施方案中，与野生型因子VIII蛋白相比，编码FVIII的CpG减少的核酸变体由细胞更有效地表达，以增加的含量被细胞分泌，其表现出比野生型因子VIII蛋白增强的表达和/或活性，或更有效地包装入病毒载体中。

Description

CpG减少的因子VIII变体、组合物和方法以及用于治疗止血障 碍的用途
相关申请
本专利申请要求2015年10月30日提交的美国专利申请No.62/249,001，2016年5月4日提交的专利申请No.62/331,872，2016年6月13日提交的专利申请No.62/349,532，以及2016年7月1日提交的专利申请No.62/357,874的优先权，所述专利申请全部以引用方式全文明确地并入本文。
技术领域
本发明涉及重组凝血因子生产和与异常止血相关的医学疾病的治疗领域。更具体地讲，本发明提供编码因子VIII(FVIII)蛋白质的核酸变体(序列)，所述变体任选提供比野生型FVIII蛋白质增加的转录和/或表达、和/或活性。
背景技术
为了描述本发明所属领域的现状，在整个说明书中引用了若干出版物和专利文献。这些引文中的每一个均以引用方式并入本文，如同全文阐述一样。
血友病是一种全世界5,000名男性有1名存在的X连锁的出血性疾病。旨在使凝血因子水平正好超过正常值1％的治疗方法与严重疾病表型的显著改善相关。目前针对血友病B(HB)的AAV介导的基因转移的临床试验已经展示出治疗水平的因子IX(FIX)的持续长期表达，但确定AAV载体剂量可由于对AAV衣壳的抗AAV免疫应答而限制。虽然这些数据与B型血友病有关，但所有血友病中80％是由于FVIII缺乏症，血友病A(HA)。
当前对该疾病的治疗是需要频繁输注因子VIII蛋白质的蛋白质替代疗法。迫切需要实现持续治疗水平的因子VIII表达，以使患者不再需要此类频繁的蛋白质治疗。实际上，连续的因子VIII表达可预防出血事件，并且可确保建立对蛋白质的免疫耐受性。
总之，用于HA的基因疗法呈现出3种不同的挑战：(1)与其它类似大小的蛋白质相比，人FVIII(hFVIII)的固有特性使其难以表达；(2)FVIII cDNA的大尺寸和序列特异性效应与阻碍AAV产生的重排相关，以及(3)25-30％严重(<1％FVIII)HA患者中出现高比率的响应于蛋白质疗法的抗FVIII抗体(抑制剂)形成。
发明内容
根据本发明，提供了编码因子VIII(FVIII)蛋白的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)减少的核酸变体。此类CpG减少的核酸变体不同于编码FVIII的野生型核酸，并且可以编码例如人FVIII蛋白，其任选全部或部分地缺少FVIII B结构域。此类CpG减少的核酸变体包括相比于密码子优化的FVIII核酸例如FVIII-CO3(SEQ ID NO:21)表现出增加的表达(例如，表达增加1-5倍)的变体，当转移到细胞中时，导致增加的FVIII蛋白分泌并因此增加活性。
在某些实施方案中，编码FVIII的CpG减少的核酸变体(其具有或不具有FVIII B结构域的全部或部分缺失)可提供增加的FVIII表达，哺乳动物中增加的FVIII蛋白质产生，以及通过增加的FVIII蛋白循环含量在基因转移的情况下提供增加的功效，并实现有益治疗结果的止血。
在某些实施方案中，编码FVIII的核酸变体相比于编码FVIII的野生型核酸具有减少的CpG含量。在某些实施方案中，核酸变体具有比编码FVIII的野生型核酸(SEQ ID NO:19)少至少10个的CpG。在某些实施方案中，核酸变体具有不超过4个的CpG；具有不超过3个的CpG；具有不超过2个的CpG；或具有不超过1个的CpG。在某些实施方案中，核酸变体具最多4个CpGs、3个CpGs、2个CpG、或1个CpG。在某些实施方案中，核酸变体不具有CpG。
在某些实施方案中，编码FVIII的核酸变体相比于编码FVIII的野生型核酸具有减少的CpG含量，并且此类CpG减少的核酸变体与SEQ ID NO:1-18中任一个具有90％或更大的序列同一性。在某些实施方案中，CpG减少的核酸变体与SEQ ID NO:1-18中任一个具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更大的序列同一性。在某些实施方案中，CpG减少的核酸变体与SEQ ID NO:1-18中任一个具有90-95％序列同一性。在某些实施方案中，CpG减少的核酸变体与SEQ ID NO:1-18中任一个具有95-100％序列同一性。在某些实施方案中，编码FVIII的核酸变体以SEQ ID NO:1-18中任一个示出。
在某些实施方案中，CpG减少的核酸变体不同于FVIII变体V3(SEQ ID NO:20)和/或不同于FVIII变体CO3(SEQ ID NO:21)。
在某些实施方案中，与野生型FVIII相比或与包含B结构域缺失的野生型FVIII相比，编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体提供更高的表达和/或表现出优异的生物学活性(例如，如通过血浆水平或凝血测定或FVIII测定或FVIII缺陷模型中的减少的出血所测定的)
在某些实施方案中，编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体与野生型人FVIII核酸或包含B结构域缺失的野生型人FVIII核酸至少75％相同。在某些实施方案中，编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体与野生型人FVIII核酸或包含B结构域缺失的野生型人FVIII核酸约75-95％相同(例如，约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％相同)。
在某些实施方案中，编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体为哺乳动物，诸如人。此类编码FVIII蛋白的哺乳动物CpG减少的核酸变体包括人类形式，其可基于人野生型FVIII或包含B结构域缺失的人野生型FVIII。
根据本发明，还提供了载体和表达载体，其包括如本文所示的编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体。在具体的实施方案中，载体或表达载体包含腺病毒相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、质粒或慢病毒载体。在某些实施方案中，AAV载体包含AAV血清型或AAV假型，如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV。在某些实施方案中，表达载体包括SEQ ID No:1-18中的任一个，或者包含SEQ ID NO:23或24。
在某些实施方案中，表达控制元件包括组成型或可调控制元件，或组织特异性表达控制元件或启动子。在某些实施方案中，表达控制元件包含赋予肝脏中表达的元件。在某些实施方案中，表达控制元件包括TTR启动子或突变TTR启动子，诸如SEQ ID NO:22。在其它具体方面，表达控制元件包括PCT公布WO 2016/168728(USSN 62/148,696；62/202,133和62/212,634)中所示的启动子，所述专利文献以引用方式全文并入本文。
根据本发明，还提供了病毒载体，其包括编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体，或包含编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体的载体或表达载体。在具体的实施方案中，病毒载体包含AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、质粒或慢病毒载体。
在某些实施方案中，AAV载体包括AAV血清型或AAV假型，其包括不同于ITR血清型的AAV衣壳血清型。在附加的具体方面，AAV载体包含VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清型具有75％或更多的序列同一性(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％等。)
表达载体可包括附加组分或元件。在具体实施方案中，表达载体诸如AAV载体还包括内含子、表达控制元件、一个或多个AAV反向末端重复序列(ITR)(例如，下列中的任一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清，或它们的组合)、填充物多核苷酸序列和/或poly A信号。在某些实施方案中，内含子在编码FVIII的CpG减少的核酸变体内或侧接编码FVIII的CpG减少的核酸变体，和/或表达控制元件可操作地连接至编码FVIII的CpG减少的核酸变体，和/或AAV ITR侧接编码FVIII的CpG减少的核酸变体的5'或3'末端和/或填充物多核苷酸序列侧接编码FVIII的CpG减少的核酸变体的5'或3'末端。
在具体实施方案中，表达控制元件包括组成型或可调节控制元件，或组织特异性表达控制元件或启动子。在某些实施方案中，表达控制元件包括赋予肝脏中表达的元件(例如TTR启动子或突变TTR启动子)。
根据本发明，还提供了宿主细胞，其包含如本文所述的编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体。在具体实施方案中，宿主细胞包括编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体或包含编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体的表达载体。在某些实施方案中，此类宿主细胞产生由核酸变体编码的FVIII蛋白并回收产生的FVIII蛋白。任选分离和/或纯化的由细胞产生的此类FVIII蛋白质可以施用于受试者。
根据本发明，还提供了组合物，所述组合物包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体、本文所述的载体和表达载体。在具体实施方案中，药物组合物包含生物相容性载体或赋形剂中的载体、表达载体、或病毒或AAV载体。此类药物组合物任选地包含空衣壳AAV(例如，缺乏包含编码FVIII的核酸变体的载体基因组)。在附加的具体实施方案中，编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸、载体、表达载体、或病毒或AAV载体包封在脂质体中或与磷脂或胶束混合。
根据本发明，还提供用于将编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体递送或转移到哺乳动物或哺乳动物细胞中的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体、包含编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体的载体、包含编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体的病毒或AAV载体施用到或接触哺乳动物或哺乳动物细胞，从而将核酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物细胞。此类方法将编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体引入培养物或受试者(例如患者)中的哺乳动物细胞中。
本发明的方法还包括治疗哺乳动物受试者(例如患者)，诸如需要FVIII的人(人产生不足量的FVIII蛋白、或缺陷型或异常型FVIII蛋白)。在一个实施方案中，治疗需要FVIII的哺乳动物的方法包括：提供编码FVIII的CpG减少的核酸变体，或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的载体；或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达载体；或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的病毒或AAV载体；并且将一定量的编码FVIII的CpG减少的核酸变体，或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的载体，或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达载体，或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的病毒或AAV载体施用于哺乳动物受试者，使得由核酸变体编码的FVIII在哺乳动物受试者中表达。
在另一个实施方案中，治疗对其有需要的患者(例如，患者产生不足量的FVIII蛋白、或缺陷型或异常型FVIII蛋白)的止血相关疾病的方法包括向患者施用治疗有效量的生物学可接受的载体中的编码FVIII的CpG减少的核酸变体，或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的载体，或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达载体，或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的病毒或AAV载体。
在本发明方法的某些实施方案中，FVIII以对哺乳动物有益或治疗效果的水平表达；和/或FVIII在哺乳动物的细胞、组织或器官中表达。此类实施方案包括将编码FVIII的CpG减少的核酸变体引入组织或器官诸如肝脏中。此类实施方案还包括将编码FVIII的CpG减少的核酸变体引入分泌细胞中。此类实施方式还包括将编码FVIII的CpG减少的核酸变体引入内分泌细胞或内皮细胞中。此类实施方案还包括将编码FVIII的CpG减少的核酸变体引入肝细胞、窦状内皮细胞、巨核细胞、血小板或造血干细胞中。
施用(例如，递送)编码FVIII的CpG减少的核酸变体、或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的载体、包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的病毒或AAV载体的候选受试者(例如患者)和哺乳动物(例如人)包括患有以下疾病的那些或具有患有以下疾病的风险的那些，诸如：血友病A、血管性血友病和与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)和过度抗凝治疗失调相关的出血。
施用(例如，递送)编码FVIII的CpG减少的核酸变体、或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的载体、包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达载体、或包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的病毒或AAV载体的候选受试者(例如患者)和哺乳动物(例如人)包括具有AAV抗体或对AAV抗体为血清阴性的那些，以及具有或具有发展AAV抗体风险的那些。此类受试者(例如患者)或哺乳动物(例如人)对于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-Rh10或AAV-Rh74血清型可以为血清阴性或血清阳性的。
因此，本发明的组合物和方法还包括向所述哺乳动物或所述患者施用空衣壳AAV。在具体实施方案中，还将AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV-12、AAV-Rh10和/或AAV-Rh74血清型的空衣壳施用于哺乳动物或患者。
根据本发明的施用方法(例如递送)包括任何体外或体内接触或递送模式。在具体实施方案中，给药(例如递送)为：静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、皮下给药、腔内给药、插管给药或经由导管给药。
本发明还提供了在耐受人FVIII的小动物模型和大动物模型中测试编码FVIII的CpG减少的核酸变体的方法，以便评估剂量和监测变体的免疫原性。使用动物模型提供了一种设置，其允许评估当前用hFVIII-BDD接受蛋白质替代疗法的人类，但不具有可能发展对这些变体的免疫应答的抗hFVIII抗体反应的证据。
附图说明
图1示出了对18种不同克隆体(分别对应于SEQ ID No:1-18的X01-X18)和FVIII-CO3(SEQ ID NO:21)液压尾静脉(HTV)注射50μg质粒之后24小时的人FVIII(hFVIII)水平。
图2A-2C示出在VIII的AAV载体施用之后，血友病A/CD4-/-小鼠中的FVIII水平，(A)CO3(SEQ ID NO:21)、X09(SEQ ID NO:9)、X12(SEQ ID NO:12)和X16(SEQ ID NO:16)；(B)CO3(SEQ ID NO:21)、X01(SEQ ID NO:1)和X11(SEQ ID NO:11)；或(C)CO3(SEQ ID NO:21)、X07(SEQ ID NO:7)和X10(SEQ ID NO:10)。
图3A-3B示出了静脉内给药载体(圆形)、4×1010(方形)、8×1010(三角形)、或1.6×1011vg/小鼠(倒三角形)的AAV-SPK-8005-hFVIII经过87天的时期之后，NOD/SCID小鼠的血浆中hFVIII抗原(以ng/ml为单位)(B)或％总抗原(C)的水平。线表示每个群组中hFVIII平均值±SD。人FVIII血浆水平由ELISA测定，并且通过假设150ng/ml等同于100％活性，将ng/ml FVIII转换成标称FVIII水平％。
图3C示出在静脉内给药载体、4×1010、8×1010或1.6×1011vg/小鼠的AAV-SPK-8005-hFVIII之后，NOD/SCID小鼠的血浆中D-二聚体的水平，如在x轴的每个时间点处从左到右所示。条代表每个组中小鼠的平均值±SD。D-二聚体水平由ELISA测定。
图4显示了NHP研究设计。
图5A-5D示出了静脉内给药2×1012(A)、5×1012(B)或1×1013vg/kg(C)的AAV-SPK-8005之后，NHP中的hFVIII抗原水平。线表示个体动物。人FVIII血浆水平由ELISA测定，并且表示在研究过程中对于同一组的动物通过连续取血获得的重复测量值(n＝每组2-3只动物)。经载体处理的动物中测得的人FVIII水平在所有三个图中均以空心方块示出。
ε＝开发针对FVIII的抑制剂。
图6A-6C示出了在2×1012(A)、5×1012(B)或1×1013vg/kg(C)的AAV-SPK-8005下，NHP中的ALT水平。
图7A-7C示出了NHP中的D-二聚体水平。在静脉内给药2×1012(A)、5×1012(B)或1×1013vg/kg(C)的AAV-SPK-8005之后，NHP的血浆中的D-二聚体抗原浓度。虚线指示500ng/ml，其为人类中正常D-二聚体的上限。
图8示出了三种剂量的AAV-SPK-8005下的FVIII水平的数据汇总。
图9A-9D示出了静脉内给药2×1012(A)、6×1012(B)或2×1013(vg/kg)(C)的AAV-SPK-8011(LK03衣壳)-hFVIII之后，食蟹猴血浆中的hFVIII水平。线表示个体动物。hFVIII血浆水平由ELISA测定并且表示在研究过程中对于同一组的动物通过连续取血获得的重复测量值(n＝每组3只动物)。经载体处理的动物中测得的人FVIII水平以空心方块示出(n＝2)。ε＝在每个单独动物中检测开发针对FVIII的抑制剂时的时间。
图10示出了用AAV-SPK-8011(LK03衣壳)-hFVIII获得的FVIII水平与使用具有AAV5和AAV8衣壳的AAV载体递送的FVIII的记录水平的比较结果。AAV5:http://www.biomarin.com/pdf/BioMarin_R&D_Day_4_20_2016.pdf,第16页。AAV8:McIntosh J等人，Blood 2013；121(17):3335-44。
图11示出了AAV-SPK(SEQ ID NO:28)和AAV-LK03(SEQ ID NO:27)在非人灵长类动物中的组织生物分布，主要是在肾脏、脾脏和肝脏中的组织生物分布(每个组织为第3条)。
图12示出了将AAV-SPK-8005全身给药于小鼠中后的肝脏和脾脏FVIII表达。
图13示出了体外分析的AAV-LK03衣壳的转导效率。X轴，食蟹猴(左竖条)、人(右竖条)。
图14A-14B示出了AAV给药之后兔中hFIX的血浆浓度。兔以(A)1×1012vg/kg(低剂量，n＝4)或(B)1×1013vg/kg(高剂量，n＝3-5)接受hFIX载体AAV-SPK或AAV-LK03的静脉内注射。使用双尾Mann-Whitney检验比较组之间的人FIX水平。没有观察到显著差异。低剂量组中的动物5和15由于错误注射而从分析中排除。动物9和10也从图中排除，因为它们产生了针对人FIX的中和抗体。
图15A-15B示出了对人FIX(抗FIX)的抗体形成的时间过程。兔以(A)1×1012vg/kg(低剂量，n＝4)或(B)1×1013vg/kg(高剂量，n＝3-5)的剂量接受hFIX载体AAV-SPK或AAV-LK03的静脉内注射。示出每个个体动物的数据。
具体实施方式
本文公开了编码FVIII的CpG减少的核酸变体，其不同于编码FVIII的野生型核酸。此类编码FVIII的CpG减少的核酸变体可以以增加的水平在细胞和/或动物中表达，这继而可在体内提供增加的FVIII蛋白水平。本发明还公开了编码FVIII的CpG减少的核酸变体，其可在体外和/或体内提供更大的生物活性。示例性编码FVIII的CpG减少的核酸变体可以表现出下列中的一个或多个：1)细胞和/或动物中的表达增加；2)增加的活性；和3)在比野生型hFVIII更低的AAV剂量下的治疗效果。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，以指称所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如变体核酸)。多核苷酸可以为单链、双链或三链的、线性或环状的，并且可以具有任何长度。在讨论多核苷酸时，可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例在本文中描述具体多核苷酸的序列或结构。
如本文所用，术语“修饰”或“变体”及其语法变体意指核酸、多肽或其子序列偏离参考序列。因此修饰和变体序列可具有与参考序列基本上相同、更多或更少的表达、活性或功能，但至少保留参考序列的部分活性或功能。修饰物或变体的具体示例是编码FVIII的CpG减少的核酸变体。
“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已经基因改变的修饰序列。所述序列可基因修饰但不改变编码的蛋白质序列。替代地，所述序列可以基因修饰以编码变体蛋白质。核酸或多核苷酸变体还可指已经密码子修饰以编码仍然保持与参考序列(诸如野生型蛋白质序列)至少部分序列同一性的蛋白质，并且还已经密码子修饰以编码变体蛋白质的组合序列。例如，此类核酸变体的一些密码子将被改变但不改变由此编码的蛋白质(FVIII)的氨基酸，而核酸变体的一些密码子将被改变，这继而改变由此编码的蛋白质(FVIII)的氨基酸。
术语“变体因子VIII(FVIII)”是指与未修饰的野生型FVIII(例如，SEQ ID NO:19)或FVIII-BDD相比已经被基因改变的经修饰的FVIII。此类变体可被称为“编码因子VIII(FVIII)的核酸变体”。变体的具体示例是编码FVIII或FVIII-BDD蛋白质的CpG减少的核酸。术语“变体”不需要在提及编码FVIII的CpG减少的核酸的每种情况中出现。同样，术语“CpG减少的核酸”等可以省略术语“变体”，但提及的“CpG减少的核酸”旨在包括基因水平的变体。
与其中CpG含量尚未降低的野生型FVIII或FVIII-BDD相比，具有减少的CpG含量的FVIII构建体可表现出改善，并且在没有对核酸进行修饰(其导致编码的FVIII或FVIII-BDD蛋白的氨基酸改变)的情况下这样做。当比较表达时，如果CpG减少的核酸编码保留B结构域的FVIII蛋白，将其与野生型FVIII表达进行比较是适当的；并且如果CpG减少的核酸编码不具有B结构域的FVIII蛋白，则将其与也具有B结构域缺失的野生型FVIII的表达进行比较。
“变体因子VIII(FVIII)”还可以指经修饰的FVIII蛋白，使得与野生型FVIII相比，经修饰的蛋白具有氨基酸改变。同样，当比较活性和/或稳定性时，如果编码的变体FVIII蛋白保留B结构域，则将其与野生型FVIII比较是适当的；并且如果编码的变体FVIII蛋白具有B结构域缺失，则将其与也具有B结构域缺失的野生型FVIII进行比较。
变体FVIII可包括B结构域的部分。因此，FVIII-BDD包括B结构域的部分。通常在FVIII-BDD中大部分B结构域缺失。
变体FVIII可包括作为SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29)示出的“SQ”序列。通常此类具有SQ(FVIII/SQ)的变体FVIII具有BDD，例如，至少全部或部分的BD缺失。变体FVIII，诸如FVIII-BDD可具有全部或部分的“SQ”序列，即，全部或部分的SEQ ID NO:29。因此，例如具有SQ序列(SFSQNPPVLKRHQR,SEQ ID NO:29)的变体FVIII-BDD可具有氨基酸序列SFSQNPPVLKRHQR的全部或仅一部分。例如，FVIII-BDD可具有包括的SFSQNPPVLKRHQR的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个氨基酸残基。因此，具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个内部缺失以及1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个氨基酸或羧基末端缺失的SFSQNPPVLKRHQR包括在本文所示的变体FVIII蛋白质范围内。
由“核酸”或“多核苷酸”序列编码的“多肽”、“蛋白质”或“肽”包括全长天然(FVIII)序列，如天然存在的野生型蛋白质，以及功能性序列、修饰形式或序列变体，只要子序列、修饰形式或变体保留一定程度的天然全长蛋白质的功能性即可。例如，编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸可具有如本文所述的B结构域缺失并保留凝血功能。在本发明的方法和用途中，此类由核酸序列编码的多肽，蛋白质和肽可以但不必要与内源蛋白质相同，所述内源蛋白质是缺陷的，或其在经处理哺乳动物表达不充分或不足。
修饰的非限制性示例包括一个或多个核苷酸或氨基酸取代(例如，1-3、3-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-500、500-750、750-850或更多个核苷酸或残基)。核酸修饰的示例是CpG减少。在某些实施方案中，编码FVIII(诸如人FVIII蛋白)的CpG减少的核酸，与编码人因子FVIII的野生型序列相比具有10个或更少的CpG；或与编码人因子FVIII的野生型序列相比具有5个或更少的CpG；或在编码FVIII的CpG减少的核酸中具有不超过5个的CpG。
氨基酸修饰的示例是参考序列的保守氨基酸取代或缺失(例如，子序列或片段)，例如，FVIII，诸如具有B结构域缺失的FVIII。在具体实施方案中，修饰或变体序列保留未修饰序列的至少部分功能或活性。
明确地包括已知或为未知的编码蛋白质的核酸的所有哺乳动物和非哺乳动物形式，包括本文所公开的编码FVIII和FVIII蛋白质的CpG减少的核酸的其它哺乳动物形式。因此，本发明包括来自非哺乳动物、不是人的哺乳动物和人的基因和蛋白质，所述基因和蛋白质以与本文所述的FVIII(例如人)基因和蛋白质基本相似的方式起作用。
术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)或可通过***或并入核酸操纵的其它载体。此类载体可用于基因操作(即“克隆载体”)，以将多核苷酸引入/转移到细胞中，并在细胞中转录或翻译***的多核苷酸。“表达载体”是一种专用载体，其包含具有宿主细胞中的表达所需的必要调节区的基因或核酸序列。载体核酸序列通常包含至少一个用于在细胞中增殖的复制起点以及任选的附加元件，诸如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、ITR、可选择的标记(例如抗生素抗性)、聚腺苷酸化信号。
病毒载体来源于或基于一种或多种包含病毒基因组的核酸元件。具体的病毒载体包括慢病毒、假型慢病毒和细小病毒载体，诸如腺相关病毒(AAV)载体。本发明还提供了包含编码FVIII的CpG减少的核酸的载体。
作为载体的修饰语，诸如重组病毒，例如慢病毒或细小病毒(例如AAV)载体，以及作为序列的修饰语，诸如重组多核苷酸和多肽，术语“重组”意指组合物已经以通常不在自然界中发生的方式操纵(即，工程化)。重组载体例如AAV载体的具体示例可以为通常在野生型病毒(例如AAV)基因组中不存在的多核苷酸***病毒基因组中的情况。重组多核苷酸的示例是编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸克隆到载体中的情况，其具有或不具有基因通常缔合在病毒(例如AAV)基因组内的5'、3'和/或内含子区。尽管在本文提及载体，诸如病毒和AAV载体以及序列诸如多核苷酸时，并不总是使用术语“重组”，但包括多核苷酸在内的重组形式明确地被包括，尽管存在任何此类省略。
通过使用分子方法从病毒(例如AAV)中移除野生型基因组，并用非天然核酸，诸如编码编码FVIII的CpG减少的核酸取代，由病毒(诸如AAV)的野生型基因组衍生重组病毒“载体”或“AAV载体”。通常，对于AAV而言，AAV基因组中的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”病毒载体(例如，AAV)区别于病毒(例如AAV)基因组，因为病毒基因组的全部或一部分已用关于病毒(例如AAV)的基因组核酸的非天然序列，诸如编码FVIII的CpG减少的核酸替代。因此，并入非天然序列将病毒载体(例如AAV)定义为“重组”载体，其在AAV的情况下可被称为“rAAV载体”。
可以将重组载体(例如lenti-、parvo-、AAV)序列包装-本文中称为用于后续体外或体外感染(转导)细胞的“颗粒”。在将重组载体序列壳体化或包装成AAV颗粒的情况下，该颗粒也可称为“rAAV”。此类颗粒壳体化或包装载体基因组的蛋白质。具体的示例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下为衣壳蛋白。
载体“基因组”指重组质粒序列的部分，其最终被包装或衣壳化以形成病毒(例如AAV)颗粒。在使用重组质粒构建或制造重组载体的情况下，载体基因组不包含不对应于重组质粒的载体基因组序列的“质粒”部分。这种重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增而言是重要的，这是繁殖和重组病毒生产所需的过程，但其本身不被包装或衣壳化成病毒(例如AAV)颗粒。因此，载体“基因组”是指由病毒(例如AAV)包装或衣壳化的核酸。
本文使用“转基因”以方便地表示旨在或已被引入细胞或生物体的核酸。转基因包括任何核酸，诸如编码多肽或蛋白质的基因(例如，编码因子VIII的CpG减少的核酸)。
在具有转基因的细胞中，已经使用载体，诸如“AVV”，“转导”或“转染”细胞引入转基因。术语“转导”和“转染”是指在将分子诸如核酸引入细胞或宿主生物体中。转基因可以或可以不整合到受体细胞的基因组核酸中。如果引入的核酸整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，则其可稳定保持在该细胞或生物体中并且进一步传递到受体细胞或生物体的后代细胞或生物体或由受体细胞或生物体的后代细胞或生物体遗传。最终，被引入的核酸可在染色体外或仅暂时存在于受体细胞或宿主生物体中。
“转导细胞”是其中已引入转基因的细胞。因此，“转导的”细胞(例如，在哺乳动物中，诸如细胞或组织或器官细胞中)意指在外源分子例如核酸(例如转基因)并入细胞中之后，细胞中的基因变化。因此，“转导的”细胞是其中已引入外源核酸的细胞或其后代。可以繁殖细胞并且表达引入的蛋白质或转录核酸。对于基因治疗用途和方法而言，转导细胞可处于受试者中。
“表达控制元件”是指影响可操作地连接的核酸的表达的核酸序列。控制元件，包括本文所述的表达控制元件，诸如启动子和增强子，包括AAV载体的载体序列可包括一个或多个“表达控制元件”。通常，包括此类元件以有利于适当的异源多核苷酸转录和适当情况下的翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、维持基因的正确阅读框以允许mRNA的框内翻译和终止密码子等)。这些元件通常以顺式作用，其被称为“顺式作用”元件，但也可以反式作用。
表达控制可处于转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平。通常，调节转录的表达控制元件靠近转录核酸的5'端(即“上游”)并置。表达控制元件也可位于转录序列的3'末端(即“下游”)处或转录物内(例如在内含子中)。表达控制元件可以邻近或远离转录序列定位(例如，距多核苷酸1-10个、10-25个、25-50个、50-100个、100-500个或更多个核苷酸)，甚至以相当远的距离定位。然而，由于某些载体(诸如AAV载体)的长度限制，表达控制元件通常在距离转录核酸1至1000个核苷酸内。
在功能上，可操作地连接的核酸的表达至少部分地可由元件(例如启动子)控制，使得元件调节核酸的转录以及适当时调节转录物的翻译。表达控制元件的具体示例是启动子，其通常位于转录序列例如编码FVIII的CpG减少的核酸的5'端。与不存在启动子时表达的量相比，启动子通常增加从可操作地连接的核酸表达的量。
如本文所使用的，“增强子”可以指邻近异源多核苷酸定位的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也起作用，并且可位于序列(例如，编码FVIII的CpG减少的核酸)的下游或内。因此，增强子元件可以位于编码FVIII的CpG减少的核酸上游或下游的100个碱基对、200个碱基对或300个或更多个碱基对。增强子元件通常使可操作连接的核酸的表达增加高于由启动子元件提供的表达。
表达构建体可包含用于驱动特定细胞或组织类型中的表达的调控元件。表达控制元件(例如启动子)包括在特定组织或细胞类型中具有活性的那些，在本文中被称为“组织特异性表达控制元件/启动子”。组织特异性表达控制元件通常在特定细胞或组织(例如肝脏)中具有活性。表达控制元件通常在特定的细胞、组织或器官中具有活性，因为它们被转录激活蛋白或其它转录调节因子识别，其对于特定的细胞、组织或器官类型是独特的。此类调节元件是本领域技术人员已知的(参见例如Sambrook等人(1989)和Ausubel等(1992))。
在本发明的表达构建体中并入组织特异性调节元件为表达编码FVIII的CpG减少的核酸提供了至少部分的组织向性。在肝脏中具有活性的启动子的示例为TTR启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子；白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.,71:5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人，Gene Ther.3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人Hum.Gene.Ther.,7:1503-14(1996)]等等。在肝脏中有活性的增强子的示例是载脂蛋白E(apoE)HCR-1和HCR-2(Allan等人，J.Biol.Chem.,272:29113-19(1997))。
表达调控元件还包括能够驱动多核苷酸在许多不同细胞类型中表达的普遍存在的或混杂的启动子/增强子。此类元件包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子序列、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列和在多种哺乳动物细胞类型中具有活性的其它病毒启动子/增强子、或自然界中不存在的合成元件(参见，例如，Boshart等人，Cell,41:521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
表达调控元件还可以以可调节的方式赋予表达，即信号或刺激增加或减少可操作地连接的异源多核苷酸的表达。响应于信号或刺激增加可操作地连接的多核苷酸的表达的可调节元件也被称为“诱导型元件”(即，由信号诱导)。具体示例包括但不限于激素(例如类固醇)诱导型启动子。典型地，由此类元素赋予的增加或减少量与存在的信号或刺激量成正比；信号或刺激量越大，表达的增加或减少就越大。具体的非限制性示例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子；类固醇激素诱导型小鼠***肿瘤病毒(MMTV)启动子；T7聚合酶启动子***(WO 98/10088)；四环素抑制***(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))；四环素诱导***(Gossen等人，Science.268:1766-1769(1995))；也参见Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518(1998))；RU486诱导型***(Wang等人，Nat.Biotech.15:239-243(1997)和Wang等人，Gene Ther.4:432-441(1997)]；和雷帕霉素可诱导***(Magari等人，J.Clin.Invest.100:2865-2872(1997)；Rivera等人，Nat.Medicine.2:1028-1032(1996))。可用于这种环境的其它可调节控制元件为由特定生理状态，例如温度、急性期、发育调节的那些。
表达控制元件还包括异源多核苷酸的天然元件。当期望异源多核苷酸的表达应该模拟天然表达时，可使用天然控制元件(例如启动子)。当异源多核苷酸的表达要在时间上或发育上，或以组织特异性方式或响应于特异性转录刺激进行调节时，可使用天然元件。还可使用其它天然表达控制元件，诸如内含子、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列。
术语“可操作地连接”是指将编码序列表达所必需的调控序列置于相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。有时将相同的定义施用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于其中生成杂交核酸分子的第一和第二核酸分子的核酸序列的排列。
在与核酸可操作连接的表达控制元件的示例中，所述关系使得控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两个DNA序列意指两个DNA以使得至少一个DNA序列能够对另一个序列施加生理效应的这样的关系(顺式或反式)排列。
因此，载体的附加元件包括但不限于表达控制(例如启动子/增强子)元件、转录终止信号或终止密码子、侧接序列如AAV ITR序列中的一个或多个拷贝的5'或3'非翻译区(例如聚腺苷酸化(polyA)序列)、或内含子。
其他元件包括例如填料或填充物多核苷酸序列，例如以改善包装并减少污染核酸的存在。AAV载体通常接受具有一般为约4kb至约5.2kb或略多的尺寸范围的DNA***片段。因此，对于较短的序列而言，包含填充物或填料以便将长度调整至对于AAV载体包装入病毒颗粒中而言可接受的病毒基因组序列的正常大小或接近正常大小。在各种实施方案中，填料/填充物核酸序列是核酸的未翻译(非蛋白质编码)区段。对于小于4.7Kb的核酸序列，填料或填充物多核苷酸序列具有当与该序列组合(例如***载体中)时具有介于约3.0-5.5Kb之间、或介于约4.0-5.0Kb之间、或介于约4.3-4.8Kb之间的总长度的长度。
内含子也可用作填料或填充物多核苷酸序列，以便实现将AAV载体包装成病毒颗粒的长度。用作填料或填充物多核苷酸序列的内含子和内含子片段也可增强表达。
短语“止血相关疾病”是指出血性疾病，例如血友病A，血友病A患者具有抑制性抗体、凝血因子VII、VIII、IX和X、XI、V、XII、II、血管性血友病因子中的缺陷、组合的FV/FVIII缺陷、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症、γ-羧化酶缺陷；与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血障碍、弥漫性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药(即FXa抑制剂)相关的过度抗凝；和血小板功能障碍如BernardSoulier综合征、Glanzman血小板功能障碍和储存池缺损。
当用作组合物的改性剂时，术语“分离的”是指组合物由人工制造或完全或至少部分地从其天然存在的体内环境中分离。通常，分离的组合物基本上不含一种或多种其通常天然与之缔合的物质，例如一种或多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。
关于本发明的核酸，术语“分离的”是指核酸分子与一个或多个序列分离，所述核酸分子与所述序列在其所来源的生物体的天然存在的基因组(基因组DNA)中紧邻(在5'和3'方向上)。例如，“分离的核酸”可包含***载体例如质粒或病毒载体，或整合到原核生物或真核生物的DNA中的DNA或cDNA分子。
关于本发明的RNA分子，术语“分离的”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。替代地，该术语可指已经与可在其天然状态下(即在细胞或组织中)与其缔合的RNA分子充分分离，使得其以“基本上纯的”形式存在的RNA分子(术语“基本上纯的”在下文定义)。
关于蛋白质，本文中有时使用术语“分离的蛋白质”或“分离和纯化的蛋白质”。该术语主要指通过表达分离的核酸分子产生的蛋白质。另选地，该术语可指已经与可与其天然缔合的其它蛋白质充分分离，以便以“基本上纯”的形式存在的蛋白质。
术语“分离的”不排除由人工制备的组合，例如包装或衣壳化载体基因组的重组载体(例如rAAV)序列或病毒颗粒以及药物制剂。术语“分离的”也不排除组合物的另选物理形式，例如杂合体/嵌合体、多聚体/寡聚体、修饰(例如磷酸化、糖基化、脂质化)或衍生化形式，或在由人工产生的宿主细胞中表达的形式。
术语“基本上纯的”是指包含至少50-60重量％的感兴趣的化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白质等)的制剂。该制剂可包含至少75重量％、或约90-99重量％的感兴趣的化合物。纯度通过适用于感兴趣的化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量。
当提及具体核苷酸序列或氨基酸序列时，短语“基本上由...组成”是指具有给定SEQ ID NO的特性的序列。例如，当在提及氨基酸序列使用时，该短语包括序列本身和不影响该序列的基本特性和新型特征的分子修饰。
如本文所用的，术语“寡核苷酸”是指引物和探针，并且定义为由两个或更多个(诸如多于三个)核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子。寡核苷酸的确切大小将取决于各种因素以及使用寡核苷酸的具体应用。
如本文所用的，术语“探针”是指寡核苷酸、多核苷酸或核酸，RNA或DNA，无论是如纯化的限制酶消化物中天然存在还是合成制备的，其能够由具有与探针互补的序列的核酸退火或与具有与探针互补的序列的核酸特异性杂交。探针可以是单链或双链的。探针的确切长度取决于许多因素，包括温度、探针来源和使用的方法。例如，就诊断应用而言，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常包含15-25个或更多个核苷酸，但其可能包含更少的核苷酸。
本文中的探针被选择成与具体靶核酸序列的不同链“基本上”互补。这意指探针必须充分互补以便能够在一组预定条件下与其相应靶链“特异性杂交”或由其相应靶链退火。因此，探针序列不需要反映靶的确切互补序列。例如，可将非互补核苷酸片段附接到探针的5'或3'端，其中探针序列的剩余部分与靶链互补。替代地，非互补碱基或较长序列可散置到探针中，前提条件是探针序列与靶核酸的序列具有足够的互补性以由此特异性退火。
术语“特异性杂交”是指具有足够互补序列的两个单链核酸分子之间的缔合，以允许在通常用于本领域的预定条件下进行此类杂交(有时被称为“基本上互补”)。具体地讲，该术语是指寡核苷酸与本发明的单链DNA或RNA分子内包含的基本上互补的序列的杂交，基本上排除寡核苷酸与非互补序列的单链核酸的杂交。
如本文所用，术语“引物”是指单链或双链的寡核苷酸，或RNA或DNA，其衍生自生物***，通过限制酶消化产生，或合成产生，当置于适当的环境中时，其能够在功能上用作模板依赖性核酸合成的启动子。当在合适的核酸模板、核酸的合适的核苷三磷酸前体、聚合酶、合适的辅因子和条件诸如合适的温度和pH情况下呈现时，引物可通过添加核苷酸通过聚合酶的作用或类似活性在其3'端延伸以产生引物延伸产物。
根据应用的具体条件和要求，引物的长度可变化。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常为15-25个或更多个核苷酸。引物必须与期望的模板具有足够的互补性以引发所需延伸产物的合成，即能够以足以提供适当并置的引物的3'羟基部分的方式由期望的模板链退火，以用于通过聚合酶或类似酶引发合成。不要求引物序列代表所需模板的确切补充。例如，可将非互补核苷酸序列附接到另外的互补引物的5'端。另选地，非互补碱基可散置在寡核苷酸引物序列内，前提条件是引物序列与期望的模板链的序列具有足够的互补性以在功能上提供用于合成延伸产物的模板-引物复合物。
术语“同一性”，“同源性”及其语法变体意指两个或更多个参考实体当它们是“比对”序列时是相同的。因此，例如，当两个多肽序列相同时，它们至少在参考区域或部分内具有相同的氨基酸序列。在两个多核苷酸序列相同时，它们至少在参考区域或部分内具有相同的多核苷酸序列。同一性可在序列的定义区域(区域或结构域)范围内。具有同一性的“区”或“区域”是指两个或更多个参考实体相同的部分。因此，当两个蛋白质或核酸序列在一个或多个序列区或区域范围内相同时，它们共享该区域内的同一性。“比对”序列是指多个多核苷酸或蛋白质(氨基酸)序列，其通常包含对于与参照序列相比缺失或附加的碱基或氨基酸(缺口)的校正。
同一性可在序列的整个长度或一部分范围内延伸。在某些实施方案中，共享百分比同一性的序列的长度为2、3、4、5或更多个连续核酸或氨基酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等连续核酸或氨基酸。在另外的实施方案中，共享同一性的序列长度是21个或更多个连续核酸或氨基酸，例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个等连续核酸或氨基酸。在其它实施方案中，共享同一性的序列长度是41个或更多个连续核酸或氨基酸，例如42、43、44、45、45、47、48、49、50个等连续核酸或氨基酸。在另外的实施方案中，共享同一性的序列长度是50个或更多个连续核酸或氨基酸，例如50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95、95-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-500、500-1,000个等连续核酸或氨基酸。
如本文所述，编码FVIII的CpG减少的核酸变体将与野生型不同，但可以与具有或不具有B结构域的野生型FVIII蛋白表现出序列同一性。在编码FVIII的CpG减少的核酸变体中，在核苷酸序列水平下，编码FVIII的CpG减少的核酸通常将与野生型FVIII编码核酸至少约70％相同，更通常约75％相同，甚至更通常约80％-85％相同。因此，例如编码FVIII的CpG减少的核酸可与野生型FVIII编码基因或彼此(例如X01对X02、X03对X04等)具有75％-85％同一性，如本文所示。
在氨基酸序列水平上，变体诸如变体FVIII蛋白将是至少约70％相同的，更通常约75％相同的或80％相同的，甚至更通常约85％同一性，或90％或更多同一性。在其他实施方案中，变体诸如变体FVIII蛋白与参考序列(例如具有或不具有B结构域的野生型FVIII蛋白)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
为了测定同一性，如果FVIII(编码FVIII的CpG减少的核酸)保留B结构域，则与野生型FVIII比较同一性是合适的。如果FVIII(编码FVIII的CpG减少的核酸)具有B结构域缺失，则与也具有B结构域缺失的野生型FVIII比较同一性是合适的。
术语“同源”或“同源性”意指两个或更多个参考实体在给定区域或部分范围内共享至少部分同一性。同源性或同一性的“区、区域或结构域”是指两个或更多个参考实体的一部分共享同源性或相同。因此，当两个序列在一个或多个序列区域范围内相同时，其在这些区域中共享同一性。“实质同源性”意指分子在结构上或功能上保守，使得其具有或预测具有参考分子的结构或功能(例如，生物学功能或活性)中一种或多种的至少部分结构或功能，或与其共享同源性的参考分子的相关/对应区域或部分。
两个序列之间的同一性(同源性)或“同一性百分比”的程度可以使用计算机程序和/或数学算法来确定。出于本发明的目的，核酸序列的比较使用可购自GeneticsComputer Group(Madison,Wisconsin)的GCG Wisconsin Package 9.1版进行。为方便起见，由该程序指定的缺省参数(缺口生成罚分＝12，缺口延伸罚分＝4)旨在用于本文以比较序列同一性。另选地，使用默认参数的空位比的由国家生物技术信息中心提供的Blastn2.0程序(可见于万维网ncbi.nlm.nih.gov/blast/；Altschul等人，1990,J Mol Biol 215:403-410)可用于确定核酸序列与氨基酸序列之间的同一性和相似性的水平。就多肽序列比较而言，通常将BLASTP算法与评分矩阵(诸如PAM100、PAM250、BLOSUM62或BLOSUM50)组合使用。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比较程序也用于量化同一性的程度((Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；Pearson,Methods MolBiol.132:185(2000)；和Smith等人，J.Mol.Biol.147:195(1981))。已经开发了使用基于Delaunay的拓扑映射来量化蛋白质结构相似性的程序(Bostick等人，Biochem BiophysRes Commun.304:320(2003))。
可以通过使用重组DNA技术方法来制备核酸分子、表达载体(例如载体基因组)、质粒，包括编码本发明的FVIII的CpG减少的核酸变体。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过各种手段制备本发明的分离的核酸分子。例如，可使用各种标准克隆、重组DNA技术，经由细胞表达或体外翻译和化学合成技术来制备编码FVIII的CpG减少的核酸变体。多核苷酸的纯度可以通过测序、凝胶电泳等来测定。例如，可使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术来分离核酸。这些技术包括但不限于：(1)基因组DNA或cDNA库与探针杂交以检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛选以检测具有共享结构特征的多肽，例如使用表达文库；(3)使用能够对感兴趣的核酸序列退火的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)；(4)对序列数据库进行计算机搜索以获得相关序列；和(5)减去的核酸库的差异筛选。
本发明的核酸可以以DNA形式保持在任何便利的克隆载体中。在一个实施方案中，将克隆体保持在质粒克隆/表达载体，诸如pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)中，其在合适的大肠杆菌宿主细胞中繁殖。另选地，核酸可保持在适于在哺乳动物细胞中表达的载体中。在翻译后修饰影响凝血功能的情况下，核酸分子可以在哺乳动物细胞中表达。
编码本发明FVIII的CpG减少的核酸变体包括可以为单链或双链的cDNA、基因组DNA、RNA及其片段。因此，本发明提供了具有能够与本发明核酸的至少一个序列杂交的序列的寡核苷酸(DNA或RNA的有义链或反义链)。此类寡核苷酸可用作检测FVIII表达的探针。
根据已知方法，可以以各种方式制备编码本发明的FVIII的B-结构域缺失的、CpG减少的核酸变体，其任选地具有氨基酸取代、缺失或添加。蛋白质可以通过免疫亲和纯化从合适的源(例如，表达工程化FVIII的转化的细菌或动物培养细胞或组织)纯化。
编码FVIII的CpG减少的核酸变体的可用性能够使用本领域已知的体外表达方法产生FVIII。例如，可以将cDNA或基因克隆到合适的体外转录载体诸如pSP64或pSP65中，以用于体外转录，随后在合适的无细胞翻译***如小麦胚牙或兔网织红细胞裂解液中进行无细胞翻译。体外转录和翻译***是可商购的，例如得自Promega Biotech,Madison,Wisconsin或BRL,Rockville,Maryland。
另选地，可通过在合适的原核或真核表达***中表达来产生更大量的FVIII。例如，编码FVIII的CpG减少的核酸变体例如可***适于在细菌细胞(诸如大肠杆菌或哺乳动物细胞系，诸如幼仓鼠肾(BHK)、CHO或Hela细胞)中表达的质粒载体中。另选地，可产生包含FVIII的标记的融合蛋白。此类FVIII标记的融合蛋白由DNA分子的部分或全部编码，在正确的密码子阅读框中与编码部分或全部期望多肽标签的核苷酸序列连接，所述多肽标签***到适于在细菌细胞(诸如大肠杆菌)或真核细胞(例如但不限于酵母和哺乳动物细胞)中表达的质粒载体中。
载体(诸如本文所述的那些)任选地包含在宿主细胞中表达DNA所必需的调节元件，所述调节元件以允许所编码的蛋白质在宿主细胞中表达的方式定位。表达所需的此类调节元件包括但不限于如本文所述和本领域技术人员已知的启动子序列、增强子序列和转录起始序列。
由重组原核或真核***中的基因表达产生的由CpG减少的核酸变体编码的FVIII可根据本领域已知的方法纯化。在一个实施方案中，可使用可商购获得的表达/分泌***，由此重组蛋白被表达并然后从宿主细胞分泌，以容易地从周围介质中纯化。如果不使用表达/分泌载体，则另选的方法包括通过亲和分离，例如通过与特异性结合到重组蛋白或镍柱的抗体免疫相互作用纯化重组蛋白来分离在其N端或C端用6-8组氨酸残基标记的重组蛋白。另选的标签可包括FLAG表位、GST或血凝素表位。技术人员通常使用此类方法。
可以根据标准程序分析由上述方法制备的FVIII蛋白。例如，可根据已知方法评估此类蛋白质的改变的凝血特性。
因此，本发明还提供了制备多肽的方法(如所公开的)，所述方法包括从编码多肽(通常为核酸)的核酸表达。这可方便地通过在导致或允许产生多肽的适当条件下培养包含此类载体的宿主细胞来实现。多肽也可以在体外***中制备。
本发明的方法和用途包括将核酸(转基因)递送(转导)到宿主细胞，其包括***和/或非***细胞。本发明的核酸、重组载体(例如rAAV)、方法、用途和药物制剂还可用于向对有需要的受试者递送、施用或提供蛋白质的方法中，作为一种治疗方法。以这种方式，转录核酸并且可在受试者体内产生蛋白质。受试者可得益于或需要该蛋白质，这是因为受试者具有蛋白质缺陷，或者因为作为治疗方法或其他方式，在受试者中产生蛋白质可赋予一些治疗效果。
包括慢病毒或细小病毒载体(例如AAV)序列、重组病毒颗粒的载体、方法和用途可用于递送具有生物学效应的编码FVIII的CpG减少的核酸变体以治疗或减轻一种或多种与FVIII缺陷或异常相关的症状。重组慢病毒或细小病毒载体(例如AAV)序列、质粒、重组病毒颗粒、方法和用途可用于对涉及或由于FVIII缺陷或异常的各种疾病状态提供治疗。
本发明的核酸、载体、表达载体(例如rAAV)和重组病毒颗粒、方法和用途允许治疗遗传疾病，例如FVIII缺陷。对于缺陷态疾病而言，基因转移可用于将正常基因引入受影响的组织用于替代疗法，以及使用反义突变形成疾病的动物模型。对于失衡的疾病状态而言，基因转移可用于在模型***中创建一种疾病状态，其然后可用于努力抵消疾病状态。使用核酸序列的位点特异性整合来纠正缺陷也是可能的。
在具体实施方案中，可将编码FVIII的CpG减少的核酸变体用作，例如，调节血液凝固级联的治疗剂和/或预防剂(蛋白质或核酸)或用作基因中的转基因。例如，编码FVIII的CpG减少的核酸变体可具有与野生型FVIII相似的凝血活性，或相比于野生型FVII的改变的凝血活性。基于细胞的策略允许在血友病A患者中连续表达编码FVIII的CpG减少的核酸变体。如本文所公开的，FVIII分子(核酸和蛋白质)的某些修饰导致在核酸水平上增加的表达、增加的凝血活性，从而有效地改善止血。
根据本发明，编码FVIII的CpG减少的核酸变体可用于多种目的。在一个实施方案中，提供用于调节血液凝固的核酸递送载体(即表达载体)，其中所述表达载体包含如本文所述的编码FVIII的CpG减少的核酸变体。将编码FVIII的表达载体施用于患者导致FVIII蛋白的表达，其用于改变凝血级联。根据本发明，如本文所述的编码FVIII蛋白的CpG减少的核酸变体或功能片段的表达增加止血。
在本发明的附加实施方案中，提供了用于施用包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的病毒载体的组合物和方法。在一个实施方案中，包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达载体是病毒载体。
包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达载体可以单独施用，或与可用于调节止血的其它分子组合施用。根据本发明，载体、表达载体或治疗剂的组合可单独施用于患者或药学上可接受的或生物学相容的组合物中。
病毒载体诸如慢病毒载体和细小病毒载体(包括AAV血清型及其变体)提供了用于离体、体外和体内将核酸递送到细胞中的方式，其编码蛋白质使得细胞表达编码的蛋白。AAV是可用作基因治疗载体的病毒，因为它们可穿透细胞并引入核酸/遗传物质，使得核酸/遗传物质可以稳定维持在细胞中。另外，例如，这些病毒可将核酸/遗传物质引入特定位点。因为AAV不与人的致病性疾病相关，所以AAV载体能够将异源多核苷酸序列(例如，治疗性蛋白质和药剂)递送到人患者但不导致显著的AAV发病或疾病。
可用于本发明的病毒载体包括但不限于多种血清型的腺相关病毒(AAV)载体(例如AAV-1至AAV-12等)和杂合/嵌合AAV载体、慢病毒载体和假型慢病毒载体(例如埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和猫免疫缺陷病毒(FIV))、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体(具有或不具有组织特异性启动子/增强子)、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、非病毒载体等。
AAV和慢病毒颗粒可有利地用作有效基因递送的载体。此类病毒体对于此类应用具有多个期望的特征，包括***和非***细胞的向性。使用这些载体的早期临床经验也被证明没有持续的毒性，并且免疫应答很小或不可检测。已知AAV通过受体介导的内吞作用或通过胞吞作用在体内和体外感染多种细胞类型。这些载体***已经靶向视网膜上皮细胞、肝脏、骨骼肌、气道、脑、关节和造血干细胞在人类中进行测试。例如，基于质粒DNA或微环的非病毒载体也是编码FVIII的大基因的合适基因转移载体。
可能期望引入一种载体，所述载体可提供例如所需基因的多个拷贝，并因此提供更大量的该基因的产物。已经在多个参考文献、专利和专利申请中详细描述了改善的AAV和慢病毒载体以及用于生产这些载体的方法，所述参考文献、专利和专利申请包括：WrightJ.F.(Hum Gene Ther 20:698-706,2009)a technology used for the production ofclinical grade vector at Children’s Hospital of Philadelphia。慢病毒载体也可在CHOP制备，并且其它载体可通过NHLBI基因治疗资源计划(GTRP)-慢病毒载体制备核心实验室(NHLBI Gene Therapy Resource Program(GTRP)-Lentivirus Vector ProductionCore Laboratory)通过慢病毒载体制备核心实验室获得。
因此，在本发明的各种实施方案中，载体包括慢病毒或细小病毒载体，诸如腺病毒载体。在具体实施方案中，重组载体是细小病毒载体。细小病毒是具有单链DNA基因组的小病毒。“腺相关病毒”(AAV)属于细小病毒家族。
因此，本发明提供包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的病毒载体。例如，重组AAV载体可包括编码FVIII的CpG减少的核酸变体，其中编码的FVIII蛋白任选地具有B结构域缺失。因此对受试者(例如哺乳动物)的载体递送或施用向受试者诸如哺乳动物(例如人)提供FVIII。
直接递送载体或体外转导人细胞，之后输注到体内将导致FVIII表达，从而对止血发挥有益的治疗效果。在本文所述的本发明因子VIII的情况下，此类施用增强促凝血活性。
AAV载体和慢病毒载体通常不包括与发病机理相关的病毒基因。此类载体通常具有完整或部分缺失的一个或多个野生型AAV基因，例如rep和/或cap基因，但保留至少一个功能性侧翼ITR序列，如将重组载体拯救、复制和包装到AAV载体颗粒中所必需的。例如，仅包括载体的基本部分，例如分别为ITR和LTR元件。因此AAV载体基因组将包括复制和包装所需的顺式序列(例如功能性ITR序列)。
重组AAV载体、以及其方法和用途包括任何病毒株或血清型。作为非限制性示例，重组AAV载体可基于任何AAV基因组，诸如AAV-1、AAV-2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh74、AAVrh10或AAV-2i8。此类载体可基于相同的菌株或血清型(或亚组或变体)，或者彼此不同。作为非限制性示例，基于一种血清型基因组的重组AAV载体可与包装载体的衣壳蛋白中的一种或多种相同。此外，重组AAV载体基因组可基于不同于包装载体的AAV衣壳蛋白中的一种或多种的AAV(例如AAV2)血清型基因组。例如，AAV载体基因组可以基于AAV2，然而三种衣壳蛋白中的至少一种可以为例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8或其变体。
在具体实施方案中，腺相关病毒(AAV)载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8、及其变体(例如，衣壳变体，诸如氨基酸***、添加、取代和缺失)，例如如WO 2013/158879(国际专利申请PCT/US2013/037170)、WO 2015/013313(国际专利申请PCT/US2014/047670)和US 2013/0059732(美国专利9,169,299，其公开了LK01、LK02、LK03等)中所示的。
AAV变体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74和AAV-2i8衣壳的变体和嵌合体。因此，提供了AAV载体和AAV变体(例如，衣壳变体)，所述AAV变体包含(衣壳化或包装)编码FVIII的CpG减少的核酸变体。
AAV和AAV变体(例如，衣壳变体)血清型(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)可能或可能不与其它AAV血清型不同，所述其它AAV血清型包括例如AAV1-AAV12、Rh74或Rh10(例如，不同于AAV1-AAV12、Rh74或Rh10血清型中的任一种的VP1、VP2和/或VP3序列)。
如本文所用，术语“血清型”是一个区别点，其用于指具有在血清学上与其它AAV血清型不同的衣壳的AAV。血清学特殊性基于与另一种AAV相比，对一种AAV缺乏抗体之间的交叉反应性来确定。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的不同(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)导致。尽管存在包含衣壳变体的AAV变体可能不与参考AAV或其他AAV血清型在血清学上不同的可能性，但它们与参考或其它AAV血清型相比至少有一个核苷酸或氨基酸残基不同。
在传统定义下，血清型意指感兴趣的病毒已经针对对于所有现存和已表征的血清型具有特异性的血清进行了中和活性的测试，并且未发现中和感兴趣的病毒的抗体。随着更多的自然出现的病毒分离物被发现和/或衣壳突变体生成，可能或可能不存在与当前存在的血清型中任一种的血清学差异。因此，在新病毒(例如AAV)不具有血清学差异的情况下，这种新病毒(例如AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，中和活性的血清学测试尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行，以根据传统血清型定义确定它们是否是另一种血清型。因此，为了方便和避免重复，术语“血清型”广义上是指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及可能在给定血清型的亚群或变体内的，不是血清学上不同的病毒(例如AAV)。
因此AAV载体包括与具体血清型的基因/蛋白质序列特性相同的基因/蛋白质序列。如本文所用，“与AAV1相关的AAV载体”是指与包含AAV1的一种或多种多核苷酸或多肽序列具有显著序列同一性的一种或多种AAV蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)。类似地，“与AAV8相关的AAV载体”是指与包含AAV8的一个或多个多核苷酸或多肽序列具有显著序列同一性的一种或多种AAV蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)。“与AAV-Rh74相关的AAV载体”是指与包含AAV-Rh74的一个或多个多核苷酸或多肽序列具有显著序列同一性的一种或多种AAV蛋白(例如，VP1、VP2和/或VP3序列)。与另一种血清型相关的此类AAV载体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8因此可具有一个或多个与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8不同的序列，但可表现出与一种或多种基因和/或蛋白质的显著序列同一性，和/或具有AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8的一种或多种功能特性(例如，诸如细胞/组织向性)。示例性非限制AAV变体包括VP1、VP2和/或VP3中任一种的衣壳变体。
在各种示例性实施方案中，与参考血清型相关的AAV载体具有包括与一个或多个AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8至少80％或更多(例如85％、90％、95％、96％)相同的序列或由组成的多核苷酸、多肽或其序列(例如，诸如ITR、或VP1、VP2和/或VP3序列)。
本发明的组合物、方法和用途包括AAV序列(多肽和核苷酸)及其子序列，其表现出与参考AAV血清型，诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8的小于100％的序列同一性，但与已知的AAV基因或蛋白质，诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8基因或蛋白质等不同或不相同。在一个实施方案中，AAV多肽或其子序列包括与任何参考AAV序列或其子序列，诸如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8至少75％或更多相同，例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等直至100％相同(例如，VP1、VP2和/或VP3衣壳或ITR)的序列或由其组成。在某些实施方案中，AAV变体具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸取代。
重组AAV载体，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8和变体，相关、杂交和嵌合序列可使用技术人员已知的重组技术构建，以包括与一个或多个功能AAV ITR序列侧接的一个或多个核酸序列(转基因)。
在本发明的一个实施方案中，编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体或表达载体可经由生物相容的载体中输注，例如经由静脉内注射施用于患者。本发明的编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体和表达载体可任选地包封到脂质体中或与其它磷脂或胶束混合以增加分子的稳定性。本发明的编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体和表达载体可以单独施用或与已知调节止血的其它试剂(例如因子V、因子Va或其衍生物)组合施用。
其中递送FVIII的适当组合物可由医师考虑各种生理变量(包括但不限于患者的病情和血液动力学状态)来确定。非常施用于不同应用和给药途径的各种组合物在本领域中为人们所熟知并在下文中描述。
由表达本发明的编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体和表达载体产生的包含纯化的FVIII蛋白的制剂，包含生理上可接受的基质并且可被配制成药物制剂。制剂可使用基本上已知的现有技术方法配制，其可与包含盐如NaCl、CaCl2和氨基酸诸如甘氨酸和/或赖氨酸的缓冲液混合并且在6至8的pH范围内。直至需要，包含FVIII的纯化制剂可以成品溶液的形式或以冻干或深冻的形式储存。
制剂可以以冻干形式储存并使用合适的重构溶液溶解成视觉上清澈的溶液。另选地，根据本发明的制剂也可制成液体制剂或制成被深冻的液体。根据本发明的制剂可任选地特别稳定，即可以在施用或递送之前以溶解形式长时间静置。
根据本发明的制剂可以单组分制剂形式或以多组分制剂形式与其它因子组合制成具有FVIII活性的药物制剂。在将纯化的蛋白质加工成药物制剂之前，对纯化的蛋白质进行常规的质量控制并形成提及的治疗形式。具体地，在重组制造期间，测试纯化的制剂中不存在细胞核酸以及源自表达载体的核酸，如EP 0 714 987中所述的。
药物蛋白质制剂可以介于30-100IU/kg(一I.U为100ng/ml)之间的剂量以每天注射一次使用或多至3次/天持续数天。患者可流血的情况下在诊所出现后立即进行治疗。另选地，患者每八至十二个小时接受一次推注，或者如果观察到充分改善，则每天一次输注FVIII。
因此，可将本发明的核酸、载体、重组载体(例如rAAV)和重组病毒颗粒以及其它组合物、药剂、药物、生物制剂(蛋白质)掺入药物组合物中。除此之外，此类药物组合物可用于体内或体外施用和递送于受试者。
在具体实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。此类赋形剂包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的免疫应答的任何药剂，并且其可施用但不具有不适当的毒性。
如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”是指适用于施用、体内递送或接触的一种或多种途径的生物学可接受的制剂，其为气态、液态或固态或它们的混合物。“药学上可接受的”和“生理上可接受的”组合物属于不是生物学上或其它方面不可取的材料，例如，所述材料可施用于受试者但不引起显著的不可取的生物学效应。因此，例如在将核酸、载体、病毒颗粒或蛋白质施用于受试者时可使用此类药物组合物。
药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体如水、盐水、甘油、糖和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括于其中，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，助剂物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可以存在于此类载体中。
药物组合物可以以盐的形式提供并且可以由许多酸形成，所述酸包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐趋于比相应游离碱形式更溶于水性或其它质子溶剂中。在其他情况下，制剂可以是在使用前与缓冲液组合的冻干粉末，其可包含以下物质中的任一种或全部：1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH范围为4.5-5.5。
药物组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如水包油或油包水)、混悬剂、糖浆剂、酏剂、分散剂和悬浮剂、涂层、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。此类药学上可接受的载体包括片剂(包衣或未包衣)、胶囊(硬或软)、微珠、粉末、颗粒和结晶。补充活性化合物(例如防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可掺入组合物中。
如本文所述或本领域技术人员已知的，可将药物组合物配制成与具体给药途径或递送途径相容。因此，药物组合物包括适用于通过各种途径给药的载体、稀释剂或赋形剂。
适用于胃肠外给药的组合物包括活性化合物的水溶液和非水溶液、悬浮液或乳液，所述制剂通常为无菌的并且可以与预期接受者的血液等渗。非限制性说明性示例包括水、缓冲盐水、汉克斯液、林格氏液、右旋糖、果糖、乙醇、动物油、植物油或合成油。含水注射悬浮液可包含增加悬浮液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。
另选地，活性化合物的悬浮液可被制备成适当的油注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
助溶剂和助剂可以加入制剂中。助溶剂的非限制性示例包含羟基基团或其它极性基团，例如醇类，诸如异丙醇；二醇，诸如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。助剂包括，例如，表面活性剂，诸如大豆卵磷脂和油酸；脱水山梨糖醇酯，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯；和聚乙烯基吡咯烷酮。
在制备药物组合物之后，可将其置于在合适的容器中并标记用于治疗。为施用含FVIII的载体或多肽，此类标记将包括施用的量、频率和方法。
适用于本发明的组合物、方法和用途的药物组合物和递送体系是本领域已知的(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)，第20版，MackPublishing Co.,Easton,PA；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)，第18版，Mack Publishing Co.,Easton,PA；The Merck Index(1996)，第12版，Merck PublishingGroup,Whitehouse,NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993),Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel和Stoklosa，Pharmaceutical Calculations(2001)，第11版，Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD；和Poznansky等人，Drug Delivery Systems(1980)，R.L.Juliano编辑，Oxford,N.Y.，第253-315页)。
本发明还提供了用于将编码FVIII的CpG减少的核酸变体引入细胞或动物中的方法。在一个具体实施方案中，本发明提供用于调节止血的方法。在一个实施方案中，方法包括在其中FVIII多肽在个体中表达的条件下，使个体(患者或受试者，诸如哺乳动物)与包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的核酸递送载体(例如，AAV载体)接触或施用所述核酸递送载体。在另一实施方案中，方法包括在其中FVIII多肽在个体表达的情况下，对个体(患者或受试者，诸如哺乳动物)的细胞提供包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的核酸递送载体(例如，AAV载体)。
从前述内容可以看出，编码FVIII的CpG减少的核酸变体可用于治疗与缺陷的、不足的或异常的血液凝固相关的病症。
可以足够或有效的量向对其有需要的受试者，施用编码FVIII的CpG减少的核酸变体(包括载体、重组载体(例如rAAV)、和重组病毒颗粒)的组合物，并且可提供本发明的方法和用途。“有效量”或“足量”是指以单一剂量或多剂量，单独或与一种或多种其它组合物(治疗剂或免疫抑制剂诸如药物)、治疗、方案或治疗方案试剂组合地提供任何持续时间(长期或短期)的可检测的应答、任何可测量或可检测程度或者任何持续时间(例如，数分钟、数小时、数天、数个月、数年或治愈)的受试者中的预期或期望的结果或对受试者的有益效果。
剂量可变化并取决于治疗所针对的疾病的类型、发作、进展、严重性、频率、持续时间或可能性，期望的临床终点，预先或同时治疗，受试者的一般健康、年龄、性别、种族或免疫学能力和本领域技术人员将理解的其它因素。如由治疗或疗法的任何不良副作用、并发症或其它风险因素以及受试者的状态所指示的，剂量、数量、频率或持续时间可按比例增加或减少。本领域技术人员将认识到可影响提供足以提供治疗或预防有效果的量所需的剂量和时间的因素。
实现治疗效果的剂量，例如载体基因组中的剂量/每千克体重(vg/kg))将基于若干因素而变化，所述因素包括但不限于：给药途径、实现治疗效果所需的异源多核苷酸表达水平、所治疗的特定疾病、对病毒载体的任何宿主免疫应答、对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质)的宿主免疫应答、以及表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员可基于上述因素以及其它因素确定rAAV/载体基因组剂量范围以治疗患有特定疾病或障碍的患者。通常，剂量范围为每千克受试者的重量，至少1×108或更多，例如1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或1×1014或更多的载体基因组(vg/kg)以实现治疗效果。小鼠中1×1010-1×1011，并且狗中1×1012-1×1013的AAV的剂量范围是有效的。
将血友病B用作示例，一般来讲，据信为了达到治疗效果，需要大于存在于正常个体的因子浓度的1％的凝血因子浓度，以将严重的疾病表型改变成中等表型。严重表型的特征在于关节损伤和危及生命的出血。为了将中等疾病表型转变为轻度表型，据信需要大于正常的5％的凝血因子浓度。正常人的FVIII水平为约150-200ng/ml血浆，但可能更低(例如，约100-150ng/ml的范围)或更大(例如，约200-300ng/ml的范围)，并且由于如例如通过活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)一期凝血测定所确定的功能性凝血，仍然认为是正常的。因此，可以通过表达FVIII来获得治疗效果，使得受试者/人中的FVIII总量大于正常受试者/人中存在的FVIII的1％，例如100-300ng/ml的1％。
关于治疗此类血友病受试者，典型的剂量是至少1×1010载体基因组(vg)每千克受试者的体重(vg/kg)，介于约1×1010至1×1011vg/kg受试者体重，或介于约1×1011至1×1012vg/kg受试者体重，或介于约1×1012至1×1013vg/kg受试者体重，以实现期望的治疗效果。AAV载体剂量可以为使得针对FVIII或AAV载体没有显著的免疫应答的水平，通常在剂量谱的下限。
用于治疗(例如，改善或提供治疗有益效果或改善)的“有效量”或“足量”的剂量通常有效提供对疾病的一种、多种或全部不利症状、后果或并发症，例如由疾病引起或与疾病相关的一种或多种不利的症状、障碍、疾病、病症、或并发症的在可测量的程度上的响应，但减少、降低、抑制、压制、限制或控制疾病的进展或恶化是令人满意的结果。
在单次给药中可以但不必要提供有效量或足够的量，但可能需要多次给药，并且可能但不必要单独给药或与另一种组合物(例如，药剂)、治疗、方案或治疗方案组合给药。例如，如由受试者的需要，所治疗疾病的类型、状态和严重程度或治疗的副作用(如果有的话)所示，所述量可按比例增加。此外，如果以单剂量或多剂量给出，而不具有第二种组合物(例如，另一种药物或试剂)、治疗、方案或治疗方案，则有效量或足量不需要有效或足够的，因为可包括高于或超过此类剂量的加剂量、量或持续时间，或者附加组合物(例如药物或试剂)、治疗、方案或治疗方案以便认为在给定的受试者中是有效的或足够的。被认为是有效的量还包括导致另一种治疗、治疗方案或方案(例如施用重组凝血因子蛋白(例如FVIII)以治疗凝血障碍(例如血友病A))的使用减少的量。
因此，本发明的方法和用途还尤其包括导致对另一种化合物、药剂、药物、治疗方案、处理方案、过程或治疗的需要或使用减少的方法和用途。例如，对于血液凝固疾病而言，如果在给定受试者中，较不频繁或剂量减少或消除施用重组凝血因子蛋白来补充受试者中的缺失或缺陷(异常或突变体)内源性凝血因子，则本发明的方法和用途具有治疗有益效果。因此，根据本发明，提供了减少对另一治疗或疗法的需要或使用的方法和用途。
有效量或足量不需要在所治疗的每个受试者中均有效，也不需要在给定组或人中对大部分治疗的受试者有效。有效量或足够量指在特定受试者而不是一组或普通人群中的有效性或足够性。如对于这种方法典型的，一些受试者对于给定的治疗方法或用途将表现出更大的响应，或者更小的响应或无响应。
术语“改善”是指受试者的疾病或其症状或潜在的细胞反应中的可检测或可测量的改善。可检测或可测量的改善包括疾病的发生、频率、严重度、进展或持续时间，或由疾病引起或与疾病相关的并发症的主观或客观的减少、降低、抑制、压制、限制或控制，或疾病的症状或潜在原因或后果的改善，或疾病的逆转。对于HemA而言，有效量将是例如降低受试者中急性出血事件的频率或严重度的量，或例如由凝血测定法所测得的减少凝血时间的量。
因此，本发明的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以实现预期治疗目的的组合物。确定治疗有效剂量完全在熟练的医师使用本发明提供的技术和知道的能力范围内。
治疗剂量将尤其取决于受试者的年龄和一般状况、异常凝血表型的严重度以及调节编码FVIII的CpG减少的核酸变体的表达水平的控制序列的强度。因此，人中的治疗有效量将落在相对宽的范围内，这可由医师根据个体患者对基于载体的FVIII治疗的反应来确定。此类剂量可以是单独的或与免疫抑制剂或药物组合。
组合物诸如药物组合物可递送至受试者，以便允许产生生物活性蛋白(例如，由CpG减少的核酸变体编码的因子VIII(FVIII))，或通过经由基于基因和/或细胞的疗法在体内诱导FVIII转基因的连续表达，或通过患者或供体细胞的体外修饰实现。在一个具体实施方案中，包含足够的遗传物质以使受体能够产生治疗有效量的FVIII多肽的药物组合物可以影响受试者的止血。
该组合物可以单独施用。在某些实施方案中，编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒在不具有免疫抑制剂的情况下提供治疗效果。在不施用免疫抑制剂的情况下，FVIII的治疗作用任选地持续一段时间，例如2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30或30-50天或更长，例如50-75、75-100、100-150、150-200天或更长。因此，在某些实施方案中，在不施用免疫抑制剂的情况下，编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒提供治疗效果并持续一段时间。
组合物可与至少一种其它药剂组合施用。在某些实施方案中，在施用编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒之前、基本上同时或之后，编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒与一种或多种免疫抑制剂结合施用。在某些实施方案中，在施用编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒之后一段时间之后，例如在施用编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒之后1-12、12-24或24-48小时，或2-4、4-6、6-8、8-10、10-14、14-20、20-25、25-30、30-50或多于50天，编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒与一种或多种免疫抑制剂结合施用。如果在施用编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒之后，在初始表达水平一段时间之后，例如，20-25、25-30、30-50、50-75、75-100、100-150、150-200或多于200天，存在FVIII的减少，则在施用编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、表达载体/重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒之后一段时间，这样施用免疫抑制剂。
在某些实施方案中，免疫抑制剂为抗炎剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂为类固醇。在某些实施方案中，免疫抑制剂是环孢菌素(例如环孢菌素A)、霉酚酸酯、利妥昔单抗或其衍生物。附加的具体试剂包括稳定化合物。
组合物可以在任何无菌、生物相容性药物载体中施用，包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。该组合物可以单独地，或与影响止血的其它试剂(例如辅因子)组合施用于患者。
单独的或与其它试剂组合的因子VIII可以在如本文所述的适当生物载体中施用或接触或直接输注到患者中。包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的本发明的载体和表达载体可通过各种方式施用于患者，以实现并任选地维持FVIII多肽的预防和/或治疗有效水平一段时间。本领域技术人员可容易地确定将本发明的编码FVIII的表达载体用于具体患者的治疗处理的特定方案。
用于生成腺病毒载体和施用于患者的方案已描述于美国专利No.5,998,205、No.6,228,646、No.6,093,699、No.6,100,242和国际专利申请No.WO 94/17810和No.WO 94/23744中，所述专利文献以引用方式全文并入本文。具体地，例如，AAV载体被用于将由CpG减少的核酸变体编码的因子VIII(FVIII)递送至对其有需要的患者。
由使用本发明的AAV载体递送的由CpG减少的核酸变体编码的因子VIII(FVIII)可通过已知的任何方式施用于患者。
本发明的方法和用途包括全身、区域性或局部递送和施用，或通过任何途径，例如通过注射或输注递送和施用。药物组合物的体内递送通常可使用常规注射器经由注射来完成，但可设想其它递送方法诸如对流加强递送(参见例如，美国专利No.5,720,720)。例如，组合物可皮下、表皮、皮内、鞘内、眶内、粘膜内、腹膜内、静脉内、胸膜内、动脉内、口服、肝内、经由门静脉或肌肉内递送。其它给药方法包括口服和肺部给药、栓剂和透皮应用。专门治疗患有凝血障碍的患者的临床医生可基于多个标准来确定用于施用包含编码FVIII的CpG减少的核酸变体的腺病毒相关载体的最佳途径，所述标准包括但不限于：患者的病情和治疗目的(例如,增强或减少凝血)。
本发明的方法和用途可与具有期望的治疗、有益、添加、协同或补充活性或效果的任何化合物、试剂、药物、治疗或其它治疗方案或方案组合。示例性组合组合物和治疗包括第二活性物质，诸如生物制剂(蛋白质)、试剂(例如，免疫抑制剂)和药物。此类生物制剂(蛋白质)、试剂、药物、治疗和疗法可在本发明的任何其它方法或使用(例如治疗受试者的凝血疾病如HemA的治疗方法)之前、基本上同时或之后施用或进行。
化合物、试剂、药物、治疗或其它治疗疗法或方案可作为组合组合物施用，或单独施用，诸如同时或串接或依次(之前或之后)递送或施用核酸、载体、重组载体(例如rAAV)或重组病毒颗粒。因此，本发明提供了其中本发明的方法或用途与本文所述或本领域技术人员已知的任何化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、方法、药品或组合物组合的组合。所述化合物、试剂、药物、治疗疗法、治疗方案、方法、药品或组合物可在施用本发明的核酸、载体、重组载体(例如，rAAV)或重组病毒之前、基本上同时或之后施用于受试者，或对受试者进行。
本发明可用于动物，包括用于人和兽医医学应用。因此合适的受试者包括哺乳动物，诸如人，以及非人哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型，例如小鼠和血液凝固疾病(诸如HemA)的其它动物模型，和本领域技术人员已知的其它动物模型。
适用于根据本发明的治疗的受试者包括那些具有或处于产生不足量或具有功能性基因产物(例如，FVIII蛋白)方面的缺陷的风险，或产生可导致疾病的异常的部分功能的或非功能性的基因产物(例如FVIII蛋白)的那些受试者。适用于根据本发明的治疗的受试者还包括具有导致疾病的异常或缺陷型(突变)基因产物(蛋白质)或处于产生导致疾病的异常或缺陷型(突变)基因产物(蛋白质)的风险的那些受试者，使得降低异常的或缺陷型(突变)基因产物(蛋白质)的量、表达或功能将导致疾病的治疗，或减少一种或多种症状或改善疾病。因此，目标受试者包括具有异常、不足或不存在的凝血因子产生的受试者，诸如血友病(例如血友病A)的受试者。
可测试受试者的免疫应答，例如针对AAV的抗体。因此根据本发明的方法，可在治疗之前筛选候选血友病受试者。受试者还在治疗后测试针对AAV的抗体，并且任选在治疗后监测一段时间。形成抗体的受试者可用免疫抑制剂治疗，或者可施用一种或多种附加量的AAV载体。
适用于根据本发明的治疗的受试者还包括具有或处于产生针对AAV的抗体的风险的那些受试者。可以使用多种技术将AAV载体施用或递送到此类受试者。例如，可以递送空衣壳AAV(即，缺乏FVIII核酸的AAV)以结合受试者中的AAV抗体，由此允许AAV载体携带编码FVIII的CpG减少的核酸变体以转化受试者的细胞。可基于在特定受试者中产生的AAV抗体的量，校准施用的空衣壳AAV的量。空衣壳可以是任何AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74或AAV-2i8。
另选地或附加地，AAV载体可通过直接肌内注射(例如,肌肉的一个或多个慢肌纤维)递送。在另一种替代方案中，引入股动脉的导管可用于经由肝动脉将AAV载体递送至肝脏。也可采用非手术方式，诸如内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)将AAV载体直接递送到肝脏，从而绕过血液和AAV抗体。其它导管***，诸如颌下腺导管，也可用作将AAV载体递送到形成或具有预先存在的抗AAV抗体的受试者中的入口。
可在形成由疾病引起或与疾病相关的不利症状、病症、并发症等之前进行对受试者的施用或体内递送。例如，可使用筛选(例如，遗传筛选)来鉴定作为发明组合物、方法和用途的候选者的此类受试者。因此，此类受试者包括筛选出对于功能基因产物(例如FVIII蛋白)的量不足或缺失为阳性，或产生异常的部分功能性或非功能性基因产物(例如，FVIII蛋白)的那些受试者。
根据本文公开的本发明的方法和用途对受试者的施用或体内递送可以在实施受试者已被鉴定为具有治疗所靶向的疾病、具有该疾病的一种或多种症状、或者即使该受试者不具有该疾病的一种或多种症状但已被筛选并被鉴定为如本文所示的阳性之后的1-2、2-4、4-12、12-24或24-72小时内实施。当然，本发明的方法和用途可在受试者已被鉴定为具有治疗所靶向的疾病、具有该疾病的一种或多种症状、或已被筛选并被鉴定为如本文所示的阳性后1-7、7-14、14-21、21-48或更多天、数月或数年实施。
如本文所用，“单位剂型”是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位包含任选与药物载体(赋形剂、稀释剂、赋形剂或填充剂)结合的预定数量，其在以一个或多个剂量施用时，被计算为产生期望的效果(例如，预防或治疗效果)。单位剂量形式可在例如安瓿和小瓶内，其可包括液体组合物或处于冻干或冻干状态下的组合物；例如，无菌液体载体可以在施用或体内递送之前加入。单个单位剂型可包括在多剂量试剂盒或容器中。重组载体(例如rAAV)序列、重组病毒颗粒及其药物组合物可以单一单位剂型后多个单位剂型包装以易于施用和获得剂量均匀性。
可测试受试者的FVIII量或FVIII活性以确定此类受试者是否施用于根据本发明的方法治疗。可在根据本发明的方法治疗之前，测试候选血友病受试者的FVIII量或活性。还可在根据本发明的方法处理后，测试受试者的FVIII量或FVIII活性。可在治疗之后，定期地(例如，每1-4周或1-6个月)监测此类经治疗受试者的FVIII量或FVIII活性。
可测试受试者对于一种或多种肝酶的不良反应，以确定此类受试者是否适用于根据本发明的方法进行治疗。因此，在根据本发明方法治疗之前，可针对一种或多种肝酶的量，筛选候选血友病受试者。还可在根据本发明的方法治疗后，测试受试者的一种或多种肝酶的量。可在治疗之后，定期地(例如，每1-4周或1-6个月)监测此类经治疗受试者的升高的肝酶。
示例性肝脏酶包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)，但也可监测指示肝损伤的其它酶。这些酶在循环中的正常水平通常被定义为具有较高水平的范围，高于该水平，酶水平被认为是升高的，并且因此指示肝损伤。正常范围部分地取决于由进行测定的临床实验室所使用的标准。
可监测受试者的出血事件以确定此类受试者是否有资格或响应于治疗、和/或反应度的量或持续时间。可监测受试者的出血事件以确定此类受试者是否需要附加治疗，例如后续AAV载体施用或施用免疫抑制剂或更频繁的监测。因此在根据本发明方法治疗之前和之后，监测血友病患者的出血事件。也可在根据本发明的方法治疗期间或之后，测试受试者的出血事件的频率和严重度。
本发明提供了具有包装材料和其中的一个或多个组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，其包括对组分的描述或对其中组分的体外、体内或离体使用说明。试剂盒可包含一组此类组分，例如核酸、重组载体、病毒(例如AAV)载体或病毒颗粒和任选的第二活性物质，诸如另一种化合物、试剂、药物或组合物。
试剂盒是指容纳试剂盒的一个或多个组分的物理结构。包装材料可无菌地保持组分，并且可由通常用于此类目的的材料(例如纸材、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管材等)制成。
标签或***物可包括其中的一种或多种组分、剂量、一种或多种活性成分的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学的识别信息。标签或插页可包括标识制造商、批号、制造地点和日期、到期日期的信息。标签或插页可包括识别制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。标签或插页可包括关于可使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或插页可包括向临床医师或受试者对于在方法、用途或治疗疗法或治疗方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明。说明书可以包括剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文所述的方法、用途、治疗方案或预防或治疗疗法中任一个的说明。
标签或插页可包括关于组分可提供的任何有益效果的信息，诸如预防或治疗有益效果的信息。标签或插页可包括关于潜在的不良副作用、并发症或反应的信息，例如关于其将不适于使用具体组合物的情况向受试者或临床医师发出警告。当受试者患有、将要或正在服用一种或多种可能与组合物不相容的其它药物，或受试者患有、将要或正在接受另一种可能与组合物不相容的治疗方案或治疗疗法时，也可能出现不良副作用或并发症，并且因此，说明书可包括关于此类不相容性的信息。
标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，其独立或固定到组件、试剂盒或包装材料(例如盒子)，或附接到容纳试剂盒组分的安瓿、管材或小瓶。标签或插页可另外包括计算机可读介质，诸如印刷有条形码的标签，磁盘，光盘诸如CD或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带、或电子存储介质诸如RAM和ROM或这些的混合，诸如磁/光存储介质、FLASH介质或存储型卡。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但本文描述了适宜的方法和材料。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物和其它参考文献、基因库(GenBank)引用和ATCC引文以参考形式全文并入。在冲突的情况下，说明书(包括定义)将起控制作用。
上文并且整个说明书和权利要求书中使用了涉及本发明的生物分子的各种术语。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征结构可由用于相同、等同或相似用途的另选的特征结构替代。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征结构(例如，编码FVIII的CpG减少的核酸变体、载体、质粒、表达/重组载体(例如，rAAV)序列或重组病毒颗粒)是具有等同或相似特征结构的示例。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“核酸”包括多种此类核酸，提及“载体”包括多种此类载体，并且提及“病毒”或“颗粒”包括多种此类病毒/颗粒。
如本文所用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或数值范围包括此类范围内的整数和值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，提及80％或更多的同一性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。
提及具有更多(更大)或更少的整数分别包括大于或小于参考数值的任何数值。因此，例如，提及小于100，包括99、98、97等，一路下降到数值一(1)；并且小于10，包括9、8、7等，一路下降到数值一(1)。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括此类范围内的值和整数的分数，以及此类范围内的整数的分数。因此，为了说明，提及数值范围，诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此提及1-50的范围包括11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最多至并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等。
提及一系列范围包括将该系列内的不同范围的边界的值组合的范围。因此，为了说明提及的一系列范围，例如范围1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-850，包括范围1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、50-75、50-100、50-150、50-200、50-250、100-200、100-250、100-300、100-350、100-400、100-500、150-250、150-300、150-350、150-400、150-450、150-500等。
本文通常使用肯定语言描述多个实施方案和方面来公开本发明。本发明还具体地包括其中全部或部分排除特定主题，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，尽管本发明在本文中一般不就本发明不包括的内容进行表达，但本发明中未明确排除的方面在本文中公开。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
本文公开了用于治疗血友病的基因治疗方法中的基因构建体。此外，这些因子VIII(FVII1)编码基因构建体可用于体外设置蛋白质表达***，以产生用于施用的重组FVIII蛋白质。每个基因构建体可任选地包括下列中的一个或多个：表达对照(例如启动子)元件、因子VIII基因和表达基因所需的其它调节特征结构，诸如内含子、ITR、终止密码子、聚A信号等。
实施例2
CpG减少因子VIII DNA序列和某些载体构建体、质粒构建体和AAV产生细胞系。
制备18种不同的编码FVIII的CpG减少的核酸变体(SEQ ID NO：1-18)，并在表达测定中进行评估。由突变转甲状腺素蛋白(TTRmut)启动子(SEQ ID NO：22)生成CpG减少的人FVIII cDNA构建体。
AAV-SPK-8011表达盒具有CpG减少的FVIII-X07核酸序列和用于包装的LK03衣壳。LK03衣壳与AAV3(一种非致病性、天然复制缺陷的单链DNA病毒)具有显著同源性。
包装质粒pLK03是7,484bp的质粒构建体，其携带在AAV2p5启动子控制下的AAV2Rep和AAV-LK03Cap基因、细菌复制起点和赋予细菌细胞中卡那霉素抗性的基因。在该构建体中，p5rep启动子已经移动帽基因的3'以降低形成野生型或伪野生型AAV物种的可能性，并增加载体的收率。
用于基因转移的克隆DNA是基因表达盒，其作为单链基因组包装在AAV-LK03衣壳中，从而在肝特异性启动子控制下编码人凝血因子VIII(hFVIII)。表达质粒被称为pAAV-TTRmut-hFVIII-X07。其通过在TTR启动子中引入4个位点突变而被修饰，并且编码区优化以增加人FVIII的表达。AAV表达盒包含以下元件：
●AAV2ITR
●转甲状腺素蛋白(TTR)启动子：其具有与野生型启动子相比，增加基因表达的4个位点突变的肝脏特异性转甲状腺素蛋白(TTR)启动子(Costa等人，1991)
●合成内含子：来源于人类延伸因子EF-1α基因
●FVIII编码序列：B结构域缺失的密码子优化的人FVIII编码序列。
●兔β球蛋白多聚A信号序列(Levitt等人，1989)。
●AAV2ITR
使用三种DNA质粒构建体转染人胚肾293细胞以通过无辅助病毒过程产生SPK-8011载体(Matsushita等人，1998)：
●将基因盒(hFVIII编码序列和相关的调节元件)克隆到质粒中以产生载体质粒，pAAV-TTRmut-hFVIII-X07。
●将缺乏病毒ITR的AAV病毒基因组(rep和cap)克隆到质粒中以产生AAV包装质粒pLK03，从而提供所需的AAV2rep和反式AAV-LK03帽基因用于AAV载体包装。将rep基因的病毒启动子(p5)重新定位于质粒中，以便防止通过非同源重组形成具有复制能力的AAV。
●将来自腺病毒-2的三个基因克隆到第三个质粒(pCCVC-AD2HP)中，提供必要的辅助病毒基因用于载体生产。质粒pCCVC-AD2HPv2是11,832bp质粒构建体，其携带三个腺病毒基因E2A、E4和VA RNA以提供AAV载体复制和衣壳化所需的“辅助”功能。质粒pCCVC-AD2HPv2是pCCVC-AD2HP的衍生物，其中包含AmpR基因和pUC ori序列的部分的DrdI-DrdI 1882bp限制性片段已经移除，并且用来自包含整个KanR基因和pUC ori序列的部分的质粒pAAV2-hRPE65v2的DrdI-DrdI片段替代。
用于AAV载体制备的细胞底物是原代人类胚胎肾细胞(HEK)293的衍生物。HEK293细胞系是由剪切的人5型腺病毒(Ad5)DNA转化的永久系(Graham等人，1977)。工作细胞库来源于费城儿童医院(CHOP)的细胞和分子治疗中心(CCMT)的已表征HEK293主细胞库。
实施例3
评价小鼠中的AAV-hFVIII载体。
将FVIII转基因构建体(hFVIII)包装到腺相关病毒(AAV)载体中并递送至小鼠。简单地说，4只血友病A/CD4-/-小鼠的组在8-10周龄时用4×1012vg/kg的AAV-hFVIII载体注射。使用免疫缺陷小鼠以能够量化FVIII血浆水平，因为正常小鼠中产生的对FVIII的抑制性抗体阻止了FVIII表达的长期分析。
测定FVIII表达水平，并且在一些情况下高于由编码hFVIII的CO3序列(SEQ IDNO：21)提供的表达。如图2所示，与参考AAV-CO3载体相比，包含AAV-SPK-8005的载体表达更高的hFVIII水平。数据令人惊讶地揭示多种DNA序列比编码FVIII的经密码子优化序列(CO3，SEQ ID NO：21)表达更高水平的FVIII。
在该研究中使用AAV-Spark8005(也被称为SPK-8005)，而不是AAV-LK03-hFVIII(也被称为AAV-LK03-hFVIII和SPK-8011)以确保小鼠肝细胞的有效转导(即hFVIII转基因表达)。因此，本研究旨在评价持续hFVIII表达的安全性，而不是AAV-LK03衣壳的安全性。
所用AAV-SPK-8005-hFVIII的三种剂量(4×1010、8×1010、1.6×1011vg/小鼠；基于25g的小鼠体重计，约1.6×1012、3.2×1012、6.4×1012vg/kg)被选择成分别产生约5-25、25-75和50-150％的hFVIII抗原水平。该研究涉及350只雄性NOD/SCID小鼠(表1)并且被分成两个子研究：主研究(n＝270)和生物分析研究(n＝80)。在主研究中，用载体或三种剂量的载体中的一种(4×1010、8×1010、1.6×1011vg/小鼠)处理60只小鼠。十只小鼠用于临床化学的第29/30天评估，10只用于血液学评估，并且对剩余的10只动物进行凝血评估。这30只小鼠在第29或30天处死。用载体或三种载体剂量中一种处理的另一组30只小鼠在第87天时间点类似地处理，并在第87天将其处死。在终止时，在主研究中对所有动物进行大体病理学观察，并且在每个时间点对10只动物/组进行全面组织病理学检查(血液学子集)。另一组30只未经处理的小鼠用于背景对照临床病理学测量。
在生物分析研究中，用载体或三种载体剂量中的一种注射20只小鼠。在测试品注射之前对这些动物采血并在第15天、第30天、第60天和第87天连续采血。每种样品收集的血浆的预定体积应当足以测定hFVIII抗原和D-二聚体水平。然而，由于血浆容量收集不足，除终点外，在所有时间点对单独的小鼠血浆仅进行单次测定。因此，对一些小鼠评估hFVIII抗原循环水平并且对其它小鼠评估D-二聚体水平。因为进行hFVIII ELISA(最少50uL)比进行D-二聚体ELISA(最少20uL)需要更多的血浆，因此测定的选择取决于收集的血浆量。
表1：小鼠研究设计
a.在预定剂量和研究的第15天、第30天、第60天和第87天从所有小鼠收集血液。
b.从总共30只小鼠(每个临床病理学评估10只未处理小鼠)收集血液，临床病理学-主研究背景对照水平。
c.AAV-SPK-8005-hFVIII也被称为SPK-8005
na＝不适用
血浆FVIII抗原水平：如图3A-3B所示，在87天过程中在hFVIII抗原的循环水平下观察到剂量响应。在低剂量载体(4×1010vg/小鼠)下，在注射后第60天观察到64+/-49ng/ml的平均hFVIII水平，并且在中剂量和高剂量下分别观察到115+/-60ng/ml和273+/58ng/ml。这些抗原水平代表正常hFVIII抗原的43％、77％和182％(150ng/mL等同于100％)。因此，在止血正常的NOD/SCID小鼠中，预计在三个剂量水平下的总(小鼠+人)FVIII水平分别为143％、177％和282％。因此，使用AAV-SPK-8005-hFVIII，在免疫缺陷小鼠的血浆中观察到持续且超生理水平的hFVIII，这使得该研究适于评估hFVIII的长期表达的安全性。
D-二聚体水平：为了评估由于hFVIII在止血正常但免疫缺陷小鼠中的持续表达而引起的血栓形成可能性，测量D-二聚体抗原水平。50只未经处理小鼠中的D-二聚体的平均预剂量水平为8.8+/-2.9ng/ml。图3C中的数据表示四个剂量组中的平均D-二聚体水平。在全部五个时间点时各组间的D-二聚体水平没有统计学上的差异(单因素方差分析p＝0.46)。结论表明，在高达正常的194％的水平下hFVIII持续表达(第30天)至少87天，与该小鼠品系中D-二聚体的水平升高无关。
临床和解剖病理学：九只动物(6只主研究和3只生物分析研究)在该研究过程期间早期安乐死或发现死亡。
对六只主研究动物进行组织病理学评估，并且这六只小鼠中的四只观察到恶性淋巴瘤，包括一只经载体对照注射的小鼠。(第1组动物7729、第3组动物7871、第3组动物7880和第3组动物7874)。认为肿瘤发现的生物学意义不明确。认为个体组与对照组比较结果的统计学意义不大。在该品种中发生胸腺淋巴瘤以及脾和***的肿瘤增大的高自发频率是已知的(Prochazka，Gaskins，Shultz，&Leiter，1992)。
这六只小鼠中不存在与测试制品有关的非肿瘤性发现。认为观察到的微观结果是偶然的，并且具有在该品种和年龄的小鼠中通常观察到的性质，和/或具有对照和经处理的动物中的相似发生率和严重度，因此认为与施用AAV-SPK-8005-hFVIII无关。
主研究中包含的剩余234只小鼠存活至预定时间点。在整个研究中小鼠中没有出现不利的或AAV-SPK-8005-hFVIII相关的临床观察结果。认为所有结痂形成、皮毛损失或皮变薄和尾部弯曲的临床观察结果与施用AAV-SPK-8005-hFVIII无关，因为这些观察结果在这个小鼠物种中是常见的和/或在各组之间发生。剂量组之间的体重和体重增益在相当的，并且不受施用AAV-SPK-8005-hFVIII影响。在第29/30安乐死之后，组4平均体重从第32天到研究完成看起来显著(p<0.05或p<0.01)的减少归因于组重量的重新分布(与组1相比，组4中的一些较重动物被安乐死)，并且与AAV-SPK-8005-hFVIII施用无关。在整个研究中，组4小鼠以与其它组相当的方式增加体重。认为平均体重或体重增益的所有其它显著(p<0.05或p<0.01)差异均与AAV-SPK-8005-hFVIII不相关，因为增加和减少是不定时发生的，不具有剂量依赖性并且被认为与小鼠体重的正常波动相关。
对主研究动物进行临床病理学研究。在每个时间点(第29/30天和第87天)对10只小鼠/组进行临床化学参数分析。对另一组10只小鼠/组进行凝血评估，并对另一组10只小鼠/组进行血液学测量。对所有动物均进行大体病理学检查，并对用于血液学评估的10只小鼠组进行组织病理学检查。从第29/30天和第87天安乐死时间点，小鼠的血液学或临床化学参数没有AAV-SPK-8005-hFVIII相关的变化。一般来讲，在相比于对照值，存在血液学和临床化学参数的显著(p<0.05或p<0.01)差异时，该差异与AAV-SPK-8005-hFVIII无关，因为相应参数不受影响并且观察结果不是剂量依赖性的。所有临床化学和血液学参数的变化都是不定时发生的，归因于单个动物，具有实验动物中通常观察到的变化幅度和/或在对未经处理动物进行评估的临床病理学参数范围内。
在施用AAV-SPK-8005-hFVIII的小鼠中观察到凝血参数的变化。在第29/30时间点时观察到平均aPTT的剂量依赖性减少，其中组3和组4显著不同于(p<0.05或p<0.01)对照值。在第87天时间点时，与对照组相比，在所有AAV-SPK-8005-hFVIII组中也均观察到平均aPTT值的显著(p<0.01)减少。在第29/30和第87天时，与对照组相比，AAV-SPK-8005-hFVIII组中还观察到平均凝血酶原时间减少，然而组2和3在第29/30天的减少以及组4在第87天的减少仅是统计学上显著的(p<0.05或p<0.01)。在整个研究中平均纤维蛋白原值在剂量组之间是相当的。认为这些影响与AAV-SPK-8005-hFVIII的药理作用有关，并且不认为是不利的。如图3A-3C所示以及上文所讨论的，用AAV-SPK-8005-hFVIII注射的所有小鼠均表达hFVIII抗原，并且因此预测超生理学水平的总FVIII在这些止血正常小鼠的血浆中循环。预计这些水平将对凝血参数具有影响，诸如减少aPTT和凝血酶原时间。
在研究的第29天或第30天处死一组120只主研究小鼠(30只/组)。在这些小鼠上没有发现与AAV-SPK-8005-hFVIII相关的大体病理学观察结果。器官重量分析显示，在第29天处死的10只对照和经载体注射的动物之间，心脏和肾脏的绝对重量不同；然而，在第30天处死的10只对照和经载体注射的动物之间没有观察到，因此这个发现的意义不明确。在第29天观察到的心脏和肾脏绝对重量的统计学上的显著增加(并且这些重量按脑重量的百分比计)不具有微观相关性。此外，按体重的百分比计，心脏和肾脏重量与对照没有显著差异。组2动物的平均绝对肺重量显著增加，但认为这是偶然并且与AAV-SPK-8005-hFVIII无关，因为没有剂量依赖性。在第29/30天没有注意到其它器官重量变化。
在第29/30天的组织病理学分析中，五只动物具有肿瘤发现。在一只组2动物中观察到细支气管肺泡腺瘤(7824)。在一只组2动物(7838)、一只组3动物(7885)和一只组4动物(7941)中观察到恶性淋巴瘤。在一只组4动物(7942)的胃中观察到腺瘤。组1中没有观察到肿瘤发现。认为肿瘤发现的生物学意义是不明确的。个体组与对照组比较结果的统计学意义不大。然而，值得注意的是，肿瘤发现仅在第29/30天在经处理的动物中观察到。在缺乏相当年龄的NOD SCID小鼠的历史对照数据的情况下，这些肿瘤发现是不确定的。
注意到没有测试制品相关的非肿瘤性微观发现。认为观察到的微观发现是偶然的，具有通常在该品种和年龄的小鼠中观察到的性质，和/或具有在对照和经处理动物中的相似发生率和严重度，因此认为与施用AAV-SPK-8005-hFVIII无关。
另一组120只主研究小鼠(30只/组)在注射后87天处死并以类似方式分析。尽管未观察到认为与AAV-SPK-8005-hFVIII相关的大体病理学观察结果，但在四只小鼠中观察到损伤(一只未经组织学分析的胸腺肿大，一只与恶性淋巴瘤相关的胸腺肿大，一个未经组织学分析的脾脏肿大，一只睾丸变色)。与在第29/30天观察到的结果相比，观察到心脏重量减少，不具有重量增加。此外，观察到肝脏重量减少。心脏重量的统计学显著的变化很小，并且与剂量无明显关系。绝对肝脏重量的统计学显著的变化很小，并且肝脏对体重和脑重的权重在各组之间相当。因此，轻微的变化被解释为是偶然的并且与AAV-SPK-8005-hFVIII的施用无关。注意在第87天没有其它器官重量变化。
在注射后第87天对小鼠进行的组织病理学鉴定4只具有肿瘤发现的动物。在一只组2动物(7808)和三只组3动物(7868、7869和7870)中观察到恶性淋巴瘤。组1中没有观察到肿瘤发现。认为肿瘤发现的生物学意义不明确。个体组与对照组比较的统计学意义不大。然而，值得注意的是，在第87天仅在经处理动物中观察到肿瘤发现。在缺乏相当年龄的NODSCID小鼠的历史对照数据的情况下，这些肿瘤发现是不确定的。
关于非肿瘤性变化，注意没有测试制品相关的微观发现。认为观察到的微观发现是偶然的，并且具有在该品种和年龄的小鼠中通常观察到的性质，和/或具有对照和经处理的动物中的相似发生率和严重度，因此认为与施用AAV-SPK-8005-hFVIII无关。
结论：通过静脉内注射，以4×1010、8×1010或1.6×1011vg/小鼠的剂量对雄性NOD/SCID小鼠单次施用AAV-SPK-8005-hFVIII或对照制品是完全耐受的。AAV-SPK-8005-hFVIII不导致任何与测试制品相关的死亡率、不利的临床观察结果或体重变化。在第29/30天或第87天，雄性小鼠中不具有在器官重量、血液学或凝血参数方面的毒理学重要差异并且不具有治疗相关的大体病理学或组织病理学发现。认为在两个安乐死时间点处观察到的平均aPTT和凝血酶原时间减少与在这些止血正常小鼠中表达的超生理水平FVIII相关，并且不是不利的。在主研究(终点评估)中，在60只经载体注射的小鼠中的九只或15％的动物中观察到恶性肿瘤。这九只小鼠中的7只患有淋巴瘤，这是***中最常见的。已知该免疫缺陷小鼠品系具有高淋巴瘤自发频率(Prochazka等人，1992)，并且寿命仅为8.5个月。因此，本研究中观察到的肿瘤频率不太可能与AAV-SPK-8005-hFVIII施用相关。本研究的目的是评价在约三个月的过程中持续表达hFVIII的安全性。它不被设计用于评价AAV-SPK衣壳。AAV-SPK和免疫缺陷小鼠品系用于确保hFVIII的高水平表达。对NOD/SCID小鼠施用AAV-SPK-8005-hFVIII导致持续的和高水平的hFVIII。因此，该研究适于评估hFVIII的长期表达的安全性。
实施例4
评价非人灵长类动物(NHP)中的AAV-SPK-8005和AAV-SPK-8011(LK03衣壳，FVIII-X07(SEQ ID NO:7))载体。
基于小鼠中的结果，将包装到腺相关病毒(AAV)载体中的FVIII转基因构建体递送至非人灵长类动物(NHP)。
简单地说，在雄性短尾猴中进行剂量范围研究施用单次静脉内输注AAV-SPK-8005或AAV-SPK-8011(LK03衣壳)。在8周内评价hFVIII的表达。图4示出了各动物组和剂量水平
NHP在约30分钟内使用校准的输液泵通过隐静脉接受静脉输注。对猕猴预筛选针对AAV衣壳的中和抗体。最初确定所有经处理动物在载体施用前具有<1:3效价。这样做以确保成功的肝转导，即使低效价抑制全身递送后肝细胞对载体的摄取(Jiang等人，2006)。在基因转移之前，所有动物对针对FVIII的中和抗体的存在也是阴性的。
通过不检测食蟹猴内源性FVIII的人特异性ELISA来测量血浆hFVIII水平。除中等剂量组中的一只猕猴外，研究中的所有动物均在载体递送后表达hFVIII。人因子VIII抗原水平在载体施用后约1-2周达到峰值。在基因转移一周后，用2×1012vg/kg AAV-SPK-8005转导的NHP表达13.2±3％的hFVIII抗原水平(平均值±平均值的标准误差)。在基因转移一周后，在下一个治疗组(5×1012vg/kg)中三只动物中的两只的平均hFVIII水平为27±0.2％。在任何时间点在该组的第三只猕猴中均不能检测到人FVIII。在重新测试基线血浆样品时，确定该动物事实上对于抗-AAV抗体的存在是阳性的，并且初始确定的<1:3的效价不正确。最后，在1×1013vg/kg的最高测试剂量下，在AAV输注后观察到峰值hFVIII抗原水平为54.1±15.6％。
如在表达人FIX的NHP中的研究所预期的，在第4周左右约三分之一的动物中人FVIII表达下降，伴随这3只猕猴中出现对hFVIII的抑制抗体(在图5中用ε符号标记)。对hFVIII的物种特异性抗体的形成先前已经被记录在非人类灵长类中，并且可能是由于人转基因产物和内源性食蟹猴FVIII之间的多个氨基酸残基的差异而导致(McIntosh,J.等人，Blood 121:3335-44(2013))。
为了评估由于人FVIII的持续表达引起的潜在血栓形成，在该研究中测量D-二聚体抗原水平。应当注意，关于食蟹猴中D-二聚体抗原水平的临床相关性甚至正常值的报道很少；作为参考，人类中D-二聚体的正常范围低于500ng/ml。由于动物表达内源性食蟹猴FVIII，所以由于肝基因转移产生hFVIII将导致超生理学水平的FVIII活性。
以5×1012vg/kg剂量给药但不表达人FVIII的动物在AAV输注后两周具有峰值863ng/ml。与基线值相比，剩余的动物未示出D-二聚体抗原水平的任何显著增加。总之，这些结果表明人FVIII在该研究中以目标水平的表达与增加的血栓形成风险无关。
载体施用四周后，没有明显的载体相关变化。肝功能检查示出正常值，具有轻微的波动，所述波动看起来与载体剂量无关，因为其在大多数情况下在给药之前存在(图6)。
图7示出了直至第5周的D-二聚体水平。在载体施用后一周，当循环人FVIII在约100％的峰值时，高剂量组中的一只动物具有D-二聚体水平的轻微(577ng/ml)的短暂升高；在该单次升高测量之后，D-二聚体水平迅速恢复正常。值得注意的是，D-二聚体水平和hFVIII抗原水平之间没有相关性(图7，下图)。
对于AAV-SPK-8011(LK03衣壳)载体，三个食蟹猴组(n＝3)用增加剂量的AAV-SPK-8011(LK03衣壳)进行处理(2×1012、6×1012和2×1013(vg/kg)；图4)。监测动物的临床观察结果、体重临床病理学(临床化学、血液学、凝血、尿分析)。此外，在整个研究中评估hFVIII抗原水平、FVIII抑制抗体和D-二聚体水平。
图9示出了hFVIII抗原数据。平均hFVIII抗原水平在约2-3周达到峰值，其中在低剂量组中观察到22.3±6.2％hFVIII，在中剂量和高剂量组中分别观察到61.6±15.7％和153±58.1％，其使用150ng/ml作为100％正常hFVIII抗原水平(图9A-9D)。因此，不同于小鼠肝脏，LK03AAV衣壳血清型在体内有效地转导NHP肝细胞。
将用AAV-SPK-8011(LK03衣壳)获得的FVIII表达水平与用基于AAV5和AAV8衣壳递送FVIII的AAV载体获得的FVIII报道水平进行比较。比较结果显示用AAV-SPK-8011(LK03衣壳)获得的FVIII水平大于使用具有AAV5和AAV8衣壳的AAV载体递送的FVIII报道水平(图10)。
在施用2×1012、6×1012或2×1013vg/kg的AAV-SPK-8011(LK03衣壳)之后，测量对食蟹猴血浆中hFVIII的体液应答。在基线和指定时间点通过ELISA评估动物的抗hFVIIIIgG抗体。
尽管在基因转移后立即观察到治疗性hFVIII水平，但在大多数动物中，该水平在第4周左右开始下降。这与使用另一AAV-hFVIII载体的先前研究一致，并且与抗hFVIII抗体增加相关。其他人也在NHP中的肝AAV-hFVIII基因转移后观察到抗FVIII抗体的生成(McIntosh,J.等人，Blood 121:3335-44(2013))。
实施例5
AAV-LK03衣壳在非人灵长类动物(NHP)中的生物分布。
在非GLP研究中评价AAV-LK03衣壳在非人灵长类动物中的生物分布。编码人凝血因子IX(AAV-LK03-hFIX)的AAV-LK03-衣壳化载体的静脉内给药示出两种主要靶组织是肝脏和脾脏(图11)。脾向性不是AAV-LK03的独特特征。例如，已经以强安全记录用于多种肝脏定向的基因治疗试验(例如NCT02396342、NCT02082860、NCT02576795)的AAV5衣壳靶向脾脏，其功效与靶向非人类灵长类动物的肝脏的功效相同(如果不高于)(Paneda等人，2013)。SPK-8011表达盒使用小鼠转甲状腺素蛋白或TTR启动子，这被认为是肝特异性的(Costa，1991)。为进一步支持启动子的肝特异性，在施用包装与SPK-8011相同的表达盒(即AAV-SPK-8005)的不同AAV载体后，基于PCR的表达分析测量小鼠的肝脏和脾脏中源自载体的FVIII表达。如图12所示，与来源于肝细胞的表达相比，脾脏中的人FVIII表达低几个数量级。
尽管已使用其它AAV载体，包括几种血友病B的载体((NCT02396342、NCT01620801、NCT00076557、NCT02484092、NCT02618915、NCT00979238、NCT01687608)和一种血友病A的载体(NCT02576795)进行了研究，但是这是使用AAV-LK03进行的首次临床研究。圣犹大儿童研究医院与伦敦大学学院合作进行的研究利用携带自补基因组的AAV8载体，该基因组编码密码子优化的人因子IX cDNA，scAAV2/8-LP1-hFIXco。在平均3.2年内接受该载体的十名受试者具有1-6％的稳定的因子IX水平，并且所有参与者均已经停止或减少了预防性因子代替疗法的使用(Nathwani等人，2014)。血友病A的临床研究使用编码人FVIII的AAV5衣壳化载体(NCT02576795)。2016年提供的初步数据显示，在多个受试者中基因转移后FVIII活性增加范围在2-60％内，其中跟进长达16周(BioMarin，2016年4月)。
实施例6
在体外设置中分析的AAV-LK03衣壳的转导效率。
将来自食蟹猴和人源的原代肝细胞用表达萤光素酶的AAV-LK03载体以范围为500至62,500载体基因组/细胞的四种不同的感染复数(MOI)转导。转导后72小时，分析萤光素酶表达。
AAV-LK03衣壳在培养物中的转导人肝细胞中独特地展示出显著较高的效率。在图13所示的代表性实施例中，与体外非人灵长类肝细胞相比，LK03展示出在转导人肝细胞时约5倍更高的效率。重要的是，这些结果在多个MOI和平行测定研究中是一致的。
实施例7
评估载体编码序列的种系传递。
对载体编码序列的种系传递潜力的评估对于基因转移策略的临床翻译是至关重要的。该研究被设计具有以下目的：(1)评估AAV-SPK和AAV-LK03向***的传染并确定载体清除的动力学；和(2)确保对兔的AAV施用成功，这通过分析血浆中的人因子IX抗原和抗FIX抗体来确认。
在该研究中，兔模型用于分析两种载体衣壳即AAV-SPK和AAV-LK03向***的载体传染(表2)。AAV-SPK向***传染示出剂量依赖性和时间依赖性动力学，其中较高剂量示出***中载体序列水平升高并持续较长时间。该动力学与先前在AAV8载体情况下观察到的非常相似(Favaro P等人，Molecular Therapy 17:1022–1030(2009))。相比之下，在AAV-LK03载体情况下发生对***的有限传染。这不太可能是由于经AAV-LK03注射小鼠中较低的整体载体暴露，因为由AAV-LK03表达的hFIX水平与AAV-SPK载体情况下观察到的水平相似或比之更高，并且介导肝定向的hFIX表达的能力可用作基因转移的替代物。
表2：研究设计
组号 测试材料 剂量水平(vg/kg) 动物号
1 AAV-SPK-hFIX.C16 1×1012 5
2A AAV-SPK-hFIX.C16 1×1013 3
2B* AAV-SPK-hFIX.C19-PD 1×1013 2
3 AAV-LK03-hFIX.C16 1×1012 5
4 AAV-LK03-hFIX.C16 1×1013 5
5 载体 N/A 2
*在AAV-SPK组中使用两种不同的hFIX编码序列，即三只动物接受AAV-SPK-hFIX.C16，并且两只动物用AAV-SPK-hFIX.C19-Padua(PD)处理。因为该研究的主要目标是评估两种新型AAV衣壳的种系传播，所以认为这是可接受的。hFIX.C16和hFIX.C19-Padua转基因之间的主要区别在于后者是密码子优化的并且编码高特异性活性hFIX变体。
方法
动物和载体：新西兰白兔得自Covance Research Products(Denver,PA)，并在6个月龄时用费城儿童医院载体中心制备的AAV载体处理。测试和对照物品经由耳缘静脉施用。
***采集：由Argus Research Lab,Inc.(Horsham,PA)的研究人员开发的人造***(AV)用于***采集。AV内衬避孕套，其尖端移除并加入收集管，并且AV填充有温水(55℃)。***样品得自由传情母鹿刺激的经训练雄鹿。在注射前和注射后1、2、4、6、8和10周以及3-8个月时收集样品。将***样品运送到Charles River Laboratories(Reno,NV)用于使用经验证的实时定量PCR测定法分析载体拷贝数。
血液样品采集：在AAV施用之前和多个时间点(注射前、注射后1周和注射后1-6个月)通过耳内侧动脉或耳缘静脉穿刺收集血液。收集后将每个样品置于冰上、加工成血浆并储存在-80℃冰箱中，直到运输至Sponsor，其中它也被保存在-80℃冰箱中，直至进行测定。
人因子IX水平：如下，使用夹心式FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals,FIX:EIA)对兔血浆中的人FIX(hFIX)蛋白水平进行量化：首先，用识别hFIX且不与内源性兔FIX(1:1000稀释)交叉反应的捕获抗体涂布微量滴定板的孔。将具有已知人hFIX浓度的参照血浆稀释以形成标准曲线(将最高标准[500ng/ml]连续稀释至7.8ng/ml)。根据预期浓度稀释样品血浆，使得吸光度值落入标准曲线的范围内。在将样品加入孔中后，将板在室温下温育90分钟，然后洗涤三次。将对hFIX的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗加入板中以结合捕获的FIX(1:100稀释)。在洗涤平板以移除未结合的缀合抗体后，在与1步Ultra TMB底物(Thermo Scientific，目录号34028)温育之后测量过氧化物酶活性。用1M硫酸终止反应并在450nm吸光度设定下在SpectraMax M2e酶标仪上读取。获得的吸光度值与样品中存在的hFIX浓度成正比。
抗hFIX抗体水平：抗hFIX测定在概念和方法上与上述hFIX ELISA相似。简单地说，用1μg/ml的重组hFIX(Benefix，Wyeth)涂覆板。在温育血浆样品后，将山羊抗兔IgG HRP-缀合的抗体(SIGMA，A4914)用于检测。认为IgG水平比基线读数高两倍的样品是阳性。
结果
对***的载体传染
以两种剂量：1×1012vg/kg(低剂量)或1×1013vg/kg(高剂量)，对新西兰兔注射在ApoE/hAA肝特异性启动子控制下表达hFIX的AAV-SPK或AAV-LK03(每组n＝5)载体。在注射前和注射后1、2、4、6、8和10周以及3-8个月时，获得来自所有兔的***样品。基因组DNA从***样品纯化并使用定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定分析hFIX序列的存在。经验证的测定由Charles River Laboratories(Reno,NV)开发。***样品如果其具有高于定量下限(LLOQ)的可检测hFIX水平(以约200ng/反应，10拷贝/反应或50拷贝/μg)，则认为***样品是阳性的。对在至少三个连续时间点上对hFIX载体序列为阴性的来自兔的***样品不进行进一步分析。
来自所有载体和经载体注射的动物的预处理***DNA对于hFIX序列是阴性的。来自用低剂量AAV-SPK-hFIX(1×1012vg/kg)注射的兔子的***对于hFIX序列一般为阴性，除了在1-4周具有低水平的三只动物之外(最多3151个拷贝/μg DNA或～1×10-2个拷贝/单倍体基因组)。超过4周收集的样品对于载体序列均不是阳性的(表3)。在高剂量AAV-SPK-hFIX(1×1013vg/kg)下，存在更高水平的载体(最多178,352个拷贝/μgDNA或0.59个拷贝/单倍体基因组)，并且在五只动物之间花费更长时间清除，至多达5月(表3)。除一只动物之外(第1周)，用低剂量的AAV-LK03-hFIX处理的兔子未示出hFIX序列对***的传染(表3)。此外，在10倍更高剂量下观察到非常少的对***的载体传染，其中三只动物在所有时间点时缺少任何hFIX序列，并且两只动物在第2周时示出低水平(最多：392个拷贝/μgDNA或1.3×10-3个拷贝/单倍体基因组)，但在以后的时间点时未示出(表3)。在两只经载体注射的动物中，一只在第1周(56个拷贝/μgDNA)和在第5个月(96个拷贝/μgDNA)具有伪发现。这些值接近LLOQ，并且很可能代表***采集或DNA制备步骤时的污染。
表3：AAV-SPK和AAV-LK03施用之后，根据时间检测兔***中的hFIX DNA序列。
载体 剂量 前 W1 W2 W4 W6 W8 W10 M3 M4 M5 M6 M7 M8
SPK 低 0/5 3/5 3/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Ndt Ndt Ndt
SPK 高 0/5 5/5 4/5 4/5 3/5 1/5 2/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5
LK03 低 0/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Ndt Ndt Ndt
LK03 高 0/5 2/5 2/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Ndt Ndt Ndt
5只动物中具有阳性***样品的动物数。
W＝周；M＝月；Ndt＝未测定。
血浆人类FIX抗原水平
在指定的时间点时测量来自上述动物的血浆样品中的循环hFIX水平(图14A-14B和表4)。
表4：在载体施用后，人FIX表达水平(ng/ml)
ND＝没有检测到
在低剂量组中，与AAV-SPK相比，AAV-LK03载体似乎是更有效的载体，如由循环hFIX水平所测量的。在用AAV-LK03或AAV-SPK处理六个月后，平均hFIX水平分别为552±217ng/ml对164±45ng/ml(图14A)。然而，这种差异未达到统计学意义，这可能是由于有限的动物数所致。有趣的是，在施用AAV-SPK载体后七天未检测到hFIX表达，然而在相同时间点观察到来源于AAV-LK03的稳健表达。两只动物(兔子#5和#15)中的低hFIX水平在背景之上几乎检测不到，这可能是由于注射失败。从分析中取消这些动物不改变缺少统计显著性。
当以高剂量测试时，两种衣壳看起来等同有效的。具体地讲，在用1×1013vg/kgAAV-LKO 3或AAV-SPK处理六个月后，平均hFIX水平分别为2226±868ng/ml对2052±909ng/ml(图14B)。值得注意的是，在AAV-SPK组中使用两种不同的hFIX编码序列，即三只动物接受AAV-SPK-hFIX.C16，而两只动物用AAV-SPK-hFIX.C19-Padua(PD)处理。hFIX.C16和hFIX.C19-PD转基因之间的主要差异在于后者是密码子优化的并且编码高特异性活性hFIX变体，其影响蛋白质的生物活性但不影响抗原水平，如由ELISA所测量的。
抗-FIX抗体
基于其他人的报道，预计大约20-40％的动物将形成针对人FIX载体的抗体(Favaro P等人，Molecular Therapy 17：1022-1030(2009))。图15A-15B和表5A与5B总结了该研究中的抗AAV IgG水平。有趣的是，用低剂量的AAV-LK03处理的五只动物中的三只在载体施用一个月后对人FIX抗体呈阳性，但IgG水平随时间下降，并且在研究结束时，仅一只动物几乎是基线水平的两倍(表5B)。在这组兔子中抗FIX IgG出现和不明确的清除的动力学与在第28天观察到的hFIX水平急剧下降，随后是在循环hFIX中的“反弹”非常相关(图14A)。此外，用AAV-SPK-hFIX.C19-Padua处理的两只动物中针对hFIX的高抗体效价可解释这两只兔子中的低表达水平。
表5A：单个经AAV注射的兔中对人FIX的抗体形成(IgG，ng/ml)的总结
N/A，不可用
表5B：随时间变化的抗hFIX抗体阳性的每组的兔的数量
结论
在多至八个月的过程中使用经过验证的测定量化AAV-SPK和AAV-LK03载体对***的传染。在施用高载体剂量后一周，在全部5只兔子的***中均检测到AAV-SPK载体序列。大多数动物在第10周时清除序列，并且最后检测到的阳性样品在第5个月时发生。这与AAV8载体的以相同剂量的载体施用于兔的时间进程相似(Favaro P等人，Molecular Therapy 17:1022–1030(2009))。与之相比，在高剂量该载体之后观察到AAV-LK03的非常有效的分布，其中5只动物中的3只在任何时间点时均示出***中无载体序列。载体对***的较低的传染不太可能是由于兔中AAV-LK03的较低总体暴露。通过测量hFIX血浆水平(基因转移的替代物)确认兔成功注射了每种AAV载体。在该研究中在高剂量(1×1013vg/kg)下，在注射有AAV-LK03和AAV-SPK的动物中观察到类似的hFIX循环水平，这展示出载体在介导肝基因转移中同样有效。
与评价表达hFIX转基因的AAV2和AAV8载体的种系传递的研究一致，一些动物可能由于兔和人因子IX之间的氨基酸差异而产生抗hFIX抗体。
这些结果增加了目前关于AAV载体种系传播可能性的数据体。AAV-SPK具有与先前研究的血清型，AAV2和AAV8载体相似的模式(Favaro P等人，Molecular Therapy 17:1022–1030(2009))。即，存在AAV载体序列对***的剂量依赖性传染，其随时间推移完全清除。然而，AAV-LK03与AAV2、AAV8和AAV-SPK的不同之处在于对***的非常少的载体分布，这使得该载体衣壳可能在基因毒性方面比其它载体更安全。
实施例8
将进行临床研究以确定单次IV输注AAV-FVIII的安全性和动力学。将用于AAV载体的AAV衣壳将在预临床研究中示出具有良好的安全性和功效，在约1x1012vg/kg或更高的剂量下，任选在1-3个月的载体输注之后达到临床相关FVIII活性水平的能力；并使中和抗体(Ab)与AAV衣壳交叉反应比AAV8少约10％。代表性临床研究的设计可如表6中所示。
表6：AAV-FVIII临床研究设计
实施例9
TTR启动子
转甲状腺素蛋白(TTR)启动子的特征最初描述于Costa和Grayson 1991，NucleicAcids Research 19(15):4139-414中。TTR启动子序列是从TATTTGTGTAG到TATTGACTTAG的经修饰序列。
具有4个核苷酸突变(TTRmut)的TTR启动子，SEQ ID NO:22
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCT
实施例10
CpG减少了编码FVIII的转基因构建体和示例性AAV衣壳。
FVIII编码CpG减少的核酸变体X01(SEQ ID NO：1)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X02 (SEQ ID NO:2)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X03 (SEQ ID NO:3)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X04 (SEQ ID NO:4)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X05(SEQ ID NO:5)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X06(SEQ ID NO:6)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X07(SEQ ID NO:7)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X08(SEQ ID NO:8)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X09(SEQ ID NO:9)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X10(SEQ ID NO:10)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X11(SEQ ID NO:11)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X12(SEQ ID NO:12)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X13(SEQ ID NO:13)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X14(SEQ ID NO:14)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X15(SEQ ID NO:15)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X16(SEQ ID NO:16)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X17(SEQ ID NO:17)
FVIII编码CpG减少的核酸变体X18(SEQ ID NO:18)
野生型因子VIII-BDD cDNA(SEQ ID NO:19)
V3因子VIII cDNA(SEQ ID NO:20)
ATGCAGATTGAGCTGAGCACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGAGGTTCTGCTTCTCTGCCACCAGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCTGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCCTGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTCTTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTATGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAACAGCAGGCACCCCAGCACCAGGCAGAAGCAGTTCAATGCCACCACCATCCCTGAGAATGACATAGAGAAGACAGACCCATGGTTTGCCCACCGGACCCCCATGCCCAAGATCCAGAATGTGAGCAGCTCTGACCTGCTGATGCTGCTGAGGCAGAGCCCCACCCCCCATGGCCTGAGCCTGTCTGACCTGCAGGAGGCCAAGTATGAAACCTTCTCTGATGACCCCAGCCCTGGGGCCATTGACAGCAACAACAGCCTGTCTGAGATGACCCACTTCAGGCCCCAGCTGCACCACTCTGGGGACATGGTGTTCACCCCTGAGTCTGGCCTGCAGCTGAGGCTGAATGAGAAGCTGGGCACCACTGCTGCCACTGAGCTGAAGAAGCTGGACTTCAAAGTCTCCAGCACCAGCAACAACCTGATCAGCACCATCCCCTCTGACAACCTGGCTGCTGGCACTGACAACACCAGCAGCCTGGGCCCCCCCAGCATGCCTGTGCACTATGACAGCCAGCTGGACACCACCCTGTTTGGCAAGAAGAGCAGCCCCCTGACTGAGTCTGGGGGCCCCCTGAGCCTGTCTGAGGAGAACAATGACAGCAAGCTGCTGGAGTCTGGCCTGATGAACAGCCAGGAGAGCAGCTGGGGCAAGAATGTGAGCACCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCAGACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCATGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCACCTGCAGGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
CO3因子VIII cDNA(SEQ ID NO:21)
全长盒，其包括突变的TTR启动子(TTRmut),合成内含子,CpG减少的因子VIII cDNA,聚 A和ITR(SEQ ID NO:23)
全长质粒，其包括突变的TTR启动子(TTRmut),合成内含子,CpG减少的因子VIII cDNA, 聚A和ITR(SEQ ID NO:24)
由X01-X18核酸序列编码的FVIII-BDD。SQ序列以粗体/下划线示出(SEQ ID NO:25)
具有BDD的野生型FVIII(SEQ ID NO:26)
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
AAV-LK03 VP1衣壳(SEQ ID NO:27)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRPL
在AAV-SPK-8005和AAV-SPK-hFIX中使用的AAV-SPK VP1衣壳(SEQ ID NO:28)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAV
GRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
hFVIII载体(WT,CO3,x09,X02,X06,X08,X15,X05,X18,X14,X01,X12,X04,X11,X07,X03,X16,X13,X17和X10)的同一性百分比矩阵
所用的某些定义/缩写
BDD：删除的全部或至少部分的B结构域(BD)
FVIII-BDD：B结构域缺失的FVIII
SQ：SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29)
FVIII/SQ：具有SQ的FVIII
FVIIIX01-X18：CpG减少的FVIII编码核酸变体，其分别以SEQ ID No：1-18示出。
TTRmut：具有4个突变的TTR启动子，其从TAmGTGTAG至TATTGACTTAG
CO3：密码子优化的FVIII核酸突变体，其示为SEQ ID NO：21
NHP：非人灵长类动物
ALT：丙氨酸转氨酶
D-二聚体：来自血凝块分解的蛋白质片段
SPK-8005：AAV衣壳(SEQ ID NO:28)+TTRmut-hFVIII-X07；也被称为AAV-SPK-8005
SPK-8011：AAV LK03衣壳(SEQ ID NO:27)+TTRmut-hFVIII-X07；也被称为AAV-SPK-8011
虽然上文已经描述并具体例示了本发明的某些实施方案，但不旨在将本发明限于此类实施方案。可在不脱离本发明的范围和精神的情况下进行各种修改，如以下权利要求所述的。

Claims (105)

1.一种编码具有B结构域缺失的因子VIII(FVIII)的核酸变体，其中，所述核算变体与SEQ ID NO:7具有92％或更大的同一性。
2.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体与SEQ ID NO:7具有93％或更大的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体与SEQ ID NO:7具有94％或更大的序列同一性。
4.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体与SEQ ID NO:7具有95％或更大的序列同一性。
5.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体与SEQ ID NO:7具有95％-100％的序列同一性。
6.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体具有20个或更少，15个或更少，10个或更少的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
7.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体具有不超过5个的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
8.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体具有4个、3个、2个、1个或0个胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
9.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体编码具有序列SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29)的一个或多个氨基酸缺失，或整个序列SFSQNPPVLKRHQR缺失的SEQ ID NO:25。
10.根据权利要求1所述的核酸变体，其中所述核酸变体编码SEQ ID NO:25。
11.一种编码具有B结构域缺失(FVIII-BDD)的因子VIII(FVIII)的核酸变体，其中所述核酸变体具有比SEQ ID NO:19更少的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
12.根据权利要求12所述的核酸变体，其中所述FVIII-BDD为哺乳动物的。
13.一种编码具有B结构域缺失(hFVIII-BDD)的人因子VIII(FVIII)的核酸变体，其中所述核酸变体具有不超过2个的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
14.根据权利要求14所述的核酸变体，其中所述核酸变体具有1个胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
15.根据权利要求14所述的核酸变体，其中所述核酸变体不具有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
16.根据权利要求1-16中任一项所述的核酸变体，其中所述编码的FVIII-BDD或hFVIII-BDD与由SEQ ID NO:19编码的hFVIII-BDD相同。
17.根据权利要求1-17中任一项所述的核酸变体，其中所述核酸变体不同于FVIII-V3(SEQ ID NO:20)和CO3(SEQ ID NO:21)。
18.根据权利要求1-18中任一项所述的核酸变体，其中所述核酸变体编码具有SFSQNPPVLKRHQR(SEQ ID NO:29)的一个或多个氨基酸缺失，或者整个序列SFSQNPPVLKRHQR缺失的SEQ ID NO:25。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的核酸变体，其中所述核酸变体编码SEQ ID NO:25。
20.一种载体，其包含根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体。
21.一种表达载体，其包含根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体。
22.根据权利要求22所述的表达载体，其选自腺病毒相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、质粒或慢病毒载体。
23.根据权利要求23所述的表达载体，其中所述AAV载体包含AAV血清型或AAV假型，其中所述AAV假型包含不同于ITR血清型的AAV衣壳血清型。
24.根据权利要求23或24所述的表达载体，其还包含内含子、表达控制元件、一种或多种腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)和/或填充物多核苷酸序列。
25.根据权利要求25所述的表达载体，其中所述内含子位于所述核酸变体内或侧接所述核酸变体。
26.根据权利要求25所述的表达载体，其中所述表达控制元件可操作地连接至所述核酸变体。
27.根据权利要求25所述的表达载体，其中所述AAV ITR侧接所述核酸变体的5’或3’末端。
28.根据权利要求25所述的表达载体，其中所述填充物多核苷酸序列侧接所述核酸变体的5’或3’末端。
29.根据权利要求25-29中任一项所述的表达载体，其中所述内含子、表达控制元件、一个或多个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)和/或填充物多核苷酸序列已被修饰以具有减少的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的表达载体，其中所述内含子、表达控制元件、一个或多个腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)和/或填充物多核苷酸序列已被修饰以具有20个或更少、15个或更少、10个或更少、5个或更少、或0个胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。
31.根据权利要求25、27、30和31中任一项所述的表达载体，其中所述表达控制元件包括组成型或可调控制元件、或组织特异性表达控制元件或启动子。
32.根据权利要求25、27、30和31中任一项所述的表达载体，其中所述表达控制元件包括赋予肝脏中的表达的元件。
33.根据权利要求25、27、30和31中任一项所述的表达载体，其中所述表达控制元件包括TTR启动子或突变TTR启动子。
34.根据权利要求34所述的表达载体，其中所述突变TTR启动子包含SEQ ID NO:22。
35.根据权利要求25-35中任一项所述的表达载体，其中所述突变ITR包含下列中任一项的一个或多个ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、或AAV-2i8AAV血清型、或它们的组合。
36.根据权利要求24-30中任一项所述的表达载体，其中所述载体包含以SEQ ID NO:23示出的ITR、启动子、聚A信号和/或内含子序列。
37.一种AAV载体，其包含根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体或根据权利要求25-37中任一项所述的表达载体。
38.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含经修饰的或变体AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，或野生型AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳序列。
39.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含修饰的或变体AAV VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或者AAV-2i8VP1、VP2和/或VP3序列具有90％或更多的同一性。
40.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含VP1、VP2和/或VP3衣壳序列，其选自下列中的任一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或者AAV-2i8AAV血清型。
41.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含衣壳，其与LK03衣壳(SEQID NO:27)具有90％或更多的序列同一性。
42.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含衣壳，其与SPK衣壳(SEQ IDNO:28)具有90％或更多的序列同一性。
43.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含LK03衣壳(SEQ ID NO:27)。
44.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含SPK衣壳(SEQ ID NO:28)。
45.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含核酸变体SEQ ID NO:7和LK03衣壳序列(SEQ ID NO:27)。
46.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含核酸变体SEQ ID NO:7和SPK衣壳(SEQ ID NO:28)。
47.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含核酸变体和以下项中的一项或多项：SEQ ID NO:23序列中的突变TTR启动子(TTRmut)、合成内含子、多聚A和ITR。
48.根据权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含所述核酸变体和以下项中的一项或多项：EQ ID NO:23序列中的突变TTR启动子(TTRmut)、合成内含子、多聚A和ITR，以及LK03衣壳序列(SEQ ID NO:27)或SPK衣壳(SEQ ID NO:28)。
49.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体，或根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体。
50.根据权利要求50所述的宿主细胞，所述宿主血细胞表达由所述核酸变体编码的FVIII。
51.一种宿主细胞，其包含根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体。
52.根据权利要求52所述的宿主细胞，所述宿主血细胞产生根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体。
53.一种药物组合物，其包含生物相容性载体或赋形剂中的根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体、根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体、或根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体。
54.根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体、根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体、或根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体，其包封于脂质体中或与磷脂或胶束混合。
55.根据权利要求54或55所述的药物组合物，其还包含空衣壳AAV。
56.根据权利要求54或55所述的药物组合物，其还包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和/或AAV-Rh74血清型的空衣壳。
57.根据权利要求54或55所述的药物组合物，其还包含与施用的所述AAV载体相同的血清型的空衣壳AAV。
58.根据权利要求54或55所述的药物组合物，其中所述空衣壳为LK03衣壳(SEQ ID NO:27)或SPK衣壳(SEQ ID NO:28)。
59.根据权利要求56-59中任一项所述的药物组合物，其中所述空衣壳与所述AAV载体的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
60.一种用于将核酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物细胞中的方法，其包括向所述哺乳动物或哺乳动物细胞施用或使所述哺乳动物或哺乳动物细胞接触根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体，根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体，或根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体，从而将核酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物细胞中。
61.一种治疗需要因子VIII的哺乳动物的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体、根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体、或根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体；和
(b)向所述哺乳动物施用一定量的根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体、根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体、或根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体，其中所述因子VIII在哺乳动物中表达。
62.根据权利要求61或62所述的方法，其中由核酸变体编码的所述因子VIII在所述哺乳动物的细胞、组织或器官中表达。
63.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞包括分泌细胞。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞包括内分泌细胞或内皮细胞。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞包含肝细胞、窦状内皮细胞、巨核细胞、血小板或造血干细胞。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述哺乳动物的组织或器官包括肝脏。
67.根据权利要求61-67中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物产生不足量的因子VIII蛋白、或缺陷型或异常型因子VIII蛋白。
68.根据权利要求61-67中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物具有血友病A。
69.根据权利要求61-67中任一项所述的方法，其中所述由核酸变体编码的因子VIII以对所述哺乳动物具有有益或治疗效果的水平表达。
70.一种治疗对其有需要的患者的止血相关疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的在生物学可接受的载体中的根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体、根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体、或根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体。
71.根据权利要求61、62或71所述的方法，其中所述哺乳动物或所述患者患有选自下列的疾病：血友病A、血管性血友病和与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血病、弥散性血管内凝血(DIC)以及过度抗凝治疗失调相关的出血。
72.根据权利要求61-72中任一项所述的方法，其中根据权利要求1-20中任一项所述的核酸变体、根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体、或根据权利要求38-49中任一项所述的AAV载体经由静脉内、动脉内、肌内、皮下、腔内或通过插管或通过导管递送至所述哺乳动物或所述患者。
73.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中FVIII以基本上不增加血栓形成风险的水平表达。
74.根据权利要求74所述的方法，其中所述血栓形成风险通过测量纤维蛋白降解产物确定。
75.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中FVIII以比存在于不具有血友病A的受试者中的FVIII水平的1％大的水平表达。
76.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中FVIII以比存在于不具有血友病A的受试者中的FVIII水平的3％大的水平表达。
77.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中FVIII的活性持续至少1周、2周、3周或4周、或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月、或至少1年是能检测的。
78.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中FVIII以比存在于不具有血友病A的受试者中的FVIII水平的1％或3％大的水平表达并持续至少1周、2周、3周或4周、或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月、或至少1年。
79.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中FVIII以具有持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天、周或月的治疗效果的水平表达。
80.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中所述FVIII以约20％的FVIII活性或大于20％活性的水平存在于哺乳动物或患者中并持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天、周或月。
81.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中所述FVIII以正常FVIII水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的水平表达。
82.根据权利要求61-72中任一项的方法，其中所述AAV载体以少于1x1012载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者的剂量施用，并且所述FVIII以约20％活性或大于20％活性的水平在哺乳动物或患者中产生并持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续日、周或月。
83.根据权利要求61-72中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约5x1011载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者的剂量施用，并且所述FVIII以约20％活性或大于20％活性的水平在哺乳动物或患者中产生并持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续日、周或月。
84.根据权利要求61-84中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物或所述患者为人。
85.根据权利要求61-85中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物、所述患者或所述人对于AAV是血清阳性或血清阴性的。
86.根据权利要求61-86中任一项所述的方法，其还包括将AAV空衣壳施用于所述哺乳动物或所述患者。
87.根据权利要求61-86中任一项所述的方法，其还包括施用AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和/或AAV-Rh74血清型的空衣壳。
88.根据权利要求61-86中任一项所述的方法，其还包括施用与所施用的AAV载体相同血清型的空衣壳AAV。
89.根据权利要求89所述的方法，其中所述空衣壳为LK03衣壳(SEQ ID NO:27)或SPK衣壳(SEQ ID NO:28)。
90.根据权利要求87-90中任一项所述的方法，其中所述空衣壳与所述AAV载体的比率为约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
91.根据权利要求61-91中任一项所述的方法，其还包括施用免疫抑制剂。
92.根据权利要求61-91中任一项所述的方法，其还包括在施用所述AAV载体后施用免疫抑制剂。
93.根据权利要求61-91中任一项所述的方法，其还包括在施用AAV载体之后1小时直至45天内的时间段内施用免疫抑制剂。
94.根据权利要求92-94中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制剂包含类固醇、环孢菌素(例如环孢菌素A)、霉酚酸酯、利妥昔单抗或它们的衍生物。
95.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约1×108至约1×1014个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的范围施用。
96.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约1×109至约1×1013个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的范围施用。
97.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约1×1010至约1×1012个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的范围施用。
98.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约1×1011至约1×1012个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的范围施用。
99.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约1×1012至约1×1013个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的范围施用。
100.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约1×1013至约1×1014个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的范围施用。
101.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约5×1011至约1×1012个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的范围施用。
102.根据权利要求61-95中任一项所述的方法，其中所述AAV载体以约5×1011个载体基因组/千克(vg/kg)哺乳动物或患者重量的剂量施用。
103.根据权利要求61-103中任一项所述的方法，其还包括分析或检测哺乳动物的AAV抗体的存在或量、针对AAV的免疫应答、FVIII抗体、针对FVIII的免疫应答、FVIII量、FVIII活性水平、一种或多种肝酶的量或水平或频率、和/或出血事件的严重性或持续时间。
104.一种制备FVIII蛋白质的方法，所述方法包括在细胞中表达如权利要求1-20中任一项所述的核酸变体、或根据权利要求21-37中任一项所述的载体或表达载体，并回收由所述细胞产生的所述FVIII蛋白质。
105.根据权利要求105所述的方法，其还包括纯化或分离由所述细胞产生的所述FVIII蛋白质。
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