CN111494398A - 荔枝果肉多酚qrr及其组合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荔枝果肉多酚QRR及其组合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。该荔枝果肉多酚QRR及其组合物可以改善肠道微生物菌群紊乱,包括增加肠道微生物多样性、丰富度和优化菌群组成结构,增强肠道屏障功能,对肠道起到保护作用。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物应用领域,具体涉及一种荔枝果肉多酚QRR及其组合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。
背景技术
随着现代都市的生活节奏日趋快速化,城市居民工作强度大,人体长期处于应激状态,且经常摄入辛辣、刺激性强的食物,极易破坏肠道内微生物生态环境的动态平衡,其具体表现为肠道菌群在种类、数量、比例、分布和生物学特性上的变化。肠道菌群紊乱,往往会导致人体出现急性肠胃炎和一些慢性肠道疾病。肠道微生物菌群参与宿主体内多个代谢途径的调节、物质的消化和吸收、信号的传递以及免疫功能的调节等。比如,肠道中的短链脂肪酸来自于肠道菌群对蛋白质和脂肪的分解,其不仅能抑制部分微生物的生长,还能有效调节肠道内的酸碱度。然而,目前已有的用于治疗肠道菌群紊乱和调节肠道中短链脂肪酸合成低下的抗生素和药物,在一定程度上,对人体的肠道有很强的毒副作用。因此,开发具有改善肠道菌群紊乱,且无毒副作用的组合物具有深远的现实意义和指导意义。
荔枝是热带和亚热带地区的特色水果,也是广东省最为主要的经济作物水果,口感鲜美深受人们喜爱。中医认为,荔枝果肉具有健脾、益肝、养颜功效。荔枝果肉的次生代谢产物中,多酚含量仅此于纤维素、半纤维素和木质素,是重要的非营养素活性物质来源。基于高效液相色谱和质谱连用技术的现代生物研究表明,荔枝果肉多酚中QRR(槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷)的含量最高,其次是表儿茶素和芦丁。据相关文献报道,荔枝果肉多酚具有优良的抗氧化性和抗炎作用,且能够调节肝脏中的脂质代谢、防止紫外线等。目前,苏东晓等人已经报道荔枝果肉多酚的提取方法,但是所使用的提取溶剂为丙酮等有机溶剂,提取时间过长,所使用的HPD-826价格昂贵,并不适合功能性食品和药品领域产品的生产。此外,张军丽等人采用高通量测序的方法,说明复合菌-荔枝多酚可以增加微生物数量,但所使用的荔枝多酚来自于荔枝果皮,并且未解释肠道内具体测试菌属的数量、分布变化,对肠道内屏障功能的改善效果等内容。本发明提供荔枝果肉多酚QRR及其组合物的提取方法具有提取率高,操作简单,成本低廉等优点。另外,关于荔枝果肉多酚QRR及其组合物在改善肠道菌群紊乱、肠道屏障功能等方面的研究和报道并未发现。
发明内容
本发明的目的在于:针对现有技术中的缺陷,本发明提供荔枝果肉多酚QRR及其组合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供:
一种用于改善肠道微生态的组合物,其包括荔枝果肉多酚QRR和其它改善肠道微生态生物活性的多酚类物质。
具体地,上述荔枝果肉多酚QRR为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷。
具体地,上述其它具有改善肠道微生态生物活性的荔枝果肉中的多酚类物质选自没食子酸、表儿茶素、儿茶素、绿原酸、咖啡酸和芦丁中的一种或多种。
具体地,上述荔枝果肉多酚QRR占比为60wt%-80wt%,上述其它多酚类物质占比为20wt%-40wt%。具体使用量可按荔枝果肉多酚QRR组合物的有效量计为100-500mg/kg。
具体地,上述组合物的剂型包括溶液剂、散剂、胶囊剂以及泡腾剂。当然,根据实际需要,也包括其他可替代性剂型。
本发明的第二个方面,提供:
上述组合物在制备改善肠道微生物菌群紊乱、肠道屏障功能受损组合物中的应用。
具体地,上述肠道微生物菌群紊乱包括肠道微生物菌群多样性减低和/或肠道微生物菌群的相对丰度下降。
具体地,上述肠道屏障功能受损包括肠道粘膜屏障破坏、粘蛋白或肠道连接蛋白含量下降。
进一步地,上述肠道微生物多样性菌群包括螺杆菌属(Helicobacter)、嗜臭杆菌属(Odoribacter)、Turicibacter、拟杆菌属(Bacteroides)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和颤螺菌属(Oscillospira)中的一种或多种。
Turicibacter为图利茨菌科下的菌属。
进一步地,上述肠道微生物丰度菌群包括肠杆菌属(Enterobacter)、链球菌属(Streptococcus)、Parabacteroides中的一种或多种。
Parabacteroides为紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)的一个菌属。
本发明的有益效果是:
本发明能够有效改善肠道菌群多样性和丰富度,使肠道中微生物组成、分布恢复至正常水平,使有益菌群和有害菌群比例处于平衡,同时可以改善肠道屏障功能。其可进一步用于肠炎和其他肠道疾病引起的菌群紊乱、屏障功能受损症状的疾病的治疗。
附图说明
图1表示不同处理对结肠炎小鼠肠道组织学变化的影响,其中(a)~(e)为不同处理组的显微成像图;(a)NC:对照组;(b)DSS:模型对照组;(c)5~ASA+DSS:阳性对照组;(d)LP+DSS:低剂量实验组;(e)HP+DSS:高剂量实验组;(f)为不同处理对各组小鼠结肠炎的组织学评分;
图2为在共聚焦显微镜下小鼠结肠组织免疫荧光切片图;
图3表示不同处理对结肠炎小鼠肠道粘蛋白、连接蛋白含量的变化;(a)为Caludin-1的面密度;(b)为Occludin的面密度;(c)为ZO-1的面密度;
图4表示不同处理对结肠炎小鼠肠道内Specaccum物种累积曲线的影响;
图5表示在门分类水平下不同处理对小鼠肠道内微生物菌群组成的影响;
图6表示在科分类水平下不同处理对小鼠肠道内微生物菌群组成的影响;
图7表示在属分类水平下不同处理对小鼠肠道内微生物菌群组成的影响;
图8表示以门分类水平下各组中微生物菌群相对丰度比较(a)Bacteroidetes;(b)Firmicutes;(c)Proteobacteria;
图9表示以科分类水平下各组中微生物菌群相对丰度比较(a)Desulfovibrionaceae;(b)Enterobacteriaceae;(c)Helicobacteraceae;(d)Lachnospiraceae;(e)Odoribacteraceae;(f)Peptostreptococcaceae;(g)Porphyromonadaceae;(h)Rikenellaceae;
图10表示属分类水平下各组中微生物菌群相对丰度比较(a)Adlercreutzia;(b)Bacteroides;(c)Helicobacter;(d)Odoribacter;(e)Parabacteroides;(f)Turicibacter。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰,以下结合具体实施方式,对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明,并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂,若无特别说明,均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一、荔枝果肉多酚QRR及其组合物的提取
(1)将新鲜荔枝去壳、去核;
(2)将步骤1所得的新鲜荔枝果肉与70%食用酒精按质量比为1:3的比例混合,打浆;
(3)将步骤2所得浆液加热至50℃,提取25min;
(4)将步骤3所得的荔枝浆液置于中型的板框过滤机中进行过滤,分离出荔枝果渣,收集滤液,重复提取3次,合并滤液。所得滤液置于旋转蒸发仪中进行浓缩;
(5)将所得浓缩液通过HPD-100大孔树脂吸附,用蒸馏水冲洗除去糖分及其水溶性物质;
(6)用70%食用酒精按1:3的比例冲洗HPD-100树脂,收集滤液,于45℃下旋转蒸发,进行浓缩;
(7)将步骤6所得的浓缩液通过聚酰胺树脂吸附,用蒸馏水冲洗树脂;
(8)用40%食用酒精按1:3的比例冲洗聚酰胺树脂,收集滤液,于45℃下旋转蒸发,进行浓缩;
(9)置于55℃的热风干燥箱中进行干燥,所得固形物即为荔枝果肉多酚QRR及其组合物。
二、荔枝果肉多酚QRR及其组合物对调节小鼠肠道的影响
为评价荔枝果肉多酚QRR及其组合物对改善结肠炎小鼠肠道菌群组成的效果,具体步骤如下:
(1)取40只4周龄的小鼠,分为NC、DSS、DSS+5-ASA、DSS+LP和DSS+HP组,喂食正常标准饲料和无菌水,适应新环境一周后用于实验。
(2)开始实验后,对照组(NC组)的小鼠按照正常标准喂食饲料和无菌水连续喂食两周;模型组(DSS组)的小鼠第一周喂食正常标准喂食饲料和无菌水,第二周开始用2.7%的葡聚糖硫酸钠(DSS)给小鼠进行灌胃处理,直至第二周结束;阳性组(DSS+5-ASA组)、低剂量实验组(DSS+LP组)和高剂量实验组(DSS+HP组)的小鼠第一周分别用100mg/kg的5-氨基水杨酸(5-ASA)、100mg/kg的荔枝果肉多酚QRR及其组合物(以下所述荔枝果肉多酚QRR及其组合物均为步骤一制备所得)和500mg/kg的荔枝果肉多酚QRR及其组合物灌胃处理,第二周开始在此基础上用2.7%DSS进行灌胃处理,直至第二周结束。
(3)处理完成后,取小鼠肠道组织,染色后进行结肠组织观察、并对小鼠的疾病情况进行组织学打分,和结肠组织蛋白免疫荧光染色观察。
实验结果见图1、图2和图3,结肠组织H&E染色切片和组织病理学评分见图1。NC组中小鼠的粘膜层肠上皮结构完整,且上皮细胞形态结构正常、排列紧密,可见较多杯状细胞,未见炎症现象。经DSS诱导后,DSS、5-ASA+DSS、LP+DSS和HP+DSS组中小鼠的结肠组织均受损,且其病理学评分显著增加。其中,DSS组和LP+DSS组粘膜层可见大面积溃疡,肠上皮结构被破坏,肠腺消失并被增生的***取代,并伴有大量中性粒细胞浸润;粘膜下其中层局部可见水肿。5-ASA+DSS组和HP+DSS组中并未观察到水肿现象,其中HP+DSS组中的粘膜层肠上皮结构完整,上皮细胞形态结构正常,仅有少量中性粒细胞的浸润。说明高剂量的荔枝果肉多酚QRR及其组合物能够有效保护肠道上皮组织。
Caludin-1、Occludin和ZO-1蛋白的表达如图2和图3所示。DSS组中Caludin-1、Occludin和ZO-1蛋白含量明显降低,显著低于NC组,结果表明DSS诱导将会降低小鼠结肠组织中紧密连接复合物关键蛋白的表达,小鼠的肠粘膜屏障被破坏。LP+DSS组中只有ZO-1平均密度蛋白含量显著高于DSS组,但仍显著低于5-ASA+DSS和HP+DSS组。HP+DSS组和5-ASA+DSS中Caludin-1、Occludin和ZO-1蛋白的表达与DSS组相比明显提高,且HP+DSS组中Caludin-1和ZO-1的平均密度蛋白均显著高于5-ASA+DSS组(p<0.05)。因此,荔枝果肉多酚QRR及其组合物和5-ASA能够通过提高关键蛋白的表达,降低肠道通透性,保护小鼠肠粘膜屏障免受损伤,其中高剂量的作用效果显著优于低剂量的效果。
综上所述,DSS小鼠经过高剂量荔枝果肉多酚QRR及其组合物处理后得到了较好的恢复,改善效果优于药物5-ASA的效果。
三、荔枝果肉多酚QRR及其组合物对改善结肠炎小鼠肠道菌群多样性和丰度影响
为评价荔枝果肉多酚QRR及其组合物对改善结肠炎小鼠肠道菌群组成的效果,具体步骤如下:
(1)取40只4周龄的小鼠,分为NC、DSS、DSS+5-ASA、DSS+LP和DSS+HP组,喂食正常标准饲料和无菌水,适应新环境一周后用于实验。
(2)开始实验后,对照组(NC组)的小鼠按照正常标准喂食饲料和无菌水连续喂食两周;模型组(DSS组)的小鼠第一周喂食正常标准喂食饲料和无菌水,第二周开始用2.7%的葡聚糖硫酸钠(DSS)给小鼠进行灌胃处理,直至第二周结束;阳性组(DSS+5-ASA组)、低剂量实验组(DSS+LP组)和高剂量实验组(DSS+HP组)的小鼠第一周分别用100mg/kg的5-氨基水杨酸(5-ASA)、100mg/kg的荔枝果肉多酚QRR及其组合物和500mg/kg的荔枝果肉多酚QRR及其组合物进行灌胃处理,第二周开始在此基础上用2.7%DSS进行灌胃处理,直至第二周结束。
(3)处理完成后,取小鼠的粪便,利用高通量测序对肠道微生物菌群进行分析。通过Chao 1、ACE、Simpson和Shannon算法和Specaccum物种累积曲线分析产肠道微生物丰度和多样性。
实验结果见表1和图4。Chao1和ACE表示的是微生物丰富度指数,Simpson和Shannon表示的是微生物多样性指数。结果显示,与对照组相比DSS组的Chao1,ACE,Simpson和Shannon均呈现显著下降,说明DSS组小鼠中肠道微生物菌群的丰富度和多样性降低,而5-ASA+DSS组、LP+DSS组和HP+DSS组均能有效提高肠道菌群的丰富度和多样性。其中HP+DSS组与DSS组相比,肠道微生物菌群丰富度和多样性显著提高。5-ASA+DSS组相比,HP+DSS组在提高肠道微生物菌群丰富度方面效果没有显著差异,在提高肠道菌群多样性方面效果最佳。
由Specaccum物种累积曲线(图4)可知,随着样本数量的增加,物种数量逐渐增加,最后趋于平缓,表明当前样本量已足以反映群落的丰富度,继续添加样本,也无法检测到新的物种。
表1.菌群多样性指数表
注:同一列上的不同字母表示具有显著性差异(p<0.05)。
四、荔枝果肉多酚QRR及其组合物对改善结肠炎小鼠肠道菌群分布的影响
为评价荔枝果肉多酚QRR及其组合物对改善结肠炎小鼠肠道菌群组成、分布的效果,具体步骤如下:
(1)采集实施例3中动物实验结束时小鼠粪便,经过液氮快速冷冻后,保存在-80℃冰箱中,依据过往项目经验,选用最合适的总DNA提取方法,同时采用Nanodrop对DNA进行定量,并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。据序列中的保守区域设计相应引物,并添加样本特异性Barcode序列,进而对rRNA基因可变区(单个或连续的多个)或特定基因片段进行PCR扩增。通过2%琼脂糖凝胶电泳,对文库做最终的片段选择与纯化。参照初步定量的结果,将PCR扩增回收产物进行荧光定量,荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNAAssayKit,定量仪器为Microplate reader(BioTek,FLx800)。根据荧光定量结果,按照每个样本的测序量需求,对各样本按相应比例进行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LTLibrary Prep Kit制备测序文库。使用NovaSeq测序仪进行双端测序,相应试剂为NovaSeq6000SP Reagent Kit(500cycles)。
(2)处理完成后,取小鼠的粪便,利用高通量测序对肠道微生物菌群分布进行分析。
(3)检测分析在门、科、属分类水平上菌群的丰度变化情况。
(4)检测有益菌群乳酸杆菌、双歧杆菌、及有害菌包括脱硫弧菌、梭菌的丰度变化情况。
实验结果见图5~图10,结果表明,在门分类水平下,厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌门,约占89%。Firmicutes和Bacteroidetes丰度的比值(F/B)是反应肠道菌群结构的重要指标。NC组中Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度分别为54.75%和28.58%,F/B为1.92;DSS组中Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度相比NC组显著降低(p<0.05),但F/B值基本不变;HP+DSS组中Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度与NC组相比无明显差异(p>0.05),F/B为1.13,说明灌胃处理给予结肠炎小鼠高剂量的荔枝多酚QRR及其组合物,能够通过降低Firmicutes的丰度和提高Bacteroidetes丰度,从而降低结肠炎小鼠肠道内Firmicutes和Bacteroidetes的比值,改善肠道内菌群分布结构。
在科分类水平下,DSS组与NC组相比,肠杆菌科(Enterbacteriaceae)的相对丰度显著增加,理研菌科(Rikenellaceae)的相对丰度显著降低(p<0.05)。HP+DSS组与DSS组相比,螺杆菌科(Helicobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)和臭杆菌科(Odoribacteraceae)的相对丰度显著增加(p<0.05),此外,HP+DSS组中肠杆菌科(Enterbacteriaceae)的相对丰度与DSS组相比下降了60%。
在属分类水平下,HP+DSS组中螺杆菌属(Helicobacter)、嗜臭杆菌属(Odoribacter)和Turicibacter对丰度显著高于DSS组与DC组(p<0.05)。HP+DSS组中拟杆菌属(Bacteroides)的相对丰度与DSS组相比增高70.90%。高剂量的荔枝果肉多酚QRR及其组合物能通过降低厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度的比值(F/B),变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度,增加理研菌科(Rikenellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)和拟杆菌属(Bacteroides)等的相对丰度,抑制肠杆菌属、Parabacteroides等菌群的数量,从而改善结肠炎小鼠肠道微生物的菌群结构。
结果显示,荔枝果肉多酚QRR及其组合物能通过改变肠道微生物的菌群构成包括肠道有益菌与肠道有害菌对健康产生积极作用。荔枝果肉多酚QRR及其组合物对几种常见肠道有益菌及有害菌的影响见表2。乳酸杆菌是肠道益生菌,能通过释放抗菌物质乳酸、过氧化氢、细菌素,竞争劲蛋白附位点等方式来调控肠道免疫功能来改善宿主健康。双歧杆菌主要位于在宿主肠道粘液层并能降解劲蛋白。脱硫弧菌是肠道有害菌,产生的硫化氢会使肠上皮粘膜受到损害。高剂量的荔枝果肉多酚QRR及其组合物可以有效地增加结肠炎小鼠的有益菌数量,同时选择性抑制有害菌的数量的原因在于荔枝果肉多酚能够被肠道中部分有益菌群利用,而产生短链脂肪酸,改变了肠道内的酸碱环境,抑制了有害菌的生长。短链脂肪酸一方面可以被有益菌群利用,一方面也可以抑制有害菌的生长,起到了平衡两者比例的作用。
表2.荔枝果肉多酚QRR及其组合物对几种常见肠道有益菌群和有害菌群的影响
五、荔枝果肉多酚QRR及其组合物组合物的制备方法
1.荔枝果肉多酚QRR及其组合物水剂的制备方法具体操作如下:
(1)取质量为25g的荔枝果肉多酚QRR及其组合物置于2L纯净水中,再添加40g环糊精和15g明胶作为辅料。
(2)加入0.5g柠檬酸和0.5g山梨酸钾,作为防腐剂。
(3)搅拌均匀,巴氏杀菌30分钟,按50mL体积分装,即得。
2.荔枝果肉多酚QRR及其组合物胶囊剂的制备方法具体操作如下:
(1)取25g的荔枝果肉多酚QRR及其组合物,粉碎,混合均匀后进行杀菌,制成内容物。
(2)取20g明胶、20水和10g甘油加热溶解,混合均匀得到胶皮溶液。
(3)取0.6g上述内容物和0.6g胶皮溶液,用软胶囊压制机成型,干燥后即得。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于改善肠道微生态的组合物,其特征在于,包括荔枝果肉多酚QRR和其它改善肠道微生态生物活性的多酚类物质。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述荔枝果肉多酚QRR为槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷。
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述其它具有改善肠道微生态生物活性的荔枝果肉中的多酚类物质为没食子酸、表儿茶素、儿茶素、绿原酸、咖啡酸和芦丁中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述荔枝果肉多酚QRR占比为60wt%-80wt%,所述其它多酚类物质占比为20wt%-40wt%。
5.根据权利要求1~4任一项所述的组合物,其特征在于,所述组合物的剂型包括溶液剂、散剂、胶囊剂以及泡腾剂。
6.权利要求1~3任一项所述组合物在制备改善肠道微生物菌群紊乱、肠道屏障功能受损组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述肠道微生物菌群紊乱包括肠道微生物菌群多样性减低和/或肠道微生物菌群的相对丰度下降。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述肠道屏障功能受损包括肠道粘膜屏障破坏、粘蛋白或肠道连接蛋白含量下降。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肠道微生物多样性菌群包括螺杆菌属(Helicobacter)、嗜臭杆菌属(Odoribacter)、Turicibacter、拟杆菌属(Bacteroides)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和颤螺菌属(Oscillospira)中的一种或多种。
10.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肠道微生物丰度菌群包括肠杆菌属(Enterobacter)、链球菌属(Streptococcus)、Parabacteroides中的一种或多种。
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