CN106119173A - 一种无苦味的虾类低分子肽及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种无苦味的虾类低分子肽及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明提供一种枯草芽孢杆菌YBPE‑4，保藏编号：CCTCC NO:M2016359。将虾类经干燥、粉碎、中性蛋白酶酶解，分离得到酶解液。利用酶解液、可溶性淀粉和磷酸二氢钾配制成发酵培养基，接入成熟的枯草芽孢杆菌YBPE‑4培养液，进行搅拌通气发酵132～144h；发酵液经离心去除菌体，获得上清液，经超滤膜过滤，获得分子量为360～5000Da的滤液；滤液经干燥，最后获得无苦味的虾类低分子肽产品。本发明具有虾类低分子肽苦味去除效果好、产物得率高等优点，生产成本较低，适宜于低值虾产业化生产无苦味低分子肽，应用前景良好。

Description

一种无苦味的虾类低分子肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种无苦味的虾类低分子肽及其制备方法与应用。
背景技术
我国是水产养殖和加工的大国，近几年仅虾类的年产量都超过100万吨。其中，虾类加工产生大量的下脚料，以及捕捞获得大量难以加工的小虾，约占虾类总量的40％以上，通常只能被用于生产动物饲料或生产虾酱食品等。虾类加工下脚料和低值小虾富含蛋白质，近期成为人们开发氨基酸、活性肽、调味基料等产品的重要资源。低分子肽具有易被吸收和呈味等特性，其不同风味取决于肽链长短、氨基酸组成及排列等，是食品工业领域中开发和应用的热点。但是，肽链经酶解作用后，过多的疏水氨基酸暴露于肽端，易导致产物呈现苦味，严重的苦味会影响低分子肽在食品领域的应用。
低分子肽苦味去除的方法目前主要有吸附法、掩盖法、微胶囊化法、酶解法和微生物法等，其中酶解法和微生物法是具有巨大潜力的脱苦方法，是苦味去除研究的热点。酶解脱苦法主要直接利用氨肽酶对肽端的疏水氨基酸进行切除，微生物脱苦法则通过微生物分泌氨肽酶，进而切除肽端的疏水氨基酸而达到脱苦目的。氨肽酶高产菌种报道极少，国内氨肽酶制剂生产尚是空白，目前仅有诺维信公司生产的风味蛋白酶制剂可以应用于低分子肽的脱苦。但是，风味蛋白酶制剂是内切蛋白酶和外切蛋白酶的混合制剂，利用它进行酶解脱苦时，低分子肽酶解程度不易控制，易造成产物分子过小和特定产物得率过低。另外，氨肽酶提取与纯化的成本约占酶制剂生产成本的70％左右，如果直接利用氨肽酶制剂进行脱苦，还有生产成本过高的缺点。因此，选育氨肽酶高产菌种，直接利用微生物发酵法对低分子肽进行脱苦，将具有产物得率高、生产成本低等特点，是未来最具有应用潜力的脱苦方法。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种枯草芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供一种无苦味的虾类低分子肽的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到无苦味的虾类低分子肽。
本发明的再一目的在于提供上述无苦味的虾类低分子肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种枯草芽孢杆菌，菌种命名为Bacillus subtilis YBPE-4，是从豆豉中分离获得的。
所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YBPE-4的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年6月30日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2016359。
一种无苦味的虾类低分子肽的制备方法，包含如下步骤：
(1)虾类酶解：将经干燥处理的虾粉碎过筛，得到粉体；粉体与水混合，然后加入中性蛋白酶进行酶解，酶解后加热对酶进行灭活，得到酶解液；
(2)种子液的准备：取部分步骤(1)制得的酶解液，加入15～25g/L可溶性淀粉和1.5～2.5g/L磷酸二氢钾，调节pH6.5～7.5，灭菌冷却后接入氨肽酶产生菌菌种，然后33～37℃、160～200rpm下培养24～28h，得到种子液；
(3)低分子肽的发酵脱苦：取剩余步骤(1)制得的酶解液，加入30～40g/L可溶性淀粉和1.5～2.0g/L磷酸二氢钾，调节pH6.5～7.5，装入通气搅拌发酵罐中，灭菌冷却后，接入步骤(2)制得的种子液，于33～37℃下进行发酵，搅拌转速控制为200～250rpm，根据菌体需氧量控制通气比为0.2～1.6vvm(相对于发酵液的初始体积)，至132～144h结束发酵；
(4)脱苦后低分子肽的分离与干燥：将步骤(3)发酵后的发酵液进行菌体灭活，然后离心去除发酵液中菌体和大颗粒物质，收集上清液；利用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤除去上清液中大分子物质，得到透过液；再利用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行浓缩并去除小分子物质，得到浓缩液；然后，将超滤浓缩液进一步真空蒸发浓缩并干燥，得到无苦味的低分子肽。
为了更好地实现本发明，步骤(2)中所述的可溶性淀粉和磷酸二氢钾均为食品级原料；
步骤(1)中所述的虾优选为小虾，小虾属于低值虾，才注重综合利用；如果是大虾，主要直接用于食用或简单加工后食用。
步骤(1)中所述的过筛优选为过80～120目筛；
步骤(1)中所述的水与粉体的质量比(液固比)优选为(15～20):1；
步骤(1)中所述的中性蛋白酶的用量为每克蛋白质(粉体所含蛋白)加入4000～5000U的中性蛋白酶；
步骤(1)中所述的酶解的条件优选为45～55℃酶解4～6h；
步骤(1)中所述的灭活的条件优选为加热至80℃～90℃，恒温10～15min；
步骤(2)中所述的酶解液的用量为步骤(1)制得的酶解液总质量的5％～10％；
步骤(2)中所述的氨肽酶产生菌优选为枯草芽孢杆菌YBPE-4，保藏编号为CCTCCNO:M 2016359；
步骤(2)中所述的种子液中的菌体浓度优选为(1.0～2.5)×1010个/mL；
步骤(2)和步骤(3)中所述的灭菌的条件优选为121℃灭菌20min；
步骤(3)中所述的发酵液发酵至72h，亮氨酸氨肽酶活力达到3400～4000U/mL；
步骤(4)中所述的灭活的条件优选为121～125℃，保温15～25min，对菌体进行加热灭活；加热灭活后优选冷却至70～75℃后再离心；
步骤(4)中所述的离心的条件优选为5000～6000rpm离心15～25min；
步骤(4)中所述的收集上清液的方式优选为：发酵液离心分离后，优选用相当于20％～30％发酵液体积的去离子水洗涤离心沉淀物，然后离心分离洗涤液，收集合并两次离心所得的上清液；
步骤(4)所述的利用截留分子量为5000Da的超滤膜对上清液进行过滤，当浓缩液体积达到上清液体积的10％～12％时，向浓缩液加入2～3倍体积的去离子水，再进行第二次超滤，使最终的浓缩液体积为发酵液体积的10％～12％，收集与合并两次超滤的透过液；
步骤(4)中所述的浓缩液的体积优选为透过液的10％～12％；
步骤(4)中所述的浓缩的方式优选为：利用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行浓缩，当浓缩液体积达到透过液体积的10％～12％时，向浓缩液加入2～3倍体积的去离子水，再进行第二次超滤，使最终的浓缩液体积为透过液体积的10％～12％，收集最终的浓缩液；
步骤(4)中所述的超滤浓缩液真空蒸发浓缩后，去除55％～65％水分；
步骤(4)中所述的干燥优选喷雾干燥；
一种无苦味的虾类低分子肽，通过上述制备方法制备得到；
所述的无苦味的虾类低分子肽的分子量为360～5000Da，相对于原料中蛋白质的得率为51％～54％；
所述的无苦味的虾类低分子肽在食品生产或食品添加剂生产中的应用。
本发明原理：中性蛋白酶是内切型蛋白酶，用于虾蛋白的水解，可从任意位置切断肽链，将蛋白质转化为不同分子量的低分子肽；枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016359是高产氨肽酶的菌种，在含有上述低分子肽的培养基中进行生长和代谢，可大量分泌氨肽酶，从肽链N端切除疏水氨基酸，使低分子肽的苦味减弱或消除；微生物发酵脱苦后，经离心分离、超滤膜分离与浓缩，再经干燥，最后可获得无苦味的低分子肽。本发明的核心是氨肽酶高产菌种的发酵技术，通过微生物发酵脱苦作用，消除低分子肽的苦味，解决低分子肽苦味限制其应用的问题。
本发明相对于现有技术，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明利用氨肽酶高产菌种对低分子肽进行发酵脱苦，与风味蛋白酶脱苦法相比，不但具有苦味去除效果好、产物得率高等优点，而且可节约酶制剂分离纯化成本，有利于降低综合生产成本。
(2)本发明在脱苦前，无需对酶解分离液进行分离、干燥等处理，直接利用虾干粉酶解液配制成氨肽酶高产菌种的培养基，可节省中间产物干燥而产生的能耗费用，也有利于降低生产成本。
(3)本发明选择低值虾为原料，综合利用酶解技术、微生物发酵技术和超滤膜分离技术等制取无苦味的低分子肽，既为低值虾的综合利用提供一个有效途径，也为其它低值水产品的综合利用提供有价值的参考，有利于促进水产养殖业及加工业的发展。
(4)本发明将虾类经干燥、粉碎、中性蛋白酶酶解，分离得到酶解液。利用酶解液、可溶性淀粉和磷酸二氢钾配制成发酵培养基，接入成熟的枯草芽孢杆菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)培养液，进行搅拌通气发酵132～144h；发酵液经离心去除菌体，获得上清液，经超滤膜过滤，获得分子量为360～5000Da的滤液；滤液经干燥，最后获得无苦味的虾类低分子肽产品。本发明具有虾类低分子肽苦味去除效果好、产物得率高等优点，生产成本较低，适宜于低值虾产业化生产无苦味低分子肽，应用前景良好。
附图说明
图1是本发明虾类多肽的微生物脱苦流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
中性蛋白酶购自北京奥博星生物科技有限公司，酶活力6.0×104U/g；
实施例中涉及到的灭菌的条件为121℃灭菌20min；
亮氨酸氨肽酶活力定义：在40℃、pH8.0的条件下，每分钟催化L-亮氨酸-4-硝基苯胺生成1μg对硝基苯胺所需的酶量为1个酶活力单位；
实施例1
(1)氨肽酶高产菌种的分离与筛选
富集培养基：葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl5g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，冷却后备用。
平板分离培养基：葡萄糖5g/L，酪蛋白15g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，冷却后备用。
斜面培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，冷却后备用。
发酵培养基：可溶性淀粉40g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH7.0，121℃灭菌20min，冷却后备用。
豆豉为市售材料，将10g豆豉接入200mL的富集培养基中，置于30℃、200rpm的条件下振荡培养16h。将培养液进行梯度稀释，涂布于平板分离培养基，置于30℃下培养36～48h，挑取菌落周围有明显透明圈的菌株56株，接入斜面培养基，培养出菌苔后，置于4℃冰箱保藏。
将各菌株的斜面菌种分别接入装有200mL发酵培养基的三角瓶，每瓶接入2环菌苔，置于37℃、200rpm的条件下振荡培养72h。培养液在6000rpm条件下离心20min，取上清液，测定氨肽酶活力。氨肽酶活力测定方法参照文献(吴庆勋,谷海先,赵光鳌.N+注入诱变选育氨肽酶高产菌株及发酵条件初步优化[J].食品与发酵工业,2006,32(1):15-18)。经测定，菌株YBPE-4(即枯草芽孢杆菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359)的产酶最高，其发酵液的氨肽酶活力达3882U/mL，故优选为本发明的发酵菌种。
(2)菌种的鉴定
利用16S rDNA进行分子生物学鉴定，首先提取菌株YBPE-4(即枯草芽孢杆菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359)的16S rDNA，经PCR扩增、纯化，送至测序公司进行序列检测，然后在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中检索同源性。
经序列检测，该菌种的1492R/27F PCR产物的DNA片段总长为1439bp，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YBPE-4菌株的16S rDNA序列，具体如下：
TCCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTGTAGGAGCCAGCCGCCGAAGTGACATG。
经同源性检索，发现该菌种与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性达99％，故该菌种被鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YBPE-4。
(3)菌种的保藏
将该菌种送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，上述鉴定结果获得中国典型培养物保藏中心的确认，并获得保藏编号，即为枯草芽孢杆菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359。
所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YBPE-4的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年6月30日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2016359。
实施例2
(1)虾类酶解
将经干燥处理的小虾粉碎过100目筛，得到粉体；称取1200g粉体(蛋白质含量为56.2％)，加入18L水，混匀；然后加入56.2g中性蛋白酶，55℃酶解4h，然后加热至85℃恒温12min，对酶进行灭活，冷却至室温，得到酶解液；
(2)种子液的准备
取900mL酶解液，加入18g可溶性淀粉和1.8g磷酸二氢钾，调节pH7.0，平均分装入5个1000mL三角瓶，灭菌冷却后，接入枯草芽孢杆菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌种，每瓶接入2环菌苔，于37℃、160rpm下培养24h，得到菌体浓度为1.08×1010个/mL的种子液；
(3)低分子肽的发酵脱苦
取剩余的酶解液17.1L，加入684g可溶性淀粉和29.93g磷酸二氢钾，混匀，调节pH7.0，装入30L的通气搅拌发酵罐中，灭菌冷却后，接入900mL步骤(2)制得的种子液，启动搅拌和通入无菌空气进行发酵：在发酵过程中，发酵温度控制为37℃，搅拌转速控制为220rpm；发酵0～60h，随着菌体量增大，通气量由3.6L/min逐步增大至28.8L/min；发酵61～72h，通气量控制为28.8L/min；发酵73～108h，通气量控制为21.6L/min；发酵109～120h，通气量控制为18L/min；发酵121～144h，通气量控制为14.4L/min；发酵至144h，结束发酵；其中，发酵至72h，发酵液的亮氨酸氨肽酶活力达到3426U/mL；
(4)脱苦后低分子肽的分离与干燥
用蒸汽加热步骤(3)发酵后的发酵液至123℃，保温20min，冷却至70℃，5500rpm离心20min，用5.4L去离子水洗涤离心沉淀物，再进行第二次离心，收集与合并两次离心所得的上清液，得到18.6L上清液；利用截留分子量为5000Da的超滤膜对上清液进行超滤，当发酵液浓缩至2.23L时，加入6.69L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至2.23L，收集与合并两次超滤的透过液，得透过液23L；然后用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行超滤，当浓液体积达到2.76L时，加入8.28L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至2.76L，收集浓缩液，即为分子量为360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、温度60℃的条件下进行真空蒸发，将浓缩液进一步浓缩至1.24L，再进行喷雾干燥，控制进风温度为180℃，出风温度为75℃，最后得到365g粉体产品，即为无苦味的低分子肽。经检测与计算，粉体产品中低分子肽含量为94.8％，低分子肽相对于蛋白质的得率为51.3％。以硫酸奎宁溶液为标准对照物进行苦味的感官评定，所得产品没有苦味。
实施例3
(1)虾类酶解
将经干燥处理的小虾粉碎过80目筛，得到粉体；称取900g粉体(蛋白质含量为56.2％)，加入18L水，混匀；然后加入33.72g中性蛋白酶，50℃酶解5h，然后加热至80℃，恒温15min，对酶进行灭活，冷却至室温，得到酶解液；
(2)种子液的准备
取1800mL酶解液，加入27g可溶性淀粉和2.7g磷酸二氢钾，调节pH6.5，平均分装入10个1000mL三角瓶，灭菌冷却后，接入枯草芽孢杆菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌种，每瓶接入2环菌苔，于33℃、200rpm下培养28h，得到菌体浓度为2.49×1010个/mL的种子液；
(3)低分子肽的发酵脱苦：
取剩余的酶解液16.2L，加入567g可溶性淀粉和32.4g磷酸二氢钾，混匀，调节pH6.5，装入30L的通气搅拌发酵罐中，灭菌冷却后，接入1800mL步骤(2)制得的种子液，启动搅拌和通入无菌空气进行发酵：在发酵过程中，发酵温度控制为33℃，搅拌转速控制为250rpm；发酵0～54h，随着菌体量增大，通气量由3.6L/min逐步增大至28.8L/min；发酵55～64h，通气量控制为28.8L/min；发酵65～72h，通气量控制为25.2L/min；发酵73～84h，通气量控制为21.6L/min；发酵85～102h，通气量控制为18L/min；发酵103～132h，通气量控制为14.4L/min；发酵至132h，结束发酵；其中，发酵至72h，发酵液的亮氨酸氨肽酶活力达到3992U/mL；
(4)脱苦后低分子肽的分离与干燥
用蒸汽加热步骤(3)发酵后的发酵液至121℃，保温25min，冷却至72℃，5000rpm离心25min，用3.6L去离子水洗涤离心沉淀物，再进行第二次离心，收集与合并两次离心所得的上清液，得到18.4L上清液；利用截留分子量为5000Da的超滤膜对上清液进行超滤，当上清液浓缩至1.84L时，加入3.68L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至1.84L，收集与合并两次超滤的透过液，得透过液20.2L；然后用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行超滤，当浓液体积达到2.02L时，加入4.04L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至2.02L，收集浓缩液，即为分子量为360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、温度60℃的条件下进行真空蒸发，将浓缩液进一步浓缩至0.707L，再进行喷雾干燥，控制进风温度为180℃，出风温度为75℃，最后得到285g粉体产品，即为无苦味的低分子肽。经检测与计算，粉体产品中低分子肽含量为95.3％，低分子肽相对于蛋白质的得率为53.7％。以硫酸奎宁溶液为标准对照物进行苦味的感官评定，所得产品没有苦味。
实施例4
(1)虾类酶解
将经干燥处理的小虾粉碎过120目筛，得到粉体；称取1100g粉体(蛋白质含量为56.2％)，加入19.25L水，混匀，加入46.37g中性蛋白酶，于45℃酶解6h，然后加热至90℃，恒温10min，对酶进行灭活，冷却至室温，得到酶解液；
(2)种子液的准备
取1540mL酶解液，加入38.5g可溶性淀粉和3.85g磷酸二氢钾，调节pH7.5，平均分装入8个1000mL三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后，接入枯草芽孢杆菌YBPE-4(CCTCC NO:M2016359)的斜面菌种，每瓶接入2环菌苔，于35℃、180rpm下培养26h，得到菌体浓度为1.77×1010个/mL的种子液；
(3)低分子肽的发酵脱苦：
取剩余的酶解液17.71L，加入531g可溶性淀粉和26.57g磷酸二氢钾，混匀，调节pH7.5，装入30L的通气搅拌发酵罐中，灭菌冷却后，接入1540mL步骤(2)制得的种子液，启动搅拌和通入无菌空气进行发酵。在发酵过程中，发酵温度控制为35℃，搅拌转速控制为200rpm；发酵0～60h，随着菌体量增大，通气量由3.85L/min逐步增大至30.8L/min；发酵61～72h，通气量控制为30.8L/min；发酵73～84h，通气量控制为23L/min；发酵85～108h，通气量控制为19.25L/min；发酵109～140h，通气量控制为15.4L/min；发酵至140h，结束发酵；其中，发酵至72h，发酵液的亮氨酸氨肽酶活力达到3764U/mL；
(4)脱苦后低分子肽的分离与干燥
用蒸汽加热步骤(3)发酵后的发酵液至125℃，保温15min，冷却至75℃，6000rpm离心15min，用4.8L去离子水洗涤离心沉淀物，再进行第二次离心，收集与合并两次离心所得的上清液，得到20.2L上清液；利用截留分子量为5000Da的超滤膜对上清液进行超滤，当上清液浓缩至2.22L时，加入5.55L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至2.22L，收集与合并两次超滤的透过液，得透过液23.5L；然后用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行超滤，当浓液体积达到2.59L时，加入6.48L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至2.59L，收集浓缩液，即为分子量为360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、温度60℃的条件下进行真空蒸发，将浓缩液进一步浓缩至1.04L，再进行喷雾干燥，控制进风温度为180℃，出风温度为75℃，最后得到348g粉体产品，即为无苦味的低分子肽。经检测与计算，粉体产品中低分子肽含量为94.9％，低分子肽相对于蛋白质的得率为53.4％。以硫酸奎宁溶液为标准对照物进行苦味的感官评定，所得产品没有苦味。
对比实施例1
(1)虾类酶解
将经干燥处理的小虾粉碎过100目筛，得到粉体；称取900g粉体(蛋白质含量为56.2％)，加入18L水，混匀，加入33.72g中性蛋白酶，于50℃酶解5h，然后加热至80℃，恒温10min，对酶进行灭活，冷却至室温，得到酶解液；
(2)风味蛋白酶的酶解脱苦
在步骤(1)制得的酶解液中，加入40.5g风味蛋白酶(诺维信公司，酶活力1.5×104U/g)，于50℃酶解2h，然后加热至80℃，恒温15min，对酶进行灭活，冷却至室温备用；
(3)脱苦后低分子肽的分离与干燥
将脱苦后的酶解液于5000rpm离心20min，用5.4L去离子水洗涤离心沉淀物，再进行第二次离心，收集与合并两次离心所得的上清液，得到21.5L上清液；利用截留分子量为5000Da的超滤膜对上清液进行超滤，当浓缩液体积为2.15L时，加入6.45L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至2.15L，收集与合并两次超滤的透过液，得透过液25.8L；然后，用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行超滤，当浓液体积达到2.58L时，加入5.16L去离子水，混匀，进行第二次超滤，再次将浓液浓缩至2.58L，收集浓缩液，即为分子量为360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、温度60℃的条件下进行真空蒸发，将浓缩液进一步浓缩至0.92L，再进行喷雾干燥，控制进风温度为180℃，出风温度为75℃，最后得到218g粉体产品。经检测与计算，粉体产品中低分子肽含量为94.3％，低分子肽相对于蛋白质的得率为40.6％。以硫酸奎宁溶液为标准对照物进行苦味的感官评定(参考文献：潘进权.毛霉AS3.2778脯氨酸氨肽酶的部分纯化及性质研究【J】.食品与发酵工业,2011,37(4):26-31)，所得产品呈现微苦。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YBPE-4，于2016年6月30日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2016359。
2.一种无苦味的虾类低分子肽的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)虾类酶解：将经干燥处理的虾粉碎过筛，得到粉体；粉体与水混合，然后加入中性蛋白酶进行酶解，酶解后加热对酶进行灭活，得到酶解液；
(2)种子液的准备：取部分步骤(1)制得的酶解液，加入15～25g/L可溶性淀粉和1.5～2.5g/L磷酸二氢钾，调节pH6.5～7.5，灭菌冷却后接入氨肽酶产生菌菌种，然后33～37℃、160～200rpm下培养24～28h，得到种子液；
(3)低分子肽的发酵脱苦：取剩余步骤(1)制得的酶解液，加入30～40g/L可溶性淀粉和1.5～2.0g/L磷酸二氢钾，调节pH6.5～7.5，装入通气搅拌发酵罐中，灭菌冷却后，接入步骤(2)制得的种子液，于33～37℃下进行发酵，搅拌转速控制为200～250rpm，根据菌体需氧量控制通气比为0.2～1.6vvm，至132～144h结束发酵；
(4)脱苦后低分子肽的分离与干燥：将步骤(3)发酵后的发酵液进行菌体灭活，然后离心去除发酵液中菌体和大颗粒物质，收集上清液；利用截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤除去上清液中大分子物质，得到透过液；再利用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行浓缩并去除小分子物质，得到浓缩液；然后，将超滤浓缩液进一步真空蒸发浓缩并干燥，得到无苦味的低分子肽；
步骤(2)中所述的氨肽酶产生菌为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的无苦味的虾类低分子肽的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的过筛为过80～120目筛；
步骤(1)中所述的水与粉体的质量比为(15～20):1；
步骤(1)中所述的中性蛋白酶的用量为每克蛋白质加入4000～5000U的中性蛋白酶；
步骤(1)中所述的酶解的条件为45～55℃酶解4～6h；
步骤(1)中所述的灭活的条件为加热至80℃～90℃，恒温10～15min。
4.根据权利要求2所述的无苦味的虾类低分子肽的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的酶解液的用量为步骤(1)制得的酶解液总质量的5％～10％；
步骤(2)中所述的种子液中的菌体浓度为(1.0～2.5)×1010个/mL。
5.根据权利要求2所述的无苦味的虾类低分子肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的发酵液发酵至72h，亮氨酸氨肽酶活力达到3400～4000U/mL。
6.根据权利要求2所述的无苦味的虾类低分子肽的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的灭活的条件为121～125℃，保温15～25min，对菌体进行加热灭活；加热灭活后冷却至70～75℃后再离心；
步骤(4)中所述的离心的条件为5000～6000rpm离心15～25min。
7.根据权利要求2所述的无苦味的虾类低分子肽的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的收集上清液的方式为：发酵液离心分离后，用相当于20％～30％发酵液体积的去离子水洗涤离心沉淀物，然后离心分离洗涤液，收集合并两次离心所得的上清液；
步骤(4)所述的利用截留分子量为5000Da的超滤膜对上清液进行过滤，当浓缩液体积达到上清液体积的10％～12％时，向浓缩液加入2～3倍体积的去离子水，再进行第二次超滤，使最终的浓缩液体积为发酵液体积的10％～12％，收集与合并两次超滤的透过液。
8.根据权利要求2所述的无苦味的虾类低分子肽的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的浓缩液的体积为透过液的10％～12％；
步骤(4)中所述的浓缩的方式为：利用截留分子量为360Da的超滤膜对透过液进行浓缩，当浓缩液体积达到透过液体积的10％～12％时，向浓缩液加入2～3倍体积的去离子水，再进行第二次超滤，使最终的浓缩液体积为透过液体积的10％～12％，收集最终的浓缩液；
步骤(4)中所述的超滤浓缩液真空蒸发浓缩后，去除55％～65％水分。
9.一种无苦味的虾类低分子肽，其特征在于通过权利要求2～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的无苦味的虾类低分子肽在食品生产或食品添加剂生产中的应用。
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