CN108795969B - 一株工程菌NXdP及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株工程菌NXdP及其构建方法和应用，属于基因工程和生物材料技术领域。本发明所述工程菌NXdP的保藏编号为CGMCC15406，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2018年03月01日。利用本发明构建得到的工程菌NXdP在发酵时仅产生水凝胶(宣福胶)，最终得到的纯品产量为15～22g/L，总产量为30～35g/L，转化率在48％以上，可有效提高水凝胶的产量，且具有很高的糖胶转化率，该菌株具有广泛的工业应用前景。

Description

一株工程菌NXdP及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物材料技术领域，具体涉及一株工程菌NXdP 及其构建方法和应用。
背景技术
鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)是根据16s rRNA序列，呼吸醌种类和细胞极性脂模式等特征提出的一个新属。区别于其它革兰氏阴性菌的重要特征是其细胞膜中含有鞘糖脂，而无脂多糖。鞘氨醇单胞菌属广泛分布于水体，土壤和空气中。目前，对于鞘氨醇单胞菌属的研究主要集中在该菌属具有降解难降解有机污染物的能力，比如二苯呋喃可被Sphingomonas sp. RW1作为唯一的碳源物质利用；具有合成β胡萝卜素的能力；具有合成一类酸性的荚膜多糖的能力，这些荚膜多糖的结构相似但不尽相同，其统称为鞘氨醇胶。
目前，已经大量生产并广泛应用的鞘氨醇胶主要包括：Sphingomonas elodeaATCC3161合成的结冷胶，Sphingomonas sp.ATCC31555合成的韦兰胶，Sphingomonassp.ATCC53159合成的迪特胶，Sphingomonas sp. ATCC31961合成的鼠李胶等。此类鞘氨醇胶具有相对保守的主链结构，而侧链基团的种类、位置则具有极大的多样性，这使鞘氨醇的结构和功能更加丰富，从而赋予了每一种鞘氨醇胶独特的物理性质。比如没有糖基侧链的结冷胶能形成凝胶，从而在食品、日化和医学上得到了广泛的应用；具有鼠李糖或甘露糖侧链的韦兰胶，能形成耐酸、耐碱、耐高温的高粘度的溶液，具有一个或两个鼠李糖侧链的迪特胶在低浓度条件下即可形成高粘度的溶液，在建筑、钻井、采油等高技术领域应用广泛；随着生物技术的发展，越来越多的可产鞘氨醇胶的菌株被鉴定，而这些新发现的天然聚合物资源在未来的生物胶应用中必将发挥更加重要的作用。
鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3(CGMCC No.10150)是一株可生产透明水凝胶的生产菌株(鞘氨醇单胞菌T-3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法，已授权CN201510110078.3)。但是在细胞内大量积累聚β羟基丁酸这种副产物，影响了水凝胶的产量及纯度，在本领域中，并没有一种工程菌，可以减少甚至完全不产生聚β羟基丁酸。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种产水凝胶的工程菌NXdP，不产生聚β羟基丁酸，实现糖胶的高转化率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株产水凝胶的工程菌NXdP(Sphingomonas sanxanigenens)，所述工程菌NXdP的保藏编号为CGMCC15406，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年03月01日。
本发明提供了一种构建上述工程菌NXdP的方法，包括以下步骤：
1)利用双交换同源重组方法敲除鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.T-3) 的phbB基因，得不产聚β羟基丁酸的工程菌T-3-ΔPHB；
2)将步骤1)得到的所述工程菌T-3-ΔPHB在TPG液体培养基中培养，培养后进行等离子诱变，得诱变工程菌T-3-ΔPHB；所述TPG液体培养基包括：葡萄糖8～12g/L，蛋白胨3～7g/L，酵母粉1～5g/L和牛肉浸粉1～5g/L；
3)将步骤2)得到的所述诱变工程菌T-3-ΔPHB在TPG固体培养基上培养，筛选水凝胶产量最高的菌株，所述水凝胶产量最高菌株为产水凝胶的工程菌NXdP；所述TPG固体培养基包括：葡萄糖8～12g/L，蛋白胨3～7g/L，酵母粉1～5g/L，牛肉浸粉1～5g/L和琼脂粉15g/L。
优选的，步骤1)所述双交换同源重组方法，包括以下步骤：
a)以鞘氨醇单胞菌T-3基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO：1～4所示序列的引物进行重叠PCR，纯化回收得重组片段；
b)利用限制性内切酶SacI和XbaI或SacI和PacI分别双酶切所述重组片段与pLO3质粒，将酶切产物进行连接，得重组质粒pLO3-Δgene；
c)将步骤b)得到的所述重组质粒pLO3-Δgene转化入E.Coli S17感受态细胞中，得E.Coli S17/pLO3-Δgene；
d)将步骤c)得到的所述E.Coli S17/pLO3-Δgene的单菌落在含有tetr的LB液体培养基中培养6～10h，离心收集E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体；
e)挑选鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种到含Cmr的种子培养基中，培养 20～28h，离心收集鞘氨醇单胞菌T-3菌体；
f)将步骤d)得到的E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体和步骤e)得到的鞘氨醇单胞菌T-3菌体分别用MgSO4溶液重悬后，按照1：(1.5～2.5)的体积比混合抽滤，在TPG固体培养基上接合转移10～15h，得单交换重组子；
g)将步骤f)得到的所述单交换重组子接种于无抗性的种子培养基中，传代两次，得F2代单交换重组子；所述种子培养基包括：蔗糖8～12g/L，蛋白胨1.8～3g/L，酵母粉1～2.5g/L，K2HPO41.8～3g/L和MgSO40.06～0.15 g/L；
h)将步骤g)得到的所述F2代单交换重组子接种至含蔗糖的TPG固体培养基上，培养65～78h，得敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子；
i)以步骤h)得到的所述敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子为模板，利用SEQ IDNO.9～12所示序列的引物重复步骤a)～h)，得敲除phbB基因双拷贝的双交换重组子；
j)以所述敲除phbB基因双拷贝的双交换重组子为模板，依次利用SEQ ID NO.17～20、SEQ ID NO.23～26、SEQ ID NO.27～30和SEQ ID NO.33～36的引物重复步骤a)～h)，得不产聚β羟基丁酸的工程菌T-3-ΔPHB。
优选的，步骤a)所述重叠PCR的程序，包括：第1～10个循环，98℃变性10s，在15s内55℃升温至72℃退火，72℃延伸1min；第11～20个循环，98℃变性10s，在15s内72℃降温至55℃退火，72℃延伸2min；第21～31 个循环，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸2min；第32个循环，72℃延伸10min。
优选的，步骤h)所述蔗糖在TPG固体培养基中的质量浓度为8～12％。
本发明还提供了一种工程菌NXdP或上述方法构建得到的工程菌NXdP 在产水凝胶中的应用。
优选的，包括以下步骤：
①将所述工程菌NXdP单菌落接种至TPG液体培养基中，震荡培养 20～26h，得培养液；
②将步骤①得到的所述培养液接种至种子培养基中，震荡培养20～26h，得种子液；
③将步骤②所述种子液接种于发酵培养基中，发酵68～75h，得发酵液；
④将步骤③得到的所述发酵液用蒸馏水稀释，加热离心，分离得到上层液体和菌体沉淀；
⑤调节步骤④得到的所述上层液体pH至3.0，收集产生的沉淀，得水凝胶，命名为宣福胶。
优选的，步骤①和步骤②所述震荡培养的温度，独立的为28～35℃。
优选的，步骤③所述发酵的培养基，包括：葡萄糖30～70g/L，豆饼粉 0.5～2g/L，K2HPO41～2g/L，MgSO40.1～1g/L和NaNO31～2g/L。
优选的，步骤③所述发酵的温度为28～35℃。
本发明提供了一株工程菌NXdP，本发明提供的所述工程菌NXdP不产生聚β羟基丁酸，只产生宣福胶，实现了糖胶的高转化率，从而提高了水凝胶(宣福胶)的纯度。结合试验结果和数据可知，当本发明所述工程菌NXdP 应用于发酵时，纯品产量为21.20±0.38g/L，总产量为32.03±2.21g/L；不同发酵时期发酵液中残留的葡萄糖含量从40g/L至0g/L不等，转化率为80％，发酵液粘度达到最大值约为6.4pa.s，且得到的水凝胶(宣福胶)剪切速率范围为0.001s-1～1000s-1，未检测到聚β羟基丁酸的存在。
附图说明
图1为敲除载体的构建流程图；
图2为聚β羟基丁酸合成关键基因的敲除及验证结果图；
图3为NXdP菌株发酵产量图；
图4为宣福胶的流变性能结果图。
具体实施方式
本发明提供了一株产水凝胶的工程菌NXdP(Sphingomonas sanxanigenens)，所述工程菌NXdP的保藏编号为CGMCC15406，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年03月01日。
本发明提供了一种构建上述工程菌NXdP的方法，包括以下步骤：
1)利用双交换同源重组方法敲除鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.T-3) 的phbB基因，得不产聚β羟基丁酸的工程菌T-3-ΔPHB；
2)将步骤1)得到的所述工程菌T-3-ΔPHB在TPG液体培养基中培养，培养后进行等离子诱变，得诱变工程菌T-3-ΔPHB；所述TPG液体培养基包括：葡萄糖8～12g/L，蛋白胨3～7g/L，酵母粉1～5g/L和牛肉浸粉1～5g/L；
3)将步骤2)得到的所述诱变工程菌T-3-ΔPHB在TPG固体培养基上培养，筛选水凝胶产量最高的菌株，所述水凝胶产量最高的菌株为产水凝胶的工程菌NXdP；所述TPG固体培养基包括：葡萄糖8～12g/L，蛋白胨3～7g/L，酵母粉1～5g/L，牛肉浸粉1～5g/L和琼脂粉15g/L。
本发明在构建工程菌NXdP时，首先利用双交换同源重组方法敲除鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.T-3)的phbB基因，得不产聚β羟基丁酸的工程菌T-3-ΔPHB。本发明所述双交换同源重组方法，优选的包括以下步骤：
a)以鞘氨醇单胞菌T-3基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO：1～4所示序列的引物进行重叠PCR，纯化回收得重组片段；
b)利用限制性内切酶SacI和XbaI或acI和PacI分别双酶切所述重组片段与pLO3质粒，将酶切产物进行连接，得重组质粒pLO3-Δgene；
c)将步骤b)得到的所述重组质粒pLO3-Δgene转化入E.Coli S17感受态细胞中，得E.Coli S17/pLO3-Δgene；
d)将步骤c)得到的所述E.Coli S17/pLO3-Δgene的单菌落在含有tetr的LB液体培养基中培养6～10h，离心收集E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体；
e)挑选鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种到含Cmr的种子培养基中，培养 20～28h，离心收集鞘氨醇单胞菌T-3菌体；
f)将步骤d)得到的E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体和步骤e)得到的鞘氨醇单胞菌T-3菌体分别用MgSO4溶液重悬后，按照1：(1.5～2.5)的体积比混合抽滤，在TPG固体培养基上接合转移10～15h，得单交换重组子；
g)将步骤f)得到的所述单交换重组子接种于无抗性的种子培养基中，传代两次，得F2代单交换重组子；所述种子培养基包括：蔗糖8～12g/L，蛋白胨1.8～3g/L，酵母粉1～2.5g/L，K2HPO41.8～3g/L和MgSO40.06～0.15 g/L；
h)将步骤g)得到的所述F2代单交换重组子接种至含蔗糖的TPG固体培养基上，培养65～78h，得敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子；
i)以步骤h)得到的所述敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子为模板，利用SEQ IDNO.9～12所示序列的引物重复步骤a)～h)，得敲除phbB基因双拷贝的双交换重组子；
j)以所述敲除phbB基因双拷贝的双交换重组子为模板，依次利用如SEQ ID NO.17～20、SEQ ID NO.23～26、SEQ ID NO.27～30和SEQ ID NO.33～36 所示序列的引物重复步骤a)～h)，得不产聚β羟基丁酸的工程菌T-3-ΔPHB。
本发明以鞘氨醇单胞菌T-3基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO：1～4 所示序列的引物进行重叠PCR，纯化回收得重组片段。在本发明中，所述重叠PCR的体系优选的包括模板1ul,上下游引物各0.4ul,预混的高保真DNA 聚合酶Prime star 12.5ul,加水补齐25ul。本发明所述重叠PCR的程序优选的包括：第1～10个循环，98℃变性10s，在15s内55℃升温至72℃退火，72℃延伸1min；第11～20个循环，98℃变性10s，在15s内72℃降温至55℃退火，72℃延伸2min；第21～31个循环，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸2min；第32个循环，72℃延伸10min。
得到重组片段后，本发明利用限制性内切酶SacI和XbaI或SacI和PacI 分别双酶切所述重组片段与pLO3质粒，将酶切产物进行连接，得重组质粒 pLO3-Δgene。本发明所述双酶切的温度优选为32～40℃，更优选的为 35～38℃，最优选的为37℃。本发明所述双酶切的时间优选的为60～120min，更优选的为80～100min，最优选的为90min。本发明对所述双酶切的体系并没有特殊限定，利用本领域的常规双酶切方法即可。本发明在所述双酶切后优选的还包括回收纯化过程，本发明对所述回收纯化的方法及步骤并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂盒操作即可。
本发明所述连接的酶优选的包括连接酶，所述连接酶优选的为T4连接酶。本发明所述连接的温度优选的为12～20℃，更优选的为14～18℃，最优选的为16℃。本发明所述连接的时间优选的为8～16h，更优选的为10～14h，最优选的为12h。本发明对所述连接的体系并没有特殊限定，利用本领域的常规连接方法即可。
得到重组质粒pLO3-Δgene后，本发明将重组质粒pLO3-Δgene转化入 E.ColiS17感受态细胞中，得E.Coli S17/pLO3-Δgene。本发明所述转化时，重组质粒pLO3-Δgene与E.Coli S17感受态细胞的体积比优选的为1:10。本发明所述转化可对重组质粒pLO3-Δgene进行扩增。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规转化方法即可。
得到E.Coli S17/pLO3-Δgene后，本发明将E.Coli S17/pLO3-Δgene的单菌落在含有tetr的LB液体培养基中培养6～10h，离心收集E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体。本发明所述单菌落与LB液体培养基的量为1个/5mL，所述LB液体培养基中tetr的质量浓度优选的为50～150μg/mL，更优选的为 80～120μg/mL，最优选的为100μg/mL。本发明所述培养优选的为摇床培养，所述培养的温度优选的为35～40℃，更优选的为36～39℃，最优选的为37℃，所述摇床的转速优选的为180～220rpm，更优选的为190～210rpm，最优选的为200rpm。本发明所述培养的时间优选的为7～9h，更优选的为8h。本发明所述离心的转速优选的为4000～8000rpm，更优选的为5000～7000rpm，最优选的为6000rpm，所述离心的时间优选的为3～8min，更优选的为4～6min，最优选的为5min。本发明在所述离心后，得到的沉淀即为E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体。
本发明挑选鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种到含Cmr的种子培养基中，培养20～28h，离心收集鞘氨醇单胞菌T-3菌体。本发明所述种子培养基包括：蔗糖8～12g/L，蛋白胨1.8～3g/L，酵母粉1～2.5g/L，K2HPO41.8～3g/L和 MgSO40.06～0.15g/L。本发明所述单菌落与种子培养基的量为1个/5mL，所述种子培养基中Cmr的质量浓度优选的为50～150μg/mL，更优选的为 80～120μg/mL，最优选的为100μg/mL。本发明所述培养优选的为摇床培养，所述培养的温度优选的为25～35℃，更优选的为28～32℃，最优选的为30℃，所述摇床的转速优选的为180～220rpm，更优选的为190～210rpm，最优选的为200rpm。本发明所述培养的时间优选的为22～26h，更优选的为23～25h，最优选的为24h。本发明所述离心的转速优选的为4000～8000rpm，更优选的为5000～7000rpm，最优选的为6000rpm，所述离心的时间优选的为3～8min，更优选的为4～6min，最优选的为5min。
得到E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体和鞘氨醇单胞菌T-3菌体后，本发明分别用MgSO4溶液重悬后，按照1：(1.5～2.5)的体积比混合抽滤，在TPG 固体培养基上接合转移10～15h，得单交换重组子。本发明所述重悬前优选的包括用MgSO4溶液洗涤的过程，所述洗涤用MgSO4溶液的浓度优选的为8～12mmol/L，更优选的为9～11mmol/L，最优选的为10mmol/L。本发明所述洗涤的次数优选的为2次，每次洗涤后优选的包括轻微离心过程。本发明所述轻微离心的转速优选为5000～7000rpm，轻微离心的时间优选为5～7min。本发明所述重悬的MgSO4溶液用量优选的为150～250μL，更优选的为 180～220μL，最优选的为200μL。本发明所述E.Coli S17/pLO3-Δgene菌体和鞘氨醇单胞菌T-3菌体的体积比优选的为1：(1.8～2.2)，更优选的为1:2。本发明所述抽滤优选的抽滤至滤膜上，所述滤膜的孔径优选的为0.22μm。本发明所述结合转移优选的将滤膜置于TPG固体培养基上，所述滤膜优选的有菌体一面朝上。本发明所述结合转移的温度优选的为25～35℃，更优选的为28～32℃，最优选的为30℃。本发明所述结合转移的时间优选的为11～13h，更优选的为12h。
得到单交换重组子后，本发明将所述单交换重组子接种于无抗性的种子培养基中，传代两次，得F2代单交换重组子。本发明在所述接种前，优选的还包括菌落PCR验证，所述菌落PCR验证时，优选的先用200uL的MgSO4溶液洗涤滤膜上的菌体，涂布于含有Cmr和tetr的双抗固体TPG固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养72h，由于pLO3在鞘氨醇单胞菌T-3中无法复制，当pLO3-Δgene接合转移至T-3后，其会通过上游同源臂或下游同源臂交换整合入基因组。在双抗平板上挑取单菌落至5ml含双抗的种子液体培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养36h。本发明所述PCR的引物序列如SEQ ID NO.5～6所示，进行菌落PCR可以验证单交换重组子，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，观察是否具有两条长短不同的目的条带。菌落PCR完成后，本发明将单交换重组子接种于无抗性的种子培养基中，传代两次，本发明所述传代优选的在摇床进行，所述摇床的温度优选的为25～35℃，更优选的为28～32℃，最优选的为30℃；所述摇床的转速优选的为150～250rpm，更优选的为180～220rpm，最优选的为200rpm。本发明所述传代的时间优选的为18～30h，更优选的为22～26h，最优选的为24h。
得到F2代单交换重组子后，本发明将所述F2代单交换重组子接种至含蔗糖的TPG固体培养基上，培养65～78h，得敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子。本发明所述蔗糖在TPG固体培养基中的质量浓度优选为8～12％，更优选为9～11％，最优选为10％。本发明所述培养的时间优选的为66～75h，更优选的为70～73h，最优选的为72h。
本发明在得到所述敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子后，优选的还包括菌落PCR验证，所述菌落PCR优选的为挑选敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子单菌落至5mL无抗体的种子培养基中摇床培养24h，所述培养的温度优选的为25～35℃，更优选的为28～32℃，最优选的为30℃；所述摇床的转速优选的为150～250rpm，更优选的为180～220rpm，最优选的为 200rpm。本发明所述菌落PCR的引物序列如SEQ ID NO.7～8所示。利用SEQ IDNO.5～6所示的引物，进行菌落PCR可以验证双交换重组子，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察是否具有一条较短的目的条带(500bp左右)。
得到敲除phbB基因单拷贝的双交换重组子后，本发明以所述敲除phbB 基因单拷贝的双交换重组子为模板，利用SEQ ID NO.9～12的引物重复步骤 a)～h)，得敲除phbB基因双拷贝的双交换重组子。在本发明中，在重复上述步骤时，重复步骤g)和步骤h)优选的也包括有菌落PCR验证，所述菌落 PCR验证用引物序列分别如SEQ ID NO:13～14和SEQ IDNO:15～16所示每次得到PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察具有一条较短的目的条带是预期结果。
本发明以上述技术方案得到的所述双交换重组子为模板，依次利用SEQ ID NO.17～20、SEQ ID NO.23～26、SEQ ID NO.27～30和SEQ ID NO.33～36 的引物重复步骤a)～h)，共重复4个周期的步骤a)～h)得不产聚β羟基丁酸的工程菌T-3-ΔPHB。本发明所述引物的信息如表1所示：
表1.引物信息
Figure BDA0001722320410000101
Figure BDA0001722320410000111
得到工程菌T-3-ΔPHB后，本发明将所述工程菌T-3-ΔPHB在TPG液体培养基中培养，进行等离子诱变，得诱变工程菌T-3-ΔPHB。本发明所述TPG 液体培养基包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和牛肉浸粉；所述TPG液体培养基中葡萄糖的含量优选为8～12g/L，更优选的为9～11g/L，最优选为10g/L。本发明所述TPG液体培养基中蛋白胨的含量优选为3～7g/L，更优选为 4～6g/L，最优选为5g/L。本发明所述TPG液体培养基中酵母粉的含量优选为1～5g/L，更优选的为2～4g/L，最优选为3g/L。本发明所述TPG液体培养基中牛肉浸粉的含量优选为1～5g/L，更优选为2～4g/L，最优选为3g/L。本发明对所述TPG液体培养基中各组分的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。本发明所述培养，优选的培养至工程菌T-3-ΔPHB的细胞密度为0.5×105～2×105个/mL，更优选的为0.8×105～1.2×105个/mL，最优选的为1×105个/mL。
本发明所述等离子诱变的过程优选的包括：向加样器底部滴加细菌，利用MPMS仪器进行诱变，得诱变工程菌。本发明所述滴加优选在无菌条件下进行，更优选在超净工作台中进行。本发明所述加样器优选的为多功能等离子诱变仪的加样器，本发明对所述加样的方法并没有特殊限定。本发明所述细菌的滴加量优选为15～25μL，更优选为18～22μL，最优选为20μL。本发明在滴加完成后，优选的包括室温静置，所述静置的时间优选的为8～12min，更优选的为9～11min，最优选为10min，使菌液在加样器底部形成一层菌膜。本发明所述MPMS仪器优选为灭菌后的仪器，本发明对所述灭菌的方式并没有特殊限定，优选的在紫外灭菌30分钟。本发明所述诱变时，N2气流量优选的为8～15slm，更优选为10～13slm，最优选为12slm。本发明所述诱变的时间优选为30～180s，更优选为60～150s，最优选为90s。
得到诱变工程菌T-3-ΔPHB后，本发明将所述诱变工程菌T-3-ΔPHB在 TPG固体培养基上培养，筛选水凝胶产量最高的菌株，所述水凝胶产量最高的菌株为产水凝胶的工程菌NXdP。本发明在TPG固体培养基上培养前，优选的还包括将所述诱变工程菌T-3-ΔPHB重悬。本发明所述重悬优选的为将得到的所述诱变工程菌与新鲜的TPG液体培养基按照1:50的体积比混合，得到诱变工程菌的TPG悬浮液。本发明所述培养，优选的为将100μL悬浮液涂布到TPG固体培养基上，所述培养的温度优选的为温度优选的为 25～35℃，更优选的为28～32℃，最优选的为30℃，所述培养的时间优选的为1～5d，更优选的为2～4d，最优选的为3d。本发明所述TPG固体培养基中所述琼脂粉的含量优选的为15g/L。本发明所述筛选的过程优选包通过培养相同时间后形成菌落的大小来筛选，本发明中，菌落越大，水凝胶产量越高。
本发明还提供了上述工程菌NXdP或利用上述方法构建得到的工程菌 NXdP产水凝胶的方法，包括以下步骤：
①将工程菌NXdP单菌落接种至TPG液体培养基中，震荡培养20～26h，得培养液；
②将步骤①得到的所述培养液接种至种子培养基中，震荡培养20～26h，得种子液；
③将步骤②所述种子液接种于发酵培养基中，发酵68～75h，得发酵液；
④将步骤③得到的所述发酵液用蒸馏水稀释，加热离心，分离上层液体和菌体沉淀；
⑤调节步骤④得到的所述上层液体pH至3.0，收集产生的沉淀，得水凝胶，命名为宣福胶。
利用工程菌NXdP产水凝胶时，本发明将工程菌NXdP单菌落接种至 TPG液体培养基中，震荡培养20～26h，得培养液。本发明所述NXdP单菌落与TPG液体培养基的接种关系优选为1个/3～8mL，更优选的为1个 /4～6mL，最优选的为1个/5mL。本发明所述震荡培养的温度优选为28～35℃，更优选的为29～32℃，最优选的为30℃。本发明所述震荡培养的时间优选的为22～25h，更优选的为23～24.5h，最优选的为24h。
得培养液后，本发明将所述培养液接种至种子培养基中，震荡培养 20～26h，得种子液。本发明所述培养液与种子培养基的体积比优选的为1： (20～60)，当利用摇瓶法进行发酵时，所述体积比为1:20；当利用分批发酵法进行发酵时，所述体积比为1:60。本发明所述震荡培养的温度优选为 28～35℃，更优选的为29～32℃，最优选的为30℃。本发明所述震荡培养的时间优选的为22～25h，更优选的为23～24.5h，最优选的为24h。
得种子液后，本发明将所述种子液接种于发酵培养基中，发酵68～75h，得发酵液。本发明所述种子液的接种体积优选为所述发酵培养基体积的 3～10％，更优选为4～6％，最优选为5％。发酵培养基的成分优选的包括葡萄糖，豆饼粉，K2HPO4，MgSO4和NaNO3，在所述发酵培养基中，当利用摇瓶法发酵时，所述葡萄糖的浓度优选的为30～70g/L，更优选的为40～50g/L，最优选的为40g/L；所述豆饼粉的浓度优选的为0.5～2g/L，更优选的为 1～1.8g/L，最优选的为1.54g/L；所述K2HPO4的浓度优选的为0.5～2g/L，更优选的为0.8～1.2g/L，最优选的为0.9g/L；所述MgSO4的浓度优选的为 0.1～1g/L，更优选的为0.3～0.5g/L，最优选的为0.4g/L；所述NaNO3的浓度优选的为1～2g/L，更优选的为1.2～1.8g/L，最优选的为1.54g/L；当利用分批发酵法发酵时，所述葡萄糖的浓度优选的为30～50g/L，更优选的为 40～50g/L，最优选的为40g/L；所述豆饼粉的浓度优选的为0.5～2g/L，更优选的为1～1.8g/L，最优选的为1.54g/L；所述K2HPO4的浓度优选的为0.5～2 g/L，更优选的为0.8～1.2g/L，最优选的为0.9g/L；所述MgSO4的浓度优选的为0.1～1g/L，更优选的为0.3～0.5g/L，最优选的为0.4g/L；所述NaNO3的浓度优选的为1～2g/L，更优选的为1.2～1.8g/L，最优选的为1.54g/L。本发明对所述发酵培养基中各组分的来源没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。本发明所述发酵的温度优选的为28～35℃，更优选的为29～32℃，最优选的为30℃。本发明所述发酵的时间优选的为69～74h，更优选的为 70～73h，最优选的为72h。
得到发酵液后，本发明将所述发酵液用蒸馏水稀释，加热离心，分离上层液体和菌体沉淀。本发明所述稀释优选的为稀释5～10倍，更优选的为6～8 倍，最优选的为7倍。本发明所述加热的温度优选的为95～121℃，更优选的为99～110℃，最优选的为105℃；所述加热的时间优选的为15～25min，更优选的为18～22min，最优选的为20min。本发明所述离心的转速优选为 10000～15000rpm，更优选为11000～13000rpm，最优选为12000rpm，所述离心的时间优选为10～50min，更优选为20～40min，最优选为30min。
得上层液体后，本发明调节所述上层液体pH至3.0，收集产生的沉淀，得水凝胶，命名为宣福胶。本发明所述上层液体pH优选的利用稀盐酸调节，所述稀盐酸的浓度优选的为1mol/L。本发明所述沉淀优选的经NaOH溶液调节pH至中性后，烘干得水凝胶。本发明所述NaOH溶液的浓度优选的为 1mol/L。本发明所述烘干的条件优选的为60℃过夜。
下面结合实施例对本发明提供的工程菌NXdP及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
聚β羟基丁酸合成途径的关键基因敲除载体的构建：
按照图1所示的流程图，使用提取试剂盒提取T-3的基因组，靶基因的上下游同源臂以T-3基因组为模板，分别使用引物SEQ ID NO：1～4及 PrimeSTARDNA聚合酶进行扩增。通过overlap PCR将上下游DNA片段连接，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组片段。将重组片段及pLO3质粒同时使用限制性酶SacI和XbaI 进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒 pLO3-Δgene，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。
实施例2
聚β羟基丁酸合成途径的关键基因敲除载体的构建：
按照图1所示的流程图，使用提取试剂盒提取T-3的基因组，靶基因的上下游同源臂以T-3基因组为模板，分别使用引物SEQ ID NO：1～4及 PrimeSTARDNA聚合酶进行扩增。通过overlap PCR将上下游DNA片段连接，将产物通过电泳检测，并将目的基因条带通过胶回收试剂盒进行纯化回收，获得重组片段。将重组片段及pLO3质粒同时使用限制性酶SacI和PacI 进行酶切，37℃，90min，将酶切后的片段使用试剂盒进行PCR纯化回收，将两者的回收产物用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，得到重组质粒 pLO3-Δgene，并将重组质粒转入E.coli S17感受态细胞中进行重组质粒的扩增，挑取测序正确的单菌落进行甘油保存。
实施例3
不产聚β羟基丁酸基因工程菌株的构建：
在TPG固体培养基挑T-3单菌落接种至含Cmr的5ml种子培养基，30℃恒温摇床中200rpm培养24h，挑取E.coli s17/pLO3-Δgene的单菌落至含有 tetr的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养8h，两株菌各取 5ml 6000rpm离心5min收集菌体，用10mmol/L的MgSO4溶液洗涤两次，离心，再用200ul的MgSO4溶液重悬菌体，将T-3和E.coli s17/pLO3-Δgene 按照2:1的比例混匀后抽滤至孔径放置在0.22um的滤膜上，将菌体朝上的滤膜置于无抗性平板上，于30℃恒温培养箱中培养12h进行接合转移。用 200ul MgSO4溶液洗涤滤膜上的菌体，梯度稀释后涂布于含有Cmr和tetr的双抗平板上，于30℃恒温培养箱中培养72h。在双抗平板上挑取单菌落至5ml 含双抗的种子液体培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养36h。使用引物 SEQ ID NO.5～6进行菌落PCR验证单交换重组子，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，观察是否具有目的条带。将单交换重组子接种于无抗性的5ml种子培养基中，30℃恒温摇床中200rpm培养24h，传代两次，然后将其涂布至10％蔗糖平板上于30℃恒温培养箱中培养72h。挑取单菌落至5ml试管中，30℃， 200rpm培养24h，使用引物SEQ ID NO.7～8进行菌落PCR验证，确定正确的双交换重组子，保存并进行下一步的继续敲除，直到得到完全不产聚β羟基丁酸的基因工程菌株，每次敲除phb基因拷贝的结果如图2所示，最终命名为T-3-ΔPHB，甘油管保存在-80℃。
实施例4
使用多功能等离子诱变***(MPMS)进行等离子诱变：
在等离子诱变前，将T-3-ΔPHB菌株在TPG培养基中预培养至约105/mL 的细胞密度；在超净工作台中将20μL细菌悬液滴在多功能等离子诱变仪的加样器底部；然后在室温下静置10分钟，在加样器底部形成一层菌膜。使用先前已经紫外灭菌30分钟的MPMS仪器对细菌进行诱变。进行诱变时， N2气流量固定为12slm，根据不同的时间长度(30s-180s)，用气流冲击细胞并进行梯度诱变。将细胞重悬于1mL新鲜的TPG液体培养基中，并将每种混合悬浮液(100μL)涂布到两个TPG平板上，然后在30℃培养3天。选择较大的菌落来进行摇瓶发酵比较其水凝胶的产量。最后得到工程菌株NXdP。
实施例5
基因工程菌NXdP摇瓶法发酵生产水凝胶(宣福胶)：
①将基因工程菌NXdP单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；
②将步骤(1)制得的培养液接种至100ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；
③以6～10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至玻璃摇瓶中，30℃，恒定pH6.8～7.2，培养72小时；
④将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，105℃加热20分钟，高速离心分离发酵液和菌体沉淀；
⑤将步骤(4)中的发酵液用稀盐酸调节pH至3.0左右，沉淀经NaOH 调节至pH中性，烘干得到生物多糖，纯品产量为15.03±2.35g/L，总产量为 32.51±3.18g/L，转化率为48.8％。
实施例6
基因工程菌NXdP分批发酵法生产水凝胶(宣福胶)：
①将基因工程菌NXdP单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；
②将步骤(1)制得的培养液接种至300ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；
③以6～10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至5L发酵罐中， 30℃，恒定pH6.8～7.2，培养72小时；
④将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，105℃加热20分钟，高速离心分离发酵液和菌体沉淀；
⑤将步骤(4)中的发酵液用稀盐酸调节pH至3.0左右，沉淀经NaOH 调节至pH中性，烘干得到生物多糖，纯品产量为21.20±0.38g/L，总产量为 32.03±2.21g/L，转化率为80％。
实验例1
分批发酵不同时期葡萄糖含量的测定：
采用安装有葡萄糖酶膜圈的生物传感分析仪SBA-40C(山东省生物传感器重点实验室)测定发酵液中葡萄糖的含量。在发酵结束后，将发酵液用蒸馏水进行5倍体积的稀释，100℃加热10分钟，离心分离上清和沉淀。上清液用于测定发酵液中葡萄糖的含量。以100mg/dl的葡萄糖作为标准液，测定结果如图3所示，结果显示：不同发酵时期发酵液中残留的葡萄糖含量从 40g/L至0g/L不等，且随着发酵时间递减，证明葡萄糖的转化率高。
实验例2
分批发酵不同时期发酵液粘度的测定：
采用美国Brookfield viscometer DV_II+进行粘度测定，使用64#转子， 60转/分钟条件下测定粘度。测定结果如图3b所示，经测定，在培养至40 小时时，发酵液粘度开始增加，培养至72小时时发酵液粘度达到最大值约为6.4pa.s，证明宣福胶的纯度高。
实验例3
宣福胶流变学性能的测定：
宣福胶的流变特性通过TA流变仪进行测定，将宣福胶溶于超纯水中 (10mg/ml)，检测条件为25℃，检测结果如图4所示，剪切速率范围为 0.001s-1-1000s-1。
实验例4
基因工程菌株发酵生产宣福胶与野生型菌株对比：利用发酵罐发酵，除菌株不同外，其余条件均相同，检测的结果如表2所示：
表 2
Figure BDA0001722320410000181
综上所述，本发明所构建的基因工程菌NXdP能够有效提高透明水凝胶 (宣福胶)的产量，且具有很高的糖胶转化率，该菌株具有广泛的工业应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一株工程菌NXdP及其构建方法和应用
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagcgagtta attaatggag gagcccgaat taagg 35
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgcccgat ttcgaggaca tgcgcccggt cactatgt 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acatagtgac cgggcgcatg tcctcgaaat cgggcatg 38
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacttcgtct agactggcgc ggttgttacg tg 32
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtcgggat tgacggtct 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgccaaggt caatgtaac 19
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgatcggtcg tcggttcata c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcatcctgc tcgacgaacc 20
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gactaatgag ctcgccggat cgacgacaaa ca 32
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agttactaat ggcggacgcg atgcgcccgg tcactatgt 39
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acatagtgac cgggcgcatc gcgtccgcca ttagtaact 39
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgcagttct agacccgcct tctgtcacaa cc 32
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctggccggaa atcacgagt 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttgctccat ccgcttgag 19
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgacattgcg ccgtttgag 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgtggcggtc gagatccct 19
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaggagctta attaacgcaa tgcaacggtg atct 34
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tattgcccgc cgttgatgtc gccgacgttc caatca 36
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgattggaac gtcggcgaca tcaacggcgg gcaata 36
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagtcattct agagcgaggg cattgcgatt g 31
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgtcgatggc ggctatctc 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccgatctgc gcatagtcc 19
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gagatcatta attaaggact gccaaacgat tgac 34
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttagcgatat attgcccacc tttctcgttg ccatgataga 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tctatcatgg caacgagaaa ggtgggcaat atatcgctaa 40
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cagtagttct agatgtcctg ttcggcactc c 31
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggactagtta attaaggccg atctgcgttt gc 32
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
accattgacc gacagcgtct ggtctgcccg aactgac 37
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtcagttcgg gcagaccaga cgctgtcggt caatggt 37
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gagatactct agaaggtcgt gaatccgcgt ca 32
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtcaacaatg cgggcatca 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caatgagctt ggcgggaca 19
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gagctattta attaagtccg ccagcagatc gaaa 34
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
caatacatgt gctggccgcc gcgggttcca ccagttac 38
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtaactggtg gaacccgcgg cggccagcac atgtattg 38
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggacttgtct agagccggga atgtcgttat ga 32
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgcgtgcatg aatgacaacc 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgttgagcgg gagcgattc 19

Claims (1)

1.一株产水凝胶的工程菌NXdP在产水凝胶中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
①将所述工程菌NXdP单菌落接种至TPG液体培养基中，震荡培养20～26h，得培养液；
②将步骤①得到的所述培养液接种至种子培养基中，震荡培养20～26h，得种子液；
③将步骤②所述种子液接种于发酵培养基中，发酵68～75h，得发酵液；
④将步骤③得到的所述发酵液用蒸馏水稀释，加热离心，分离得到上层液体和菌体沉淀；
⑤调节步骤④得到的所述上层液体pH至3.0，收集产生的沉淀，得水凝胶，命名为宣福胶；
步骤①和步骤②所述震荡培养的温度，均为28～35℃；
步骤③所述发酵培养基，包括：葡萄糖30～70g/L，豆饼粉0.5～2g/L，K2HPO41～2g/L，MgSO40.1～1g/L和NaNO31～2g/L；
步骤③所述发酵的温度为28～35℃；
所述工程菌NXdP的保藏编号为CGMCC15406，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2018年03月01日。
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