CN101020649A - 一种天然茶氨酸的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种天然茶氨酸的分离纯化方法，属于茶叶深加工技术领域。目前国内利用低档茶叶提取茶多酚后排放的废液中含有一定量的茶氨酸，本发明以该茶多酚工业废液为原料，经过如下步骤：超滤、大孔树脂脱色、阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱、微晶纤维素柱层析、无水乙醇结晶分离纯化获得天然茶氨酸。本发明方法提取的茶氨酸的纯度达到95％以上，整个过程中茶氨酸总的回收率达到60％以上。本发明既可以解决环保问题，又可以获得高价值的茶氨酸产品，将为茶叶的综合利用与开发提供新的方向。

Description

一种天然茶氨酸的分离纯化方法
技术领域
一种天然茶氨酸的分离纯化方法，属于茶叶深加工技术领域。
背景技术
茶氨酸是茶叶中特有的非蛋白氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一，约占茶叶中氨基酸总量的50％～60％，茶氨酸属酰胺类化合物，化学命名为：N-乙基-γ-谷氨酰胺。研究表明茶氨酸具有影响脑中神经递质分泌、拮抗咖啡因引起的兴奋、缓解紧张情绪、降血压、抗疲劳、辅助抑制肿瘤等生理功能。目前主要应用于药物和食品添加剂，茶氨酸的需求量也日益增多，而对于茶氨酸的提取合成研究，哪一种更加适合工业放大等问题尚待进一步深入研究。国内外科学家研究开发了多种生产茶氨酸的方法，主要有化学合成法、茶树组织培养法和微生物发酵法等。在利用化学方法合成茶氨酸方面，已有大量的研究报道和专利，化学合成法的优点是操作相对简单，可工业化生产，但缺点是难提纯，易混杂D型茶氨酸和其他有毒物质，其安全性有待验证。日本在利用细胞培养和微生物发酵来合成茶氨酸方面做了大量的工作，并提出了工业化生产茶氨酸的工艺流程，这些方法虽能生产天然茶氨酸，但由于目前运行成本仍过高，暂时还无法工业化。
我国是世界上主要产茶国之一，在茶叶生产过程中，会产生20％左右低档茶和副产品。为综合利用低档茶叶，提高其附加价值，对茶叶的各种深加工技术研究越来越多。目前国内利用低档茶叶提取茶多酚的生产厂家很多，其提取茶多酚后排放的废水中含有一定量的茶氨酸，目前基本未加以综合利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然茶氨酸的分离纯化方法，利用工业上生产茶多酚的废液为原料，从生产茶多酚废水中提取天然茶氨酸，既可以解决环保问题，又可以获得高价值的茶氨酸产品，这将为茶叶的综合利用与开发提供新的方向。
本发明的技术方案：提供一种天然茶氨酸的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)超滤：茶多酚工业废液经0.2μm微滤后进行超滤，得到超滤透过液；
(2)大孔树脂脱色：在常温下，将超滤透过液以4柱床体积/每小时的流速通过装有D301-G大孔吸附树脂的层析柱脱色，当处理量为16～18倍柱床体积时停止上样，用2～3倍柱床体积的去离子水顶洗，合并饱和点以前的处理液和顶洗液，得澄清液；
(3)阳离子交换树脂吸附：采用001×7(H+)强阳离子交换树脂对澄清液中的茶氨酸进行离子交换吸附；
(4)氨水洗脱：吸附饱和后，先用2～3倍柱床体积的去离子水洗涤柱，流速为2.0～3.0柱床体积/每小时，水洗涤液弃去；再以pH为11.3氨水溶液洗脱，速度为1.0～1.5柱床体积/每小时，收集2～3倍柱床体积茶氨酸的氨水洗脱液；
(5)减压浓缩：将茶氨酸的氨水洗脱液在真空度为0.05～0.1MPa、温度为60～70℃下减压浓缩至干得到茶氨酸粗品；
(6)微晶纤维素柱层析：茶氨酸粗品用少量的水溶解，通过微晶纤维素柱层析，选用正丁醇/冰乙酸/水洗脱，正丁醇/冰乙酸/水体积比为4/1/5，采用纸层析法对每段分部收集洗脱液进行定性分析，合并得到的茶氨酸组分；
(7)无水乙醇结晶：减压浓缩蒸去溶剂后，用无水乙醇结晶得到茶氨酸纯品。
步骤(1)超滤：选用截留分子量为6KD的聚砜膜，在操作压力0.08～0.10Mpa，温度30～40℃条件下进行超滤。
步骤(3)阳离子交换树脂吸附，条件为上样澄清液的pH值为3.2～3.5，上样澄清液中茶氨酸浓度为2.5～3.0mg/ml，上样流速为1.5～2.0柱床体积/每小时，上样体积8～10倍柱床体积
步骤(6)中洗脱过程中采用纸层析法对每段分部收集洗脱液进行定性分析，纸层析采用展开剂为体积比为4/1/1的正丁醇/冰乙酸/水溶液，其中溶有4mg/ml茚三酮，层析后80℃加热显色。
步骤(7)无水乙醇结晶：70℃下减压浓缩蒸去有机溶剂至干，添加少量热水溶解，溶解后的溶液用6～8倍体积的无水乙醇在0～4℃下进行结晶，晶浆离心分离，无水乙醇洗涤后真空干燥得到天然茶氨酸产品。
本发明的有益效果：对原料液的前处理采用超滤工艺去除大分子杂质，另外超滤后得到的超滤浓缩液中茶多糖的含量较高，可分离纯化得到茶多糖产品，进一步对茶叶进行综合利用。大孔吸附树脂和离子交换树脂的再生性能好，可再生多次使用。采用微晶纤维素柱层析进一步纯化，无水乙醇结晶后得到天然茶氨酸的纯度大于95％，整个过程中茶氨酸总的回收率达到60％以上。
具体实施方式
以下给出实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)超滤工艺：茶多酚工业废液经0.2μm微滤膜微滤后，选用截留分子量为6KD的聚砜超滤膜，在操作压力0.08-0.10Mpa，温度30-40℃条件下进行超滤，得到超滤透过液。
(2)大孔吸附树脂脱色：超滤透过液在常温下，以4柱床体积/每小时流速通过装有D301-G大孔吸附树脂的层析柱，当处理量为16倍柱床体积时停止上样，用2倍柱床体积的去离子水顶洗，合并饱和点前的流出液和顶洗液得到澄清液。
(3)阳离子交换树脂吸附：将001×7树脂置换成氢型后装柱，浓缩脱色澄清液至茶氨酸浓度为3.0mg/ml，用盐酸调pH值为3.5，以流速为1.5柱床体积/每小时上柱，上样体积为8倍柱床体积。
(4)氨水洗脱：吸附平衡后用2倍柱床体积的去离子水洗涤柱，流速为2.0柱床体积/每小时。再以pH为11.3氨水溶液洗脱，洗脱速度为1.0柱床体积/每小时，收集2倍柱床体积得到茶氨酸的氨水洗脱液。
(5)粗品茶氨酸：将得到的茶氨酸的氨水洗脱液在真空度为0.1MPa，温度为70℃下减压浓缩至干得到茶氨酸粗品。
(6)纯化工艺：将茶氨酸粗品用少量的水溶解，通过微晶纤维素柱层析，选用正丁醇/冰乙酸/水(4/1/5，V/V)作流动相，分段收集洗脱液，采用纸层析法对各段洗脱液进行定性分析，合并得到的茶氨酸部分。进行定性分析，纸层析采用展开剂为体积比为4/1/1的正丁醇/冰乙酸/水溶液，其中溶有4mg/ml茚三酮，层析后80℃加热显色。
(7)纯品茶氨酸：合并茶氨酸部分70℃下减压浓缩蒸去有机溶剂至干，添加少量热水溶解，溶解后的溶液用6倍体积的无水乙醇作为结晶溶剂，0～4℃下结晶，产生结晶状物质，将一次结晶后的晶浆离心分离，湿的茶氨酸晶体用无水乙醇作为清洗剂清洗两遍。将两次清洗的母液连同上次第一次离心得到的母液合并，再浓缩，进行二次结晶。一次和二次结晶得到的晶体合并，在60℃下真空干燥得到纯度＞95％的天然茶氨酸产品。
实施例2
(1)超滤工艺同实施例1。
(2)大孔吸附树脂脱色：处理量为18倍柱床体积时停止上样，用3倍柱床体积的去离子水顶洗，合并饱和点以前的流出液和顶洗液得到澄清液。其余条件同实施例1。
(3)阳离子交换树脂吸附：浓缩脱色澄清液至茶氨酸浓度为2.5mg/ml，用盐酸调pH值为3.2，以流速为2.0柱床体积/每小时上柱，上样体积为10倍柱床体积。其余条件同实施例1。
(4)氨水洗脱：吸附平衡后用3倍柱床体积的去离子水洗涤柱，流速为3.0柱床体积/每小时。再以pH为11.3氨水溶液洗脱，洗脱速度为1.5柱床体积/每小时，收集3倍柱床体积得到茶氨酸的氨水洗脱液。
(5)粗品茶氨酸：将得到的茶氨酸的氨水洗脱液在真空度为0.05MPa，温度为60℃下减压浓缩至干得到茶氨酸粗品。
(6)纯化工艺：将茶氨酸粗品用少量的水溶解，通过微晶纤维素柱层析，选用正丁醇/冰乙酸/水(4/1/5，V/V)作流动相，分段收集洗脱液，采用纸层析法对各段洗脱液进行定性分析(同实施例1)，合并得到的茶氨酸部分。
(7)纯品茶氨酸：合并茶氨酸部分70℃下减压浓缩蒸去有机溶剂至干，添加少量热水溶解，溶解后的溶液用8倍体积的无水乙醇作为结晶溶剂，0～4℃下结晶，产生结晶状物质，将一次结晶后的晶浆离心分离，湿的茶氨酸晶体用无水乙醇作为清洗剂清洗两遍。将两次清洗的母液连同上次第一次离心得到的母液合并，再浓缩，进行二次结晶。一次和二次结晶得到的晶体合并，在60℃下真空干燥得到纯度＞95％的天然茶氨酸产品。

Claims (5)

1、一种天然茶氨酸的分离纯化方法，其特征是步骤为：
(1)超滤：茶多酚工业废液经0.2μm微滤后进行超滤，得到超滤透过液；
(2)大孔树脂脱色：在常温下，将超滤透过液以4柱床体积/每小时的流速通过装有D301-G大孔吸附树脂的层析柱脱色，当处理量为16～18倍柱床体积时停止上样，用2～3倍柱床体积的去离子水顶洗，合并饱和点以前的处理液和顶洗液，得澄清液；
(3)阳离子交换树脂吸附：采用001×7强阳离子交换树脂对澄清液中的茶氨酸进行离子交换吸附；
(4)氨水洗脱：吸附饱和后，先用2～3倍柱床体积的去离子水洗涤柱，流速为2.0～3.0柱床体积/每小时，水洗涤液弃去；再以pH为11.3氨水溶液洗脱，速度为1.0～1.5柱床体积/每小时，收集2～3倍柱床体积茶氨酸的氨水洗脱液；
(5)减压浓缩：将茶氨酸的氨水洗脱液在真空度为0.05～0.1MPa、温度为60～70℃下减压浓缩至干得到茶氨酸粗品；
(6)微晶纤维素柱层析：茶氨酸粗品用少量的水溶解，通过微晶纤维素柱层析，选用正丁醇/冰乙酸/水洗脱，正丁醇/冰乙酸/水体积比为4/1/5，采用纸层析法对每段分部收集洗脱液进行定性分析，合并得到的茶氨酸组分；
(7)无水乙醇结晶：减压浓缩蒸去溶剂后，用无水乙醇结晶得到茶氨酸纯品。
2、根据权利要求1所述的一种天然茶氨酸的分离纯化方法，其特征是步骤(1)超滤：选用截留分子量为6KD的聚砜膜，在操作压力0.08～0.10Mpa，温度30～40℃条件下进行超滤。
3、根据权利要求1所述的一种天然茶氨酸的分离纯化方法，其特征是步骤(3)阳离子交换树脂吸附，条件为上样澄清液的pH值为3.2～3.5，上样澄清液中茶氨酸浓度为2.5～3.0mg/ml，上样流速为1.5～2.0柱床体积/每小时，上样体积8～10倍柱床体积。
4、根据权利要求1所述的一种天然茶氨酸的分离纯化方法，其特征是步骤(6)中洗脱过程中采用纸层析法对每段分部收集洗脱液进行定性分析，纸层析采用展开剂为体积比为4/1/1的正丁醇/冰乙酸/水溶液，其中溶有4mg/ml茚三酮，层析后80℃加热显色。
5、根据权利要求1所述的一种天然茶氨酸的分离纯化方法，其特征是步骤(7)无水乙醇结晶：70℃下减压浓缩蒸去有机溶剂至干，添加少量热水溶解，溶解后的溶液用6～8倍体积的无水乙醇在0～4℃下进行结晶，晶浆离心分离，无水乙醇洗涤后真空干燥得到天然茶氨酸产品。
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