JP7003283B2 - 末梢血から間葉系幹細胞集団を製造する方法及びその使用 - Google Patents

Description

本開示は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離及び増殖する方法、並びにそれに由来する細胞集団に関する。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、新生児組織（例、ヒトの臍帯のホウォートンゼリー）、骨髄、末梢血、胎盤、臍帯血、脂肪組織を含む様々な組織から単離できる。そのうち、末梢血からは、ＭＳＣが最も容易に得られる。しかしながら、ＭＳＣは末梢血中に非常に低いレベルで存在し、ＭＳＣをインビトロで増殖させても、その後の分化及び使用のために十分な量のＭＳＣを得ることができない。

そのため、当該技術分野において、その後の治療用途のために十分なＭＳＣ集団の製造を可能にする末梢血からＭＳＣを得る改善された方法は必要とされる。

以下は、読者に基本的な理解を提供するために本開示の簡略化された概要を提示する。この概要は、開示の広範な概要ではなく、本開示の重要な／決定的な要素を特定するものでも、本開示の範囲を描写するものでもない。その唯一の目的は、後に提示されるより詳細な説明の前置きとして、本明細書に開示されるいくつかの概念を簡略化した形で提示することである。

本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をヒト被験体の末梢血から単離し、グリセリン含有培地中でインビトロで増殖することにより、自家移植に適しかつ実質的に純粋な単離された未分化ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）集団を製造できることを発見した。

したがって、本開示の第１の態様は、未分化ｈＭＳＣ集団を提供する方法に関する。上記方法は、
ヒト被験体から末梢血を得るステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）の末梢血にグリセリンを添加するステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の末梢血中の他の体性幹細胞からｈＭＳＣを分離するステップ（ｃ）と、
ステップ（ｃ）の分離されたｈＭＳＣをグリセリン含有培地中で培養することにより、未分化ｈＭＳＣ集団を製造するステップ（ｄ）と、を含み、
上記培地は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるいずれかの動員剤を含まない。

本開示の実施形態によれば、ステップ（ａ）において、上記末梢血は、溶血剤を含まないチューブに収集される。

本開示の実施形態によれば、ステップ（ｂ）において、グリセリンは、約１－１０ｍｇ／ｍＬの濃度で末梢血に存在する。

本開示の実施形態によれば、ステップ（ｄ）において、上記培地は、少なくとも２０％（ｖ／ｖ）の血清を含み、上記グリセリンは、約０．１－１ｍｇ／ｍＬの濃度で上記培地に存在し、３７℃でｈＭＳＣをグリセリン含有培地を含む培養プレート中で少なくとも１２時間培養する。

本開示の任意の実施形態によれば、上記方法は、
培養したｈＭＳＣを、ステップ（ｄ）の培養プレートよりも少なくとも１６倍大きい表面積を有する別の培養プレートに移し、引き続きグリセリン含有培地中で少なくとも４日間培養することにより、未分化ｈＭＳＣ集団を製造するステップ（ｅ）をさらに含む。

本開示の実施形態によれば、ステップ（ｅ）において、ｈＭＳＣを少なくとも６日間培養することにより未分化ｈＭＳＣ集団を製造する。

本開示の実施形態によれば、上記のように製造された未分化ｈＭＳＣ集団は、細胞表面マーカーＣＤ３４－、ＣＤ４５－、及びＨＬＡ－ＤＲに対して陰性であり、細胞表面マーカーＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、及びＣＤ１０５＋に対して陽性である。

したがって、本開示は、本開示の方法により製造された実質的に純粋な未分化ｈＭＳＣ集団を含むクローン細胞株の発見に関する。

さらに、本開示は、治療を必要とする被験体の疾患若しくは障害の治療のために本開示の方法により製造された未分化ｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫の使用にも関する。

本開示の実施形態によれば、ｈＭＳＣ集団は実質的に純粋なｈＭＳＣである。

本開示の実施形態によれば、上記実質的に純粋なｈＭＳＣは、軟骨細胞、軟骨及び脂肪細胞に分化するように誘導され得る。

したがって、自家のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を移植する必要がある被験体の疾患又は障害を治療する方法が提供される。この方法は、有効量の本開示の方法により製造された未分化ｈＭＳＣ集団を上記被験体に投与して上記疾患又は障害を治療することを含む。

本開示の実施形態によれば、ｈＭＳＣの自家移植によって治療可能な疾患又は障害は、骨又は軟骨疾患、神経変性疾患、心疾患、肝疾患、がん、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、創傷治癒及び組織再生からなる群より選択される。

本開示の特定の実施形態によれば、被験体に有効量の未分化ｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫を３日以下、２日以下又は１日以下の期間投与する。

本開示の付随する特徴及び利点の多くは、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。

特許又は出願書類には、少なくとも１つのカラー図面が含まれる。この特許又は特許出願の刊行物のカラー図面の写しは、請求及び必要な手数料の支払いがあった場合に庁によって提供される。

本説明は、添付の図面に照らして以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろう。

図１Ａから１Ｃは、それぞれ本開示の一実施形態に係る、（Ａ）ＣＤ９０、（Ｂ）ＣＤ１０５に対して陽性であり、（Ｃ）ＣＤ３４に対して陰性である実施例１のｈＭＳＣを示す。 本開示の一実施形態に係る、アルカリホスファターゼ染色により確認された実施例１のｈＭＳＣから分化した軟骨細胞を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、アルシアンブルーで染色された実施例１のｈＭＳＣから分化した軟骨を示す写真である。 本開示の一実施形態に係る、オイルレッドＯで染色された実施例１のｈＭＳＣから分化した脂肪細胞を示す写真である。

添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、この実施例の機能と、この実施例を構成し動作させるための一連のステップを示す。しかし、同じ又は同等の機能及び順序は、異なる実施例によって達成されてもよい。

１．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付する特許請求の範囲で使用される特定の用語がここに集められる。別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

文脈で別途明記示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の言及を含む。

用語「幹細胞」は広い意味で使用され、伝統的な幹細胞、前駆細胞、前前駆細胞などを含む。用語「幹細胞」は、増殖してより多くの前駆細胞を生じさせることができる未分化細胞を指す。前記前駆細胞は、分化した又は分化可能な娘細胞を生じさせることができる多数の母細胞を生成する能力を有する。娘細胞自体は、誘導されることで増殖し、その後、１つ又は複数の成熟細胞型に分化する子孫を生成することができる。用語「幹細胞」は、特定の状況下で、より特殊化若しくは分化した表現型に分化する能力又は潜在力を有し、特定の状況下で実質的に分化することなく増殖する能力を保持する細胞を指す。

用語「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」は、複数の特定の種類の結合組織（例えば、脂肪組織、骨組織、間質組織、軟骨組織、弾性組織及び線維性結合組織）に分化できる多能性幹細胞を指す。同定の目的については、ヒトＭＳＣは、表現型マーカーＣＤ３４^－、ＣＤ４５^－、ＣＤ７３^＋、ＣＤ９０^＋及びＣＤ１０５^＋の発現、並びに要素を特別に支持する組織（軟骨細胞、軟骨及び脂肪細胞を含むがこれらに限定されない）に分化する能力に基づいて同定することができる。

単離されたｈＭＳＣ集団に関する用語「集団」は、細胞の混合又は異質集団から除去及び分離されたｈＭＳＣの集団を指す。いくつかの実施形態において、細胞が分離され又は増加した異種集団と比較して、ｈＭＳＣ集団は、実質的に純粋なｈＭＳＣ集団である。

特定の細胞集団に関する用語「実施的に純粋」は、全細胞集団を構成する細胞に対して少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％純粋な細胞集団を指す。本開示に記載の方法により製造されたｈＭＳＣ集団に関する用語「実施的に純粋」は、約３０％未満、より好ましくは約２０％、１５％、１０％、８％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％未満又は１％未満の他の非ｈＭＳＣを含むｈＭＳＣ集団を指す。いくつかの実施形態によれば、本開示は、末梢血から単離されたｈＭＳＣ集団を増殖させる方法を含み、ここで、増殖した末梢血由来のｈＭＳＣ集団は、実質的に純粋なｈＭＳＣ集団である。

用語「クローン細胞株」は、培地で培養可能で、無限に継代できる細胞系統を指す。クローン細胞株は、幹細胞株（例えば、本開示の末梢血に由来するｈＭＳＣ）であってもよく、又は末梢血由来のｈＭＳＣに由来するものであってもよい。クローン細胞株は、本開示の末梢血に由来するｈＭＳＣを含むクローン細胞株の文脈で使用され、少なくとも１ヶ月分化せずに増殖することを可能にするインビトロ条件下で培養されている。このようなクローン幹細胞株（例えば、本開示の末梢血に由来するｈＭＳＣ）は、元の幹細胞からいくつかの細胞系統に沿って分化する潜在力を有する。

細胞個体発生の文脈では、「分化した」という修飾語は相対的な用語である。「分化した細胞」とは、比較される細胞よりも発生経路がさらに進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系統が限定される前駆細胞に分化し、次いで、下流の他の種類の前駆細胞に分化し、さらに、末期分化細胞に分化することができる。この末期分化細胞は、特定の組織タイプで特有の役割を果たし、増殖する能力を保持する場合と保持しない場合がある。

本明細書で用いられる用語「治療」は、所望の薬理学的及び／又は生理的効果、例えば、組織再生を得ることを意味することを意図する。効果は、疾患又はその症状の発生を完全に又は部分的に予防又は阻害する観点から防止的であってもよく、及び／又は、疾患及び／又は疾患に起因する副作用を部分的に又は完全に治癒する観点から治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」は、哺乳動物（特にヒト）の疾患の予防（例えば、防止）、治癒又は一時的に軽くする治療を含み、そして、（１）疾患の傾向にあるが、まだ診断されていない個人で生じる疾患又は状態（例えば、創傷）の予防（例えば、防止）、治癒又は一時的に軽くする治療、（２）（例えば、疾患の発症を抑制することによって）疾患を阻害すること、又は（３）疾患を緩和する（例えば、疾患と関連した症状を低減する）こと、を含む。

用語「投与される」、「投与する」若しくは「投与」、又は「移植」は、本明細書では互換的に使用され、本発明のｈＭＳＣ集団を被験体の所望の部位（少なくとも一部のｈＭＳＣは、生存状態である）に投与する任意の適切な送達経路（静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、頭蓋内、又は皮下を含むが、これらに限定されない）を指す。被験体への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）から数日のような短い期間又は数ヶ月のような長い期間であり得る。

本明細書で用いられる「有効量」という用語は、血小板凝集に起因する疾患の治療に関して所望の結果を成し遂げるために必要な期間及び投与量で有効なｈＭＳＣの量を指す。例えば、創傷の治療において、皮膚及び関連する軟組織の再生を促進する薬剤（即ち、本開示のｈＭＳＣ）が効果的である。有効量の薬剤は、必ず疾患又は状態を治癒することを要求せず、疾患又は病状の発症を遅延、妨害又は防止するか、或いは疾患又は病状を改善するような疾患又は状態の治療を提供する。具体的な有効量又は十分量は、治療される特定の病状、患者の身体状態（例えば、患者の体重、年齢、又は性別）、治療される哺乳動物又は動物の種類、治療期間、併用療法の性質（ある場合）、及び使用される特定の製剤などの要因によって異なる。有効量は、指定期間全体にわたって１、２又は３回以上で投与される適切な形態で１、２又は３以上の投与量に分けてもよい。

用語「被験体」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の化合物によって治療可能な人類を含む哺乳動物を意味する。用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、家畜、及び、農場動物、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ又は牛；動物園、スポーツ又はペット動物；及びマウス及びラットのようなげっ歯類を含む哺乳綱のすべてのメンバーを指す。さらに、用語「被験体」又は「患者」は、１つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。従って、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、被験体はヒトである。

用語「培地」は、組織若しくは細胞集団を維持し、又は細胞集団を培養するための培地（例えば、培養培地）であって、細胞生存を維持し、増殖をサポートする栄養素を含むものを指す。細胞培養培地には、塩、緩衝液、アミノ酸、グルコース又は他の糖、抗生物質、血清又は血清代替物、及び他の成分、例えば成長因子などのいずれかの適切な組み合わせが含まれる。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地は、当業者に知られている。

本明細書において、用語「動員」は、細胞がそれらの存在するニッチ（例えば、骨髄）を離れ、血液に入る過程を指す。用語「動員剤」は、末梢組織及び骨髄の幹細胞ニッチに存在する幹細胞（例えば、ＭＳＣ）のプール又は集団に接着性を喪失させる薬剤を指す。

２．末梢血に由来するヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の単離及び培養
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、通常、骨髄から得られる非造血幹細胞である。ＭＳＣは、非常に低レベルで末梢血に存在し、末梢血からの採取では、インビトロで増殖しても治療用途のために十分な量の細胞が得られない場合が多い。本発明者らは、予期せぬことに、末梢血に由来するＭＳＣを単離及び増殖する方法を発見することにより、単独で又は他の細胞と組み合わせて再生療法における自家療法（例えば、創傷治癒、骨修復、及び他の整形外科の適応症）に適用可能な実質的に純粋なｈＭＳＣ集団の製造を可能にする。

したがって、本開示の第１態様は、未分化ｈＭＳＣ集団の提供方法を提供することを目的とする。この方法は、
ヒト被験体から末梢血を得るステップ（ａ）と、
グリセリンをステップ（ａ）の末梢血に添加するステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の末梢血における他の体性幹細胞からｈＭＳＣを分離するステップ（ｃ）と、
ステップ（ｃ）の分離されたｈＭＳＣをグリセリン含有培地中で培養し、ｈＭＳＣ集団を製造するステップ（ｄ）と、を含み、
上記培養は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるいずれかの薬剤を含まない。

いくつかの実施形態によれば、本発明方法のステップ（ａ）において、ヒト被験体から末梢血を採取し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）が入ったチューブに収集する。本開示の実施形態によれば、被験体は、健康な被験体、又はｈＭＳＣ移植を必要とする疾患若しくは障害に罹患している被験体であり得る。さらに、本発明のｈＭＳＣの製造のために末梢血を採取する被験体には、特定の年齢制限がない。特定の実施形態によれば、末梢血は、２０歳から３０歳のヒト被験体から採取される。他の実施形態によれば、末梢血は、５０歳から６０歳のヒト被験体から採取される。さらなる実施形態によれば、末梢血は、７０歳から８０歳のヒト被験体から採取される。

末梢血を収集した直後、グリセリンと混合し、３７℃で少なくとも４時間、好ましくは少なくとも６時間インキュベートする（本発明方法のステップ（ｂ））。本開示の実施形態によれば、グリセリンは、好ましくは約１－１０ｍｇ／ｍＬ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０ｍｇ／ｍＬ）、より好ましくは約２－８ｍｇ／ｍＬ（例えば、２、３、４、５、６、７及び８ｍｇ／ｍＬ）、最も好ましくは約５ｍｇ／ｍＬの量で末梢血に存在する。

インキュベートした後、セルソーター又は遠心エルトリエーションなどの適切な手段によりグリセリン含有末梢血中のｈＭＳＣを他の体性幹細胞から分離する（本発明方法のステップ（ｃ））。

本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明方法のステップ（ｃ）において、レーザースキャンフローサイトメータなどのセルソーターを用いて末梢血中のｈＭＳＣを他の体性幹細胞から分離する。フローサイトメータは通常、レーザー光源と、流量測定チャンバーと、光学システム（レンズ、フィルター及び光検出器からなる）から構成される。２つの光電子増倍管（１つはレーザーに対して１８０度、もう１つは９０度）によりそれぞれ前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＣＣ）を測定する。前方向チューブにおけるフィルターと光電子増倍管から構成される３つの蛍光検出器により蛍光を検出する。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）装置は、特定の前方散乱及び／又は側方散乱の細胞が選択されるように設定される。ＦＳＣは細胞の表面積又はサイズに比例する。ＦＳＣは、主に回折光の測定に用いられ、フォトダイオードにより順方向における入射レーザービームの軸から少し外れて検出される。ＦＳＣは、粒子の蛍光に関係なく、所定サイズより大きい粒子を検出する適切な方法を提供する。側方散乱光（ＳＣＣ）は、粒度又は内部の複雑さに比例する。ＳＳＣは、主に屈折率の変化がある細胞内の任意の界面で発生する屈折光と反射光の測定に用いられる。ＳＳＣは、集光レンズによってレーザービームに対して約９０度で集光され、ビームスプリッターによって適切な検出器に転送される。よって、特定のＦＳＣ及びＳＳＣでゲーティングすることにより、細胞を選択することができる。本開示の実施例によれば、細胞表面の発現レベルに基づいて末梢血中のｈＭＳＣを他の体性幹細胞から分離し、異なる蛍光強度で染色されたイベントにゲートが設定された細胞集団を選択する。

さらに、ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）で得られたグリセリン含有末梢血をセルソーター（例えば、ＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ Ａｐｈｅｒａｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）に注入し、必要に応じて血液が凝固しないように抗凝固剤を添加する。次に、この混合物を遠心分離機で回転させて、末梢血をＭＳＣ集団と他の血液成分や血漿からの単核細胞に分離する。その後、分離されたＭＳＣを収集バッグに入れて保存し、一方、他の血液成分及び血漿を廃棄するか、又は被験体に戻す。

さらに、本発明方法のステップ（ｃ）において、遠心エルトリエーションによりグリセリン含有末梢血中のｈＭＳＣを他の体性幹細胞から分離する。遠心エルトリエーションでは、サイズの大きな幹細胞から小さな幹細胞が分離される。特定の実施形態において、ステップ（ｂ）のグリセリン含有末梢血を回転遠心分離機に配置された一般的な漏斗形状の分離チャンバーに導入する。液体エルトリエーション緩衝液の流れを末梢血を含むチャンバーに導入する。チャンバーを通る液体エルトリエーション緩衝液の流速が増加すると、サイズがより小さく、沈降がより遅い細胞は液体によってチャンバー内のエルトリエーション境界に掃引され、サイズがより大きく、沈降がより速い細胞は遠心力と沈降力のバランスが取れているチャンバーの領域に移動する。したがって、末梢血は多くの異なる幹細胞集団を含むので、エルトリエーションにより別個の集団に分離することができる。エルトリエーションでは、サイズの大きな幹細胞から小さな幹細胞が分離される。末梢血に由来するＭＳＣの取得及び／又は単離には、任意のエルトリエーション装置を使用することができる。

本発明方法のステップ（ｄ）において、ステップ（ｃ）で製造されたｈＭＳＣを、さらに、単離されたｈＭＳＣの増殖を増強する条件で培養することにより増殖させる。本開示の好ましい実施形態によれば、ステップ（ｃ）で得られたｈＭＳＣをペトリ皿（表面積約１０ｃｍ^２）におけるグリセリン含有成長培地中で培養する。この成長培地には、既知の幹細胞動員剤（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）が含まれない。特定の成分を含まない培地に言及する場合、本開示は、培地にこの成分が含まれるが、その最小活性を示す濃度よりも小さい濃度で含まれることを意図することが理解され得る。したがって、例えば、特定の培地には、微量の上記幹細胞動員剤（即ち、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ又はこれらの組み合わせ）を含み得る。しかしながら、本開示の方法は、市販の培地の調製品に含まれるか、又は培地成分濃度の全体的な調整から生じる増殖因子以外に、外因的に加えられた増殖因子を含まない培地に関する。

本発明のｈＭＳＣを培養するのに適した典型的な培地は、完全培地（例えば、ＤＭＥＭ）であり得る。この完全培地は、少なくとも２０％（ｖ／ｖ）の血清、好ましくは少なくとも３０％（ｖ／ｖ）の血清、より好ましくは少なくとも５０％の血清を含み、完全培地におけるグリセリンの濃度は、好ましくは約０．１－１．０ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９及び１．０ｍｇ／ｍＬ）、より好ましくは約０．２－０．８ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７及び０．８ｍｇ／ｍＬ）、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態において、ｈＭＳＣを培養するための成長培地は、０．１－１．０ｍｇ／ｍＬのグリセリンが添加されてもよい１００％（ｖ／ｖ）血清である。培養中に、細胞代謝に必要なサプリメント（例えば、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及びトランスフェリンなどの有用なタンパク質など）を添加することができる。培地は酵母、細菌、及び真菌による汚染を防ぐために抗生物質を含んでもよい。抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどであり得る。本開示の一実施形態によれば、培地は脳下垂体抽出物、血漿及びウシ胎児血清を含む。一定期間培養してｈＭＳＣを増殖させてもよい。これによって、十分量のｈＭＳＣを製造することができる。特定の実施形態によれば、ステップ（ｃ）で得られたｈＭＳＣを３０％（ｖ／ｖ）の血清及び０．５ｍｇ／ｍＬのグリセリンを含む培地中で３７℃で少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも１６時間、より好ましくは少なくとも２４時間培養することにより、自家移植に適したｈＭＳＣ集団を製造する。

本開示の実施形態によれば、本発明方法により製造されたｈＭＳＣ集団は、造血幹細胞マーカーＣＤ３４及びＣＤ４５、並びに移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を媒介することが知られているヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）細胞表面マーカーに対して陰性染色を示し、細胞表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性染色を示す。細胞表面マーカー発現を決定する方法は、当技術分野でよく知られている。例には、免疫学的方法（例えば、ＦＡＣＳ）及び生化学的方法（例えば、放射性、蛍光、又はアビジン－ビオチンによる細胞表面標識）が含まれる。或いは、磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）又はイムノパニングにより細胞を同定することができる。

本発明方法により製造されたｈＭＳＣ集団上の細胞表面マーカーの発現のパターンは、このｈＭＳＣ集団が確かに未分化の成熟ｈＭＳＣの豊富な集団であることを証明し、このｈＭＳＣ集団は自家幹細胞移植を必要とする再生療法で使用され得る。

３．ヒトＭＳＣクローン細胞株
本開示の他の態様は、上記のいずれかの方法により製造された実質的に純粋な未分化ｈＭＳＣ集団を含むクローン細胞株に関する。

本開示のこの態様によれば、新たに単離された又は上記の方法で製造されたｈＭＳＣを、分化を誘導しない条件下（例えば、分化因子の非存在下）で培養することによりさらに増殖させる。一般に、ｈＭＳＣが宿主から単離され、又はｈＭＳＣ集団（例えば、本発明方法のステップ（ｄ）で製造されたｈＭＳＣ）を製造するために選択された後、ステップ（ｄ）よりも少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍又は少なくとも２０倍大きい表面積を有する培養プレート中で培養し、引き続き上記グリセリン含有培地（即ち、ステップ（ｄ）の培地）で培養する。上記ｈＭＳＣ集団は、異質細胞集団又は純粋なｈＭＳＣ集団であってもよい。必要に応じて、ｈＭＳＣをバイオリアクターで培養して大量の細胞を製造する。本開示の実施形態によれば、本発明のステップに適した培地は、細胞動員剤（例えば、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ及びこれらの組み合わせ）を含まず、好ましくは約０．１－１．０ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９及び１．０ｍｇ／ｍＬ）、より好ましくは約０．２－０．８ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７及び０．８ｍｇ／ｍＬ）、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でグリセリンを含む。同質の未分化ｈＭＳＣ集団を製造するために、培養は、少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１４日間行う。同質の未分化ｈＭＳＣ集団は、好ましくは少なくとも７０％のｈＭＳＣ、より好ましくは少なくとも８０％のｈＭＳＣ、最も好ましくは少なくとも９０％のｈＭＳＣを含む。

本開示の実施形態によれば、ｈＭＳＣは、少なくとも２倍の集団倍加、少なくとも４倍の集団倍加、少なくとも６倍の集団倍加、少なくとも８倍の集団倍加、少なくとも１０倍の集団倍加、少なくとも１２倍の集団倍加、少なくとも１５倍の集団倍加、少なくとも２０倍の集団倍加、少なくとも３０倍の集団倍加、又は少なくとも４０倍の集団倍加に増殖することができる。

上記ステップ（ｄ）と同様に、このようにして製造された同質ｈＭＳＣ集団は、未分化のままであり、造血幹細胞マーカーＣＤ３４及びＣＤ４５、並びに細胞表面マーカーＨＬＡ－ＤＲに対して陰性染色を示し、細胞表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性染色を示す。

本発明方法により製造されたｈＭＳＣ集団培養物は、新たに使用するか、又は使用するまで保存することができる。保存は、例えば、凍結保存剤（グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを含むが、これらに限定されない）の存在下で凍結保存される。

４．本発明のｈＭＳＣを含む組成物
本開示のｈＭＳＣは、単独で、培地と共に、又は医薬的に許容されるキャリア及び他の添加剤と組み合わせて提供され得る。添加剤（例えば、免疫抑制剤、抗生物質、成長因子など）は、細胞生着及び／又は臓器機能を促進することができる。したがって、本開示のｈＭＳＣは、医薬組成物で被験体に投与され得る。医薬組成物において、本開示のｈＭＳＣは、医薬的キャリア又は希釈剤（例えば、滅菌生理食塩水及び水性緩衝溶液）と混合される。

適切な投与経路には、経口、直腸、経粘膜（例えば、経鼻）、腸内又は非経口送達（筋肉内、皮下、心室内注射、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内又は眼内注射）が含まれるが、これらに限定されない。

或いは、全身的ではなく局所的に医薬組成物を投与してもよい。例えば、標的部位（例えば、臓器）に直接医薬組成物を注射することができる。

本開示によれば、医薬組成物は、１つ以上の医薬的に許容されるキャリアを使用して従来の方法で製剤化することができる。適切な製剤は投与経路に依存する。

注射のために、本開示のｈＭＳＣは、水溶液、好ましくは生理学的に許容される緩衝液（例えば、リンガー溶液）又は生理学的に許容される塩溶液に製剤化され得る。

本開示の文脈での使用に適した医薬組成物は、活性成分（例えば、ｈＭＳＣ）が所望の目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内であり、特に本開示の説明に照らして行われる。

本開示の医薬組成物は、本発明のｈＭＳＣを含む１つ又は複数の単位剤形を含み得るキットとして提示されてもよい。上記キットはさらに、キット上又はキットに付随してラベル又は添付文書を含んでもよい。ラベル又は添付文書は、キットが特定の疾患及び／又は障害の治療用であることを示す。キットは、リン酸緩衝生理食塩水又はリンガー溶液などの緩衝液をさらに含んでもよい。キットは、本発明のｈＭＳＣを所望の標的部位に投与する方法についての指示をさらに含んでもよい。

一実施形態によれば、上記キットは、少なくとも（ａ）本発明のｈＭＳＣを含む第１容器と、必要に応じて（ｂ）緩衝液を含む第２容器と、（ｃ）キットの使用方法をユーザーに提示するためのキットに関連した凡例とを含んでもよい。凡例は、パンフレット、テープ、ＣＤ、ＶＣＤ、又はＤＶＤの形式であり得る。

５．本発明のｈＭＳＣ又はその分化した子孫の使用
上述した本発明方法により製造された未分化ｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫は、自家移植によって有益な効果が達成される無数の疾患及び／又は障害を治療及び／又は予防するために自家移植に使用することができる。

本開示の他の態様は、被験体の疾患及び／又は病状を治療する方法に関する。当該方法では、有効量の本発明方法により製造されたｈＭＳＣ集団及びその分化した子孫を被験体に数日から数週間投与する。

ＭＳＣは、様々な細胞系統に分化することができる。分化は、望ましい表現型を有する細胞（例えば骨芽細胞、脂肪細胞）が豊富な成長環境でＭＳＣを培養することによって達成できる。培養物は、特定の系統への分化を増強する薬剤を含み得る。本開示の一実施形態によれば、ｈＭＳＣ集団はデキサメタゾン、アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸を含む培地でコンフルエントに達するまで培養することにより、軟骨細胞に分化する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．９（４），６７９を参照）。分化した軟骨細胞は、アルカリホスファターゼ染色により確定される。本開示の他の実施形態によれば、ｈＭＳＣ集団は、商業的な軟骨形成培地で培養することにより、軟骨に分化する。分化した軟骨は、プロシアグリカンをアルシアンブルーで染色することにより確認される。本開示のさらなる実施形態によれば、ｈＭＳＣ集団は、脂肪細胞に分化する。脂肪生成分化を誘導するために、ｈＭＳＣは脂肪生成培地で処理される。脂肪生成培地は、ヒドロコルチゾン、インドメタシン、及び／又は市販のＭＳＣ脂肪生成刺激サプリメント（例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）から購入されるもの）を含む。脂肪生成分化は、オイルレッド染色によって確認される。

本開示の実施形態によれば、ｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫によって治療可能な疾患及び／又は障害は、骨又は軟骨疾患、神経変性疾患、心疾患、肝疾患、がん、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、創傷治癒及び組織再生からなる群より選択される。

本発明方法で製造されたｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫による治療に適した骨欠損には、骨形成不全症、骨折、先天性骨欠損などが含まれるが、これらに限定されない。

本発明方法で製造されたｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫は、被験体に移植することにより、整形外科及び他の（例えば、歯科用）補綴装置、例えば、関節置換及び／又は歯牙移植に骨と結合組織の支持を提供することができる。

ＭＳＣが軟骨に分化できるため、本発明方法で製造されたｈＭＳＣ集団及びその分化した子孫は、間接病状（変形性関節症、関節リウマチ、炎症性関節炎、軟骨軟化症、無血管性壊死、外傷性関節炎などを含むが、これらに限定されない）の治療に適している。

本発明方法で製造された集団は、ＣＮＳ障害の治療にも適用できる。ＣＮＳ障害の例には、疼痛障害、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、神経変性疾患、及びけいれん性障害が含まれるが、これらに限定されない。このような障害のより具体的な例には、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、黄斑変性症、行動性振戦及び遅発性ジスキネジア、パニック、不安うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイム病及び癲癇が含まれますが、これらに限定されない。

ＭＳＣは造血幹細胞や免疫細胞と相互作用することが知られており、同種造血生着の促進及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の防止のための潜在的な細胞治療を示している。したがって、本発明方法で製造されたｈＭＳＣ集団は、ＧｖＨＤの治療にも適用できる。
本発明方法で製造されたｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫は、組織再生の促進にも適用できる。ｈＭＳＣの移植は、自己免疫疾患、炎症性疾患、急性及び慢性の虚血性状態の治療、組織工学、新しい組織の再生、並びに罹患臓器又は損傷臓器の自然治癒に有用である。

ＭＳＣを梗塞した心臓に導入することにより、有害なリモデリングが防止され、回復が促進されることが知られている。ＭＳＣが梗塞部位に直接注射されるか、又は静脈内投与されると、損傷部位に戻ることが確認された。したがって、本発明のｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫は、心疾患、特に心筋梗塞の治療にも適用できる。

本発明のｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫によって治療可能ながんの例には、乳がん、脳腫瘍、黒色腫、肺がん、リンパ腫、神経上皮腫、腎臓がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、子宮がんが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、がんは転移性である。

上記ｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫は、性質が移植部位に依存する様々な移植アプローチにより治療を受ける個体に移植することができる。細胞は、組織の損傷又は健康な領域に移植されてもよい。ｈＭＳＣが健康な領域に投与された場合、ｈＭＳＣは損傷領域に移動する。

上記ｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫は臓器への直接注射、血流への注射、腹腔内注射、リンパ系臓器への直接注射によって移植することができる。適切な移植方法は、所望の臓器への移植細胞のホーミング及び生着、所望の臓器特異的マーカーの発現、及び被験体の所望の臓器の機能をモニタリングすることによって決定することができる。

ｈＭＳＣ集団又はその分化した子孫は、被験体において所望の治療効果を達成する量で投与される。本発明方法で使用されるｈＭＳＣの有効量は、インビトロ及び／又はインビトロ細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、投与量は、実験動物で策定して望ましい濃度を達成し、さらにこの情報を用いてヒト用の投与量をより正確に決定することができる。投与量は投与経路によって異なる。正確な投与量及び投与経路は、主治医によって患者の病状と病歴に基づいて決定することができる。

治療すべき病状に応じて、有効量の本発明のｈＭＳＣは、単回投与又は複数回投与であり得る。治療コースは、数日から数週間の期間であってもよく、効果的に治癒するか又は疾患の症状が軽減されるまで続いてもよい。

本開示のさらなる目的、利点及び特徴は、限定することを意図しない以下の実施例を検討すると、当業者に明らかになるであろう。

材料と方法
表面抗原分析
０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを用いて細胞を培養プレートから分離した。細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で洗浄し、フルオレセインイソチオシアニド（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗体で４℃で３０分間染色した。ＭＳＣマーカーは、抗ＣＤ２９（インテグリンβ１鎖）、抗ＣＤ１０５（ＳＨ２、エンドグリンＣＤ７３（＋））であり、造血幹細胞マーカーは、抗ＣＤ３４（陰性対照）であり、白血球マーカーは、抗ＣＤ４５（白血球共通抗原）である。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）により分析した。励起用光源として４８８ｎｍのアルゴンレーザービームを使用して、細胞を最大１，０００細胞／秒の速度で通過させた。ＦＩＴＣ及びＰＥ結合アイソタイプコントロール抗体で染色した細胞を使用してバックグラウンド蛍光を計算した。

ＳＴＥＭＰＲＯ骨形成分化キット（Ｇｉｂｃｏ）を用いて骨細胞へのｈＭＳＣの分化を誘導し、ＳＴＥＭＰＲＯ脂肪生成分化キット（Ｇｉｂｃｏ）及び軟骨形成誘導培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて脂肪細胞及び軟骨細胞へのｈＭＳＣの分化を誘導した。次に、これらの細胞を３７℃で９５％空気及び５％ＣＯ_２加湿インキュベーター内で維持した。１４日間２～５日間ごとに培地を交換した。標準的な手順に従ってアルシアンブルー染色により分化した軟骨を評価した。標準的な手順に従ってオイルレッドＯ染色より分化した脂肪細胞を評価した。

実施例１：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の製造及び培養
本研究には、書面でインフォームドコンセントに同意した１５人のヒト被験体が含まれる。これらの被験体は、年齢に応じて各群５人で５０－６０歳群、７０－８０歳群、及び２０－３０群に分けられた。各被験者から血液（１０ｍＬ）を採取し、ヘパリンを含むチューブに収集し、次に、グリセリン０．５ｍｇ（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、グリセリンを含む血液を３７℃のインキュベーターに６時間保存した。次に、血液を含むグリセリンを３，５００ｒｐｍの速度で１８分間遠心分離した。遠心分離後、チューブの中間層の細胞を抽出し、ＰＢＳ溶液（８ｍＬ）に再懸濁した。細胞懸濁液を１８×ｇの速度で再度１３分間遠心分離し、上清を捨て、チューブの中間層の細胞を抽出し、１０ｍＬのｔｈｅｒｍｏ－ｌｉｆｅ培地（ケラチノサイト－ＳＦＭ ５００ｍＬ、ウシ下垂体抽出物２．５ｍＬ、１３％の新鮮なヒト冷凍血漿（ＦＦＰ）、３０％のウシ胎児血清、１５ｍＬのグリセリン（１００ｍｇ／ｍＬ）、及び上皮成長因子（ＥＧＦ，２．５μｇ）を含む）を含む培養プレート（表面積：約１０ｃｍ^２）に接種した。次に、細胞接種培養プレートをインキュベーターに置き、３７℃、７０％ＲＨ（相対湿度）、５％ＣＯ_２の条件で１６～１８時間インキュベートした。その後、細胞を収集し、上記ｔｈｅｒｍｏ－ｌｉｆｅ培地１０ｍＬを含む別の培養プレート（表面積：１７５ｃｍ^２）に再接種した。培地を３日ごとに交換し、培地の交換を少なくとも１回繰り返した。間葉系幹細胞は５日目に現れ始め、最終的に７日目頃にコンフルエントに達した。得られたｈＭＳＣを単離し、使用するまで凍結温度で保存した。

さらに、ｈＭＳＣは、高齢被験体（例えば、７０～８０歳の被験体）の末梢血から成功裏に取得し、インビトロで増殖できることが発見された。

実施例２：実施例１のｈＭＳＣの特性
２．１ 細胞表面抗原分析
トリプシン／ＥＤＴＡを用いて実施例１の接着細胞を単離し、「材料及び方法」に記載の順に従ってフローサイトメータにより表面抗原分析を行なった、結果を図１に示す。

実施例１の細胞は、細胞表面マーカーＣＤ７３（データ示さず）、ＣＤ９０（図１Ａ）及びＣＤ１０５（図１Ｂ）に対して陽性を示し、ＣＤ３４（図１Ｃ）、ＣＤ４５（データ示さず）及びＨＬＡ－ＤＲ（データ示さず）に対して陰性を示した。この結果により、これらの細胞は間葉系幹細胞であることが実証された。

２．２ 実施例１のｈＭＳＣの分化
この実施例において、実施例１のｈＭＳＣが依然として分化能力を有することを証明するために、ｈＭＳＣのその後の分化を誘発する薬剤をそれぞれ含む培地でｈＭＳＣを培養した。実施例１のｈＭＳＣから分化した軟骨細胞、軟骨及び脂肪細胞は、標準的な手順に従って、それぞれアルカリホスファターゼ（図２Ａ）、アルシアンブルー（図２Ｂ）、及びオイルレッドＯ（図２Ｃ）で染色することにより確認された。

実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は１又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。

Claims (7)

1. 末梢血から未分化ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）集団を提供する方法であって、
   前記末梢血にグリセリンを添加するステップ（ａ）と、
   ステップ（ａ）の末梢血中の他の体性幹細胞からｈＭＳＣを分離するステップ（ｂ）と、
   ステップ（ｂ）の分離されたｈＭＳＣをグリセリン含有培地中で培養することにより、ｈＭＳＣ集団を製造するステップ（ｃ）と、を含み、
   上記培地は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるいずれかの動員剤を含まない、方法。
2. ステップ（ｂ）において、前記末梢血は、溶血剤を含まないチューブに収集される、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ａ）において、前記グリセリンは、約１－１０ｍｇ／ｍＬの濃度で前記末梢血に存在する、請求項１に記載の方法。
4. ステップ（ｃ）において、前記培地は、少なくとも２０％（ｖ／ｖ）の血清を含み、前記グリセリンは、約０．１－１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で前記培地に存在し、前記ｈＭＳＣは、３７℃でグリセリン含有培地を含む培養プレート中で少なくとも１２時間培養される、請求項１に記載の方法。
5. 培養したｈＭＳＣを、ステップ（ｃ）の培養プレートよりも少なくとも２０倍大きい表面積を有する別の培養プレートに移し、引き続きグリセリン含有培地中で培養し、未分化ｈＭＳＣ集団を製造するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. ステップ（ｄ）において、ｈＭＳＣを少なくとも４日培養することにより未分化ｈＭＳＣ集団を製造する、請求項５に記載の方法。
7. 前記のように製造された未分化ｈＭＳＣ集団は、細胞表面マーカーＣＤ３４－、ＣＤ４５－、及びＨＬＡ－ＤＲに対して陰性であり、細胞表面マーカーＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、及びＣＤ１０５＋に対して陽性である、請求項４から６の何れか１項に記載の方法。

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