CN107400666B

CN107400666B - 一种氨肽酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN107400666B
Application number: CN201710812644.4A
Authority: CN
Inventors: 叶茂; 邓毛程; 李静; 张远平; 陈维新; 刘慧平
Original assignee: Guangdong Light Industry Vocational And Technical College
Current assignee: Guangdong Light Industry Vocational And Technical College
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2017-09-11
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2037-09-11
Also published as: CN107400666A

Abstract

本发明公开了一种氨肽酶及其编码基因和应用。该氨肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了编码该氨肽酶的核苷酸序列。该氨肽酶具有能水解几乎所有的氨基酸残基的作用，具有良好的应用潜力，并且对丰富氨肽酶家族成员，开发我国传统调味品环境资源都具有重要意义。因此，可将其用于制备呈味肽，可通过如下步骤制备呈味肽：将本发明提供的氨肽酶加入到含有蛋白底物的水解反应体系中，在25～35℃条件下进行酶水解反应2～6h，得到相应的呈味肽。

Description

一种氨肽酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，特别涉及一种氨肽酶及其编码基因和应用。

背景技术

氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个游离出来的水解酶，其底物作用范围一般较为广谱，不仅能够水解多肽，而且能水解完整的蛋白质分子。氨肽酶主要应用于蛋白质水解、风味肽和生物活性多肽制备以及生物学与医学等领域：当蛋白质大分子酶解时，肽链中含有的疏水性氨基酸暴露出来，接触味蕾而呈现苦味，而这些疏水性氨基酸一般位于肽链末端，而利用氨肽酶进一步水解蛋白质水解液，可以脱除其苦味；与蛋白酶复合使用，在酱油酿造、鱼露生产及其它蛋白水解产品的制备过程中，不仅可以提高蛋白质的利用率，而且能形成风味独特、滋味鲜美的复合氨基酸水解液；利用氨肽酶的酶解制备抗癌、抗氧化、抗菌等特性的活性肽；在医学用途方面，亮氨酰氨肽酶等还可用作蛋白质序列测定的分子工具，脯氨肽酶能有效清除神经毒性化学毒剂及有机磷农药，既可作为医学上的解毒剂，又可以作为环境消毒剂。因而，氨肽酶具有很高的研究价值和更广阔的应用前景。

宏基因组学(Metagenomics)是近年来随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展兴起的一门新兴的科学技术。其基本研究思路是直接提取环境中所有微生物的基因组DNA，克隆到合适的载体，构建宏基因组文库，将环境中全部微生物的核酸信息收集在一起，并运用序列筛选或功能筛选方式从文库中获得有用的酶、抗生素、活性物质等。这种完全不依赖于环境中微生物的分离和培养的技术拓展了微生物学的研究思路与方法，为从不同自然生境中的未培养微生物中寻找新的基因资源和活性物质提供了有力的技术手段。

到目前为止，从宏基因组文库中寻找新氨肽酶基因的研究，国内外尚无相关的报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种氨肽酶。该酶对N-端氨基酸残基专一性低，能水解几乎所有的氨基酸残基，对丰富氨肽酶家族成员，开发新的蛋白水解成风味肽的途径都具有重要意义。

本发明的另一目的在于提供编码所述氨肽酶的基因。

本发明的再一目的在于提供所述氨肽酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种氨肽酶，其氨基酸序列如下所示：

MNFQVQDAAIVIEAVIVALAFFAEKIIFAQQLDAAITGSLQALLAHKGISTVGYAVSLLHSLAGLNVDRYYVGLEGQQLAYGIQTLLRKAGDAFTTIKGGAVSDEQIKLPSFTKQRLDAAVLHIAVVSPGHGAYELTYSKKKDKQELFEFTAIALDDAQLDLEGFISVGDVTGVLLNFARQLGNAHPHVLTPAIKTAEEAVALFGKTDYDVKLDKEQMEGIGNGSLLAVKKGSENIPRLIVLTYNGKEDAAPVVALVGPGITFDSGGYSLKTRQGMEFMKFDMGCGAAVGGTVEAIGHLLPPKNIVGVIPASDNIVNGEAISPLDVGTSLSGYTIEVMNTFPEGRLLLADAVFYAYQDGPGVLADVATLTGAYIVVLGAHKTAGAMINPGILFNQLLDASEEVDEPAGLPAIWGTEGGVVTSDVADLPNYGGRDGTALFEGMFLTEEPENTPWLYLDIAGGSRIEDAVLIGPDGAEGLLVPTLVDLLTREGEAEA。

一种核苷酸序列，是编码所述的氨肽酶的核苷酸序列；优选为无内含子，具有1485bp完整的开放读码框的核苷酸序列；更优选为如下所示的序列：

ATGAACTTCCAGGTTCAGGACGCTGCTATCGTTATCGAAGCTGTTATCGTTGCTCTGGCTTTCTTCGCTGAAAAAATCATCTTCGCTCAGCAGCTGGACGCTGCTATCACCGGTTCTCTGCAGGCTCTGCTGGCTCACAAAGGTATCTCTACCGTTGGTTACGCTGTTTCTCTGCTGCACTCTCTGGCTGGTCTGAACGTTGACCGTTACTACGTTGGTCTGGAAGGTCAGCAGCTGGCTTACGGTATCCAGACCCTGCTGCGTAAAGCTGGTGACGCTTTCACCACCATCAAAGGTGGTGCTGTTTCTGACGAACAGATCAAACTGCCGTCTTTCACCAAACAGCGTCTGGACGCTGCTGTTCTGCACATCGCTGTTGTTTCTCCGGGTCACGGTGCTTACGAACTGACCTACTCTAAAAAAAAAGACAAACAGGAACTGTTCGAATTCACCGCTATCGCTCTGGACGACGCTCAGCTGGACCTGGAAGGTTTCATCTCTGTTGGTGACGTTACCGGTGTTCTGCTGAACTTCGCTCGTCAGCTGGGTAACGCTCACCCGCACGTTCTGACCCCGGCTATCAAAACCGCTGAAGAAGCTGTTGCTCTGTTCGGTAAAACCGACTACGACGTTAAACTGGACAAAGAACAGATGGAAGGTATCGGTAACGGTTCTCTGCTGGCTGTTAAAAAAGGTTCTGAAAACATCCCGCGTCTGATCGTTCTGACCTACAACGGTAAAGAAGACGCTGCTCCGGTTGTTGCTCTGGTTGGTCCGGGTATCACCTTCGACTCTGGTGGTTACTCTCTGAAAACCCGTCAGGGTATGGAATTCATGAAATTCGACATGGGTTGCGGTGCTGCTGTTGGTGGTACCGTTGAAGCTATCGGTCACCTGCTGCCGCCGAAAAACATCGTTGGTGTTATCCCGGCTTCTGACAACATCGTTAACGGTGAAGCTATCTCTCCGCTGGACGTTGGTACCTCTCTGTCTGGTTACACCATCGAAGTTATGAACACCTTCCCGGAAGGTCGTCTGCTGCTGGCTGACGCTGTTTTCTACGCTTACCAGGACGGTCCGGGTGTTCTGGCTGACGTTGCTACCCTGACCGGTGCTTACATCGTTGTTCTGGGTGCTCACAAAACCGCTGGTGCTATGATCAACCCGGGTATCCTGTTCAACCAGCTGCTGGACGCTTCTGAAGAAGTTGACGAACCGGCTGGTCTGCCGGCTATCTGGGGTACCGAAGGTGGTGTTGTTACCTCTGACGTTGCTGACCTGCCGAACTACGGTGGTCGTGACGGTACCGCTCTGTTCGAAGGTATGTTCCTGACCGAAGAACCGGAAAACACCCCGTGGCTGTACCTGGACATCGCTGGTGGTTCTCGTATCGAAGACGCTGTTCTGATCGGTCCGGACGGTGCTGAAGGTCTGCTGGTTCCGACCCTGGTTGACCTGCTGACCCGTGAAGGTGAAGCTGAAGCT。

上述核苷酸序列可通过化学合成方法得到，也可通过如下步骤制备得到：

一、提取传统发酵食品环境样品，提取总基因组并纯化；

二、将纯化后的总基因组经Sau3AI酶切处理；

三、将酶切产物连接到pUC18/BamHI(BAP)载体上，电击转化大肠杆菌DH5α中构建传统发酵食品环境宏基因组文库，用液体选择培养基和固体选择培养基从文库中筛选氨肽酶阳性克隆，通过高通量筛选得到阳性克隆子；

四、经测序和Blast比较设计引物，以阳性克隆子的质粒为模板，用设计好的引物进行链式酶聚合反应，从而克隆得到上述核苷酸序列。

步骤一中所述的传统发酵食品包括酱油、腐乳、豆酱和腊肠等。

步骤三中所述的选择培养基的组成如下：100μg/ml氨苄青霉素、10mmol/L L-亮氨酸-4-硝基苯胺、1(w/v)％葡萄糖和0.5(w/v)％无氨基酸酵母氮源，溶剂为水。

步骤四中所述的设计好的引物如下：

上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGAACTTCCAGGTTCAG-3’；

下游引物F2：5’-CGGAAGCTTAGCTTCACCTTCACGGTCA-3’。

另外，本发明还提供了上述氨肽酶的制备方法，可通过化学合成方法获得，或是采用上述核苷酸序列表达得到，包括如下步骤：

(1)将核苷酸序列克隆至表达载体中，再转入表达细胞中，得到含有重组载体的细胞；

(2)对步骤(1)得到的含有重组载体的细胞进行培养，经IPTG诱导，从培养物分离、纯化，获得氨肽酶。该氨肽酶具有能水解几乎所有的氨基酸残基的作用。

步骤(1)中所述的表达载体优选为pET-32a(+)。

步骤(1)中所述的表达细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

步骤(2)中所述的培养的培养基优选为含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基。

步骤(2)中所述的诱导的具体步骤如下：当含有重组载体的细胞生长至OD₆₀₀＝1.0时加入IPTG至终浓度0.8mM，20℃、200r/min下培养20h。

步骤(2)中所述的分离的方式优选为离心。

另外，本发明还提供了所述的氨肽酶在制备呈味肽中的应用，优选包括如下步骤：将所述的氨肽酶加入到含有蛋白底物的水解反应体系中，在25～35℃条件下进行酶水解反应2～6h，得到相应的呈味肽。

所述的蛋白底物包括大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白和酵母蛋白等。

所述的水解反应体系的pH值为6～8；优选为7。

所述的水解反应体系中的缓冲溶液优选为磷酸缓冲液。

所述的蛋白底物在所述的水解反应体系中的质量浓度为1％～10％；优选为1％。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)相比于现有技术，本发明应用宏基因组技术从我国传统调味品环境宏基因组文库获得的氨肽酶，发现了该酶具有能水解几乎所有的氨基酸残基的作用，具有良好的应用潜力，并且对丰富氨肽酶家族成员，开发我国传统调味品环境资源都具有重要意义。

(2)本发还通过对该酶在水解蛋白生成呈味肽中的最适条件进行研究，发现了在以大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、酵母蛋白等蛋白为底物原料的水解生成呈味肽反应中，本发明的氨肽酶在25-35℃条件下进行酶催化反应2-6h，所述底物的质量浓度为1％～10％，采用上述反应条件能够高效、快速地水解生成呈味肽，呈味肽分子量≤3000Da，感官鉴定有特征风味，具有很好的应用价值。

附图说明

图1是本发明提供的氨肽酶纯化的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1和2分别为重组蛋白粗酶液(未纯化)，泳道3为纯化后的蛋白。

图2是纯化的氨肽酶的底物特异性测定结果图。

图3是纯化的氨肽酶的最适反应温度测定结果图。

图4是纯化的氨肽酶的最适反应pH值测定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1氨肽酶基因的获得及水解蛋白生成呈味肽功能的验证

1、氨肽酶基因的获得

从我国传统发酵食品——酱油发酵环境样品(即酱醪)，构建发酵食品环境宏基因组文库。用含有100μg/ml氨苄青霉素、10mmol/L L-亮氨酸-4-硝基苯胺、1(w/v)％葡萄糖和0.5(w/v)％无氨基酸酵母氮源(YNB)的培养基作为选择培养基。将文库中的细胞同影印接种针复制到固体选择性培养基平板上，37℃下培养3天，筛选菌落周围有黄色水解圈出现的阳性克隆子，从文库中筛选氨肽酶阳性克隆。

提取上述阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，得到一个氨肽酶的核酸序列，该序列由1485个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示，将其命名为an_105；该核酸编码的多肽，含495个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其命名为AN_105。

2、基因片段的克隆

根据核酸an_105序列，设计扩增引物：上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGAACTTCCAGGTTCAG-3’(下划线为BamHI酶切位点序列)；下游引物F2：5’-CGGAAGCTTAGCTTCACCTTCACGGTCA-3’(下划线为HindIII酶切位点序列)。

以阳性克隆子的质粒为模板，以F1和F2为引物，进行PCR扩增，反应体系为：PrimeSTAR^TM HS DNA Ploymerase(2.5U/μl)0.3μl，5×缓冲液6μl，dNTP Mix(2.5mM)2.4μl，模板(100ng/μl)0.6μl，引物F1和F2(10mM)各0.3μl，超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火15s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，4℃。

将PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后用BamHI和HindIII双酶切16h，与经过同样处理的pET-32a(+)(Invitrogen)表达载体进行连接，电转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒DNA，进行测序验证发现其核苷酸序列与SEQ ID NO.2中的序列相同，能够有效地获取目的基因片段。

3、重组氨肽酶AN_105的获得

将含有经测序验证正确质粒的菌株接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、250r/min下培养14h，按2(v/v)％的接种量转接至100ml的含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，当生长至OD₆₀₀＝1.0时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度0.8mM，20℃、200r/min下培养20h，12000r/min离心5min，弃上清，将菌体重悬于20ml 50mMTri-HCl(pH7.5)中，用超声波破碎仪破碎菌体(200w，时间10秒，间隔15秒，全程5分钟，冰浴)，4℃，13000r/min离心15min，收集上清，即获得重组氨肽酶粗酶液。

将重组氨肽酶粗酶液用Invitrogen公司的His标签蛋白纯化试剂盒ProbandPurification system进行纯化重组蛋白，具体操作步骤按该公司产品说明书进行。纯化后的重组蛋白液氮速冻，保存至超低温冰箱中。纯化后的重组蛋白的浓度是290μg/ml。

粗酶液和纯化后的蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，结果如图1所示。可见，通过His标签蛋白纯化试剂盒Proband Purification system能成功从粗酶液纯化得到本发明的氨肽酶。

4、水解蛋白生成呈味肽功能的验证

将上述重组氨肽酶粗酶液2ml或纯化的酶液20μl，加入8ml pH7.0磷酸盐缓冲液(0.2M磷酸二氢钠水溶液39ml和0.2M磷酸氢二钠水溶液61ml混合)作为反应介质，分别试验不同的底物(大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、酵母蛋白等蛋白)，浓度为1(w/w)％，30℃水浴反应6h后，水解生成相应的呈味肽，呈味肽分子量≤3000Da，感官鉴定有特征风味。产物通过GC-MS进行结构鉴定。

实施例2重组氨肽酶AN_105底物特异性分析

100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，1mM底物，加入纯化的酶液10μl，在35℃测定吸光值A_405nm。测定底物为：L-亮氨酸-4-硝基苯胺(L-Leu-PNA,L-Leucine p-nitroanilidehydrochloride,CAS 16010-98-3)，L-蛋氨酸-4-硝基苯胺(L-Met-PNA,L-Methionine p-nitroanilide,CAS 6042-04-2)，L-脯氨酸-4-硝基苯胺(L-Pro-PNA,L-Proline p-nitroanilide trifluoroacetate salt,CAS 108321-19-3)，L-赖氨酸-4-硝基苯胺(L-Lys-PNA,L-Lysine p-nitroanilide dihydrobromide,CAS40492-96-4)，L-精氨酸-4-硝基苯胺(L-Arg-PNA,L-Arginine p-nitroanilide dihydrochloride,CAS 40127-11-5)，N-戊二酰-L-苯丙氨酸-4-硝基苯胺(L-Phe-PNA,N-Glutaryl-L-phenylalanine p-nitroanilide,CAS 5800-34-0)，L-谷氨酸-4-硝基苯胺(L-Glu-PNA,L-Glutamic acidγ-(p-nitroanilide)hydrochloride,CAS67953-08-6)，D-苯丙氨酸-缬氨酸-4-硝基苯胺(D-Phe-Val-PNA,D-Phe-Val-p-nitroanilide,CAS 108321-89-7)，D-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-4-硝基苯胺(D-Val-Leu-Lys-4-PNA,D-Val-Leu-Lys p-nitroanilide dihydrochloride)，N-苯甲酰-酪氨酸-4-硝基苯胺(N-Benzoyl-L-Tyr-PNA,N-Benzoyl-L-tyrosine p-nitroanilide,CAS 6154-45-6)。结果如图2所示，重组氨肽酶AN_105对大部分的底物具有催化活性，其中催化活性最高的底物为L-亮氨酸-4-硝基苯胺(L-Leu-PNA)，其次为L-精氨酸-4-硝基苯胺(L-Arg-PNA)和L-赖氨酸-4-硝基苯胺(L-Lys-PNA)。

实施例3重组氨肽酶AN_105最适反应温度的测定

100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，以1mM L-亮氨酸-4-硝基苯胺为底物，加入纯化后的酶液10μl，分别在20、25、30、35、40、45、50、55和60℃测定吸光值A_405nm。结果如图3所示，重组氨肽酶AN_105在25～50℃仍具有较高的催化活性，最适反应温度为35℃。

实施例4重组氨肽酶AN_105最适反应pH值的测定

以1mM L-亮氨酸-4-硝基苯胺为底物，加入纯化后的酶液10μl，分别在pH4.0～7.0(100mM磷酸盐缓冲液)及pH7.0～9.0(Tris-HCl缓冲液)等不同pH值条件下，35℃测定吸光值A_405nm。结果如图4所示，重组氨肽酶AN_105最适反应pH为7.0，在pH4.0～9.0仍有较高的酶活力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东轻工职业技术学院

<120> 一种氨肽酶及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 495

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Asn Phe Gln Val Gln Asp Ala Ala Ile Val Ile Glu Ala Val Ile

1 5 10 15

Val Ala Leu Ala Phe Phe Ala Glu Lys Ile Ile Phe Ala Gln Gln Leu

20 25 30

Asp Ala Ala Ile Thr Gly Ser Leu Gln Ala Leu Leu Ala His Lys Gly

35 40 45

Ile Ser Thr Val Gly Tyr Ala Val Ser Leu Leu His Ser Leu Ala Gly

50 55 60

Leu Asn Val Asp Arg Tyr Tyr Val Gly Leu Glu Gly Gln Gln Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Gly Ile Gln Thr Leu Leu Arg Lys Ala Gly Asp Ala Phe Thr Thr

85 90 95

Ile Lys Gly Gly Ala Val Ser Asp Glu Gln Ile Lys Leu Pro Ser Phe

100 105 110

Thr Lys Gln Arg Leu Asp Ala Ala Val Leu His Ile Ala Val Val Ser

115 120 125

Pro Gly His Gly Ala Tyr Glu Leu Thr Tyr Ser Lys Lys Lys Asp Lys

130 135 140

Gln Glu Leu Phe Glu Phe Thr Ala Ile Ala Leu Asp Asp Ala Gln Leu

145 150 155 160

Asp Leu Glu Gly Phe Ile Ser Val Gly Asp Val Thr Gly Val Leu Leu

165 170 175

Asn Phe Ala Arg Gln Leu Gly Asn Ala His Pro His Val Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Ile Lys Thr Ala Glu Glu Ala Val Ala Leu Phe Gly Lys Thr Asp

195 200 205

Tyr Asp Val Lys Leu Asp Lys Glu Gln Met Glu Gly Ile Gly Asn Gly

210 215 220

Ser Leu Leu Ala Val Lys Lys Gly Ser Glu Asn Ile Pro Arg Leu Ile

225 230 235 240

Val Leu Thr Tyr Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Leu

245 250 255

Val Gly Pro Gly Ile Thr Phe Asp Ser Gly Gly Tyr Ser Leu Lys Thr

260 265 270

Arg Gln Gly Met Glu Phe Met Lys Phe Asp Met Gly Cys Gly Ala Ala

275 280 285

Val Gly Gly Thr Val Glu Ala Ile Gly His Leu Leu Pro Pro Lys Asn

290 295 300

Ile Val Gly Val Ile Pro Ala Ser Asp Asn Ile Val Asn Gly Glu Ala

305 310 315 320

Ile Ser Pro Leu Asp Val Gly Thr Ser Leu Ser Gly Tyr Thr Ile Glu

325 330 335

Val Met Asn Thr Phe Pro Glu Gly Arg Leu Leu Leu Ala Asp Ala Val

340 345 350

Phe Tyr Ala Tyr Gln Asp Gly Pro Gly Val Leu Ala Asp Val Ala Thr

355 360 365

Leu Thr Gly Ala Tyr Ile Val Val Leu Gly Ala His Lys Thr Ala Gly

370 375 380

Ala Met Ile Asn Pro Gly Ile Leu Phe Asn Gln Leu Leu Asp Ala Ser

385 390 395 400

Glu Glu Val Asp Glu Pro Ala Gly Leu Pro Ala Ile Trp Gly Thr Glu

405 410 415

Gly Gly Val Val Thr Ser Asp Val Ala Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Gly

420 425 430

Arg Asp Gly Thr Ala Leu Phe Glu Gly Met Phe Leu Thr Glu Glu Pro

435 440 445

Glu Asn Thr Pro Trp Leu Tyr Leu Asp Ile Ala Gly Gly Ser Arg Ile

450 455 460

Glu Asp Ala Val Leu Ile Gly Pro Asp Gly Ala Glu Gly Leu Leu Val

465 470 475 480

Pro Thr Leu Val Asp Leu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Ala Glu Ala

485 490 495

<210> 2

<211> 1485

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgaacttcc aggttcagga cgctgctatc gttatcgaag ctgttatcgt tgctctggct 60

ttcttcgctg aaaaaatcat cttcgctcag cagctggacg ctgctatcac cggttctctg 120

caggctctgc tggctcacaa aggtatctct accgttggtt acgctgtttc tctgctgcac 180

tctctggctg gtctgaacgt tgaccgttac tacgttggtc tggaaggtca gcagctggct 240

tacggtatcc agaccctgct gcgtaaagct ggtgacgctt tcaccaccat caaaggtggt 300

gctgtttctg acgaacagat caaactgccg tctttcacca aacagcgtct ggacgctgct 360

gttctgcaca tcgctgttgt ttctccgggt cacggtgctt acgaactgac ctactctaaa 420

aaaaaagaca aacaggaact gttcgaattc accgctatcg ctctggacga cgctcagctg 480

gacctggaag gtttcatctc tgttggtgac gttaccggtg ttctgctgaa cttcgctcgt 540

cagctgggta acgctcaccc gcacgttctg accccggcta tcaaaaccgc tgaagaagct 600

gttgctctgt tcggtaaaac cgactacgac gttaaactgg acaaagaaca gatggaaggt 660

atcggtaacg gttctctgct ggctgttaaa aaaggttctg aaaacatccc gcgtctgatc 720

gttctgacct acaacggtaa agaagacgct gctccggttg ttgctctggt tggtccgggt 780

atcaccttcg actctggtgg ttactctctg aaaacccgtc agggtatgga attcatgaaa 840

ttcgacatgg gttgcggtgc tgctgttggt ggtaccgttg aagctatcgg tcacctgctg 900

ccgccgaaaa acatcgttgg tgttatcccg gcttctgaca acatcgttaa cggtgaagct 960

atctctccgc tggacgttgg tacctctctg tctggttaca ccatcgaagt tatgaacacc 1020

ttcccggaag gtcgtctgct gctggctgac gctgttttct acgcttacca ggacggtccg 1080

ggtgttctgg ctgacgttgc taccctgacc ggtgcttaca tcgttgttct gggtgctcac 1140

aaaaccgctg gtgctatgat caacccgggt atcctgttca accagctgct ggacgcttct 1200

gaagaagttg acgaaccggc tggtctgccg gctatctggg gtaccgaagg tggtgttgtt 1260

acctctgacg ttgctgacct gccgaactac ggtggtcgtg acggtaccgc tctgttcgaa 1320

ggtatgttcc tgaccgaaga accggaaaac accccgtggc tgtacctgga catcgctggt 1380

ggttctcgta tcgaagacgc tgttctgatc ggtccggacg gtgctgaagg tctgctggtt 1440

ccgaccctgg ttgacctgct gacccgtgaa ggtgaagctg aagct 1485

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgaacttcca ggttcag 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggaagctta gcttcacctt cacggtca 28

Claims

1.一种氨肽酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种核苷酸序列，其特征在于：是编码权利要求1所述的氨肽酶的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：所述的核苷酸序列是为无内含子，具有1485bp完整的开放读码框的序列。

4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于：所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述的氨肽酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将权利要求2～4任一项所述的核苷酸序列克隆至表达载体中，再转入表达细胞中，得到含有重组载体的细胞；

（2）对步骤（1）得到的含有重组载体的细胞进行培养，经IPTG诱导，从培养物分离、纯化，获得氨肽酶。

6.根据权利要求5所述的氨肽酶的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的表达载体为pET-32a(+)；

步骤（1）中所述的表达细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；

步骤（2）中所述的培养的培养基为含100µg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基；

步骤（2）中所述的诱导的具体步骤如下：当含有重组载体的细胞生长至OD600=1.0时加入IPTG至终浓度0.8mM，20℃、200 r/min下培养20h。

7.权利要求1所述的氨肽酶在制备呈味肽中的应用。

8.根据权利要求7所述的氨肽酶在制备呈味肽中的应用，其特征在于包括如下步骤：将所述的氨肽酶加入到含有蛋白底物的水解反应体系中，在25～35℃条件下进行酶水解反应2～6 h，得到相应的呈味肽。