CN107349376A - 一种抗鸡球虫益生药物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗鸡球虫益生药物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗鸡球虫益生药物的制备方法,所述益生药物是由中药复方提取液经酿酒酵母兼性厌氧发酵制备得到的;所述中药复方提取液是将以下质量份数的各原料药混合后,水提而成:常山60‑90份、草果30‑60份、地锦草40‑60份、马齿苋30‑50份、铁苋菜20‑40份、乌韭10‑30份、甘草10‑30份、乌梅20‑40份、陈皮20‑50份、神曲10‑30份。本发明还提供应用上述方法制备得到的抗鸡球虫益生药物及其应用。本发明的益生药物对鸡球虫病有很好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于中兽药和微生态药物技术领域,具体涉及一种抗鸡球虫益生药物及其制备方法和应用。
背景技术
鸡球虫病是一种呈全球分布流行、发病率高和死亡率高的肠道寄生虫病,禽类5-10 %的死亡率是由本病引起的,可导致家禽生长受阻、饲料转化率降低和肉蛋品质下降。在所有的鸡球虫属中,柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)对鸡危害最为严重,主要寄生于鸡盲肠上皮细胞。全球每年因该病造成的经济损失约为50 亿美元,我国在30 亿元左右,其中抗球虫药物费用约为6 亿元。目前,国内外主要利用化学合成药物来预防和治疗鸡球虫病,如地克珠利、妥曲珠利和常山酮等,它们对现代养鸡业的健康发展贡献很大,国内外对于它们的抗球虫作用及机理研究较多。随着球虫耐药性的日趋严重、免疫预防尚未普遍应用、抗球虫化学药物存在严重的药物残留问题以及人们健康意识的不断加强,迫切需要研发安全环保、广谱高效的抗球虫药物。
因此,养禽业更倾向于在雏鸡易感日龄内使用针对性强、生物利用度高、安全性强的药物,通过便捷的口服途径进行预防与治疗,以此弥补现有用药状况的不足之处。
中药常山具有杀虫、截疟、祛痰之功效,作为具有抗球虫活性的中药材可单独使用或作复方制剂的主药使用,而有效活性单体常山乙素(febrifugine,dichroine B,β-dichroine)和常山甲素(isofebrifugine,dichroine A,α-dichroine)即为常山提取物中的抗球虫有效组分。研究表明,常山乙素的毒性及疗效均较常山甲素为高,相较常山甲素具有更为强大的抗疟作用,抗疟疗效约为常山甲素的100倍。鉴于常山为有小毒的中药材,提取液在临床用药中存在催吐之功,目前在抗球虫中药复方中其有效活性成分常山总生物碱的含量偏低,给临床安全使用带来不确定因素。加之常山原药材或饮片中常山乙素、常山甲素因提取分离困难,导致有效活性成分提取率较低。
发明内容
本发明提供了一种抗鸡球虫益生药物及其制备方法和应用,本发明提供的益生药物具有杀灭球虫、凉血止痢、清热燥湿、健脾理气的功效,适应于治疗鸡球虫病及球虫与细菌的混合感染。
本发明提供一种抗鸡球虫益生药物的制备方法,所述益生药物是由中药复方提取液经酿酒酵母兼性厌氧发酵制备得到的;所述中药复方提取液是将以下质量份数的各原料药混合后,水提而成:常山60-90份、草果30-60份、地锦草40-60份、马齿苋30-50份、铁苋菜20-40份、乌韭10-30份、甘草10-30份、乌梅20-40份、陈皮20-50份、神曲10-30份。
作为优选,所述中药复方提取液是将以下质量份数的各原料药混合后,水提而成:常山80份、草果40份、地锦草50份、马齿苋40份、铁苋菜30份、乌韭20份、甘草20份、乌梅30份、陈皮40份、神曲20份。
作为优选,所述中药复方提取液的制备方法为:将各原料药粉碎,按配方量称取重量份的各原料药,加入中药总重量6-10 倍量的去离子水,浸泡30-60 分钟,煎煮40-60 分钟,过滤去渣;滤渣再加3-5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加3-5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣,合并上述3次的煎煮过滤液。
作为优选,所述中药复方提取液的发酵方法为:在所述中药复方提取液中,加入饴糖200-300 g/L、麦芽汁100-200 mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L,灭菌冷却至28-32℃,接种酿酒酵母,接种量为8-10%,在35℃,无菌发酵室中,摇床进行兼性厌氧发酵培养,优选摇床速率为40r/min,至液面长出白色菌膜为止。
作为优选,所述酿酒酵母的菌株编号为CVCC 2.1011,作为优选,菌含量为9.0×108 CFU/mL。
本发明还提供应用上述的方法制备得到的抗鸡球虫益生药物。
作为优选,将发酵得到的发酵滤液去除液面菌膜,得到益生药物的口服饮水剂。
作为优选,将发酵得到的发酵滤液离心浓缩,作为优选,所述离心浓缩时的温度为4℃,转速为5000-7000rpm,离心时间为8-10min,收集沉淀,在沉淀中加入基础冻干保护剂和蛋白稳定剂,混匀,调整pH值,平衡,冷冻干燥后,得到益生药物的散剂。
本发明还提供上述抗鸡球虫益生药物在制备治疗鸡球虫病的药物或饲料添加剂中的应用。
作为优选,所述鸡球虫病为柔嫩艾美尔球虫所致的鸡球虫病。
本发明的中药复方根据中兽医药和现代中医药学理论,以清热截疟、祛痰燥湿、凉血止痢、健脾理气为原则,按照一定的重量份组方而成,所述中药复方包括常山、草果、地锦草、马齿苋、铁苋菜、乌韭、甘草、乌梅、陈皮、神曲。组方原则:按照中兽医辨证施治理论,鸡球虫病为外感湿热,湿热蕴集大肠,热毒迫血妄行,导致粪便带血,湿困脾土,致使鸡群下痢,其治疗原则应以清热燥湿、截疟祛痰、凉血止痢为主。方中常山、草果合用共奏清热生津抗疟之功,草果可加强常山的截疟药力,免除常山涌吐之弊;地锦草、马齿苋、铁苋菜有助于清利湿热,收敛止血;乌韭有助于解毒;乌梅、陈皮、神曲相配利于生津止泻、健脾益气;甘草具有泻火解毒、缓急止痛、补中益气、调和诸药的作用。全方配伍严谨,且组方制备的中药复方提取液具有抗疟祛痰、清热止泻、凉血止痢、理气化湿之功效。
本发明的中药复方提取液经活性酵母培养物兼性厌氧发酵后,利于中药复方中多糖、淀粉、纤维素等药物活性成分的转化和分解,得到更为有效的药物活性成分,并降低药物毒副作用,改善药物适口性。
活性酵母培养物除具有厌氧发酵中药提取液、提高中药有效活性成分的含量及利用率的功效之外,其营养成分还可刺激雏鸡免疫***的防御能力,减少肠内有毒物质的产生,对机体免疫功能具有促进作用,增强雏鸡免疫力,提高治愈率,无耐药性,有效控制雏鸡球虫病的发生。
本发明提供的一种防治鸡球虫病的益生药物组合物,由活性酵母培养物厌氧发酵中药复方提取液制备而成,药物有效活性成分及利用率更高,具有杀灭球虫、清热燥湿、凉血止痢、健脾益气、增加肠道内有益菌群数量、提高雏鸡抗病力及免疫功能等功效。其选材方便、提取效率高、成本相对较低,易于形成规模化生产,可制备成便于兽医临床应用的口服给药制剂类型。
本发明根据中兽医药和现代中医药学理论,以清热截疟、祛痰燥湿、凉血止痢、健脾理气为原则组方制备抗球虫中药复方药物。通过应用现代中药提取分离技术,提取中药复方的有效活性成分,并结合益生菌发酵技术分解、转化复方提取液中生物碱、多糖、淀粉、纤维素等药物有效成分,得到更为有效的活性单体,并降低常山的毒副作用,改善药物适口性,使得药物有效活性成分及利用率得到更进一步的提高。同时,益生菌的营养成分可刺激鸡只免疫***的防御能力,减少肠内有毒物质的产生,对机体免疫功能具有促进作用,增强雏鸡免疫力,提高治愈率,无耐药性,有效控制鸡球虫病的发生。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售。本发明所用到的各种中药原料药都可从医药商店或试剂公司购买得到,其规格符合国家或行业标准即可。
实施例1 活性酵母菌培养物的制备,步骤如下:
(1)培养基的配制:
液体培养基:成分为:葡萄糖50 g/L、酵母浸膏2.0 g/L、麦芽汁120 mL/L、MgSO4 0.5g/L、FeSO4 0.1 g/L、尿素1.0 g/L。调整pH至6.0,121 ℃,灭菌20 min,分装至锥形瓶,备用。
斜面和平板培养基:成分为:葡萄糖50 g/L、酵母浸膏2.0 g/L、麦芽汁120 mL/L、MgSO4 0.5 g/L、FeSO4 0.1 g/L、尿素1.0 g/L、琼脂20 g/L。调整pH至6.0,121 ℃,灭菌20min,分装至锥形瓶,备用。
(2)酵母菌培养:
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心,为饲料酵母,菌株编号CVCC 2.1011),将菌种从斜面贮种中挑出一环生长较为丰满的酵母菌菌苔,接于50 mL的液体培养基中,置30 ℃恒温培养,约24 h左右,即可发至对数期,此时摇匀菌液,将其转接到100 mL的液体培养基中,相同条件下培养24 h,即得复壮酵母。
转接、扩大培养:将复壮酵母接入液体培养基,30℃,40 r/min摇床培养,观察。菌种扩大传代培养的接种量控制在6-10 %,装液量小于60 %以保证溶氧量,培养温度30 ℃,转速40 r/min恒温摇床培养以增加通气量,液体培养基的pH值6.0,糖浓度5 %,酵母浸膏浓度2.0 g/L。控制菌含量以9.0×108 CFU/mL为宜(3.0麦氏比浊管浓度)。
实施例2 中药复方提取液的制备方法,其中各单味中药的配比如下:
中药复方提取液由以下重量份的各组分组成:常山60-90份、草果30-60份、地锦草40-60份、马齿苋30-50份、铁苋菜20-40份、乌韭10-30份、甘草10-30份、乌梅20-40份、陈皮20-50份、神曲10-30份。
中药复方提取液的制备方法为:将各单味中药经超微粉碎机粉碎,按配方量称取重量份的单味中药,加入中药总重量6-10 倍量的去离子水,浸泡30-60 分钟,煎煮40-60分钟,过滤去渣;滤渣再加3-5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加3-5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣,合并上述3次的煎煮过滤液。
经实验:应用本发明方法制备得到的中药复方提取液经发酵后,均能获得抗鸡球虫益生药物,对鸡球虫病均有良好的治疗效果,其中以下述中药复方提取液1号为原料时,制备得到的益生药物治疗效果最佳。
以下为几个较优配方及制备方法:
(1)中药复方提取液1号的组分配比(单位:g):常山80、草果40、地锦草50、马齿苋40、铁苋菜30、乌韭20、甘草20、乌梅30、陈皮40、神曲20。
中药复方提取液1号的制备方法为:将各单味中药经超微粉碎机粉碎,按配方量称取重量份的单味中药,加入中药总重量8 倍量的去离子水,浸泡60 分钟,煎煮60 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣。合并上述3次的煎煮过滤液。
(2)中药复方提取液2号的组分配比(单位:g):常山60、草果30、地锦草50、马齿苋40、铁苋菜30、乌韭10、甘草10、乌梅20、陈皮20、神曲10。
中药复方提取液2号的制备方法为:将各单味中药经超微粉碎机粉碎,按配方量称取重量份的单味中药,加入中药总重量6 倍量的去离子水,浸泡40 分钟,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加3 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加3 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣。合并上述3次的煎煮过滤液。
(3)中药复方提取液3号的组分配比(单位:g):常山90、草果60、地锦草60、马齿苋50、铁苋菜40、乌韭30、甘草30、乌梅40、陈皮50、神曲30。
中药复方提取液3号的制备方法为:将各单味中药经超微粉碎机粉碎,按配方量称取重量份的单味中药,加入中药总重量10 倍量的去离子水,浸泡60 分钟,煎煮60 分钟,过滤去渣;滤渣再加5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣。合并上述3次的煎煮过滤液。
(4)中药复方提取液4号的组分配比(单位:g):常山80、草果40、地锦草40、马齿苋30、铁苋菜20、乌韭20、甘草20、乌梅30、陈皮30、神曲20。
中药复方提取液4号的制备方法为:将各单味中药经超微粉碎机粉碎,按配方量称取重量份的单味中药,加入中药总重量8 倍量的去离子水,浸泡60 分钟,煎煮60 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣。合并上述3次的煎煮过滤液。
(5)中药复方提取液5号的组分配比(单位:g):常山60、草果30、地锦草60、马齿苋50、铁苋菜40、乌韭10、甘草20、乌梅30、陈皮40、神曲20。
中药复方提取液5号的制备方法为:将各单味中药经超微粉碎机粉碎,按配方量称取重量份的单味中药,加入中药总重量9 倍量的去离子水,浸泡50 分钟,煎煮50 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣。合并上述3次的煎煮过滤液。
(6)中药复方提取液5号的组分配比(单位:g):常山80、草果60、地锦草50、马齿苋40、铁苋菜30、乌韭20、甘草10、乌梅30、陈皮40、神曲20。
中药复方提取液6号的制备方法为:将各单味中药经超微粉碎机粉碎,按配方量称取重量份的单味中药,加入中药总重量10 倍量的去离子水,浸泡60 分钟,煎煮60 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加4 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣。合并上述3次的煎煮过滤液。
实施例3 发酵滤液的制备方法,步骤如下:
以每升实施例2制备得到的合并煎煮滤液为单位,添加饴糖200-300 g/L、麦芽汁100-200 mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L。121℃,灭菌15 分钟。冷却至30 ℃左右,接种实施例1制备的活性酿酒酵母培养物80-100 mL/L 滤液(接种量8-10 %,百分比为体积百分比),35 ℃、兼性厌氧发酵培养7-10 天(发酵瓶瓶口的封膜带有透气孔,不完全密闭,置于无菌发酵室,摇床40 r/min培养观察),至液面长出白色菌膜为止。
以下为几个较优发酵滤液制备方法,所用合并煎煮滤液优选为中药复方提取液1号:
(1)发酵滤液1号:以每升合并煎煮滤液为单位,添加饴糖200 g/L、麦芽汁100 mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L。121℃,灭菌15 分钟。冷却至30 ℃左右,接种实施例1制备的活性酵母培养物80 mL/L 滤液(接种量8 %),35 ℃、兼性厌氧发酵培养7 天(无菌发酵室,摇床40 r/min培养观察),至液面长出白色菌膜为止。
(2)发酵滤液2号:以每升合并煎煮滤液为单位,添加饴糖300 g/L、麦芽汁200 mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L。121℃,灭菌15 分钟。冷却至30 ℃左右,接种实施例1制备的活性酵母培养物100 mL/L 滤液(接种量10 %),35 ℃、兼性厌氧发酵培养10 天(无菌发酵室,摇床40 r/min培养观察),至液面长出白色菌膜为止。
(3)发酵滤液3号:以每升合并煎煮滤液为单位,添加饴糖200 g/L、麦芽汁100 mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L。121℃,灭菌15 分钟。冷却至30 ℃左右,接种实施例1制备的活性酵母培养物100 mL/L 滤液(接种量10 %),35 ℃、兼性厌氧发酵培养7 天(无菌发酵室,摇床40 r/min培养观察),至液面长出白色菌膜为止。
(4)发酵滤液4号:以每升合并煎煮滤液为单位,添加饴糖300 g/L、麦芽汁200 mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L。121℃,灭菌15 分钟。冷却至30 ℃左右,接种实施例1制备的活性酵母培养物80 mL/L 滤液(接种量8 %),35 ℃、兼性厌氧发酵培养10 天(无菌发酵室,摇床40 r/min培养观察),至液面长出白色菌膜为止。
(5)发酵滤液5号:以每升合并煎煮滤液为单位,添加饴糖300 g/L、麦芽汁量200mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L。121℃,灭菌15 分钟。冷却至30 ℃左右,接种实施例1制备的活性酵母培养物90 mL/L 滤液(接种量9 %),35 ℃、兼性厌氧发酵培养7 天(无菌发酵室,摇床40 r/min培养观察),至液面长出白色菌膜为止。
(6)发酵滤液6号:以每升合并煎煮滤液为单位,添加饴糖200 g/L、麦芽汁量200mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L。121℃,灭菌15 分钟。冷却至30 ℃左右,接种活性酵母培养物90 mL/L 滤液(接种量9 %),35 ℃、兼性厌氧发酵培养7 天(无菌发酵室,摇床40r/min培养观察),至液面长出白色菌膜为止。
经实验:本发明的发酵滤液对鸡球虫病均有良好的治疗效果,其中以中药复方提取液1号为发酵原料,并采用发酵滤液5号的配方和制备方法制备得到的益生药物的治疗效果最佳。因此,在本发明中,将以此配方对后续实验进行说明。
实施例4 发酵滤液作为饮水剂、散剂时的制备及使用方法
(1)饮水剂的制备:将实施例3制备得到的发酵滤液去除液面菌膜,即得复合药物的口服饮水剂。本发明优选发酵滤液5号制备饮水剂。
使用方法:清晨空腹饮水给药,临床治疗剂量为:雏鸡每升饮用水添加20-30 mL饮水剂药物,1 次/天,5 天为1个疗程。
(2)散剂的制备:将实施例3制备得到的发酵滤液离心浓缩(4℃,5000-7000 rpm条件下,离心8-10 min),收集管底复合药物沉淀。沉淀中加入基础冻干保护剂和蛋白稳定剂(w/w,质量百分比,3-5 %甘油、5-10 %脱脂奶粉、10-15 %蔗糖或甘露醇、10-15 %的β-环糊精或***胶,剩余的是药物沉淀,加一起是100%)。混匀,调整pH值在5.2-6.0之间,平衡时间为60 min。-20 ℃预冻12 h,真空冷冻干燥24 h,得到复合药物散剂。
本发明优选发酵滤液5号制备散剂并拌服添加给药。
使用方法:药物散剂的使用量为200-600mg/kg鸡重量,拌料混饲,1 次/天,5 天为1个疗程(250 g左右的小鸡大概一天吃50 g饲料,按1 ‰的添加量,50 g饲料里含50 mg散剂,换算下来就是200 mg/kg鸡体重;如果是急性发病的治疗剂量,还可以再加大添加剂量至每千克鸡饲料添加3 g散剂,换算下来就是600 mg/kg鸡体重)。
实施例5 急性毒性试验及半数致死量测定
1 预实验
试验药品的制备步骤如下:
(1)按照实施例1的方法培养活性酵母菌培养物至菌含量达9.0×108 CFU/mL;
(2)以实施例2中中药复方提取液1号的配方及制备方法制备中药复方提取液;
(3)以实施例3中发酵滤液5号的制备方法制备发酵滤液;
(4)将发酵滤液去除液面菌膜,得到饮水剂,并进行3倍稀释。
试验动物:昆明系清洁级小鼠60只,小鼠体重18 g-22 g,雌雄各半,每组10只,分为6组。分别按不同剂量(1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 mg/kg体重剂量)口服灌胃试验药品,观察临床症状,记录死亡数,确定0-100 %死亡剂量的所在范围。
2 急性毒性试验
将健康小鼠随机分成5个剂量组(即4.0、4.8、5.76、6.90、8.30 mg/kg体重剂量)和1个对照组(空白对照,不灌药),组间剂量比为1:1.2。每组10只,雌雄各半,口服灌胃,给药后观察小鼠死亡情况并记录试验结果。
3 结果与分析
给药灌胃后,中、高剂量组小鼠出现精神沉郁、活动量减少的现象,未见其他明显的异常反应。灌胃后第2 d,小鼠饮食、饮水量均有一定程度的增加,活动增多,精神状态良好,未出现异常反应。灌胃后第3-7 d,小鼠食欲良好,未出现毒性反应。
4 结论
采用改良寇氏法计算药物的LD50为3679.8 mg/kg,95 %置信区间为:2055.3~4315.6mg/kg。依照《兽药试验技术规范汇编》中急性毒性试验规定,在外源化学物急性毒性分级标准中,小鼠一次经口 LD50在 500~5000 mg/kg范围内,即可认为该药物处于低毒-实际无毒范围。
实施例6 药物抗柔嫩艾美耳球虫疗效试验
1 材料与方法
1.1 试验动物
1日龄的岭南黄雏鸡120只,购自甘肃省兰州华陇家禽育种公司。雏鸡饲料购自兰州市富昌饲料厂,未添加任何抗球虫药物。饲养条件与管理:在中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所标准化实验动物房(经严格消毒,无鸡球虫卵囊污染环境),隔离笼养。按常规饲喂饲料,自由采食饮水,饲养至14日龄,按体重随机分组,分笼饲养。
1.2 试验药物
试验药物的制备步骤如下:
(1)按照实施例1的方法培养活性酵母菌培养物至菌含量达9.0×108 CFU/mL;
(2)以实施例2中中药复方提取液1号的配方及制备方法制备中药复方提取液;
(3)以实施例3中发酵滤液5号的制备方法制备发酵滤液;
(4)将实施例3制备得到的发酵滤液离心浓缩,(4℃,5000 rpm的条件下,离心10 min),收集管底复合药物沉淀。沉淀中加入基础冻干保护剂和蛋白稳定剂(w/w,质量百分比,7 %脱脂奶粉、4 %甘油、12 %蔗糖、10 %的β-环糊精,67%的药物沉淀),混匀,调整pH值为6.0,平衡时间为60 min。-20 ℃预冻12 h,真空冷冻干燥24 h,得到复合药物散剂。
使用方法:拌料混饲,1 次/天,5 天为1个疗程。试验分为6个药物剂量组,散剂添加量分别为50、100、200、300、400、500 mg/kg鸡重量,饲料拌服给药,连续给药7天。
对照药物:地克珠利,购自江苏南农高科动物药业有限公司,按生产厂家说明书推荐剂量1.0 mg/kg剂量给药。
1.3 试验虫株
柔嫩艾美耳球虫(对尼卡巴嗪轻度抗药,对常山酮和克球粉中度抗药,对球痢灵、氯羟吡啶、马杜拉霉素、拉沙洛菌素、盐霉素、莫能霉素严重抗药),由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
1.4 抗球虫试验
1.4.1 试验动物分组与给药
雏鸡饲养至12日龄时,连续两天对试验鸡进行粪便检查,确定无球虫感染后,于14日龄开始试验。选取90只健康无球虫雏鸡,逐只称重,选取体重相近雏鸡,随机分为9个组,每组10只。6个药物剂量组(饲料拌服给药)、地克珠利对照组(1.0 mg/kg,拌服给药)、感染对照组(红对照组)和健康对照组(白对照组)。除白对照组外,其余各感染组每只鸡经口接种完全孢子化卵囊6万个(卵囊为柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊),接种24 h后,开始给药,连续给药7天。
1.4.2 临床及病理剖检观察
接种柔嫩艾美耳球虫后,观察和记录各组试验鸡的发病情况及临床表现。感染后第3天,每天检查粪便,记录血便情况,直至试验结束。感染后第5-8天,每天收集粪便称重,用麦氏虫卵计数法(饱和盐水漂浮法)计算每克粪便卵囊数(Oocysts per gramme,OPG)。于第8天试验结束后,对每组存活鸡进行单只称重,计算各组增重率。然后全部扑杀,收集各组鸡盲肠,纵向剪开,按Johnson & Reid(1970)病变记分法,对每组鸡盲肠进行病变计分。同时,收集各组盲肠内容物及粘膜上皮组织,进行盲肠卵囊量计数。
1.5 药物疗效评定指标和标准
1.5.1 增重率 =(试验结束后平均体重-试验开始时的平均体重)/ 试验开始时的平均体重×100 %。
1.5.2 相对增重率 =(感染试验组的平均增重率÷健康对照组平均增重率)×100%。
1.5.3 病变记分 试验期间每日观察各组鸡的精神、食欲、粪便、死亡等情况,并记录结果。对试验期间死亡的鸡进行尸体解剖,参考Johnson & Reid评价标准,观察其病理学变化。
病变记分在0~4+ 范围之内,0表示未见异常,4+ 表示最严重病变,盲肠出血严重,高度肿胀,肠腔内充满凝血及黏膜碎片。试验中因球虫病死亡的鸡只,其肠道病变记分均记为4分。
病变值=每组鸡的平均病变记分×10。
1.5.4 粪便记分 参照Morehouse和Baron(1970)评价标准,非正常粪便记分在0~4+ 范围之内,0表示未见异常,4+ 表示最严重的异常稀粪,粪便中带有血液和黏液。
1.5.5 存活率:存活率(%)=(存活鸡只数 / 开始鸡只数)×100 %。
1.5.6 卵囊值:按角田清值方法计算,以感染对照组的卵囊量为100 %(40分)。
1.5.7 抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI)
根据各组试验鸡的相对增重率、存活率、病变值和卵囊值,按美国Merck公司的方法,计算抗球虫指数ACI。
以ACI为标准判定药物疗效,ACI ≤ 120 为无效;ACI介于120~160为低效;ACI介于160~180为中效;ACI >180为高效。
ACI =(相对增重率+存活率)×100 -(病变值+卵囊值)。
2 试验结果
2.1 临床症状及血便情况
接种球虫后第3 d,除白对照组鸡只外,其他感染试验组鸡只均表现出不同程度的临床症状,如采食量减少、羽毛蓬乱、两翼下垂、缩头缩颈、闭眼昏睡、不愿走动、离群呆立、排血便等情况。
接种球虫后第4 d和第5 d,除白对照组粪便记分为0外,红对照组鸡只仍表现排出大量血便症状(粪便记分为4),所有药物剂量组的鸡只其血便明显减少,精神状况和采食量出现明显好转迹象(粪便记分为3)。
2.2 病理解剖学变化
病理解剖发现,所有白对照组试验鸡只,其脏器均正常。红对照组试验鸡只,盲肠和十二指肠显著肿胀,内含大量血样内容物。所有药物剂量组试验鸡只,盲肠及十二指肠亦出现肿胀、血样性内容物,但病变程度较感染对照组明显减轻,其他脏器未见明显眼观病变。病变值见表1。
2.3 抗球虫效果
通过相对增重率、存活率、卵囊值和病变值等指标计算ACI,由表1可知,试验药物各药物剂量组的ACI值分别为89.7、128.2、155.8、163.7、165.7和157.0,均高于红对照组(ACI为68.7);200、300、400和500 mg/kg鸡重量剂量组其ACI值均高于地克珠利药物组(ACI值为134.8)。
表1 发酵滤液5号散剂抗柔嫩艾美耳球虫的疗效结果
3. 结 论:
药物按200、300、400和500 mg/kg鸡重量剂量饲料拌服给药,可以提高试验鸡只的增重率,对人工感染E.tenella的发病试验鸡只具有良好的治疗效果,其中300和400 mg/kg鸡重量剂量组的抗球虫指数均高于160,属于中等疗效,且显著高于地克珠利药物对照组和红对照组。
鉴于试验存在虫株毒力较强,且攻虫量偏大的情况,通过本次抗球虫疗效观察试验,证实人工感染条件下试验药物能有效预防鸡球虫病,较化学药物地克珠利具有更好的抗球虫疗效。说明本发明的中药提取物经活性酵母培养物厌氧发酵后,低毒低残留、安全范围大,疗效对比试验效果理想,有望成为新型抗球虫药物。
实施例7 本发明的益生药物发酵前后效果对比实验
急性毒性结果证实,相较于未发酵药物,本发明的发酵后药物可减轻小鼠腹泻症状,药物LD50由2032.2 mg/kg升高至3679.8 mg/kg,毒性级别明显降低。其次,使用本发明的发酵后的药物,组织脏器病理组织学检查未见异常病理变化,小鼠肝脏、肾脏未发现损伤、淤血、变大。光镜下肝小叶轮廓清楚,肝细胞无变形、坏死。而未发酵药物灌服后临床可见小鼠有精神沉郁及扎堆反应,剖检可见肝脏有充血、淤血现象,且光镜下肝细胞呈弥漫性改变,肝窦明显淤血、扩张,肝细胞变形、坏死,肾脏表现为细胞肿胀,颗粒变性和透明变性。
本发明的发酵后药物提取物的多糖总含量较未发酵增加3.57倍(苯酚-硫酸法测定),高效液相色谱和药物稳定性检测结果表明,常山乙素和常山甲素的含量分别提高19 %和16 %。慢性毒性试验证实,相较于未发酵药物,发酵后的药物可显著提高大鼠平均日采食量(由11.3 g/d提高至15.2 g/d)和饲料利用率(料重比由9.9降为5.8),提高平均日增重(由1.33 g/d提高至2.67 g/d),促生长、促增重效果较好。眼观未见大鼠腹泻、便血症状,用药安全性进一步提高。临床治疗试验中,相较于未发酵药物,服用发酵药物的试验鸡只,盲肠、十二指肠未见明显肿胀和血样内容物,肠黏膜未见明显充血出血现象,部分鸡只眼观可见派尔集合***(证实肠道黏膜免疫提高)。鸡只相对增重率提高11个百分点,抗球虫指数由142.3提高至165.7。)
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗鸡球虫益生药物的制备方法,其特征在于:所述益生药物是由中药复方提取液经酿酒酵母兼性厌氧发酵制备得到的;所述中药复方提取液是将以下质量份数的各原料药混合后,水提而成:常山60-90份、草果30-60份、地锦草40-60份、马齿苋30-50份、铁苋菜20-40份、乌韭10-30份、甘草10-30份、乌梅20-40份、陈皮20-50份、神曲10-30份。
2.根据权利要求1所述的抗鸡球虫益生药物的制备方法,其特征在于:所述中药复方提取液是将以下质量份数的各原料药混合后,水提而成:常山80份、草果40份、地锦草50份、马齿苋40份、铁苋菜30份、乌韭20份、甘草20份、乌梅30份、陈皮40份、神曲20份。
3.根据权利要求1或2所述的抗鸡球虫益生药物的制备方法,其特征在于:所述中药复方提取液的制备方法为:将各原料药粉碎,按配方量称取重量份的各原料药,加入中药总重量6-10 倍量的去离子水,浸泡30-60 分钟,煎煮40-60 分钟,过滤去渣;滤渣再加3-5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣;滤渣再加3-5 倍量的去离子水,煎煮40 分钟,过滤去渣,合并上述3次的煎煮过滤液。
4.根据权利要求1或2所述的抗鸡球虫益生药物的制备方法,其特征在于:所述中药复方提取液的发酵方法为:在所述中药复方提取液中,加入饴糖200-300 g/L、麦芽汁100-200mL/L、MgSO4 5.0 g/L、FeSO4 3.0 g/L,灭菌冷却至28-32℃,接种酿酒酵母,接种量为8-10%,在35 ℃,无菌发酵室中,摇床进行兼性厌氧发酵培养,至液面长出白色菌膜为止。
5.根据权利要求1或2所述的抗鸡球虫益生药物的制备方法,其特征在于:所述酿酒酵母的菌株编号为CVCC 2.1011,作为优选,菌含量为9.0×108 CFU/mL。
6.应用权利要求1-5任一所述的方法制备得到的抗鸡球虫益生药物。
7.根据权利要求6所述的抗鸡球虫益生药物,其特征在于:将发酵得到的发酵滤液去除液面菌膜,得到益生药物的口服饮水剂。
8.根据权利要求6所述的抗鸡球虫益生药物,其特征在于:将发酵得到的发酵滤液离心浓缩,作为优选,所述离心浓缩时的温度为4℃,转速为5000-7000rpm,离心时间为8-10min,收集沉淀,在沉淀中加入基础冻干保护剂和蛋白稳定剂,混匀,调整pH值,平衡,冷冻干燥后,得到益生药物的散剂。
9.权利要求6-8任一所述的抗鸡球虫益生药物在制备治疗鸡球虫病的药物或饲料添加剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述鸡球虫病为柔嫩艾美尔球虫所致的鸡球虫病。
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