CN108387435B - 一种痕量丝素蛋白富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种痕量丝素蛋白富集方法，包括以下步骤：1）不同丝素蛋白单克隆抗体的混合；2）耦联反应；3）免疫磁珠的获得；4）鉴定；5）耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化；6）丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合；7）丝素蛋白的洗脱；8）检测；9）加标回收。本发明利用丝素蛋白的复合单克隆抗体制备免疫磁珠，并利用这种免疫磁珠富集痕量丝素蛋白，可以更好地进行考古土样中痕量丝素蛋白的提取，具有提取不同分解片段、富集效率高、操作简便、实验耗时短等多方面优势。

Description

一种痕量丝素蛋白富集方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种痕量丝素蛋白富集方法。

背景技术

丝绸作为中华文明的重要发明之一,承载着极其丰富的文化、技术和社会内涵,为考古学、历史学、技术史的研究提供了珍贵的资料。已出土的丝绸残片表明丝绸的起源应不晚于5500年前。然而,从发现蚕丝纤维到将其织造成精美的丝绸必然需要长时间的发展。因此,我们的祖先开始使用蚕丝纤维的时间远早于5500年前。但是，丝绸的起源问题一直笼罩在迷雾中。如何利用科学的手段确定丝绸起源并源自中国，具有十分重要的历史和文化价值。

丝绸由蚕丝织成，蚕丝是由18种氨基酸构成的天然蛋白质纤维。在漫长的历史进程中，当年埋入墓葬或遗址中的丝织品早已失去了实体面貌，降解成肽段和氨基酸，或者成为痕迹，或者化入泥土，在肉眼下已经无法辨识，且年代越早的证据越难寻觅。如何在丝绸宏观形态消失的情况下探寻更早的证据成为了研究早期丝绸的关键问题。相对于完整的丝织物,无形的纤维丝素蛋白残留物更有可能保存下来,也有可能成为探寻早期蚕丝遗存的新证据。

在长达数百年甚至数千年的时间长河中，考古材料中剩余的丝绸含量微乎其微，因此在对样品进行检测之前进行考古材料中痕量丝素蛋白进行富集，以提高检测的准确性，同时又要考虑的操作上的简便以及耗时少的问题。

目前进行痕量丝素蛋白的检测有多种方法，其中ELISA检测方法是利用抗原抗体的特异性结合进行检测，是丝素蛋白生物检测的最新技术，但ELISA检测方法需要检测目的物丝素蛋白能够有一定的浓度，而在考古发掘样品中的丝蛋白经过长期的岁月和环境的侵蚀，土中剩余的丝素蛋白含量微乎其微，而且可能被分解成不同的片段，常用的溶液提取法很难得到足够的丝素蛋白，利用丝素蛋白不同抗原决定簇制备的单克隆抗体混合物，可以结合痕量丝素蛋白分解成的不同片段，提高检测的效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用免疫磁珠富集痕量丝素蛋白，从而将土样中的痕量丝素蛋白进行富集的方法。

包括以下步骤：

1） 不同丝素蛋白单克隆抗体的混合：取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合；

2）耦联反应：取蛋白 G包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH为6.0、浓度为15mmol/L的2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液中，然后加入步骤1）中制备的混合抗体70μg，置于振荡器上室温耦联反应过夜；

3）免疫磁珠的获得：用磁力架收集步骤2）中耦联反应后的磁珠并去除上清液，得到重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠；

4）鉴定：另取1mg未耦联的磁珠和步骤3）中耦联后的磁珠在55-65℃下烘干，进行傅里叶红外检测，观察1541cm^-1处的特征峰，确定耦联状态；

5）耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化：在步骤3）中得到的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠中加入1ml新鲜配制的浓度为0.2mol/L、PH为8.2的三乙醇胺溶液，三乙醇胺溶液中含有20mmol/L的邻苯二甲酸二甲酯，混合后的溶液置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育30min；孵育完成后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠2-4次，然后再用1mL的磷酸盐吐温缓冲液洗涤磁珠1-3遍，最后用1mL含0.02% NaN₃、0.1%牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液重悬磁珠，并保存于4℃冰箱；

6）丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合：把步骤5）最终得到的免疫磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在常温下孵育1h；每毫升免疫磁珠中加入含有10～100ng的丝素蛋白样品，置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,并在25℃反应60min；然后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠3次；

7）丝素蛋白的洗脱：加入100uL洗脱溶液与步骤6）得到的磁珠混匀，洗脱溶液是甘氨酸，浓度为0.1mol/L、PH为2，把磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育10min；然后用磁力架收集磁珠，上清液转移到另一个小管中，重复一次收集洗脱液；

8）检测：合并步骤7）中的洗脱液，并用0.1mol/L NaOH溶液调整pH为7后进行ELISA检测；

9）加标回收：在10～100ng丝素蛋白添加到每毫升免疫磁珠中时，丝素蛋白的富集效率达到80%以上。

所述步骤1）取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合。

所述的一种痕量丝素蛋白富集方法，其特征在于所述步骤2）取蛋白 G包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH为6.0、浓度为15mmol/L的2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液中，然后加入步骤1）中制备的混合抗体70μg置于振荡器上室温耦联反应过夜。

所述的一种痕量丝素蛋白富集方法，其特征在于所述步骤5）中丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠中加入1ml新鲜配制的浓度为0.2mol/L、PH为8.2的三乙醇胺溶液，混合后的溶液置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育30min，进行固定化。

所述的一种痕量丝素蛋白富集方法，其特征在于所述步骤7）中的洗脱液为甘氨酸，所述甘氨酸浓度为0.1mol/L、PH为2，保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育10min，并重复一次收集洗脱液。

所述的一种痕量丝素蛋白富集方法，其特征在于所述步骤9）在10～100ng丝素蛋白添加到每毫升免疫磁珠中时，丝素蛋白的富集效率达到80%以上。

本发明的技术要点在于：重链为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白的单克隆抗体同protein G包裹磁珠的耦联及固定化技术，包括重链为IgG1、IgG2b、IgA的三种单克隆抗体等质量混合及加入量、耦联用的溶液条件，耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化溶液条件及步骤；利用免疫磁珠对考古材料中痕量丝素蛋白进行富集的操作技术，包括丝素蛋白样品添加量、反应条件及步骤，洗脱丝素蛋白的溶液条件及步骤。

本发明具有以下有益效果：本发明利用丝素蛋白的单克隆抗体制备免疫磁珠，并利用这种免疫磁珠富集痕量丝素蛋白，可以更好地进行土样中痕量丝素蛋白及其分解片段的富集和提取，具有提取不同分解片段、富集效率高、操作简便、实验耗时短等多方面优势。

附图说明

图1是本发明免疫磁珠的红外检测图谱；

图2是本发明丝素蛋白不同添加量的回收率。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。

具体工艺步骤如下：

1）不同丝素蛋白单克隆抗体的混合：取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合；

2）耦联反应：取蛋白 G（protein G）包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH为6.0、浓度为15mmol/L的2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液中，然后加入步骤1）中制备的混合抗体70μg，置于振荡器上室温耦联反应过夜；

3）免疫磁珠的获得：用磁力架收集步骤2）中耦联反应后的磁珠并去除上清液，得到重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠；

4）鉴定：另取1mg未耦联的磁珠和步骤3）中耦联后的磁珠在60℃下烘干，进行傅里叶红外检测，观察1541cm^-1处的特征峰，确定耦联状态；图1 中1634.99cm-1处为羧基震动的特征峰，耦联后的磁珠与未耦联的磁珠相比，该处特征峰明显相差较大，表明IgG1、IgG2b、IgA三个重链不同的丝素蛋白抗体与磁珠成功耦联；

5）耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化：在步骤3）中得到的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠中加入1ml新鲜配制的浓度为0.2mol/L、PH为8.2的三乙醇胺溶液，所述三乙醇胺溶液中含有20mmol/L的邻苯二甲酸二甲酯（DMP），混合后的溶液置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育30min；孵育完成后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤交联后的磁珠3次，然后再用1mL的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤磁珠2遍，最后用1mL含0.02% NaN3、0.1%牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液（PBS）重悬磁珠，并保存于4℃冰箱；

6）丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合：把步骤5）最终得到的免疫磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在常温下孵育1h；每毫升免疫磁珠中加入含有10～100ng的丝素蛋白样品，置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,并在25℃反应60min；然后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠3次；

7）丝素蛋白的洗脱：加入100uL洗脱液（甘氨酸浓度为0.1mol/L、PH为2）与步骤6）得到的磁珠混匀，洗脱液为甘氨酸，甘氨酸浓度为0.1mol/L、PH为2把磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育10min；然后用磁力架收集磁珠，上清液转移到另一个小管中，重复一次收集洗脱液；

8）检测：合并步骤7）中的洗脱液，并用0.1mol/L NaOH溶液调整pH为7后进行ELISA检测；

9）加标回收：丝素蛋白添加量在10～100ng/mL免疫磁珠时，富集效率达到80%以上，图2可以看出，丝素蛋白添加量在10～50ng/mL免疫磁珠时，回收率达到97%以上，丝素蛋白添加量为100ng时，回收率也能够达到80%，但当蛋白添加量达到200ng时，回收率仅有57.8%；结果表明通过免疫磁珠可以有效富集痕量丝素蛋白，在10～100ng/mL时富集效率可以达到80%以上。

最后应当说明的是，以上实施仅用以说明本发明的技术方案而非限制本发明，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (1)

1.一种痕量丝素蛋白富集方法，其特征在于包括以下步骤：

1）不同丝素蛋白单克隆抗体的混合：取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合；

2）耦联反应：取蛋白 G包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH为6.0、浓度为15mmol/L的2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液中，然后加入步骤1）中制备的混合抗体70μg，置于振荡器上室温耦联反应过夜；

3）免疫磁珠的获得：用磁力架收集步骤2）中耦联反应后的磁珠并去除上清液，得到重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠；

4）鉴定：另取1mg未耦联的磁珠和步骤3）中耦联后的磁珠在55-65℃下烘干，进行傅里叶红外检测，观察1541cm^-1处的特征峰，确定耦联状态；

5）耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化：在步骤3）中得到的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠中加入1ml新鲜配制的浓度为0.2mol/L、PH为8.2的三乙醇胺溶液，三乙醇胺溶液中含有20mmol/L的邻苯二甲酸二甲酯，混合后的溶液置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育30min；孵育完成后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠2-4次，然后再用1mL的磷酸盐吐温缓冲液洗涤磁珠1-3遍，最后用1mL含0.02% NaN₃、0.1%牛血清蛋白的磷酸缓冲盐溶液重悬磁珠，并保存于4℃冰箱；

6）丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合：把步骤5）最终得到的免疫磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在常温下孵育1h；每毫升免疫磁珠中加入含有10～100ng的丝素蛋白样品，置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态,并在25℃反应60min；然后用磁力架收集磁珠并去除上清液，接着用1mL磷酸缓冲盐溶液洗涤交联后的磁珠3次；

7）丝素蛋白的洗脱：加入100uL洗脱溶液与步骤6）得到的磁珠混匀，洗脱溶液是甘氨酸，浓度为0.1mol/L、PH为2，把磁珠置于振荡器上以保证磁珠处于悬浮状态，在室温孵育10min；然后用磁力架收集磁珠，上清液转移到另一个小管中，重复一次收集洗脱液；

8）检测：合并步骤7）中的洗脱液，并用0.1mol/L NaOH溶液调整pH为7后进行ELISA检测；

9）加标回收：在10～100ng丝素蛋白添加到每mL免疫磁珠中时，丝素蛋白的富集效率达到80%以上。

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