CN107384843A

CN107384843A - 少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株及其构建方法

Info

Publication number: CN107384843A
Application number: CN201710560140.8A
Authority: CN
Inventors: 余丰年; 王晋源
Original assignee: Shanghai Blg Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Blg Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明提供了一种少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株及其构建方法，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.2016610；本发明构建了一种PHB缺失少动鞘脂单胞菌突变株，利用同源重组敲除少动鞘脂单胞菌中PHB合成途径中的乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因，得到基因缺失突变株，从而抑制PHB的产生，提高了胶体的纯度和透明度；同时保持了较高的产胶率和产胶稳定性；从而大大提高了大规模生产去除PHB的透明型高酰结兰胶的可能性。

Description

少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株及其构建方法。

背景技术

结兰胶是一种由少动鞘脂单胞菌(Sphingomonas elodea)产生的胞外多糖。 1988年日本首先批准结兰胶应用于食品中。随后，美国和欧洲等国家也批准其作为凝胶剂，稳定剂，悬浮剂和增稠剂在食品中使用。由于其优越的凝胶能力，凝胶稳定性，极好的悬浮性，分散性以及良好的风味释放性，近年来越来越受到食品、制药和化妆品等诸多行业的关注。

结兰胶分子的基本结构是一条主链，由重复的四糖单元构成，参与形成的单糖有葡萄糖、葡萄糖醛酸及鼠李糖，摩尔比2：1：1。在这种多糖的天然形式中，每个四糖重复单元平均有一个乙酰基和半个甘油酰基。

工业上，结兰胶是通过少动鞘脂单胞菌在无菌条件下，严格控制通气、搅拌、温度和PH来进行发酵形成的。发酵完成后，先对粘性发酵液施以巴斯德消毒以杀灭存活细胞，再用醇提法回收结兰胶。然而，在发酵过程中同时会产生一种副产物，聚beta羟丁酸(PHB)。PHB是一种不溶的高聚物，是影响结兰胶溶液透明度的主要物质，干扰结兰胶的回收和纯化。而且，PHB是一种能量储藏多聚物，其大约占总产量的20％，PHB的合成可能会和结兰胶的合成竞争碳源。

结兰胶因从发酵液中回收方法的不同而显示不同的性质。从发酵液中直接回收产生天然或高酰基形式的结兰胶，分离这种高酰基结兰胶产生软的、柔韧的弹性凝胶。在高温下用强碱处理结兰胶发酵液使之脱酰化，从而产生硬而易碎的低酰基结兰胶。

随着结兰胶应用领域的不断扩大，在某些应用上需要透明型胶。然而，目前只有低酰基结兰胶才能被澄清化。高酰基结兰胶经过强碱处理后，再进行酸处理(以中和/酸化发酵培养液)和过滤除去固体和细胞碎片，产生澄清的低酰基结兰胶。由于高酰基结兰胶的高凝胶温度和荚膜特性使得其与少动鞘脂单胞菌细胞无法通过过滤分开，只能通过化学或酶处理少动鞘脂单胞菌细胞，但PHB仍然残留在产品中导致溶液浑浊。

另外，PHB不但会影响胶体的澄清度，还会影响胶体的流变学特性，从而影响胶体的品质。为了除去PHB，Mike Cleary等通过对少动鞘脂单胞菌进行化学随机诱变的方法得到了不产生PHB的突变株LPG-2(U.S.Pat.No.5300429). 此突变株被提交到ATCC菌种库，编号为ATCC53967.然而，LPG2产生的结兰胶品质不稳定，可能是由于化学诱变导致了菌株在其他位点也产生了突变，从而使其无法用在实际生产中。

近年来，少动鞘脂单胞菌的开发发明者美国C.P.Kelco公司为除去结兰胶中的PHB做了新的尝试。从乙酰辅酶A到PHB的合成分为三步。第一步由3-酮硫解酶催化产生乙酰乙酰辅酶(phaA)。第二步乙酰乙酰辅酶A还原酶催化乙酰乙酰辅酶A(phaB)生成beta-羟丁酸辅酶A，最后，PHB合成酶聚合(phaC) beta-羟丁酸辅酶A产生PHB。Bower Stan等用基因工程的方法定向敲除phaC 基因得到phaC缺失突变株，从而抑制PHB的产生(U.S.Pat.No.7829297B2)。然而，实验中发现，抑制PHB的生成导致了上一步的中间产物beta-羟丁酸辅酶 A的大量积累，有机酸的大量积累严重影响胶的产量。尽管接着在发酵过程中筛选到恢复产胶能力的自发突变株，但产胶不稳定，导致其也无法运用在实际生产中。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的通过基因工程方法构建PHB缺失少动鞘脂单胞菌突变株。利用同源重组敲除少动鞘脂单胞菌中PHB合成途径中的乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因，得到基因缺失突变株，从而抑制PHB的产生，同时减少一些阻碍结兰胶合成的中间代谢产物的积累。另外，由于第二次筛选的恢复产胶能力的自发突变株比较稳定，产胶能力也相对稳定，从而大大提高了大规模生产去除PHB的透明型高酰结兰胶的可能性。

为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：

本发明首先提供一种少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株，所述少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株编码乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因phaB缺失，该少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No. CCTCC M 2016610，保藏日期为2016年11月2日。

另一方面，本发明还提供构建权利要求1所述的少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株的构建方法，包括以下步骤：

步骤一，乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB基因片段的扩增

为了确定高度保守区域，从NCBI基因库搜索与少动鞘脂单胞菌

相近种属的细菌的乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列，利用分析软件进行多序列比对分析；在保守区域中选择简并性低的两个区域设计简并引物，所用的引物如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，以少动鞘脂单胞菌的基因组DNA 为模板，进行PCR扩增得到如SEQID NO.3所示的基因片段；

步骤二，乙酰乙酰辅酶A还原酶基因的全长和上下游序列的扩增

根据已知部分序列，利用染色体步移技术扩增全长基因序列以及其上下游侧翼序列，在已扩增片段的基因序列上分别设计三条同向的特异引物，使用染色体步行试剂盒，进行热不对称PCR反应，通过三次巣式PCR扩增，获得如SEQ ID NO.3所示已知基因片段的如SEQ ID No.4所示的上游侧翼序列，以及如SEQ ID No.5所示下游侧翼序列，经与SEQID NO.3对比后得到phaB基因的全长序列，如SEQ ID NO.6所示；

步骤三，phaB基因缺失的外源载体的构建

根据扩增的phaB基因的上下游侧翼序列利用如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示引物扩增phaB上游的SphI-XbaI片段，如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示引物扩增扩增phaB下游435bp的XbaI-SacI片段；上游片段 SphI-XbaI片段经酶切，胶回收后，连接到经双酶切后的***载体PLO2的相同酶切位点上，随后下游序列XbaI-SacI片段经双酶切，胶回收后连接到***上游片段的PLO2载体上，构建得到phaB基因缺失质粒；

步骤四，利用同源重组法构建phaB基因敲除突变株

将所述步骤三构建得到phaB基因缺失质粒转化到大肠杆菌S17-1中，纯化大肠杆菌后过夜培养，并与培养到稳定期的少动鞘脂单胞菌混合，混合培养液在滤纸上浓缩后置于TYE平板上培养7个小时进行结合转移；将混合培养的细胞稀释后涂板于含有卡那霉素和青霉素的YM培养基上，选择卡拉霉素抗性结合子，纯化4个卡拉霉素抗性结合子，并在非选择性培养基中传代培养3-4代，然后涂布在含10％的蔗糖培养基上，从蔗糖培养基上挑选8个单菌落进行卡那霉素敏感性试验，最终筛选得到phaB基因缺失菌株。

进一步地，所述步骤一中在保守区域中选择简并性低的两个区域氨基酸序列分别为VAIVTGG和INGGQHM，所用的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述步骤二中扩增已知基因片段上游序列所用的引物如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；扩增已知基因片段下游序列所用的引物如SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。

再一方面，本发明还提供利用所述的少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株制备的结兰胶。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明构建了一种PHB缺失少动鞘脂单胞菌突变株，利用同源重组敲除少动鞘脂单胞菌中PHB合成途径中的乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因，得到基因缺失突变株，从而抑制PHB的产生，提高了胶体的纯度和透明度；同时减少一些阻碍结兰胶合成的中间代谢产物的积累，保持了较高的产胶率；另外，由于第二次筛选的恢复产胶能力的自发突变株比较稳定，产胶能力也相对稳定，从而大大提高了大规模生产去除PHB的透明型高酰结兰胶的可能性。

附图说明

图1为基因库中几种Sphingomonas种属的乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列的比对示意图，包括Sphingomonas paucimobilis(EZP71693)， Sphingomonas sp.Ag1(KKI21593)，Sphingomonas sanxanigenens DSM 19645＝NX02(AHE56854)，Sphingomonashengshuiensis(AJP73923)， Sphingomonas endophytica(KTT74693)，Sphingomonas taxi(KIU26514)， Sphingomonas sanguinis(KTW11707)，Sphingomonas yabuuchiae(KTW01378)。

图2为***载体PLO2的图谱。

图3为构建本发明基因工程菌的示意图。

图4为phaB缺失突变菌株与野生株发酵生产的结兰胶加入钙离子高温加热后冷却制备成凝胶后透明度的比较。

生物材料保藏证明

Sphingomonas elodea Ace，分类命名为少动鞘脂单胞菌Sphingomonas elodea，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2016年11月2日，保藏号为CCTCC No.M2016610。

具体实施方式

本发明提供了一种少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株，所述少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株编码乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因phaB缺失，该少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M2016610。同时本发明还公开了构建该菌株的方法及其利用该菌种进行发酵实验的结果。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

本实施例为少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株的构建，具体为：

1)乙酰乙酰辅酶A还原酶基因(phaB)片段的扩增

为了确定高度保守区域，从NCBI(national center for biotechnologyinformation)基因库搜索与少动鞘脂单胞菌相近种属的细菌的乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列，利用Clustal W进行多序列比对分析。如附图1所示，在保守区域中选择简并性低的两个区域氨基酸序列分别为VAIVTGG和INGGQHM (箭头所示)来设计简并引物，以少动鞘脂单胞菌的基因组DNA为模板，进行 PCR扩增得到708bp的基因片段(SEQ ID NO.3)。所用的引物为： GTNGCNATNGTNACNGGNGG(SEQ ID NO.1)和 CATRTGYTGNCCNCCRTTDAT(SEQ IDNO.2)。PCR的扩增条件为：94℃2min,4个循环的94℃30s,48℃1min,72℃1min,35个循环94℃30s,52℃ 1min,72℃1min,最后72℃延伸2min后通过冷却终止反应。

2)乙酰乙酰辅酶A还原酶基因的全长和上下游序列的扩增

根据已知的部分序列，利用染色体步移技术扩增全长基因序列以及其上下游侧翼序列。在已扩增片段的基因序列上分别设计三条同向的特异引物，使用 Takara公司的染色体步行试剂盒，按照试剂盒使用说明进行热不对称PCR反应，通过三次巣式PCR扩增，获得已知片段(SEQ ID NO.3)的上游侧翼序列604 bp(SEQ ID NO.4)，方框中是起始密码子)和下游侧翼序列947bp(SEQ ID NO. 5，方框中是起终止密码子)的片段。经与SEQ ID NO.3对比后得到phaB基因的全长序列723bp(SEQ ID NO.6)。扩增已知片段上游序列所用的引物为SPR1: CTTGGCGACGATCTTCTCCAGCA(SEQ ID NO.7)；SPR2: CGCGTCATTTTCAGGATGGTGC(SEQ ID NO.8)；SPR3: TCCCACTTGTACGCCTTGATGCC(SEQ ID NO.9)，扩增下游序列所用的引物为SPF1:GATCACCGTCGCCGCCAATTATG(SEQ ID NO.10)；SPF2:GCATCAAGGCGTACAAGTGGGAC(SEQ ID NO.11)；SPF3: GCACCATCCTGAAAATGACGCGC(SEQ IDNO.12)。

3)phaB缺失的外源载体的构建

根据扩增的phaB基因的上下游侧翼序列设计引物TTAGCATGCGCAAGACCGGGCGCCTGCTG(SEQ ID NO.13)和 AGATCTAGAGTGCCTTCCTCTCCACAATC(SEQ ID NO.14)扩增phaB上游的376bp的SphI-XbaI片段(总共394bp)；设计引物ATATCTAGACTACGCGAGAGCAAGTGTGC(SEQ ID NO.15)和 TATGAGCTCTGGAAGCGCACCAGATTCC(SEQ ID NO.16)扩增phaB下游 435bp的XbaI-SacI片段(总共453bp)。上游片段SphI-XbaI片段经酶切，胶回收后，连接到经双酶切后的***载体PLO2的相同酶切位点上，随后下游序列 XbaI-SacI片段经双酶切，胶回收后连接到***上游片段的PLO2载体上，构建 phaB基因缺失质粒(SEQ ID NO.3)。

4)利用同源重组法构建phaB缺失突变株

phaB缺失载体转化到大肠杆菌S17-1中，纯化大肠杆菌后37℃过夜培养，并与培养到稳定期的少动鞘脂单胞菌混合，混合培养液在滤纸上浓缩后置于TYE 平板上37℃培养8小时后进行结合转移。将混合培养的细胞稀释后涂板于含有卡那霉素(10ug/ML)和青霉素(30ug/ML)的YM培养基上，选择卡拉霉素抗性结合子。纯化4个卡拉霉素抗性结合子，并在非选择性培养基YEME(0.25％的麦芽提取物，0.25％酵母提取物)中传代培养3-4代，然后涂布在含10％的蔗糖培养基上。从蔗糖培养基上挑选8个单菌落进行卡那霉素敏感性试验，其中4 个无抗性菌落进一步进行PCR验证，最终筛选到2个phaB缺失菌株。

实施例2

phaB缺失突变菌株的摇瓶发酵试验

将实施例1中两个phaB缺失菌株在含有合适的有机和无机氮源，玉米糖浆以及无机盐的发酵培养基中进行摇瓶发酵实验，用异丙醇沉淀回收发酵液后，干燥得到总沉淀物(total precipitable material,TPM)。结果发现发酵液很稀，使用Brookfield粘度计用30rpm测定，粘度仅有56cp，异丙醇沉淀几乎得不到沉淀物，发酵液有浓浓的酸气。对发酵液的成分进行分析后表明发酵过程中生产了大量的有机酸，原因是当PHB的合成途径受到阻碍时，代谢途径向合成有机酸合成的方向改变。有机酸的大量积累对结兰胶的合成具有抑制作用。

筛选恢复结兰胶生产能力的phaB缺失突变株及其发酵验证

将phaB缺失菌株的发酵液涂在培养基平板上观察长出的菌落，发现有些菌落的形状更加饱满，粘稠。纯化其中两个菌落PDGG-1和PDGG-2，进行摇瓶发酵验证结兰胶产量。结果显示这两个菌落的TPM是野生型菌株(WT)的85％左右(TPM降低15％左右是由于产品中PHB质量的丧失所致)，说明在发酵过程中，一些菌株发生了补偿突变，使得结兰胶合成达到正常水平。将这两个发生补偿突变的菌株进行PCR测试，证实了是phaB缺失突变株，同时测定发酵液中PHB的含量。PHB含量的测定是在1961年Law和Slepecky在细菌学杂志上发表的方法的基础上进行改进的(Journal of General Microbiology 1958, 19:196-209)。首先取5ml发酵液与5.75％的次氯酸钠溶液在37℃混合培养 16小时。离心后回收不溶物，用5ml水清洗后，悬浮在5ml去离子水中。取0.2ml 与4.8ml的浓硫酸混合煮沸10分钟,测定235nm条件下的吸光值。结果如表1 所示，两个补偿突变菌株均未检测到PHB的存在，说明PDGG-1和PDGG-2 均为成功去除PHB的恢复结兰胶产胶能力的缺失突变体。

表1.phaB缺失突变株的摇瓶发酵实验结果

菌株	TPM(g/L)	％WT	PHB
				WT	17.21	—	+
PDGG-1	14.64	85.1％	-
				PDGG-2	14.92	86.7％	-

为了进一步验证突变株的稳定性，将野生型菌株与PDGG-1缺失突变株分别在50L发酵罐上进一步进行验证实验，并测定发酵液中PHB的有无。结果如表2，表明补偿突变株在发酵罐中发酵也很稳定，产量也与摇瓶相似，具有稳定的产胶能力。

表2.phaB缺失突变株的发酵罐发酵实验结果

菌株	TPM(g/L)	％WT	PHB
				WT	16.25	—	+
PDGG-1	14.13	87.0％	-

通过上述实施例可以知道，本发明构建的PHB缺失少动鞘脂单胞菌突变株，利用同源重组敲除少动鞘脂单胞菌中PHB合成途径中的乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因，得到基因缺失突变株，从而抑制PHB的产生，提高了胶体的纯度和透明度；同时减少一些阻碍结兰胶合成的中间代谢产物的积累；并保持了较高的产胶率；另外，由于进一步筛选的恢复产胶能力的自发突变株比较稳定，产胶能力也很稳定，从而大大提高了大规模生产去除PHB的透明型高酰结兰胶的可能性。

实施例3

phaB缺失突变菌株与野生株发酵生产的结兰胶的强度与透明度的比较

结兰胶加热冷却后会形成凝胶，由于它独特的质构和流变学性能使其广泛运用于食品领域。胶的强度作为质构的主要指标，也是结兰胶性能的重要评价参数之一，因此我们比较了phaB缺失突变株与野生株发酵产生的结兰胶的强度，强度是指用探针压迫胶表面时产生的破裂张力。

将phaB缺失突变菌株PDGG-1和PDGG-2与野生株WT发酵生产的结兰胶干燥后粉碎，过80目筛，按下述方法制备成胶。加1mL 0.3M的CaCl2.2H2O 溶液于置于烧杯中的147.5ML去离子水中。将混合液置于磁力搅拌器上以 700rpm的速度边搅拌边缓缓加入1.5g结兰胶，继续搅拌直到完全分散水合，然后在烧杯上盖上铝箔纸，置于95℃水浴中加热溶胶15分钟后，去掉铝箔纸，用玻璃棒搅拌均匀，擦干烧杯外部的水，称量后补水到150g。重新盖上铝箔纸，放回95℃水浴中放置5分钟，用勺子去掉表面一层泡沫，倒入放在塑料平板的测试环中，盖上塑料板，在20-21℃恒温柜中冷却20-24小时。将胶从测试环中取出，用TA-XT plus质构分析仪测试，结果如表3。

表3phaB缺失突变菌株与野生株发酵生产的结兰胶的强度比较

菌株	平均胶强度(g/cm²)
		WT	628
PDGG-1	635
		PDGG-2	609

结果显示：phaB缺失突变菌株与野生株发酵生产的结兰胶的强度无显著性差异，说明phaB基因的缺失不会改变结兰胶的强度。

另外，测试胶强度前，对制备的两种胶体进行观察，明显看出phaB缺失突变菌株发酵后提取的结兰胶的透明度远远高于野生株发酵生产的结兰胶，如图4 所示，左边的是用野生菌株(WT)生产的结兰胶配制的凝胶，右边的是phaB 缺失突变菌株(PDGG-1)生产的结兰胶制备的凝胶，其透明度良好，明显能够看到胶体下方字母，而用野生菌株(WT)生产的结兰胶配制的凝胶完全无法看到下方字母。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海北连生物科技有限公司

<120> 少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株及其构建方法

<130> IPI172163

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> n =a或g或c或t; r =a或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> r is a, or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gtngcnrtng tnacnggngg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> r =a或g; y =c或t; n =a或g或c或t; d =g或a或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> r is a, or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> y is c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> r is a, or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> d is g, a, or t

<400> 2

catrtgytgn ccnccrttda t 21

<210> 3

<211> 709

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增基因片段

<400> 3

gtagcggtcg ttaccggcgg tacccgcggt attggcgaag cgatcagtct ggcgctcaag 60

gacgccggga tcaccgtcgc cgccaattat gccggcaatg acgagaaggc tgccgccttc 120

accgaacgca ccggcatcaa ggcgtacaag tgggacgtgg gcgatttcga tgcctgcgcc 180

gccggcgtgc agcaggtgga agccgagctc ggcccggtcg acatcgtcgt caacaatgcc 240

ggcatcaccc gtgacggcac catcctgaaa atgacgcgcg acatgtggga agacgtgatc 300

cgcatcaacc tgggcggctg cttcaacatg gcgcatgcgg tgttcccggg catgcgcacc 360

cgcaaatggg gccgcatcgt caacatcggc tcgatcaacg gccaggccgg ccagtacggg 420

caggtgaact atgccgccgc caagtccggc atccacggct tcaccaaggc gctggcgcag 480

gaaggcgcgc gattcggcgt gaccgtcaat gcgatcgcgc cgggctatat cgataccgac 540

atggtcgccg cggtgccggc ggacgtgctg gagaagatcg tcgccaagat ccccgtcggc 600

cggctgggcc aggcgcacga gatcgcccgt gcggtggcgt tcctctgcgc ggaagagggc 660

gggttcgtca ccggatcgac gctgtcgatc aacggcggcc agcatatg 708

<210> 4

<211> 544

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游侧翼序列

<400> 4

tgccgcaaga ccgggcgcct gctgggcgag gcgctggggc gcgagctgat cgtcaccttc 60

cagtcgcgat tcggccgcgc caagtggctg gagccggcga ccgacacgac gctggaggcg 120

ctgcccgcca agggcatccg ccgcatcgcg atcgtggcgc ccggtttctc ggcggattgc 180

ctcgaaacgc tggaagaact ggcgatccgc ggccgcgaat ccttcctgga cgcgggcggc 240

gagaatttcg catatttgcc ttgtctcaat gatagcggcg cgggcatgga gttgctccga 300

caacttatcg ggcgcgaact tgccggctgg gtgaaccccg cctagccatt tcttgggttt 360

gattgtggag aggaaggcac atggcacgtg tagcggtcgt taccggcggt acccgcggta 420

ttggcgaagc gatcagtctg gcgctcaagg acgccgggat caccgtcgcc gccaattatg 480

ccggcaatga cgagaaggct gccgccttca ccgaacgcac cggcatcaag gcgtacaagt 540

ggga 544

<210> 5

<211> 947

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游侧翼序列

<400> 5

gcaccatcct gaaaatgacg cgcgacatgt gggaagacgt gatccgcatc aacccgggcg 60

gctgcttcaa catggcgcat gcggtgttcc cgggcatgcg cacccgcaaa tggggccgca 120

tcgtcaacat cggctcgatc aacggccagg ccggccagta cgggcaggtg aactatgccg 180

ccgccaagtc cggcatccac gacttcacca aggcgctggc gcaggaaggc gcgcgattcg 240

gcgtgaccgt caatgcgatc gcgccgggct atatcgatac cgacatggtc gccgcggtgc 300

cggcggacgt gctggagaag atcgtcgcca agatccccgt cggccggctg ggccaggcgc 360

acgagatcgc ccgtgcggtg gcgttcctct gcgcggaaga gggcgggttc gtcaccggat 420

cgacgctgtc gatcaacggc ggccagcata tgtactgagc gaacaagggg gccggatcct 480

ggtggatccg gcccccaacg tctctcgata cgctacgcga gagcaagtgt gcgcgtacaa 540

caccttccga ttagtccggt tcccttgagc ctttcctgaa cgacttggtt atttgtcgtt 600

catcttcgca ggtgcagcac tggcggccgc ggtgggaatc gctaaagagt aggggatgcg 660

ctttcggctc cgcctgttcg cccttccgcc gctggcgctt tcgattctgt tcctcaccgc 720

gtccggcagg gagttgcgca ccccgctggg tagccggccg gagatgcggg cggagcgcgt 780

cccgcttgcg cctggcgatc ccggccgcac gacggtcggg cgacttcgct atctgggcgg 840

cgtgcgactg acgagccggg acctcggctt ctccggcttc tcggcgctca gtgtggccgg 900

cgattcgttc accctgctca gcgatcgcgg gaatctggtg cgcttcc 947

<210> 6

<211> 723

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> phaB基因的全长序列

<400> 6

atggcacgtg tagcggtcgt taccggcggt acccgcggta ttggcgaagc gatcagtctg 60

gcgctcaagg acgccgggat caccgtcgcc gccaattatg ccggcaatga cgagaaggct 120

gccgccttca ccgaacgcac cggcatcaag gcgtacaagt gggacgtggg cgatttcgat 180

gcctgcgccg ccggcgtgca gcaggtggaa gccgagctcg gcccggtcga catcgtcgtc 240

aacaatgccg gcatcacccg tgacggcacc atcctgaaaa tgacgcgcga catgtgggaa 300

gacgtgatcc gcatcaacct gggcggctgc ttcaacatgg cgcatgcggt gttcccgggc 360

atgcgcaccc gcaaatgggg ccgcatcgtc aacatcggct cgatcaacgg ccaggccggc 420

cagtacgggc aggtgaacta tgccgccgcc aagtccggca tccacggctt caccaaggcg 480

ctggcgcagg aaggcgcgcg attcggcgtg accgtcaatg cgatcgcgcc gggctatatc 540

gataccgaca tggtcgccgc ggtgccggcg gacgtgctgg agaagatcgt cgccaagatc 600

cccgtcggcc ggctgggcca ggcgcacgag atcgcccgtg cggtggcgtt cctctgcgcg 660

gaagagggcg ggttcgtcac cggatcgacg ctgtcgatca acggcggcca gcatatgtac 720

tga 723

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 7

cttggcgacg atcttctcca gca 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 8

cgcgtcattt tcaggatggt gcc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 9

tcccacttgt acgccttgat gcc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 10

gatcaccgtc gccgccaatt atg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 11

gcatcaaggc gtacaagtgg gac 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 12

gcaccatcct gaaaatgacg cgc 23

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 13

ttagcatgcg caagaccggg cgcctgctg 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 14

agatctagag tgccttcctc tccacaatc 29

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 15

atatctagac tacgcgagag caagtgtgc 29

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物序列

<400> 16

tatgagctcg gaagcgcacc agattccc 28

Claims

1.少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株，其特征在于，所述少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株编码乙酰乙酰辅酶A还原酶的基因phaB缺失，该少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M2016610。

2.构建权利要求1所述的少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB基因片段的扩增

为了确定高度保守区域，从NCBI基因库搜索与少动鞘脂单胞菌相近种属的细菌的乙酰乙酰辅酶A还原酶的氨基酸序列，利用分析软件进行多序列比对分析；在保守区域中选择简并性低的两个区域设计简并引物，以少动鞘脂单胞菌的基因组DNA为模板，进行PCR扩增得到如SEQ ID NO.3所示的基因片段；

根据已知部分序列，利用染色体步移技术扩增全长基因序列以及其上下游侧翼序列，在已扩增片段的基因序列上分别设计三条同向的特异引物，使用染色体步行试剂盒，进行热不对称PCR反应，通过三次巣式PCR扩增，获得如SEQ ID NO.3所示已知基因片段的如SEQID No.4所示的上游侧翼序列，以及如SEQ ID No.5所示下游侧翼序列，经与SEQ ID NO.3对比后得到phaB基因的全长序列，如SEQ ID NO.6所示；

步骤三，phaB基因缺失的外源载体的构建

根据扩增的phaB基因的上下游侧翼序列利用如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示引物扩增phaB上游的SphI-XbaI片段，如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示引物扩增PhaB下游435bp的XbaI-SacI片段；上游片段SphI-XbaI片段经酶切，胶回收后，连接到经双酶切后的***载体PLO2的相同酶切位点上，随后下游序列XbaI-SacI片段经双酶切，胶回收后连接到***上游片段的PLO2载体上，构建得到phaB基因缺失质粒；

步骤四，利用同源重组法构建phaB基因敲除突变株

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一中在保守区域中选择简并性低的两个区域氨基酸序列分别为VAIVTGG和INGGQHM，所用的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤二中扩增已知基因片段上游序列所用的引物如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；扩增已知基因片段下游序列所用的引物如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。

5.一种利用权利要求1所述的少动鞘脂单胞菌基因敲除突变株制备的结兰胶。

6.如权利要求5所述的结兰胶在制备食品、药品及日用品中的应用。