CN105543128A - 一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用，属于生物技术技术领域。本发明所述的适冷耐盐褐藻酸裂解酶基因c3，从分离自北极黄河站海带样品的冷单胞菌Psychromonas？sp.C-3的基因组DNA中克隆得到，该酶属于多糖裂解酶第七家族，具有良好的适冷性和NaCl耐受性，在食品和医药领域具有很大的应用潜力。

Description

一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用

技术领域

本发明涉及一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

褐藻酸(alginate,alginicacid)又名褐藻胶、海藻胶，是一种主要来源于海产褐藻的酸性多糖。褐藻酸是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate，M)与其差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronate,G)两种单体通过1,4糖苷键连接而成的非支链多糖。目前商品化的褐藻酸多以褐藻酸盐的形式存在。褐藻酸盐具有良好的亲水性、成凝胶、粘稠性以及生物相容性，广泛应用于食品、医药和化工等多个领域。而褐藻酸降解产物-褐藻低聚糖/褐藻寡糖具有抗肿瘤、促进生长、增强免疫活性、抗氧化、抗炎等多种生物学活性和药用价值，近年来受到广泛的关注，成为新的研究热点。

褐藻酸裂解酶能够催化褐藻酸的降解，通过β-消除机制作用于含有古洛糖和甘露糖的C-O糖苷键，在产物的非还原末端C4,5间生成不饱和糖醛酸4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronicacid。该酶根据作用底物的不同可分为β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3，PM型)和α-L-1,4-古洛糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11，PG型)。聚甘露糖醛酸和聚古罗糖酸酸片段是褐藻酸分子所特有的，赋予了褐藻低聚糖和褐藻寡糖多样的生物学活性，在医药、保健品领域具有广阔的开发应用前景，其需求量也越来越大。相对于传统的酸解生产方式，用褐藻酸裂解酶酶法制备褐藻低聚糖/寡糖具有反应条件温和、可操控性强、产率高等优点，因而成为褐藻资源生物高值化应用的强有利的工具。

褐藻酸裂解酶在自然界中广泛分布，主要来源于微生物，海洋藻类、海洋软体动物和棘皮动物等。细菌来源的褐藻酸裂解酶种类多，来源广，便于生产，便于异源表达等特点具有很好的应用潜力。微生物产生的褐藻酸裂解酶大多是中温酶，而低温和适冷的耐盐褐藻酸裂解酶则鲜有报导。适冷耐盐褐藻酸裂解酶在低温高盐条件下具有很高的活性，在食品和医药领域具有很大的应用潜力。新型适冷耐盐褐藻酸裂解酶的发现对于该酶的研究及应用都具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用。

一株冷单胞菌(Psychromonassp.)C-3，2015年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号CCTCCM2015748。

一种海洋褐藻酸裂解酶基因c3，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

上述基因编码的海洋褐藻酸裂解酶C3，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。

一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋褐藻酸裂解酶C3。

上述海洋褐藻酸裂解酶C3和/或上述海洋褐藻酸裂解酶基因c3在褐藻酸裂解中的应用。

褐藻酸裂解酶基因c3是从分离自北极黄河站海带样品的Psychromonassp.C3的基因组DNA中克隆得到的。对具备褐藻酸降解能力的该菌株全基因测序，得到可能编码褐藻酸裂解酶的基因c3，在信号肽预测网站预测其信号肽长度，并根据其序列设计特异性引物，利用PCR技术从Psychromonassp.C3的基因组DNA中克隆了编码褐藻酸裂解酶的基因c3，构建了含褐藻酸裂解酶基因c3的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞对该基因的核酸序列进行了测定。测序结果表明褐藻酸裂解酶基因c3为一个含有861个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码286个氨基酸。运用在线信号肽预测网站SignalP预测褐藻酸裂解酶C3的信号肽由20个氨基酸组成，因此褐藻酸裂解酶C3是一个含有20个氨基酸的信号肽，共编码286个氨基酸的多肽。序列分析表明，褐藻酸裂解酶C3属于多糖裂解酶第七家族。对切去信号肽的纯化的褐藻酸裂解酶C3进行性质测定。结果表明该酶对甘露糖醛酸段表现出特异性降解。最适pH为8.0，且在pH6.0～10.0范围内稳定存在。最适酶活温度为20℃，且在0℃仍保持超过40％的活力，表现出良好适冷性。C3对高浓度的NaCl也表现出很好的耐受性。

有益效果：

1、本发明所述的褐藻酸裂解酶C3在低温下有较高酶活性，中高温下不稳定，从而保证了其使用的安全性；

2、本发明所述的褐藻酸裂解酶C3表现出显著高盐高活性的特点，在3MNaCl中的酶活性仍超过100％；

3、本发明所述的褐藻酸裂解酶C3只降解PM的这一特性可用于从褐藻酸钠中制备甘露糖醛酸寡糖。

附图说明

图1、通过PCR扩增克隆的编码极地褐藻酸裂解酶C3的基因片段的电泳图

其中泳道2为扩增的DNA片段

图2、在大肠杆菌中异源表达纯化得到的藻酸裂解酶C3电泳图；

图3、极地褐藻酸裂解酶C3的酶活温度曲线；

其中：(A)温度对酶活性的影响，(B)温度对酶稳定性的影响；

图4、不同浓度的NaCl对极地褐藻酸裂解酶C3酶活性的影响曲线；

图5、极地褐藻酸裂解酶C3的酶活pH曲线；

图6、极地褐藻酸裂解酶C3的底物特异性分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

培养基：

富集培养基：0.5wt％蛋白胨、0.1wt％酵母粉、0.5wt％褐藻酸钠，人工海水配制，pH6.5。

分离培养基：0.5wt％蛋白胨、0.1wt％酵母粉、0.5wt％褐藻酸钠、1.5wt％琼脂，人工海水配制，pH6.5。

LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

LB固体平板：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

实施例1：极地褐藻酸裂解酶C3编码基因序列的获取及其序列分析

菌种来源：菌株Psychromonassp.C3分离自北极黄河站采集的海带样品。一株冷单胞菌Psychromonassp.C-3，2015年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号CCTCCM2015748。

具体步骤如下：

1.1菌株的筛选

将海带样品放入富集培养基中培养，再用灭菌海水梯度稀释涂布于分离培养基平板。选取生长良好的菌落进行纯培养。取纯培养菌株，点种于分离培养基平板上，15℃培养48h，测定菌株的直径。然后加入5mL质量浓度为10％的西吡氯铵溶液，轻轻旋转平板使溶液均匀铺满整个平皿，静置10min充分染色，然后用清水冲洗培养基表面去除西吡氯铵溶液，测定透明圈的直径，并计算透明圈与菌落的直径比。

1.2极地褐藻酸裂解酶C3基因序列的确定

选取固体平板上产生透明降解圈的菌株C3，大量提取其基因组DNA：

(1)培养100ml细菌培养物至饱和状态，质量浓度为3％NaCl溶液洗菌体2次；

(2)沉淀物加入5ml质量浓度为3％NaCl溶液，用吸管反复吹打使之重悬；

(3)加入10mlTE，轻晃混匀；

(4)加入溶菌酶，使其终浓度为1mg/ml，37℃作用1～2h；

(5)加入质量浓度为20％SDS和20mg/mL蛋白酶K至终浓度0.1mg/ml，55℃温育3h；

(6)向菌体中加入65℃预热的CTAB/NaCl溶液4ml，65℃温育20min；

(7)加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)震荡10min后离心，抽提1次，上清液再用等体积氯仿抽提1次；

(8)向上清中加入2倍体积预冷的无水乙醇，用玻璃棒将DNA搅丝；

(9)DNA用质量浓度为70％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，稍干后溶于适量0.1×SSC中，用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度后置于4℃冰箱保存(可于-20℃长期保存)。

经全基因测序后通过对其基因注释，得到可能编码褐藻酸裂解酶的基因c3。该基因861bp，其中含有一个861bp的开放阅读框架，其编码极地褐藻酸裂解酶C3，起始密码子位于1bp，终止密码子位于859bp，共编码286个氨基酸的蛋白。获得的基因c3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

实施例2：褐藻酸裂解酶C3的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR对极地褐藻酸裂解酶c3基因序列进行扩增

(1)根据极地褐藻酸裂解酶c3基因序列设计两条特异性引物：

C3F:GGAATTCCATATGAATGTTCAGTTTTCTAATCAAGATG(SEQIDNO.3)，用下划线标出的是NdeI酶切位点；SEQIDNO.3

C3R:CCGCTCGAGTTATTTAGTTTCTAACGCTTTATATTC(SEQIDNO.4)，用下划线标出的是XhoI酶切位点；SEQIDNO.4

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(2)以C3F和C3R为引物，以菌株C3的DNA为模板，用FastPfuDNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；

PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约800bp的DNA片段(如图1)。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)用限制性内切酶NdeI和XhoI对回收片段和质粒pET22b分别进行双酶切反应。酶切结束后，对酶切产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段和载体片段。将经过双酶切的c3基因片段连接到pET22b载体上，16℃过夜连接。

(5)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(6)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(7)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒，进行NdeI/XhoI双酶切，通过酶切验证正确的质粒送北京华大基因公司测序。

上述LB固体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

上述LB液体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

2.2重组表达载体pET22b-c3转化到大肠杆菌BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将测序正确的重组载体pET22b-c3转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3极地褐藻酸裂解酶c3基因在大肠杆菌中诱导表达与纯化

(1)在平板上刮取大片菌苔，接于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～3h；

(2)按1％(v/v)接种量转接到1,000ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG至终浓度为0.4mM，继续在15℃摇床培养18h；

(3)收集经过IPTG诱导表达的LB培养液，9,000rpm离心5min，收集菌体；

(4)用含100mMNaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)悬浮菌体；

(5)将重新悬浮的菌液进行压力破碎；

(6)将破碎后的菌液12,000rpm离心1h，收集上清液；

(7)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(8)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得褐藻酸裂解酶C3的电泳纯酶(如图2)。通过分子筛层析除去咪唑，最后置于-20℃保存备用，制得极地褐藻酸裂解酶C3。

实施例3：极地褐藻酸裂解酶C3的性质测定

3.1最适温度及温度稳定性分析

标准反应为：

80μl5mg/l的褐藻酸钠(购自Sigma公司)底物与100μl浓度为50mMTris-HCl(pH8.0)混合液于20℃预热5min后，加入20μl稀释好的浓度为1mg/ml的极地褐藻酸裂解酶C3酶液并于20℃反应30min，沸水浴5min终止反应。测定OD₂₃₅值，以不加酶液的反应作为空白对照。酶活力单位(U)定义为：一定温度下每分钟产生产物使235nm处的吸收值增加0.1所需要的酶量。

最适反应温度的测定：以褐藻酸钠为底物，在25mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中，分别检测极地褐藻酸裂解酶C3在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃下的酶活。最高酶活定义为100％。

结果表明该酶的最适酶活温度为20℃(如图3A)。

温度稳定性分析：酶液分别在20℃、30℃和35℃下温育，取相同的酶量温育不同的时间检测褐藻酸裂解酶C3在20℃、25mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中的残余活力。0℃酶活定义为100％。

结果表明，低于30℃条件下，褐藻酸裂解酶C3能稳定存在，在35℃条件下变得不稳定，在35℃温育30min后，残余酶活力不到40％(如图3B)。

3.2对NaCl的耐受性分析

向反应体系分别加入不同浓度的NaCl，终浓度分别为0、0.5M、1.0M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M，分别测定不同NaCl浓度条件下的酶活，以不加NaCl的酶活做为空白对照，将最高的酶活定义为100％。

结果表明该酶是耐盐酶。C3酶活受NaCl的激活；当盐浓度高达3.0M时，C3酶活仍高于无NaCl时的酶活力(如图4)。

3.3最适pH分析

配制pH值在5.0～11.0范围内、间隔1个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定褐藻酸裂解酶C3在20℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。

结果表明褐藻酸裂解酶C3最适pH为8.0(如图5)。

3.4底物特异性分析

以三种底物褐藻酸钠、聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸于20℃，25mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中与褐藻酸裂解酶C3分别反应，比较酶对不同底物的活性大小，分析酶的底物降解偏好性。最高酶活定义为100％。

结果表明该酶是PM特异性。

4.结果

利用CTAB/NaCl法提取了Psychromonassp.C3的基因组DNA。通过全基因测序及基因注释分析得到一个861bp的开放阅读框编码褐藻酸裂解酶C3的基因c3的核酸序列，并通过PCR扩增得到该基因的DNA片段(图1)。将基因c3在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得有活性的属于多糖裂解酶第七家族的褐藻酸裂解酶C3(图2)。该酶最适酶活温度为20℃，在0℃时仍能保持30％以上的酶活(图3)，具有显著的盐激活且耐盐的特点(图4)，最适pH为8.0(图5)，对甘露糖醛酸段有特异性降解(图6)。因此，基因c3编码的褐藻酸裂解酶C3是一个新型适冷耐盐的褐藻酸裂解酶。

Claims (6)

1.一株冷单胞菌(Psychromonassp.)C-3，2015年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号CCTCCM2015748。

2.一种由权利要求1所述冷单胞菌Psychromonassp.C-3褐藻酸裂解酶基因c3，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

3.权利要求2所述褐藻酸裂解酶基因c3编码的褐藻酸裂解酶C3，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。

5.一种重组细胞，该宿主菌包含有权利要求4所述重组表达载体或表达权利要求3所述褐藻酸裂解酶C3。

6.权利要求3所述褐藻酸裂解酶C3和/或权利要求2所述褐藻酸裂解酶基因c3在食品和医药领域的应用。