JP7237903B2 - 止血疾患を治療するための変異因子viiiのゲノム組込及び発現のための改良された発現カセット - Google Patents
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Description
この出願は、2014年8月13日に提出された米国仮特許出願第62/036,936号に対する優先権を主張する。全本、表、配列表及び図面を含む先の出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれている。
イントロダクション
(1)ヒトFVIII(hFVIII)の固有特性は、同様のサイズの他のタンパクと比較して発現することが困難である。
(2)FVIII cDNAの大きいサイズ及び配列特異的効果がAAV生産を妨げる再配列と関連している。
(3)重篤な(FVIII<1%)血友病A患者の25~30%において生じる、タンパク療法に呼応した抗FVIII抗体(阻害薬)生成の高い速度。
たFVIIIをコードする核酸変異体は、発現増加を示し、細胞中に移された場合、特別のコドンに最適化された配列(CO/CO3)に対して4~5倍であり(例えば、図6B参照)、FVIIIタンパク分泌の増大及び従って活性の増大(例えば図7参照)に結びつく。また、そのようなコドンが最適化されたFVIIIをコードする核酸変異体は、異なるAAVベクターの血清型中により効率的にパッケージされ、AAV血清型を超えてAAVベクターの生産増大に結びつく(例えば、表3-5参照)。
る。
いて、第VIII因子を必要とする哺乳動物を治療する方法は:FVIIIをコードする核酸変異体、FVIIIをコードする核酸変異体を含む発現ベクター、又は、FVIIIをコードする核酸変異体を含むウイルス若しくはAAVのベクターを提供するステップと;FVIIIをコードする核酸変異体によってコードされる第VIII因子が哺乳類の被検体中で発現されるように、FVIIIをコードする核酸変異体、FVIIIをコードする核酸変異体を含む発現ベクター、又は、FVIIIをコードする核酸変異体を含むウイルス若しくはAAVのベクターの一定量を哺乳類被検体に投与するステップを含む。
ことを示した(Sabatinoら、Mol Ther 19、442-449、2011)。また、この戦略は、先在する無効化するcFVIII抗体を有する血友病AイヌにおいてcFVIIIに対する阻害因子を根絶した(Finn, J.D.ら、Blood
116、5842-5848、2010)。これらのデータは、AAV-FVIIIが疾病表現型を著しく改善し、FVIII阻害因子を除去することができることを実証する。興味深いことには、cFVIIIはヒトFVIII(hFVIII)より本質的に安定しており、生物活性が増大する結果となる(Sabatino, D.Eら、Blood
114、4562-4565、2009)。したがって、cFVIIIのAAV容量は、hFVIIIの治療容量を予測しない。これは、両方の種において同様の生物活性を有し、人間における治療的AAV用量を予測した第IX因子と対照的である。顕著に、血友病イヌモデルは、血友病Bのための肝臓及び筋肉の試みにおける導入遺伝子に対する効能及び免疫反応の両方の優れた予測因子であった。
1)細胞及び/又は動物における発現増加
2)活性増大(例えば、増加した凝固によって反映される)
3)安定性の増大
4)現在用いられているBドメインに関する免疫原性の明白な増加なしで、在来のhFVIIIより低いAAV用量で治療効果を達成する、FVIIIを削除した、構築する。
酸因子をベースとする。特定のウイルスベクターは、レンチウイルス、偽型レンチウイルス、及び、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター等のパーボウイルスベクターを含む。さらに提供されるのは、変異体FVIIIポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターである。
71:5124-32(1997);B型肝炎ウイルス・コア・プロモーター、Sandigら、Gene Ther. 3:1002-9(1996);アルファフェトプロテイン(AFP)、Arbuthnotら、Hum. Gene. Ther., 7:1503-14(1996)である。肝臓において活性なエンハンサーの一例は、アポリポタンパクE(apoE)HCR-1及びHCR-2(Allanら、J. Biol.
Chem、272:29113-19(1997))である。
ン抑制性システム(Gossenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992));テトラサイクリン誘導系(Gossenら、Science.268:1766-1769(1995)参照;Harvey,ら、Curr.Opin.Chem.Biol.2:512-518(1998)参照);RU486誘導系(Wangら、Nat. Biotech. 15:239-243 (1997)及びWangら、., Gene Ther. 4:432-441 (1997));及び、ラパマイシン誘導系(Magariら、J. Clin. Invest. 100:2865-2872(1997);Riveraら、Nat.
Medicine. 2:1028-1032(1996))を含む。この文脈において有用なその他の調節可能な制御因子は、特定の生理的状態(例えば、温度、急性期、発達)によって制御されるものである。
ITR配列又はイントロンの1つ以上のコピー等の配列に隣接する因子を含む。
対象化合物に対して適切な方法(例えば、クロマトグラフ法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC解析等)によって測定される。
から構成された核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因、及び、オリゴヌクレオチドが使用される特定の用途に依存するであろう。
えば、コドン最適化されたFVIIIコード核酸変異体は、野生型FVIIIをコードする遺伝子に対して、又は、互いに対して(つまり、本明細書に開示されているCO1対CO2、CO1対CO3、CO2対CO3等)75%~85%同一性を有していてもよい。
現によって大量のFVIIIが生産されてもよい。例えば、第VIII因子(FVIII)をコードする核酸変異体の一部分又はすべては、例えば、大腸菌等の細菌細胞、又は、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、CHO細胞若しくはHeLa細胞等の哺乳動物細胞株における発現に適したプラスミドベクター中に挿入されてもよい。あるいは、一実施形態において、FVIIIを含む、標識された融合タンパクを生成することができる。そのような標識されたFVIII融合タンパクは、DNA分子の一部分又はすべてによってコードされ、正確なコドンリーディングフレームにおいて、大腸菌のような細菌細胞、又は、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含むがそれらに限定されない真核細胞における発現に適したプラスミドベクター中に挿入される所望のポリペプチドタグの一部分又はすべてをコードするヌクレオチド配列に連結される。
クから利益を得るか又はタンパクを必要としてもよい。
て、その発現が止血を向上させるものをコードしてもよい。ある実施形態において、第VIII因子(FVIII)をコードする核酸変異体は、PACE/フーリン切断部位の変異、欠損若しくは置換を有するFVIIIタンパク等のFVIIIポリペプチド変異体又はその機能性フラグメントをコードする。
る。これらのベクターシステムは、網膜上皮、肝臓、骨格筋、気道、脳、関節及び造血幹細胞をターゲットとして、ヒトにおいてテストされた。非ウイルスベクター、例えば、プラスミドDNA又は小環をベースとしたものは、FVIIIをコードするような大きい遺伝子のための好適な遺伝子移入ベクターである。
Vector Production Core Laboratoryによる、レンチウイルスベクター生産コア研究所を通して入手可能である。
している。例えば、ベクターの必須部分(例えば、ITR因子及びとLTR因子)だけが、それぞれ含まれている。従って、AAVベクターゲノムは、複製及びゲノム組込(例えば、機能的なITR配列)のためにシスで必要とされる配列を含むだろう。
1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74若しくはAAV-2i8、遺伝子又はタンパク等の既知のAAV遺伝子又はタンパクとは区別され、かつ、同一でないものを含む。一実施形態において、AAVポリペプチド又はその部分配列は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74又はAAV-2i8(例えば、VP1、VP2及び/又はVP3)等の任意の参照AAV配列又はその部分配列に対して、少なくとも75%以上、例えば、80%、85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%等、又は、最大100%同一である配列を含んでいる又は当該配列からなる。特別な態様において、AAV変異体は、1個、2個、3個、4個、5個、5~10個、10~15個、15~20個、又は、それ以上のアミノ酸置換を有する。
ッファー、並びに、グリシン及び/又はリジン等のアミノ酸と、6~8のpH領域で混合されてもよい。必要とされるまで、FVIII変異体を含む精製された製剤は、完成した溶液の形態、又は、凍結乾燥若しくは急速冷凍された形態で格納することができる。
ることができる。
1)細胞によって又は動物において発現増加を示す。
2)細胞によって分泌の増加を示す。
3)活性の増大を示す。例えば、凝固の向上によって反映される。
4)安定性の向上を示す。
5)AAVベクターによるゲノム組込の向上を示す。
当業界で知られている(例えば、Remington:The Science and
Practice of Pharmacy (2003) 20版、Mack Pu
blishing Co., Easton、PA;Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18版、Mack Publishing Co., Easton、PA;The Merck Index (1996) 12版、Merck Publishing Group、Whitehouse、NJ;Pharmaceutical Principles of Solid
Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.;Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11版、Lippincott Williams & Wilkins、Baltimore、MD;及び、Poznansky et al.、Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed.,
Oxford, N.Y.,253-315頁を参照されたい)。
治癒した)にわたる任意の測定できる若しくは検知できる程度の利益を被検体に提供する量を表す。
1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013若しくは1×1014又は
それ以上に及ぶであろう。マウスにおける1×1010~1×1011の範囲のAAV用量、及び、イヌにおける1×1012-1×1013のAAV用量が有効であった。
又は治療計画が含まれていてもよいので、第2の組成(例えば、別の薬剤又は作用物質)、治療、プロトコル又は治療計画を伴わない一回の又は複数回の投与で与えられる場合でも、有効な量又は十分な量が有効又は十分である必要はない。また、有効であると考えられる量は、凝固障害(例えば血友病A)の治療のための組み換え型の凝固因子タンパク(例えばFVIII)の投与等のような、別の治療、治療計画又はプロトコルの使用の低減をもたらす量を含む。
タンパクをコードするコドン最適化核酸変異体)、又は、いずれかの機能性フラグメント)の生産を可能にするように被検体に送達されてもよい。特別な実施形態において、レシピエントが治療的有効量のFVIIIポリペプチドを生産することを可能にするのに十分な遺伝物質を含む医薬組成物は、当該レシピエントの止血に影響を及ぼすことができる。あるいは、本明細書に開示されているように、細胞内プロテアーゼ開裂認識部位(PACE/フーリン)における1つ以上の変異、欠損又は置換を有するFVIII等の有効量の変異因子VIIIポリペプチドは、必要性のある患者に直接注入されてもよい。
門脈内、又は筋肉内に届けられてもよい。投与の他の形式は、経口投与、経肺投与、坐剤、及び、経皮的塗布を含む。血液凝固因子異常を有する患者の治療を専門とする臨床医は、患者の病状及び治療の目的(例えば、血液凝固の強化又は減少)を含むがこれらに限定されない多くの基準に基づいて、FVIII核酸配列を含むアデノウイルス随伴ベクターを投与するための最適ルートを決定することができる。
ってFVIII核酸を運ぶAAVベクターが被検体の細胞を形質転換できるようにする。投与する空のカプシドAAVの量は、特定の被検体において生産されるAAV抗体の量に基づいて調整することができる。空のカプシドは、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9)、AAV10、AAV11、AAV12、Rh10、Rh74又はAAV-2i8等のような、任意のAAV血清型であってもよい。
、任意に、他の化合物、作用物質、薬剤又は組成物等のような第2の活性成分を含んでいてもよい。
この発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は等価の方法及び材料を本発明の実行又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料は本明細書に記載されている。
ステップが除外されている。従って、本発明が含んでいないものという観点では、たとえ本発明が本明細書中に一般に表現されていなくても、本発明において明示的に除外されていない態様はそれにも拘わらず本明細書に開示されている。
実施例1
C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S. & Valle,
D.) 4367-4392 (McCraw-Hill、ニューヨーク、2001)。FVIII遺伝子は、186kbに及ぶ26のエクソンを含んでおり、巨大な前駆体分子(2332個のアミノ酸)として合成される(図1)(Kaufman, R.J.,ら、The biology and genetics of factor VIII deficiency in hemophilia A. in Hemostasis and Thrombosis: Basic principles and
clinical practice (編集者 Colman, R.W., Hirsch, J., Mander, V.J., Clowes, A.W. & George, J.N.) (Lippincott-Raven, Philadelphia, 1998)。
実施例2
現を改善することができる旨が以前に説明されている(Wardら、2011、Blood 117(3):798-807)。DNA塩基配列のコドン最適化は、各DNAコドンがタンパク合成においてタンパク鎖中の特定のアミノ酸残基をコードする3つのヌクレオチドの連続物であるという事実に基づく。64個の異なるコドンが存在するが、20個のみのアミノ酸が存在し、従って、同じアミノ酸をコードすることができる多数のコドンが存在する。翻訳プロセスの最適化のための選択プロセスを反映する異なる種類の間で観察されるコドン使用頻度のバイアスが存在する。重要なことに、DNA塩基配列はコドン最適化において修飾されるが、タンパク配列が野性型配列と同一である。
実施例3
PACEフーリン認識部位のヒューマンファクターVIII変異体
DDより4倍高かった。その一方で、デルタ4及びデルタ1645はそれぞれ2倍と3倍高かった。デルタ2及びデルタ1648は野性型FVIIIと同程度であった。これらの結果は、デルタ3PACEフーリン欠損変異体及びデルタ4PACEフーリン欠損変異体の改善されたコドン最適化FVIII構築物中への導入を支持している。
実施例4
実施例5
表2Aは、野生型hFVIIIとコドン最適化された3つの変異体(CO1、CO2及びCO3と表される)との間のhFVIII配列同一性を示す。
(1)野生型ヒトFVIII-BDD(hFVIIIwtSQ);
(2)PACEフーリン認識配列中の4つの残基の欠損を有する野生型ヒトFVIII-BDD(hFVIIIwtSQデルタ4)
(3)コドンに最適化(CO)されたhFVIII-BDD(hFVIIICO)
(4)PACEフーリン認識部位の3つの残基の欠損を有するコドン最適化された(hFVIIICOデルタ3)
(5)PACEフーリン認識部位の4つの残基の欠損を有するコドン最適化されたhFVIII(hFVIIICOデルタ4)(図6)
によって測定された。Rh74VVについては、ベクター投与後4週のhFVIII発現のレベルは、(hFVIIIwtSQ)については9.4+1.5ng/ml(正常なFVIIIレベルの6.3%)であり、(hFVIIIwtSQデルタ4)については32.4+13.0ng/ml(21.6%)であり、42.2+7.1ng/ml(28.1%)(hFVIIICO)、(177.8+8.5ng/ml(118.5%)(hFVIIICOデルタ3)、及び、114.3+60.2ng/ml(76.2%)(hFVIIICOデルタ4)であった(図6)。
測は、最適化された構成物であるTTRm-hFVIIICOデルタ3がTTR-hFVIIIwtSQより30~40倍優れていることを示す。
実施例6
ヒト因子VIII調製のためのAAV-8ベクター生産
ヒト因子VIII調製のためのAAV-8ベクター生産量、標準偏差
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATG
GATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGAGGCACCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACAC
CCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
コドン最適化されたVIII cDNA、aka CO/CO3、R1645Hを有する変異体(配列番号:2)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTG
AAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCACCACCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGC
AGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
コドン最適化された因子cDNA、aka CO/CO3、アミノ酸1645-1648
が削除された変異体い、デルタ4 (配列番号:3)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCG
CTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATG
TTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
コドン最適化された因子VIII cDNA、aka CO/CO3、アミノ酸1645が削除された変異体、デルタ1645(配列番号:4)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATA
TCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCACCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAG
ATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
コドン最適化された因子VIII cDNA、aka CO/CO3、アミノ酸1645及び1646が削除された変異体、デルタ2(配列番号:5)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCC
ACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCC
CTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
コドン最適化された因子VIII cDNA、aka CO/CO3、アミノ酸1645-1647が削除された、デルタ3(配列番号:6)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTG
AAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGCGCGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCG
CCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
コドン最適化されたFVIII cDNA、aka CO/CO3、アミノ酸1648が削除された変異体、デルタ1648(配列番号:7)
ATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGCGGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTT
CCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAGAGGCACCAGGAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTCCAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGAC
TGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGA
4個のヌクレオチド変異を有するTTRプロモーター(TTRm)、配列番号:8
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCT
4つのヌクレオチド変異を有するTTRプロモーター(TTRm)、合成イントロン、コドン最適化された因子VIII cDNA(PACE/フーリンがカギ括弧内に示される)、ポリAを含む全長構築物(配列番号:9)
GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTgactTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGCAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTGACACTGACATCCACTTTTTCTTTTTCTCCACAGGTTTAAACGCCACCATGCAGATTGAGCTGTCAACTTGCTTTTTCCTGTGCCTGCTGAGATTTTGTTTTTCCGCTACTAGAAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAACTGTCTTGGGATTACATGCAGAGTGACCTGGGAGAGCTGCCAGTGGACGCACGATTTCCACCTAGAGTCCCTAAATCATTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTCTATAAGAAAACACTGTTCGTGGAGTTTACTGATCACCTGTTCAACATCGCTAAGCCTCGGCCACCCTGGATGGGACTGCTGGGACCAACAATCCAGGCAGAGGTGTACGACACCGTGGTCATTACACTGAAAAACATGGCCTCACACCCCGTGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGGGCAGAGTATGACGATCAGACTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACGATAAGGTGTTTCCTGGC
GGGTCTCATACCTATGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGCCCCATGGCTTCCGACCCTCTGTGCCTGACCTACTCTTATCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGATCTGAACAGCGGACTGATCGGAGCACTGCTGGTGTGTAGGGAAGGGAGCCTGGCTAAGGAGAAAACCCAGACACTGCATAAGTTCATTCTGCTGTTCGCCGTGTTTGACGAAGGAAAATCATGGCACAGCGAGACAAAGAATAGTCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCTTCAGCCAGAGCTTGGCCCAAAATGCACACTGTGAACGGCTACGTCAATCGCTCACTGCCTGGACTGATCGGCTGCCACCGAAAGAGCGTGTATTGGCATGTCATCGGAATGGGCACCACACCTGAAGTGCACTCCATTTTCCTGGAGGGGCATACCTTTCTGGTCCGCAACCACCGACAGGCCTCCCTGGAGATCTCTCCAATTACCTTCCTGACAGCTCAGACTCTGCTGATGGATCTGGGACAGTTCCTGCTGTTTTGCCACATCAGCTCCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGTCCCGAGGAACCTCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAAGCTGAAGACTATGACGATGACCTGACCGACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTCGATGACGATAACAGCCCCTCCTTTATCCAGATTAGATCTGTGGCCAAGAAACACCCTAAGACATGGGTCCATTACATCGCAGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTATGCACCACTGGTGCTGGCACCAGACGATCGATCCTACAAATCTCAGTATCTGAACAATGGACCACAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGAGGTTCATGGCTTATACCGATGAAACCTTCAAGACTCGCGAAGCAATCCAGCACGAGAGCGGGATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAAGTGGGGGACACCCTGCTGATCATTTTTAAGAACCAGGCCAGCAGGCCTTACAATATCTATCCACATGGAATTACAGATGTGCGCCCTCTGTACAGCCGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCGGGGAAATTTTTAAGTATAAATGGACTGTCACCGTCGAGGATGGCCCCACTAAGAGCGACCCTAGGTGCCTGACCCGCTACTATTCTAGTTTCGTGAATATGGAAAGGGATCTGGCCAGCGGACTGATCGGCCCACTGCTGATTTGTTACAAAGAGAGCGTGGATCAGAGAGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGAGGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAAACCGGTCATGGTATCTGACCGAGAACATCCAGAGATTCCTGCCTAATCCAGCCGGAGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTTCAGGCTTCTAACATCATGCATAGTATTAATGGCTACGTGTTCGACAGTCTGCAGCTGTCAGTGTGTCTGCACGAGGTCGCTTACTGGTATATCCTGAGCATTGGAGCACAGACAGATTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGCTACACTTTTAAGCATAAAATGGTGTATGAGGACACACTGACTCTGTTCCCCTTCAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCCATGGAGAATCCCGGGCTGTGGATCCTGGGATGCCACAACAGCGATTTCAGGAATCGCGGGATGACTGCCCTGCTGAAAGTGTCAAGCTGTGACAAGAACACCGGAGACTACTATGAAGATTCATACGAGGACATCAGCGCATATCTGCTGTCCAAAAACAATGCCATTGAACCCAGGTCTTTTAGTCAGAATCCTCCAGTGCTGAAG「AGGCACCAGCGC」GAGATCACCCGCACTACCCTGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGACTACGACGATACAATTTCTGTGGAAATGAAGAAAGAGGACTTCGATATCTATGACGAAGATGAGAACCAGAGTCCTCGATCATTC
CAGAAGAAAACCCGGCATTACTTTATTGCTGCAGTGGAGCGCCTGTGGGATTATGGCATGTCCTCTAGTCCTCACGTGCTGCGAAATCGGGCCCAGTCAGGGAGCGTCCCACAGTTCAAGAAAGTGGTCTTCCAGGAGTTTACAGACGGATCCTTTACTCAGCCACTGTACCGGGGCGAACTGAACGAGCACCTGGGGCTGCTGGGACCCTATATCAGAGCTGAAGTGGAGGATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCAGGCATCTAGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTGATCTCTTACGAAGAGGACCAGAGGCAGGGAGCAGAACCACGAAAAAACTTCGTGAAGCCTAATGAGACCAAAACATACTTTTGGAAGGTGCAGCACCATATGGCCCCAACAAAAGACGAATTCGATTGCAAGGCATGGGCCTATTTTTCTGACGTGGATCTGGAGAAGGACGTCCACAGTGGCCTGATCGGGCCACTGCTGGTGTGTCATACTAACACCCTGAATCCCGCACACGGCAGGCAGGTCACTGTCCAGGAATTCGCCCTGTTCTTTACCATCTTTGATGAGACAAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAGCGAAATTGCCGGGCTCCATGTAATATTCAGATGGAAGACCCCACATTCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCCATCAATGGGTATATTATGGATACTCTGCCCGGACTGGTCATGGCTCAGGACCAGAGAATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGGTCCAACGAGAATATCCACTCAATTCATTTCAGCGGACACGTGTTTACTGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTACAACCTGTATCCCGGCGTGTTCGAAACCGTCGAGATGCTGCCTAGCAAGGCAGGGATCTGGAGAGTGGAATGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCCGGAATGTCTACCCTGTTTCTGGTGTACAGTAATAAGTGTCAGACACCCCTGGGGATGGCTTCCGGACATATCCGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATTCCGGGTCTATCAACGCTTGGTCCACAAAAGAGCCTTTCTCTTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCACCAATGATCATTCATGGCATCAAAACTCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCTCTGTACATCTCACAGTTTATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAATGGCAGACATACCGCGGCAATAGCACAGGGACTCTGATGGTGTTCTTTGGCAACGTGGACAGTTCAGGGATCAAGCACAACATTTTCAATCCCCCTATCATTGCTAGATACATCAGGCTGCACCCAACCCATTATTCTATTCGAAGTACACTGCGGATGGAACTGATGGGGTGCGATCTGAACAGTTGTTCAATGCCCCTGGGAATGGAGTCCAAGGCAATCTCTGACGCCCAGATTACCGCTAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCCTCCAAAGCACGACTGCATCTGCAGGGACGAAGCAACGCATGGCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTCGATTTTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGAGTCACAACTCAGGGCGTGAAAAGTCTGCTGACCTCAATGTACGTCAAGGAGTTCCTGATCTCTAGTTCACAGGACGGCCACCAGTGGACACTGTTCTTTCAGAACGGAAAGGTGAAAGTCTTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACTCTCTGGACCCACCCCTGCTGACTCGCTACCTGCGAATCCACCCACAGTCCTGGGTGCATCAGATTGCACTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTATTGAGCGGCCGCAATAAAAGATCAGAGCTCTAGAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGT
コドン最適化された因子VIII cDNA、aka CO1(配列番号:10)
ATGCAGATCGAGCTGTCTACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGCGGTTCTGCTTCAGCGCCACCAGACGGTACTATCTGGGCGCCGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAGCTGCCCGTGGATGCCAGATTCCCTCCAAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTGTTCGTGGAATTCACCGACCACCTGTTCAATATCGCCAAGCCCAGACCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGACCTACAATTCAGGCCGAGGTGTACGACACCGTCGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCCGTGTCTCTGCATGCCGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGCGCCGAGTACGACGATCAGACCAGCCAGCGCGAGAAAGAGGACGACAAGGTGTTCCCTGGCGGCAGCCACACCTACGTGTGGCAGGTGCTGAAAGAAAACGGCCCCATGGCCTCCGACCCTCTGTGCCTGACATACAGCTACCTGAGCCACGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGCCTGATCGGAGCCCTGCTCGTGTGTAGAGAGGGCAGCCTGGCCAAAGAGAAAACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTCGCCGTGTTCGACGAGGGCAAGAGCTGGCACAGCGAGACAAAGAACAGCCTGATGCAGGACCGGGACGCCGCCTCTGCTAGAGCCTGGCCCAAAATGCACACCGTGAACGGCTACGTGAACAGAAGCCTGCCCGGACTGATCGGCTGCCACCGGAAGTCTGTGTACTGGCACGTGATCGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTTCTGGAAGGACACACCTTTCTCGTGCGGAACCACCGGCAGGCCAGCCTGGAAATCAGCCCTATCACCTTCCTGACCGCCCAGACACTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTTCTGCTGTTCTGCCACATCAGCTCCCACCAGCACGACGGCATGGAAGCCTACGTGAAGGTGGACAGCTGCCCCGAGGAACCCCAGCTGCGGATGAAGAACAACGAGGAAGCCGAGGACTACGACGACGACCTGACCGACAGCGAGATGGACGTGGTGCGCTTCGACGACGATAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGAAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTATATCGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGATTACGCCCCTCTGGTGCTGGCCCCCGACGACAGAAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGCGGATCGGCCGGAAGTATAAGAAAGTGCGGTTCATGGCCTACACCGACGAGACATTCAAGACCAGAGAGGCCATCCAGCACGAGAGCGGCATCCTGGGCCCTCTGCTGTATGGCGAAGTGGGCGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGACCCTACAACATCTACCCTCACGGCATCACCGACGTGCGGCCCCTGTACTCTAGAAGGCTGCCCAAGGGCGTGAAACACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCCGGCGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACCGTGGAAGATGGCCCCACCAAGAGCGACCCCAGATGCCTGACACGGTACTACAGCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCCTCCGGCCTGATTGGCCCACTGCTGATCTGCTACAAAGAAAGCGTGGACCAGCGGGGCAACCAGATCATGAGCGACAAGCGGAACGTGATCCTGTTTAGCGTGTTCGATGAGAACCGGTCCTGGTATCTGACCGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCTGCCGGCGTGCAGCTGGAAGATCCTGAGTTCCAGGCCTCCAACATCATGCACTCCATCAATGGCTATGTG
TTCGACAGCCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTGCACGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATCGGGGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTACGAGGATACCCTGACCCTGTTCCCCTTTAGCGGCGAAACCGTGTTCATGAGCATGGAAAACCCCGGCCTGTGGATCCTGGGCTGCCACAACAGCGACTTCCGGAACAGAGGCATGACCGCCCTGCTGAAGGTGTCCAGCTGCGACAAGAACACCGGCGACTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCAGCGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATCGAGCCCAGAAGCTTCAGCCAGAACCCCCCCGTGCTGAAGCGGCACCAGAGAGAGATCACCCGGACCACCCTGCAGTCCGACCAGGAAGAGATCGATTACGACGACACCATCAGCGTGGAAATGAAGAAAGAAGATTTCGACATCTACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCCGGTCCTTTCAGAAAAAGACCCGGCACTACTTCATTGCCGCTGTGGAACGGCTGTGGGACTACGGCATGAGCAGCAGCCCTCACGTGCTGAGAAACAGGGCCCAGAGCGGCAGCGTGCCCCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAATTCACAGACGGCAGCTTCACCCAGCCTCTGTACCGCGGCGAGCTGAATGAGCACCTGGGACTGCTGGGCCCCTATATCAGAGCCGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGGAATCAGGCCTCCCGGCCCTACAGCTTCTACAGCTCCCTGATCAGCTACGAAGAGGACCAGAGACAGGGCGCTGAGCCCCGGAAGAACTTCGTGAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCTACAAAGGACGAGTTCGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAAAAGGACGTGCACTCTGGGCTGATCGGCCCCCTGCTCGTGTGCCACACCAACACCCTGAATCCCGCCCACGGCAGACAAGTGACAGTGCAGGAATTCGCCCTGTTCTTCACCATCTTCGACGAAACAAAGAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAAAGAAACTGCCGGGCTCCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAAGAGAACTACCGGTTCCACGCCATCAACGGCTACATCATGGACACACTGCCCGGCCTCGTGATGGCTCAGGATCAGCGGATCCGGTGGTATCTGCTGTCCATGGGCTCCAACGAGAACATCCACAGCATCCACTTCAGCGGCCACGTGTTCACCGTGCGGAAAAAAGAAGAGTACAAAATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTCGAGACAGTGGAAATGCTGCCCAGCAAGGCCGGCATCTGGCGGGTGGAATGTCTGATCGGCGAGCATCTGCACGCTGGGATGAGCACACTGTTTCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACACCTCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCCGGGACTTTCAGATCACAGCCAGCGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCAAAACTGGCCAGACTGCACTACAGCGGCAGCATCAACGCCTGGTCCACCAAAGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCTCCCATGATCATCCACGGAATCAAGACCCAGGGCGCCAGACAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGCAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGCAATAGCACCGGCACCCTGATGGTGTTCTTCGGCAACGTGGACTCCAGCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCCGGTACATCCGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGAGAATGGAACTGATGGGCTGCGACCTGAACTCCTGCAGCATGCCCCTGGGGATGGAAAG
CAAGGCCATCTCCGACGCCCAGATCACCGCCTCCAGCTACTTCACCAACATGTTCGCCACCTGGTCCCCATCCAAGGCCCGGCTGCATCTGCAGGGCAGAAGCAATGCTTGGAGGCCCCAAGTGAACAACCCCAAAGAATGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAAACCATGAAAGTGACCGGCGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCTCTGCTGACCTCTATGTACGTGAAAGAGTTCCTGATCTCCAGCAGCCAGGACGGCCACCAGTGGACCCTGTTTTTCCAGAACGGCAAAGTGAAAGTGTTTCAGGGGAACCAGGACTCCTTCACCCCCGTCGTGAATAGCCTGGACCCTCCACTGCTGACCAGATACCTGCGGATCCACCCTCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCTCTGCGGATGGAAGTGCTGGGATGCGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
コドン最適化された因子VIII cDNA、aka CO2(配列番号:11)
ATGCAGATCGAGCTGTCTACCTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGCGGTTCTGCTTTAGCGCTACTAGACGCTACTACCTGGGCGCCGTGGAACTGAGCTGGGACTATATGCAGTCAGACCTGGGCGAGCTGCCCGTGGACGCTAGATTCCCACCTAGAGTGCCTAAGAGCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTCTATAAGAAAACCCTGTTCGTCGAGTTCACCGATCACCTGTTTAATATCGCTAAGCCTAGACCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCTACTATTCAGGCCGAGGTCTACGACACCGTCGTGATCACCCTGAAGAATATGGCTAGTCACCCCGTCAGCCTGCACGCCGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTAGCGAGGGCGCCGAGTACGACGATCAGACTAGTCAGCGCGAGAAAGAGGACGACAAAGTCTTTCCTGGCGGCTCTCACACCTACGTGTGGCAGGTCCTGAAAGAAAACGGCCCTATGGCTAGCGACCCCCTGTGCCTGACCTATAGCTACCTGAGTCACGTGGACCTGGTCAAGGACCTGAATAGCGGCCTGATCGGCGCCCTGCTCGTGTGTAGAGAGGGCTCACTGGCTAAAGAGAAAACTCAGACCCTGCACAAGTTTATCCTGCTGTTCGCCGTGTTCGACGAGGGCAAGAGCTGGCACTCAGAGACTAAGAATAGCCTGATGCAGGATAGGGACGCCGCTAGCGCTAGAGCCTGGCCTAAGATGCACACCGTGAACGGCTACGTGAACAGATCACTGCCCGGACTGATCGGCTGTCACCGGAAGTCCGTCTACTGGCACGTGATCGGAATGGGCACTACCCCCGAGGTGCACTCTATCTTTCTGGAAGGCCACACCTTCCTCGTCAGAAATCACCGGCAGGCTAGCCTCGAGATTAGCCCTATCACCTTCCTGACCGCTCAGACACTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTTTGTCACATTAGCTCTCACCAGCACGACGGGATGGAAGCCTACGTGAAAGTGGATAGCTGCCCCGAGGAACCTCAGCTGAGAATGAAGAACAACGAGGAAGCCGAGGATTACGACGACGACCTGACCGATAGCGAGATGGACGTCGTCAGATTCGACGACGATAACTCACCTAGCTTTATTCAGATTAGATCAGTGGCTAAGAAGCACCCTAAGACCTGGGTGCACTATATCGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCCCCTCTGGTGCTGGCCCCCGACGATAGAAGCTATAAGTCTCAGTACCTGAACAACGGCCCTCAGCGGATCGGCCGGAAGTATAAGAAAGTGCGGTTTATGGCCTACACCGACGAAACCTTCAAGACTAGAGAGGCTATTCAGCACGAGTCAGGGATCCTGGGCCCCCTGCTCTACGGCGAAGTGGGCGACACCCTGCTGATTATCTTTAAGAATCAGGCTAGTAGGCCCTATAATA
TCTACCCCCACGGAATCACCGACGTGCGGCCCCTCTACTCTAGACGGCTGCCTAAGGGCGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCTATTCTGCCCGGCGAGATCTTTAAGTACAAGTGGACCGTGACCGTCGAGGACGGCCCTACTAAGTCCGACCCTCGGTGCCTGACTAGGTACTACTCTAGCTTCGTGAATATGGAACGGGACCTGGCTAGCGGACTGATTGGCCCTCTGCTGATCTGCTACAAAGAATCAGTGGATCAGCGGGGCAATCAGATTATGAGCGATAAGCGGAACGTGATCCTGTTTAGTGTGTTTGACGAGAATAGGTCCTGGTATCTGACCGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCTAACCCTGCCGGCGTGCAGCTGGAAGATCCCGAGTTTCAGGCTAGCAATATTATGCACTCTATTAACGGATACGTGTTCGATAGCCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTGCACGAGGTGGCCTACTGGTATATCCTGTCTATCGGCGCTCAGACCGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTAGCGGCTACACCTTTAAGCACAAGATGGTCTACGAGGATACCCTGACCCTGTTCCCCTTTAGCGGCGAAACCGTGTTTATGTCTATGGAAAACCCCGGCCTGTGGATCCTGGGGTGTCACAATAGCGACTTTAGGAATAGAGGAATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCTAGCTGCGATAAGAACACCGGCGACTATTACGAGGACTCTTACGAGGATATTAGCGCCTACCTGCTGTCTAAGAACAACGCTATCGAGCCTAGAAGCTTCAGTCAGAACCCCCCCGTGCTGAAGCGGCACCAGAGAGAGATCACTAGAACTACCCTGCAGAGCGACCAGGAAGAGATCGACTACGACGACACTATTAGCGTCGAGATGAAGAAAGAGGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAGAACCAGTCACCTAGATCCTTCCAGAAGAAAACTAGGCACTACTTTATTGCCGCCGTCGAGCGGCTGTGGGACTACGGAATGAGTTCTAGCCCTCACGTGCTGAGAAATAGGGCTCAGTCAGGCTCAGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAATTCACCGACGGCAGCTTCACTCAGCCCCTCTATAGGGGCGAGCTGAACGAGCACCTGGGACTGCTGGGACCTTATATTAGAGCCGAAGTCGAGGACAATATTATGGTCACCTTTAGGAACCAGGCCTCTAGGCCCTACAGCTTCTACTCTAGCCTGATCAGCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGGGCCGAACCTAGAAAGAACTTCGTGAAGCCTAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCTACTAAGGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTTAGCGACGTGGACCTCGAGAAGGACGTGCACTCAGGGCTGATCGGACCTCTGCTCGTCTGTCACACTAACACCCTGAACCCCGCTCACGGCCGGCAGGTCACAGTGCAGGAATTCGCCCTGTTCTTCACTATCTTCGACGAAACTAAGAGCTGGTACTTCACAGAGAATATGGAAAGAAACTGTAGGGCCCCCTGTAATATTCAGATGGAAGATCCTACCTTTAAAGAGAACTATAGGTTTCACGCTATTAACGGCTATATTATGGACACCCTGCCCGGCCTCGTGATGGCTCAGGATCAGCGGATTAGGTGGTATCTGCTGTCTATGGGCTCTAACGAGAATATTCACTCTATTCACTTTAGCGGCCACGTGTTCACCGTCCGGAAGAAAGAAGAGTATAAGATGGCCCTCTATAACCTCTACCCCGGCGTGTTCGAGACAGTGGAAATGCTGCCTAGTAAAGCCGGAATCTGGCGGGTCGAGTGTCTGATCGGCGAGCACCTCCACGCCGGAATGAGCACCCTGTTTCTGGTCTACTCTAACAAGTGTCAGACCCCTCTGGGAATGGCTAGCGGCCACATTAGAGACTTT
CAGATCACCGCTAGCGGACAGTACGGCCAGTGGGCCCCTAAGCTGGCTAGACTGCACTATAGCGGATCTATCAACGCCTGGTCTACCAAAGAGCCCTTTAGCTGGATTAAGGTGGACCTGCTGGCCCCTATGATTATTCACGGGATTAAGACTCAGGGCGCTAGGCAGAAGTTTAGTAGCCTCTATATTAGTCAGTTTATCATTATGTATAGCCTGGACGGCAAGAAGTGGCAGACCTATAGAGGCAATAGCACCGGCACCCTGATGGTGTTCTTCGGCAACGTGGACTCTAGCGGGATCAAGCACAATATCTTTAACCCCCCTATTATCGCTAGATATATTAGGCTGCACCCTACTCACTACTCTATTAGGTCTACCCTGAGGATGGAACTGATGGGCTGCGATCTGAATAGCTGCTCTATGCCCCTGGGGATGGAATCTAAGGCTATTAGCGACGCTCAGATCACAGCCTCTAGCTACTTCACTAATATGTTCGCTACCTGGTCCCCTAGCAAGGCCCGGCTGCACCTCCAGGGCAGATCTAACGCTTGGCGGCCTCAGGTCAACAACCCTAAAGAGTGGCTGCAGGTCGACTTTCAGAAAACTATGAAGGTCACCGGCGTGACCACTCAGGGCGTGAAATCACTGCTGACCTCTATGTACGTGAAAGAGTTCCTGATTAGCTCTAGCCAGGACGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAACGGCAAAGTGAAAGTGTTTCAGGGCAATCAGGATAGCTTCACCCCCGTGGTCAATAGCCTGGATCCCCCACTGCTGACTAGATACCTGAGAATTCACCCTCAGTCTTGGGTGCACCAGATCGCCCTGAGAATGGAAGTCCTGGGCTGTGAAGCTCAGGACCTCTACTAA
使用されているいくつかの定義/略語
SQ及びBDD:Bドメイン欠損を有するFVIII
TTRm:TAmGTGTAGからTATTGACTTAGへの、4つの変位を有するTTRプロモーター
CO及びCO3:配列番号1に記載されている、コドン最適化されたFVIII核酸変異体
CO1:配列番号10に記載されている、コドン最適化されたFVIII核酸変異体
CO2:配列番号11に記載されている、コドン最適化されたFVIII核酸変異体
表3~表5のPrep表示はCO/CO3の5つの別個のベクター調製物を表す。
hFVIII-RH:ヒトFVIIIの位置1645においてArgがHisに置換
デルタ4:FVIIIのアミノ酸1645~1648の欠損
デルタ1645:FVIIIのアミノ酸1645~1647の欠損
デルタ2:FVIIIのアミノ酸1645及び1646の欠損
デルタ3:FVIIIのアミノ酸1645~1647の欠損
デルタ1648:FVIIIのアミノ酸1648の欠損
Claims (41)
- 第VIII因子(FVIII)をコードする核酸変異体であって、
前記核酸変異体は、野性型FVIIIにおけるTTA、TTG、CTT、CTC又はCTAと対比してCTGに変化した1つ以上のロイシンコドン、及び、少なくとも45.2%のGC含有量を有し、配列番号1の配列と94%以上の配列同一性を有し、
前記核酸変異体によってコードされるFVIIIは、野性型FVIII発現と比較して発現が多い、核酸変異体。 - 第VIII因子(FVIII)をコードする核酸変異体であって、
前記核酸変異体は、野性型FVIIIにおけるTTA、TTG、CTT、CTC又はCTAと対比してCTGに変化した1つ以上のロイシンコドン、及び、少なくとも45.2%のGC含有量を有し、配列番号1の配列と94%以上同一であり、
前記核酸変異体によってコードされるFVIIIがBドメイン欠損を含み、Bドメイン欠損発現を含む野性型FVIIIと比較して発現が多い、核酸変異体。 - 前記核酸変異体は、前記野性型FVIIIのゲノム組込みと比較して、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター中により効率的にゲノム組込される、請求項1又は2に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体によってコードされるFVIIIが、野性型FVIIIと比較して又はBドメイン欠損を含む野性型FVIIIと比較してより大きな生物活性を示す、請求項1~3のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 前記生物活性は、凝固分析、又は、FVIIIアッセイ若しくはFVIII欠失モデルにおける出血減少によって決定される、請求項4に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体のコドンの少なくとも85%は、CTGロイシンコドンである、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体は、野性型FVIIIにおけるTTA、TTG、CTT、CTC又はCTAロイシンコドンから変化したすべてのCTGロイシンコドンを有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体は、野性型FVIIIにおいてAAAリジンコドンと対照として1つ以上のAAGリジンコドンを有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体は、50-59%、50-56%、50-53%又は45.2-59.2%のGC含有量を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体は、野生型ヒトFVIII核酸又はBドメイン欠損を含む野生型ヒトFVIII核酸に対して少なくとも75%同一である、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体がヒトFVIIIであり、及び/又は、前記野性型FVIII又はBドメイン欠損を含む野性型FVIIIがヒトFVIIIである、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 前記核酸変異体は配列番号1-7及び9のいずれかで構成される、請求項1に記載の核酸変異体。
- PACE/フーリン切断部位をコードするコドンの1個、2個、3個又は4個すべてが欠損している、請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 位置1645-1648からHHQR又はRHQRと示されているPACE/フーリン切断部位をコードするコドンの1個、2個、3個又は4個すべてが欠損している、請求項1~12のいずれか1項に記載の核酸変異体。
- 請求項1~14のいずれかの核酸変異体を含む発現ベクター。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、プラスミド及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項15に記載の発現ベクター。
- 前記AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74又はAAV-2i8AAV血清型を含む、請求項16に記載の発現ベクター。
- イントロン、発現制御因子、1つ以上のアデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端リピート(ITR)、及び/又は、フィラーポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項15に記載の発現ベクター。
- 前記イントロンが前記変異体FVIIIの内部若しくは前記変異体FVIIIに隣接しているか、又は、前記発現制御因子が前記変異体FVIIIに作用可能に連結しているか、又は、前記AAV ITRが前記変異体FVIIIの5’末端若しくは3’末端に隣接しているか、又は、前記フィラーポリヌクレオチド配列が前記変異体FVIIIの5’末端又は3’末端に隣接している、請求項18に記載の発現ベクター。
- 前記発現制御因子は、構成的制御因子、若しくは、調節可能制御因子、又は、組織特異的発現制御因子、若しくは、プロモーターを含む、請求項18に記載の発現ベクター。
- 前記発現制御因子は、肝臓中の発現を与える因子を含む、請求項18に記載の発現ベクター。
- 前記発現制御因子はTTRプロモーターか変異体TTRプロモーターを含む、請求項18に記載の発現ベクター。
- 前記変異体TTRプロモーターは配列番号8で構成される、請求項22に記載の発現ベクター。
- 前記ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、若しくは、AAV-2i8AAV血清型又はこれらの組み合わせのいずれかの1つ以上のITRを含む、請求項18に記載の発現ベクター。
- 請求項1~14のいずれかに記載の核酸変異体又は請求項15~24のいずれかの発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1~14のいずれかの核酸変異体又は請求項15~24のいずれかの発現ベクターを含むAAV粒子。
- 前記AAV粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、又は、AAV-2i8のVP1、VP2及びVP3配列の少なくとも1つに対して75%以上の配列同一性を有するVP1、VP2及びVP3キャプシド配列の少なくとも一つを含む、請求項26に記載のAAV粒子。
- 前記AAV粒子が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74及びAAV-2i8 AAV血清型のいずれかから選択されるVP1、VP2及びVP3キャプシド配列の少なくとも1つを含む、請求項26に記載のAAV粒子。
- 生物学的適合性を有する担体又は賦形剤中に、請求項1~14のいずれかに記載の核酸変異体、請求項15~24のいずれかに記載の発現ベクター、又は、請求項26~28のいずれかのAAV粒子を含み、空のカプシドAAVを任意に含む、医薬組成物。
- 哺乳動物又は哺乳動物細胞へ核酸配列を送達又は移動するための薬剤の製造における核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用であって、
前記薬剤は、請求項1~14のいずれかに記載の核酸変異体、請求15~24のいずれかに記載の発現ベクター、又は、請求項26~28のいずれかのAAV粒子を含む、核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。 - 第VIII因子を必要とする哺乳動物への送達のための薬剤の製造における発現ベクター、又はAAV粒子の使用であって、前記薬剤は、請求項1~14のいずれかに記載の核酸変異体、請求項15~24のいずれかに記載の発現ベクター又は請求項26~28のいずれかのAAV粒子を含む、核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 前記第VIII因子は、前記哺乳動物の細胞、組織又は器官において発現される請求項30又は31に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 前記哺乳動物の細胞が分泌細胞を含む、請求項30又は31に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 前記哺乳動物の細胞が内分泌細胞又は内皮細胞を含む、請求項30又は31に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 前記哺乳動物の細胞が肝細胞、シヌソイドの内皮細胞、巨核球、血小板細胞又は造血幹細胞を含む、請求項30又は31に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 前記哺乳動物の組織又は器官が肝臓を含む、請求項32に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 前記哺乳動物は、不十分な量の第VIII因子タンパクを生産するか、又は、不完全若しくは異常な第VIII因子タンパクを生産する、請求項30又は31に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 前記哺乳動物には血友病Aを有する、請求項30又は31に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 静脈内に、動脈内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、又は、挿管若しくはカテーテルによって送達するための前記薬剤の製造における、請求項1~14のいずれかに記載の核酸変異体、請求項15~24のいずれかに記載の発現ベクター、請求項26~28のいずれかに記載のAAV粒子の使用、又は請求項30~38のいずれかに記載の核酸変異体、発現ベクター、若しくはAAV粒子の使用。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項30又は31に記載の核酸変異体、発現ベクター、又はAAV粒子の使用。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、及び配列番号11のいずれか1つに従う、第VIII因子(FVIII)をコードする核酸変異体。
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