CN112695037B

CN112695037B - Egfr特异性的核酸适配体及其应用

Info

Publication number: CN112695037B
Application number: CN202011331042.5A
Authority: CN
Inventors: 董肇楠; 渠香云; 蒋晓旭; 陈雅琪; 王弢
Original assignee: Jiangsu Microdiag Biomedicine Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Microdiag Biomedicine Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN112695037A

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种EGFR特异性的核酸适配体及其应用。可用本发明所提供的核酸适配体获得EGFR阳性EVs和细胞。富集得到的EVs结构完整，保持活性，均匀分散，且纯度高，可有效去细胞残留蛋白(HCP)和脂质体、核酸小分子等杂质，并且回收率稳定、重复性好，操作简单、流速快，可在3h内完成EVs的提取。在捕获细胞方面，同样具有操作简便、捕获效率高等特点。相对于传统技术采用抗体进行捕获，本发明采用核酸适配体EVs和细胞特异性更好，并且捕获效率更高。

Description

EGFR特异性的核酸适配体及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种EGFR特异性的核酸适配体及其应用。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由细胞分泌到细胞外的20nm～1000nm大小的膜囊泡结构群体，广泛分布于细胞培养上清以及各种体液(血液、尿液、唾液等)。EVs主要由蛋白质，核酸以及磷脂分子组成，作为细胞与细胞间遗传物质与信息的传递者。

如何去除红细胞和白细胞及其他器官组织等背景来源的细胞外囊泡的干扰，获得肿瘤组织来源的细胞外囊泡(主要是细胞外囊泡)，是提高细胞外囊泡用于肿瘤诊断检测的关键。目前，抗原/抗体免疫亲和作用原理，采用生物标志物抗体，捕获膜表面上表达这些标志物的细胞外囊泡，是较为成熟的分离肿瘤来源细胞外囊泡的方法。然而使用抗体包被磁珠捕获技术，存在回收率低、成本高、使用条件复杂、细胞外囊泡难以有效洗脱，肿瘤异质性妨碍免疫识别，抗原表位可能被阻断或掩盖等因素；并且基质的非特异性吸附会导致获得的细胞外囊泡中存在杂蛋白和游离核酸等干扰。

因此，如何快速、高效获得EGFR阳性肿瘤来源细胞外囊泡，对于细胞外囊泡在肿瘤疾病中的研究和应用至关重要。

发明内容

本发明涉及一种核酸适配体(Aptamer)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4中的至少一项所示。

本发明还请求保护所述核酸适配体的的互补链。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及用于分离EGFR或表面包含EGFR的物质的层析介质，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的配基，所述配基为如上所述的核酸适配体。

本发明还涉及层析分离装置，其含有权利要如上所述的层析介质。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及从液相组合物中移出EGFR或表面包含EGFR的物质的方法，包括：

用如上所述的层析介质与所述液相组合物共孵育，以使所述核酸适配体能够与所述EGFR或表面包含 EGFR的物质结合，并用如上所述的互补链进行洗脱；

所述表面包含EGFR的物质包括细胞外囊泡或细胞。

本发明还涉及一种用于分离EGFR或表面包含EGFR的物质的试剂盒，其含有如上所述的核酸适配体以及如上所述的互补链。

本发明的有益效果为：

可用本发明所提供的核酸适配体获得EGFR阳性EVs和细胞(例如循环肿瘤细胞)。富集得到的EVs 结构完整，保持活性，均匀分散，且纯度高，可有效去细胞残留蛋白(HCP)和脂质体、核酸小分子等杂质，并且回收率稳定、重复性好，操作简单、流速快，可在3h内完成EVs的提取。在捕获细胞方面，同样具有操作简便、捕获效率高等特点。相对于传统技术采用抗体进行捕获，本发明采用核酸适配体EVs和细胞特异性更好，并且捕获效率更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中利用核酸适配体偶联的树脂载体捕获分离特异细胞外囊泡的原理示意图；

图2为本发明一个实施例中对与载体(磁珠/树脂)偶联的生物素化EGFR Aptamer1和阴性Aptamer 的检测结果；

图3为本发明一个实施例中捕获富集细胞外囊泡的电镜图；

图4为本发明一个实施例中EGFR适配体捕获肺癌血浆及阳性细胞培养上清细胞外囊泡后的流式检测结果；A:JK细胞外泌体；B:A549细胞外泌体；C:肺癌血浆外泌体；

图5为本发明一个实施例中适配体Aptamer捕获EGFR阳性细胞外囊泡免疫荧光验证；

图6为本发明一个实施例中不同处理时间下添加EGFR阳性细胞外囊泡对细胞增殖的影响；

图7为本发明一个实施例中EGFR适配体捕获细胞外囊泡核酸RNA检测分析验证结果图；

图8为本发明一个实施例中不同浓度抗体/适配体与EGFR阳性细胞结合验证结果；横坐标指抗体或适配体浓度，纵坐标指对应的结合的细胞浓度(OD值)；

图9为本发明一个实施例中采用WB对EGFR适配体Aptamer捕获的细胞蛋白表达检测；

M：Protein Marker；1：阳性细胞A549(阳控)；2：阳性细胞A549 EGFR适配体Aptamer捕获组； 3：阳性细胞A549 EGFR抗体捕获组；4：阳性细胞A549与裸磁珠(阴控)组；5：阴性细胞Jurkat(阳控)；6：阴性细胞Jurkat EGFR抗体捕获；7：阴性细胞Jurkat EGFR适配体Aptamer捕获组；8：阴性细胞Jurkat与裸磁珠(阴控)组；

图10为本发明一个实施例中通过WB对阳性适配体捕获EGFR阳性细胞与同类型适配体对比结果；

图11为本发明一个实施例中对EGFR Aptamer 1～4捕获细胞进行EGFR和CD81双荧光检测的结果；

图12为本发明一个实施例中使用Cell-Tracker荧光探针检测EGFR Aptamer 1～4捕获到的CTC细胞；

图13为本发明一个实施例中EGFR适配体捕获不同类型样本(血液、胸腹水、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)中肺肿瘤来源EGFR阳性细胞外囊泡的检测结果；

图14为本发明一个实施例中以miR-16作为内参PCR检测血浆中细胞外囊泡标志物miR-21相对表达量。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及一种核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4中的至少一项所示。

本发明还请求保护所述核酸适配体的的互补链。

在一些实施方式中，如上所述的核酸适配体或如上所述的互补链经过修饰以增加RNA的稳定性和/或增强与靶标的亲合力。

在一些实施方式中，用于增加RNA的稳定性的修饰包括2'-F RNA核苷酸修饰和/或2’-氟嘧啶修饰；

在一些实施方式中，用于增强与靶标的亲合力的修饰包括二硫代磷酸酯骨架修饰、脱氧核糖核酸、正电修饰及氨基酸侧链修饰中的至少一种。

在一些实施方式中，如上所述的核酸适配体或如上所述的互补链还具有如下标记中的至少一种：荧光团、比色标记、量子点、生物素、用于拉曼衍射成像的炔烃基团、用于click反应的环烯烃、用于聚合物标记的引发基团、多肽/蛋白分子、LNA/PNA、非天然氨基酸及其类似物、非天然核酸及其类似物或者纳米结构；

所述纳米结构包括无机纳米颗粒、NV-center、聚集/组装诱导发光分子、稀土离子配体分子、多金属氧簇。

如本文所用的术语“标记”指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记包括但不限于染料；放射性标记，诸如³²P；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

在一些实施方式中，所述标记是荧光团、比色标记、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发集团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。

在一些实施方式中，所述标记是荧光团。

在一些实施方式中，所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。

在一些实施方式中，所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等。

在一些实施方式中，所述罗丹明类染料包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明 (TAMRA)等。

在一些实施方式中，所述菁染料主要选自两类，一类是噻唑橙(thiazole orange,TO)、噁唑橙(oxazole orange,YO)系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。

在一些实施方式中，荧光团还可以选择下述染料：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。

荧光团通常标记在引物或探针序列的5'端，但通过改变修饰键(例如-OH或-NH键)也可以将其置于 3'端。

基体支持物可以是任何形状，例如基本球形，基本立方体形等。

在一些实施方式中，所述基体支持物为颗粒状，颗粒尺寸范围为1μm～500μm。

在一些实施方式中，颗粒尺寸范围为1μm～300μm；也可以选择2μm、5μm、10μm、20μm、50μm、 100μm、200μm。

进一步的，所述基体支持物可为无孔的。“无孔”是指基体支持物没有明显可以测量到的孔，例如

在优选的实施方式中，基体支持物是多孔的。

在一些实施方式中，孔径为

也可以选择

在一些实施方式中，所述基体支持物包括琼脂、琼脂糖、磁珠、二氧化硅、二氧化钛、藻酸盐、纤维素、葡聚糖、淀粉、环糊精、壳聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、***胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、聚丙烯酰胺凝胶、肝硫酯、明胶、硅胶、陶瓷、玻璃、树脂中的任一种，或任意几种形成的共聚物。

在一些实施方式中，所述树脂的活性基团包括聚氨酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇对苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的任一种，或任意几种的混合物或共聚物。

层析分离装置种类较多，包括但不限于以下种类：SPE固相萃取柱，带分离膜的离心管，分离膜 (membranes)，快速检测生物芯片(bio-chips)，微孔芯片，纤维束柱。

用如上所述的层析介质与所述液相组合物共孵育，以使所述核酸适配体能够与所述EGFR或表面包含 EGFR的物质结合，并用如上所述的互补链进行洗脱。

在一些实施方式中，所述基体支持物为树脂微球，其在共孵育体系中的浓度≥1.8×10⁷Resin/mL，优选≥2.0×10⁷Resin/mL，更优选为(1.8～2.2)×10⁷Resin/mL。

在一些实施方式中，所示树脂微球为一种固化重组高容量链霉亲和素琼脂糖树脂，每毫升可结合超过10mg的生物素标记蛋白。

在一些实施方式中，所示树脂微球为SA-Resin树脂(Thermo)。

在一些实施方式中，所述基体支持物为磁珠，其在共孵育体系的浓度≥4.8×10⁷beads/mL，优选≥5.0×10⁷ beads/mL，更优选(4.8～5.2)×10⁷beads/mL。

在一些实施方式中，所述核酸适配体在共孵育体系中的浓度≥180nM，优选≥200nM，更优选180nM ～220nM。

在一些实施方式中，所述互补链在进行洗脱时的浓度≥0.9μM，优选≥1μM，更优选0.9μM～1.1μM。

在一些实施方式中，所述共孵育的时间≥0.9h，优选≥1h，更优选0.9h～1.1h。

在一些实施方式中，所述表面包含EGFR的物质为细胞外囊泡或细胞。

在本发明中，细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)通常为20-1000nm大小的膜囊泡结构群体，其可包括细胞外囊泡(exosomes)、微泡(microvesicles)和凋亡小体(apoptosis body)等。

在一些实施方式中，所述细胞为肿瘤细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为循环肿瘤细胞。

在一些实施方式中，所述液相组合物为细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、胸腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、尿、***、***分泌物、黏液、唾液、痰；或者它们的稀释液/裂解液。

所述液相组合物可以是新鲜的或事先冷冻的，然后解冻。

液相组合物的来源优选的实例为大鼠、小鼠或人类，其用于制备分别为大鼠、小鼠或人类的细胞胞外囊泡；更优选的，所述液相组合物来源于人类。

在一些实施方式中，当所述液相组合物用于检测细胞外囊泡时，所述组合物在基本上不破坏EVs形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原的条件下被分离；EVs的富集方式可通过密度梯度离心、分子色谱排阻(SEC)法、超速离心、超滤、聚乙二醇沉淀和试剂盒提取等进行。

在一些实施方式中，所述核酸适配体单独包装。

在一些实施方式中，所述核酸适配体包被于固相载体上；进一步地所述固相载体可为聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等材质；载体的形式可以是试管、EP管、多孔板(特别是酶标板)、微量反应板凹孔、小珠(特别是磁珠)、小圆片等。

在一些实施方式中，所述核酸适配体固定于如上所述的层析介质上。

在一些实施方式中，所述核酸适配体固定于如上所述的层析分离装置上。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

本发明实施例中所用的核酸适配体及释放剂序列如下表所示。

1、特异细胞外囊泡捕获分离方法

1.1样品前处理并获得总细胞外囊泡

利用PEG沉淀或分子色谱排阻(SEC)法或超速离心法等从样本(血液、尿液、胸腹水、细胞上清、肺泡灌洗液等)中提取纯化出总细胞外囊泡。具体步骤如下：

1.1.1 PEG沉淀法富集总细胞外囊泡

500μL血清/血浆加入120μL PEG8000沉淀剂，250μL胸腹水加入60μL PEG8000沉淀剂；上下颠倒5 次混匀后，在4-8℃静置30分钟；然后13000rpm离心2分钟，吸弃上清留沉淀，加入100μLPBS重悬混匀，即得到总细胞外囊泡。

1.1.2分子色谱排阻(SEC)法富集总细胞外囊泡

预处理后的样本，加入到平衡后的SEC柱内，待样本混合液完全进入凝胶后，向柱中加入PBS并收集流出液，然后将收集到的洗脱液加入到超滤管中，12000g离心5min(5000g,10min)，超滤浓缩即可富集到的总细胞外囊泡。

样本上样量为：血清/血浆500μL(用PBS稀释至1mL)、尿液20mL、胸腹水500μL、细胞上清液20mL、肺泡灌洗液5mL。

1.1.3超速离心法富集总细胞外囊泡

预处理后的样本，采用超速离心法(4℃，120000g离心4h)，沉淀用100μLPBS重悬混匀，即得到总细胞外囊泡。

1.2核酸适配体识别、分离特异细胞外囊泡

1.2.1核酸适配体合成

根据上表的序列合成EGFR阳性适配体、EGFR阴性适配体对照、竞争性洗脱剂。

1.2.2制备核酸适配体修饰的载体：

(1)载体修饰步骤：

利用末端修饰有生物素的核酸适配体与表面修饰有链霉亲和素的载体(SA-树脂或磁珠)为反应体系，反应体系中树脂浓度为1×10⁶-1×10⁷个/mL，磁珠浓度为1×10⁷-1×10⁸个/mL；核酸适配体浓度20-500nM, 缓冲液(PBS加入3％BSA)200μL，室温旋转(10转/min)混匀30-60min共温育。

树脂法3000-5000×g离心1min，弃上清；磁珠法将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。

然后再用缓冲液(PBS加入3％BSA)500μL清洗2次去除游离核酸适配体：树脂法3000-5000×g离心1min，弃上清；磁珠法将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。

(2)载体修饰效果：

1)评价方法：针对EGFR的4种适配体的RNA序列设计PCR扩增通用引物(Aptamer F、Aptamer R) 和对RNA适配体进行逆转录的引物Aptamer RT，将适配体、修饰上适配体的磁珠、裸磁珠分别稀释为等体积溶液，采用下述引物和反应体系去扩增：

①引物序列

引物名称	引物序列(5'--3')
		阳性Aptamer F(通用)	CGGCCGCUAUAAUGCACGGA
阳性Aptamer R(通用)	ACTGTGTCTGCCTACACGGTT
		阳性Aptamer RT(通用)	TGTCTGCCTACACGGTTCC
阴性Aptamer F	GCAGUCCCACAUACUCGACA
		阴性Aptamer R	AGTGTCTCGTCTGACAGCGTT
阴性Aptamer RT	TGTCTCGTCTGACAGCGTTCG

②反转录RT体系：

反转录程序：冰上，5min；PCR仪上：42℃，60min；85℃，5min

反转录产物cDNA稀释10000倍后上机PCR验证。

如图2及下表所示：载体(磁珠/树脂)均可与生物素化的EGFR Aptamer 1和阴性Aptamer偶联，同样PCR检测到EGFR Aptamer 2/3/4均可与载体(磁珠/树脂)偶联。

1.2.3修饰有核酸适配体的载体识别、捕获细胞外囊泡

1)将上述修饰有核酸适配体的载体介质(树脂或磁珠)与样本细胞外囊泡混合、混匀(样本为经过 PEG沉淀法或分子色谱排阻(SEC)法或超速离心法获得的总细胞外囊泡)补充缓冲液(PBS加入3％BSA) 至200μL体系。

2)4℃、旋转敷育1h(10转/min)。

2)树脂法3000-5000×g离心1min，弃上清；磁珠法将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。

3)然后再用缓冲液(PBS加入3％BSA)500μL清洗3次去除未结合的细胞外囊泡：树脂法3000-5000×g 离心1min，弃上清；磁珠法将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。得到核酸适配体载体(树脂或磁珠)与特异细胞外囊泡复合物。

1.2.4特异细胞外囊泡分离释放

利用核酸适配体的竞争洗脱剂(完全互补链)替换释放细胞外囊泡：

(1)将上述得到的细胞外囊泡复合物样本加入缓冲液(pH 7.4的PBS)至100μL；

(2)加入核酸适配体的竞争洗脱剂(完全互补链)，洗脱剂终浓度为0.5-1.0μM；

(3)37℃旋转敷育0.5h；

(4)树脂法3000-5000×g离心1min，吸取上清；磁珠法将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离。上清即为得到完整分散的特异细胞外囊泡。

1.3核酸适配体捕获EGFR阳性细胞外囊泡效果验证

1.3.1 EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡电镜分析

将按照1.1-1.2获得的细胞外囊泡进行电镜检测(exosome TEM)(服务外包)，分析细胞外囊泡的大小、形态等。

如图3：细胞外囊泡捕获富集细胞外囊泡电镜观察：细胞外囊泡膜结构完整，粒径范围(80-10nm)，符合经典细胞外囊泡文献报道。

1.3.2 EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡流式分析

将按照1.1-1.2获得的细胞外囊泡采用流式荧光检测，分析细胞外囊泡蛋白标志物CD-63荧光。

如图4及下表所示：EGFR适配体捕获血液及阳性细胞培养上清细胞外囊泡后，经流式检测，均检测到细胞外囊泡标志物CD-63表达。

1.3.3 EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡荧光分析

将按照1.1-1.2获得的细胞外囊泡同时敷育EGFR和CD81的一抗+荧光二抗，用于荧光显微检测 EGFR+CD81双染模式下是否同时表达EGFR和细胞外囊泡标志物CD81；另外设置裸树脂SA-Resin(对照)为实验组3，具体步骤如下：

1)上述捕获样本加入EGFR和CD81对应一抗，4摄氏度旋转温育1h；

2)4000g离心1min，弃上清，PBS洗涤两次；

3)加入对应荧光二抗，4摄氏度旋转温育1h；

4)4000g离心1min，弃上清，PBS洗涤两次；

5)200μL PBS重悬，转移至孔板中；

结果参见图5，根据图中显示可以看出：阳性适配体EGFR Aptamer 1捕获组可明显观测到EGFR和 CD81双荧光，而阴性适配体捕获组及裸SA-Resin背景对照，均未观测到荧光；说明EGFR阳性适配体捕获到的是细胞外囊泡(因为CD81呈阳性)、且为EGFR阳性的细胞外囊泡。

从上述三个评价方法可以看出，EGFR适配体可以特异性的与EGFR阳性细胞外囊泡结合，从而实现捕获、分离。

1.3.4 EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡活性分析

(1)按照1.1-1.2操作方法从肺癌样本中获得EGFR阳性细胞外囊泡；

(2)采用MTT技术，将EGFR阳性细胞外囊泡与THP-1细胞共培养，通过细胞增殖情况验证捕获到的阳性细胞外囊泡活性。MTT试验步骤：

①铺板：胰酶消化对数期细胞，细胞计数调整浓度至5×10^4/mL，将混合好的细胞悬液分装到6孔板中，每孔加2mL。试验分为三组：空白组，孔中加入2mL完全培养基；对照组，孔中加入细胞悬液；试验组，孔中加入细胞悬液和细胞外囊泡，共3块6孔板。

②细胞培养：将6孔板放入CO₂恒温培养箱培养。

③分别在8h，16h，24h对6孔板进行处理，每孔加入200μL MTT(5mg/mL)溶液，继续培养4-6h。

④弃培养基，加入150μL DMSO，至于摇床低速震荡10min，溶解沉淀。

⑤在酶标仪检测490nm波长处各个处理组的OD值。

结果如图6显示：在0h空白试验和对照组基本无差异，随着培养时间增加(8h至16h)试验组细胞开始生长速度加快；至24h时试验组细胞增殖显著高于对照组。说明EGFR阳性细胞外囊泡可促进细胞生长，进而说明所捕获到的阳性细胞外囊泡具有活性。

2、特异细胞外囊泡捕获分离体系优化

2.1实验例和对比例的捕获体系

2.1.1实验例捕获体系载体用量优化

各捕获体系分组除载体用量外其他参数均一致，本发明其他参数优化实验若非特别强调均为单一变量分析实验。

(1)采用超速离心方法获得A549细胞(肺癌)上清总细胞外囊泡，等分为5份；

(2)采用相同量EGFR Aptamer 1(100nM)与不同量(1×10⁷至1×10⁸个/mL)SA-Resin树脂(Thermo) 偶联后分别捕获上述对应细胞细胞外囊泡；用相同量EGFR Aptamer 1(100nM)与不同量(1×10⁷至9×10⁷个/mL)磁珠(Thermo)偶联后分别捕获上述对应细胞细胞外囊泡

(3)采用化学发光法检测细胞外囊泡蛋白标志物(CD-81)，验证捕获体系捕获效果。

化学发光法蛋白定量检测步骤

a.包板

化学发光板100μl/孔4℃过夜包板；

洗板机1×PBST洗板1次，拍干；

酶标板稳定剂Ⅰ200μl/孔，37℃，2h；

甩去酶标板稳定剂Ⅰ，拍干，37℃烘干，30min，铝箔袋封装；

b.检测

标曲、待检样本100μl/孔，37℃，1h；

洗板机1×PBST洗板3次，拍干；

抗体100μl/孔，37℃，1h；

洗板机1×PBST洗板3次，拍干；

化学发光A、B液1：1混合，100μl/孔，Lumo上机检测

(4)提取纯化细胞外囊泡总RNA，然后RT-PCR检测细胞外囊泡miRNA(miR-16)表达量，分析。

①反转录RT体系、程序同1.2.2；

②qPCR检测体系：

热循环程序：

结果如下表所示：当树脂量达到2×10⁷Resin/mL时既已达到了饱和状态。同理验证捕获磁珠量达到 5×10⁷beads/mL左右时也达到了饱和状态。

2.1.2抗体捕获分离特异细胞外囊泡

2.1.2.1制备抗体修饰的载体：

1)利用末端修饰有生物素的抗EGFR抗体(厂家abcam，货号ab85987)与表面修饰有链霉亲和素的磁珠为反应体系，反应体系中磁珠浓度为1×10⁷-1×10⁸个/mL，缓冲液(PBS加入3％BSA)200μL，室温旋转(10转/min)混匀30-60min共温育。

2)温育完成后将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。

3)加入500μL的洗涤缓冲液(PBS加入3％BSA)，颠倒充分混匀，洗涤沉淀磁珠2-3次，以除去非特异性吸附的抗体，得到修饰有抗体的用于识别捕获细胞外囊泡特异标志物的免疫磁珠。

2.1.2.2修饰有抗体的载体识别、捕获细胞外囊泡

1)将上述修饰有抗体的免疫磁珠与样本混合、混匀(样本为经过物理法PEG沉淀、超速离心、SEC 等富集的总胞外囊泡)

2)4℃、旋转敷育1h(10转/min)。

3)温育完成后将样品放置在磁力架上1分钟，进行磁分离，去掉上清液。

4)加入500μL的洗涤缓冲液(PBS加入3％BSA)，颠倒充分混匀，洗涤沉淀磁珠2-3次，以除去非特异性吸附的细胞外囊泡，得到免疫磁珠与特异细胞外囊泡复合物。

2.1.2.3特异细胞外囊泡分离释放

1)上述磁珠与特异细胞外囊泡复合物，加入洗脱液(50mM HAc-Na、150mM NaCl pH2.9)200μL，震荡反应10min，

2)4℃、旋转敷育30min(10转/min)。

3)温育完成后将样品放置在磁力架上静止3min沉淀，然后吸取上清液，即得到特异细胞外囊泡。

2.2捕获体系树脂载体选择

(1)采用超速离心方法获得A549细胞(肺癌)上清总胞外囊泡外泌体，等分为10份；

(2)采用相同量EGFR Aptamer 1(100nM)与不同类树脂型(如下表)，与树脂选择饱和状态量(5×10⁷个/mL)偶联后分别捕获上述对应细胞外泌体；

树脂类型	厂家
		<![CDATA[PurKine<sup>TM</sup>生物素标签链霉亲和素树脂(6％交联)]]>	Abbkine
Immobilized Biotin Resin(Settled Resin)	HZBscience
		Pierce Streptavidin Plus UltraLink Resin(SA Resin树脂)	Thermo
Biotin Agarose Resin	齐岳生物
		琼脂糖凝胶树脂(生物素化)	索莱宝

(3)采用化学发光法检测外泌体蛋白标志物(CD-81)，验证捕获体系捕获效果。

化学发光法蛋白定量检测步骤(同上)

a.包板

化学发光板100μl/孔4℃过夜包板；

洗板机1×PBST洗板1次，拍干；

酶标板稳定剂Ⅰ200μl/孔，37℃，2h；

甩去酶标板稳定剂Ⅰ，拍干，37℃烘干，30min，铝箔袋封装；

b.检测

标曲、待检样本100μl/孔，37℃，1h；

洗板机1×PBST洗板3次，拍干；

抗体100μl/孔，37℃，1h；

洗板机1×PBST洗板3次，拍干；

化学发光A、B液1：1混合，100μl/孔，Lumo上机检测

(4)提取纯化外泌体总RNA，然后RT-PCR检测外泌体miRNA(miR-16)表达量，分析。(同上)

①反转录RT体系、程序同1.2.2；

②qPCR检测体系：

热循环程序：

结果如下表所示：与SA Resin树脂(Thermo)相比，Immobilized Biotin Resin(Settled Resin)树脂可达到类似捕获效果，但其裸树脂存在大量非特异吸附问题(即特异性较差)，而其他厂家类型树脂捕获效果明显低于SA Resin树脂(Thermo)，且均存在一定非特异吸附问题。综合评价显示，SA Resin树脂 (Thermo)在捕获效果及特异性方面明显优于其他类型树脂。

2.3捕获体系适配体用量优化

采用相同量SA-Resin树脂(2×10⁷Resin/mL)(Thermo)与不同量EGFR Aptamer 1(50-1000nM)偶联后分别捕获细胞细胞外囊泡，方法同2.1。

结果如下表所示：当树EGFR Aptamer 1量达到200nM时既已达到了饱和状态。同理验证当EGFR抗体量达到3μg/mL时也可达到最佳捕获效果。

2.4捕获体系孵育时间优化

采用2×10⁷个Resin/mLSA-Resin树脂(Thermo)与200nM EGFR Aptamer 1偶联后分别捕获细胞细胞外囊泡，方法同步骤2.1。

结果如下表所示：当树脂-适配体捕获温育时间在1h左右时既已达到了较佳捕获效率。同理验证当树脂-EGFR抗体获温育时间在1h左右时达时也可到了最佳捕获效果。

2.5捕获载体对比筛选

考虑到不同载体粒径大小(比表面积越大，相应与靶标结合的位点越多)及材质差异，可能会对捕获体系的捕获效率产生不同影响，所以选择1款大粒径(SBI)9.1μm Exo-Flow磁珠与SA-Resin树脂(Thermo) 进行对比捕获验证，同时对比EGFR适配体与抗体捕获细胞外囊泡效果。

验证方法与步骤如下：

采用超速离心方法获得肺癌A549细胞上清总细胞外囊泡

采用树脂和磁珠(均分别与EGFR适配体1和抗体偶联)同时捕获样本中EGFR阳性细胞外囊泡(方法同上)

组合试剂	用量
		SA-Resin树脂	<![CDATA[2×10<sup>7</sup>个Resin/mL]]>
磁珠	<![CDATA[5×10<sup>7</sup>beads/mL]]>
		EGFR适配体	200nM
EGFR抗体	3μg/mL

2)采用化学发光法检测细胞外囊泡蛋白标志物(CD-81)，验证捕获体系捕获效果(方法同上)。

3)采用RT-PCR检测细胞外囊泡miRNA(miR-16)表达量，分析(方法同上)。

结果如下表所示：实验组EGFR适配体1与树脂组合捕获后，可检测到最高的CD81蛋白浓度，并且通过RT-PCR检测到Exo-GAPDH的表达量也是最高，即说明EGFR Aptamer 1与树脂组合可捕获到EGFR 阳性细胞外囊泡并且是最优的组合。

2.6捕获体系洗脱剂用量优化

验证方法如下：

1)采用超速离心方法获得肺癌A549细胞上清总细胞外囊泡

2)采用SA-Resin树脂(2×10⁷个Resin/mL)(Thermo)与同量适配体1(200nM)(偶联后分别捕获上述对应细胞细胞外囊泡

3)利用不同量核酸适配体的竞争洗脱剂1(EGFR适配体1的完全互补链)替换释放细胞外囊泡(方法同上)。

4)采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测(外送服务外包)，确定不同样本类型捕获到的EGFR阳性细胞外囊泡分散性、粒径大小及分布情况

结果如下表所示：当洗脱剂1浓度c达到1μM左右时，即可达到对EGFR阳性细胞外囊泡最佳的洗脱效率。同样对应于EGFR Aptamer 2/3/4，当洗脱剂2/3/4浓度在1μM左右时，也可达到最佳的细胞外囊泡洗脱效率。

3特异细胞外囊泡捕获分离体系性能评价

3.1 EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡的纯度

采用步骤1的方法分别制备经EGFR适配体捕获前和捕获后的血液细胞外囊泡，通过NTA测得的细胞外囊泡浓度与BSA测得的总蛋白含量的比值，分析EGFR适配体捕获前后细胞外囊泡的纯度。

结果如下表所示，血液总细胞外囊泡样本经EGFR适配体捕获后蛋白质中颗粒含量远远高于捕获前，纯度提高了73倍。说明EGFR适配体捕获体系可有效去除(红细胞和白细胞)干扰背景来源的细胞外囊泡，以及去除杂蛋白(白蛋白)干扰，保证了细胞外囊泡纯度。

3.2 EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡体系捕获下限

采用实施例1的方法制备A549细胞上清总细胞外囊泡，然后10倍梯度稀释至细胞外囊泡浓度为 10E+10～10E+5 particles/mL，采用步骤2优化所得最优条件进行捕获。采用化学发光法检测细胞外囊泡蛋白标志物(CD-81)，验证捕获体系捕获效果(方法同上)。

		CD81蛋白化学发光法检测
			编号	分组	C(pg/mL)
1	总细胞外囊泡10E+10particles/mL	628837
			2	总细胞外囊泡10E+9particles/mL	73445
3	总细胞外囊泡10E+8particles/mL	11036
			4	总细胞外囊泡10E+7particles/mL	2734
5	总细胞外囊泡10E+6particles/mL	424
			6	总细胞外囊泡10E+5particles/mL	376
7	裸磁珠(阴性对照)	397
			8	裂解液对照(阴性对照)	342

如上表所示，EGFR适配体捕获体系可捕获到的细胞外囊泡下限约为1×10⁶particles/mL，而细胞外囊泡10⁶particles/mL浓度以下检测结果与阴性对照组无差异。

3.3 EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡体系稳定性

3.3.1细胞外囊泡蛋白层面评价

采用步骤1的方法制备血液细胞外囊泡，采用化学发光法检测细胞外囊泡蛋白标志物(CD-81)，通过考察捕获体系批间CV值来评价捕获体系的稳定性。

结果如下表所示：EGFR适配体捕获体系批间变异度CV值<3％，表明捕获体系具有很强的稳定性和可重复性。

3.3.2细胞外囊泡的核酸层面评价

采用步骤1的方法制备血液细胞外囊泡，采用miRNeasy mini kit提取纯化细胞外囊泡总miRNA、 RT-PCR检测细胞外囊泡miRNA表达量；通过考察捕获体系批内、批间CV值来评价捕获体系的稳定性。检测引物序列如下：

引物名称	引物序列(5'--3')
		miR-484RT-引物	GATGAGGAGTGTCGTGTAGTCGGCAATTTCCTCATCATCGGGA
miR-484F-引物	GTGGTCAGTCAGGCTCAGTCCCCTC
		miR-484R-引物	CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC
miR-484探针	FAM-TTTCCTCATCATCGGGA-MGB
		miR-21RT-引物	GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCATCAACAT
miR-21F-引物	CTCCGTCAGGGTAGCTTATCAGACTG
		miR-21R-引物	CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGC
miR-21探针	FAM-TTTCCTCATCATCAACAT-MGB

反转录RT体系、程序同步骤1.2.2；qPCR检测体系同步骤2.1.1。

结果如图7及下表所示：在血液中，适配体捕获EGFR阳性细胞外囊泡后，均可有效PCR检测出miRNA 的表达，且检测重复性稳定性较好，miRNA批内重复CV％<1％，批间重复CV％<2。其他生物流体(尿液、胸腹水、细胞上清、灌洗液等)使用也可达到类似的检测效果。

4适配体与抗体捕获EGFR阳性细胞外囊泡效果对比

验证方法如下：

1)采用超速离心方法获得肺癌A549细胞上清细胞外囊泡。

2)采用树脂-EGFR适配体体系和磁珠-抗体体系，同时捕获样本中EGFR阳性细胞外囊泡(方法同上)

3)捕获后的细胞外囊泡，采用RT-PCR检测细胞外囊泡miRNA(miR-16)表达量，分析(方法同上)。

4)捕获后的细胞外囊泡，经各自洗脱方式洗脱后，采用NTA技术检测(外送服务外包)，对比抗体和适配体捕获到EGFR阳性细胞外囊泡量。

结果如下面两个表所示：采用适配体捕获到EGFR阳性外泌量要优于抗体组，说明EGFR适配体捕获效率比抗体的回收率高，并且更能有效洗脱。

5 EGFR适配体捕获分离细胞

5.1捕获、分离方法

1)取状态良好的EGFR阳性细胞A549和阴性细胞Jurkat，弃掉培养基，PBS洗涤一次；

2)加胰酶约600-800μl，培养箱消化1-2min；

3)加入完全培养基2mL，轻柔吹打，收集细胞至离心管；JK细胞悬浮细胞，直接收集离心洗涤即可；

4)1000rpm离心4min；

5)弃掉培养基，加入预冷的PBS(过滤除菌)轻柔吹打洗涤，转移至小Ep管；

6)3500rpm离心4min预冷PBS再洗涤一次；

7)适配体(50nM)/加入一抗(1μg)，4℃温育1h,期间混匀；

8)PBS洗涤两次，所得样本即为EGFR阳性细胞。

5.2捕获、分离体系优化

按照4.1的操作捕获EGFR阳性细胞A549和阴性细胞Jurkat，考察不同浓度抗体/适配体捕获效果：

2)上述混合液(ELISA)检测OD值

1.将上述样本加入HRP-SA(1:10000)，室温温育1h

2.离心洗涤两次

3.加入100μL，移至酶标板，加入100μL TMB,37℃避光温育1h

4.加入终止液50μL,450nm读数

如图8所示：随着抗体及EGFR Aptamer 1用量的逐渐降低，所对应结合的阳性细胞量呈下降趋势，而阴性细胞系结合量很低且无显著变化；说明EGFR适配体Aptamer1和抗体均可捕获到EGFR阳性细胞，并且适配体结合细胞量要稍优于抗体。

5.3捕获、分离体系效果

5.2.1流式分析捕获特异性

将4.1所得混合液，加入FITC-SA(1：200)，4℃温育1h,期间不间断混匀，直接转移至hoechst染色， 37℃15min温育；PBS洗涤两次；加入200μl PBS，分96孔板，流式验证适配体捕获EGFR阳性细胞效果。所有操作均需避光。

结果如下表所示：EGFR Aptamer 1和抗体可与EGFR阳性细胞有效结合。

5.2.2 WB分析捕获特异性

将4.1所得混合液采用WB对细胞蛋白表达验证分析

结果如图9所示：EGFR抗体和EGFR Aptamer 1均可捕获到EGFR阳性细胞，而未捕获到EGFR阴性细胞。

6与同类型适配体效果对比

所用适配体与已有报道EGFR同类型适配体序列如下：

6.1捕获细胞外囊泡效果

所用适配体与已有报道EGFR同类型适配体对比捕获特异EGFR阳性细胞外囊泡验证(序列同上)。

按照步骤1制备A549细胞上清总细胞外囊泡，通过检测细胞外囊泡蛋白标志物(CD-81)和miRNA (miR-16)表达量，验证捕获体系捕获效果。

结果如下表所示：适配体Aptamer 1捕获组与同类型对照1、2和3捕获组均检测到了外泌体标志物蛋白CD-81表达，即捕获到了EGFR阳性外泌体。通过RT-PCR检测到4种适配体Aptamer 1/2/3/4捕获到的 EGFR阳性外泌体miRNA表达及外泌体蛋白标志物量分析，阳性适配体Aptamer 1捕获外泌体效果明显优于另外3种已报道的对照适配体(捕获效率至少提高30％以上)。

注：捕获效率计算方法：以假设实验组捕获效率为100％，对照组捕获CD81蛋白量与实验组捕获的蛋白量比值％作为对照组的捕获效率。

6.2捕获细胞效果

按照步骤4捕获EGFR阳性细胞A549和阴性细胞Jurkat，采用WB对捕获到的细胞EGFR蛋白表达验证分析；提取纯化捕获到的细胞总RNA，然后使用RT-PCR检测mRNA(GAPDH)表达量，验证捕获体系捕获效果。

如图10所示，适配体Aptamer 1捕获组与同类型对照1和2捕获组均检测到了EGFR蛋白表达，即捕获到了EGFR阳性细胞。如下表所示：通过RT-PCR检测到4种适配体捕获到的EGFR阳性细胞mRNA表达，适配体Aptamer 1捕获组mRNA表达量稍优于其他组；说明阳性适配体Aptamer 1捕获细胞外囊泡效果稍优于另外3种对照适配体。

注：捕获效率计算方法：细胞(对照)量与GAPDH表达量有正相关性，以总细胞(对照)GAPDH 表达量为参照，实验组与对照组所捕获细胞GAPDH表达量与总细胞GAPDH表达量的比值*100％作为捕获效率。

对上述结果的分析：

1.实验组核心序列与对照组有1-2个碱基差异，能有效稳固核心区域的二维和三维结构，从而提高稳定性和捕获效率；2.对照组1在核心序列始端增加了一个探针序列，但增加的序列会使适配体与载体的偶联效率降低，并且探针偶联效率会受到温度影响(温度升高探针易解链)影响连接效率。3.对照组2两端辅助序列过长，会对核心区域的二维和三维结构的稳定性产生一定影响，从而影响捕获效率。4.对照组 3是短序列，只包含靶向识别的结合部分，主要用于靶向载药，另外序列较短，受到载体及靶标位组效应等影响，不适宜用于捕获，只能用于靶向识别。

7与衍生适配体效果对比

衍生适配体序列长度在40～130之间，核心序列与本申请所提供的适配体EGFRAptamer 1不变或基本不变，***序列不同，整体同一性分别在55％，60％，70％，80％，90％左右的RNA适配体的效果的实验数据。

所用适配体及其衍生适配体捕获特异EGFR阳性外泌体序列如下表：

结果如下表所示，适配体Aptamer 1捕获组与衍生适配体组均检测到了外泌体标志物蛋白CD-81表达，通过RT-PCR检测到5种衍生适配体捕获到的EGFR阳性外泌体miRNA表达，说明EGFRAptamer及其衍生适配体也可捕获到EGFR阳性外泌体。但总体而言，衍生适配体的效果随着相似度的降低效果变差。

8、EGFR 4种适配体捕获效果对比

8.1 EGFR 4种适配体捕获EGFR阳性细胞外囊泡

适配体捕获特异EGFR阳性细胞外囊泡

1)采用超速离心方法获得肺癌A549细胞上清总细胞外囊泡

2)采用树脂分别与EGFR适配体Aptamer 1/2/3/4偶联，然后捕获样本中EGFR阳性细胞外囊泡(方法同上)

3)荧光显微镜检测EGFR+CD81双染模式下是否同时表达EGFR和细胞外囊泡标志物CD81(方法同上)。

4)采用RT-PCR检测细胞外囊泡miRNA(miR-16)表达量，分析(方法同上)。

如图11荧光显微所示，4种适配体Aptamer 1/2/3/4均可明显观测到EGFR和CD81双荧光，即捕获到了EGFR阳性细胞。如上表所示：通过RT-PCR检测到4种适配体Aptamer 1/2/3/4捕获到的EGFR阳性细胞mRNA表达，适配体Aptamer 1捕获组mRNA表达量稍优于其他组；说明阳性适配体Aptamer 1捕获细胞外囊泡效果稍优于另外3种适配体。

8.2 EGFR 4种适配体捕获EGFR阳性细胞

适配体捕获特异EGFR阳性细胞

1)适配体Aptamer 1/2/3/4分别与载体偶联制备捕获体系(方法同上1.2.1节内容)

2)捕获EGFR阳性细胞A549和阴性细胞Jurkat(方法同上1.3.1节内容)

3)采用荧光显微观察捕获阳性细胞

方法步骤：

1.细胞采用celltracker进行荧光染色。

2.将计数好的细胞投入到1mL捕获反应体系中。

3.采用EGFR适配体捕获体系进行捕获(方法同上)。

4.捕获载体与细胞复合物采用PBS(pH 7.4)清洗2次。

5. 50μl PBS(PH 7.4)缓冲液重悬，转移至384孔板进行荧光观察。

4)提取纯化捕获到的细胞总RNA，然后RT-PCR检测mRNA(GAPDH)表达量，分析。

RT-PCR检测体系：

热循环程序：

如图12所示，4种适配体Aptamer 1/2/3/4均观测到循环肿瘤细胞荧光，即捕获到了EGFR阳性细胞。如上表所示：通过RT-PCR检测到4种适配体Aptamer 1/2/3/4捕获到的EGFR阳性细胞mRNA表达，且 mRNA表达量无显著差异；而EGFR阴性细胞捕获组均未检测到mRNA表达，即未捕获到EGFR阴性细胞。说明4种阳性适配体Aptamer 1/2/3/4均可特异捕获到EGFR阳性细胞，且捕获效率无显著差异。

9、EGFR适配体捕获不同样本类型肺肿瘤来源的细胞外囊泡

9.1不同样本细胞外囊泡NTA验证

验证方法如下：

1)采用树脂-适配体捕获不同类型(血液、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本EGFR阳性细胞外囊泡

2)然后经竞争洗脱液洗脱使细胞外囊泡与载体分离，获得游离细胞外囊泡(方法同上)

3)采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测，确定不同样本类型捕获到的EGFR阳性细胞外囊泡分散性、粒径大小及分布情况。

结果如下表所示：EGFR适配体可捕获到不同类型样本(血液、胸腹水、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)中肺肿瘤来源EGFR阳性细胞外囊泡；且获得的细胞外囊泡均匀分散、无团聚现象，细胞外囊泡粒径大小基本都在80-130nm之间。

9.2不同样本细胞外囊泡WB特异性验证

验证方法如下：

1)采用树脂-适配体捕获肺癌不同类型(血液、尿液、胸腹水、肺泡灌洗液等)样本EGFR阳性细胞外囊泡(方法同上)

2)采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测靶标蛋白EGFR，验证不同样本类型能否捕获到EGFR 阳性细胞外囊泡。

如图13所示，EGFR适配体可捕获到不同类型样本(血液、胸腹水、细胞上清、胸腹水、肺泡灌洗液等)中肺肿瘤来源EGFR阳性细胞外囊泡。

10、EGFR适配体捕获分离细胞外囊泡miRNA标志物临床应用评价

验证方法如下：

1)树脂-EGFR适配体体系，捕获肺(癌)恶性结节和健康样本中的细胞外囊泡；与非捕获组对比，验证细胞外囊泡捕获前后临床区分效果。

2)采用miRNeasy mini kit提取纯化捕获前后的细胞外囊泡总miRNA

3)然后RT-PCR检测细胞外囊泡miRNA标志物miR-21(以miR-16作为内参)表达量，分析。

结果：

图14以miR-16作为内参PCR检测血浆中细胞外囊泡标志物miR-21相对表达量。

选了10例肺(癌)恶性结节和10例健康样本，对比细胞外囊泡捕获前后临床区分效果。肺癌相关肿瘤标志物miR-21的PCR检测结果(图14)显示：EGFR适配体捕获后检测对健康和癌的区分效果显著提高；并且捕获后健康组表达分布相对更集中，原因是捕获出了组织特异细胞外囊泡，并且去除了大部分白细胞和红细胞干扰，使临床效果更好。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司

<120> EGFR特异性的核酸适配体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 70

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 1

gccgcuauaa ugcacggauu uaaucgccgu agaagagcau gucaaagccg gaaccgugua 60

ggcagacaca 70

<210> 2

<211> 70

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 2

gccgcuauaa ugcacggauu uaaucgccgu agaaaagcau gucaaagccg gaaccgugua 60

ggcagacaca 70

<210> 3

<211> 70

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gccgcuauaa ugcacggauu uaaucgccgu agaacagcau gucaaagccg gaaccgugua 60

ggcagacaca 70

<210> 4

<211> 70

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 4

gccgcuauaa ugcacggauu uaaucgccgu agaauagcau gucaaagccg gaaccgugua 60

ggcagacaca 70

Claims

1.核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4中的至少一项所示。

2.权利要求1所述核酸适配体的互补链。

3.根据权利要求1所述的核酸适配体或权利要求2所述的互补链，其经过修饰以增加RNA的稳定性和/或增强与靶标的亲合力。

4.根据权利要求3所述的核酸适配体或互补链，用于增加RNA的稳定性的修饰包括2'-FRNA核苷酸修饰；

用于增强与靶标的亲合力的修饰包括二硫代磷酸酯骨架修饰、脱氧核糖核酸、正电修饰及氨基酸侧链修饰中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的核酸适配体或互补链，用于增加RNA的稳定性的修饰包括2'-氟嘧啶修饰；

6.根据权利要求3所述的核酸适配体或互补链，其还具有如下标记中的至少一种：荧光团、比色标记、量子点、生物素、用于拉曼衍射成像的炔烃基团、用于click反应的环烯烃、用于聚合物标记的引发基团、多肽/蛋白分子、LNA/PNA、非天然氨基酸及其类似物、非天然核酸及其类似物或者纳米结构；

7.用于分离EGFR或表面包含EGFR的物质的层析介质，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的配基，所述配基为权利要求1、3～6任一项所述的核酸适配体。

8.根据权利要求7所述的层析介质，所述基体支持物包括琼脂、琼脂糖、磁珠、二氧化硅、二氧化钛、藻酸盐、纤维素、葡聚糖、淀粉、环糊精、壳聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、***胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、聚丙烯酰胺凝胶、肝硫酯、明胶、硅胶、陶瓷、玻璃、树脂中的任一种，或任意几种形成的共聚物。

9.根据权利要求8所述的层析介质，所述树脂的活性基团包括聚氨酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇对苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的任一种，或任意几种的混合物或共聚物。

10.层析分离装置，其特征在于，含有权利要求7～9任一项所述的层析介质。

11.从液相组合物中移出EGFR或表面包含EGFR的物质的方法，包括：

用权利要求7～9任一项所述的层析介质与所述液相组合物共孵育，以使所述核酸适配体能够与所述EGFR或表面包含EGFR的物质结合，并用权利要求2～6任一项所述的互补链进行洗脱；

所述表面包含EGFR的物质包括细胞外囊泡或细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，所述基体支持物为树脂微球，其在共孵育体系中的浓度≥1.8×10⁷Resin/mL。

13.根据权利要求11所述的方法，所述基体支持物为磁珠，其在共孵育体系的浓度≥4.8×10⁷beads/mL。

14.根据权利要求11所述的方法，所述核酸适配体在共孵育体系中的浓度≥180nM。

15.根据权利要求11所述的方法，所述互补链在进行洗脱时的浓度≥0.9μM。

16.根据权利要求11～15任一项所述的方法，所述共孵育的时间≥0.9h。

17.根据权利要求11～15任一项所述的方法，所述细胞为循环肿瘤细胞。

18.根据权利要求11～15任一项所述的方法，所述液相组合物为细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、胸腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、尿、***、***分泌物、黏液、唾液或痰；或者它们的稀释液/裂解液。

19.用于分离EGFR或表面包含EGFR的物质的试剂盒，其含有权利要求1、3～6任一项所述的核酸适配体以及权利要求2～6任一项所述的互补链。