CN107326062A - 一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,包括如下步骤:S1、抽取一定量(约15ml)脐血样本,进行传染病六项检测;S2、将通过六项检测后的脐血样本进行冻存细胞制品(P2代)检定;S3、进行发放(复苏)细胞检定;S4、按要求完成包装、冻存、运输及有效期的标定。本发明使得脐带间充质干细胞质量的评估全过程能够标准化、规范化、程序化,产品能被质量管理体系所控制。
Description
技术领域
本发明涉及医疗领域,具体涉及一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法。
背景技术
间充质干细胞用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞,这两类细胞都具有间充质干细胞共同的特点低免疫源性,特别是后者更为明显。脐带中组织结构简单,除了主要的大血管,其余均以***为主,造成了脐带间充质干细胞基本未与抗原接触,所以免疫源性很低,这极大的增加了临床应用的可能性。脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物,而且具有更大的应用潜能。已经有较多的报道关于脐带间充质干细胞的制备。如何快速、有效地制备高品质的间充质干细胞用于临床和科研是目前干细胞的热点研究内容之一。目前尚未有关于脐带间充质干细胞制剂的质量评估方法的资料公开。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,包括如下步骤:
S1、抽取一定量(约15ml)脐血样本,进行传染病六项检测;
S2、将通过六项检测后的脐血样本进行冻存细胞制品(P2代)检定;
S3、进行发放(复苏)细胞检定;
S4、按要求完成包装、冻存、运输及有效期的标定。
其中,所述六项检测包括HbsAg、抗-HCV、***抗体、抗-HIV、巨细胞病毒和ALT的检测;其中前四者采用酶联免疫法检测,检测结果应为阴性;巨细胞病毒采用酶联免疫法检测,IgG和IgM的检测结果应为阴性;ALT采用速率法检测,检测结果应≤40单位。
其中,所述步骤S2具体包括如下步骤:
S21、细胞活率的检测;
S22、通过倒置显微镜进行细胞形态的观察,收集的贴壁细胞应为成纤维状梭形细胞;
S23、间充质干细胞表型特征的检测
将样本按条码号顺序排列好,每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支,分别标记好同型对照管和抗体管;将样本移入专用流式管,500g离心5分钟;弃上清,再加入1ml PBS,充分混匀,500g离心5分钟,弃上清,再加入适当体积的PBS悬浮细胞沉淀;在两管中分别加入样本100μl细胞悬液;在相应的管中分别加入相应量抗体以及相应的同型对照试剂;充分混匀,置4℃冰箱避光孵育30分钟。加入1ml PBS,充分混匀,500g离心5分钟;弃上清液,然后加入1mL PBS清洗,充分混匀,500g离心5分钟;弃上清液,加入适量PBS,充分混匀,调整细胞至合适浓度,随后上机检测;在复苏冻存细胞直接检测或必要时复苏冻存细胞再培养72h后检测中,至少有一个检测点的结果应完全符合以下要求:阳性抗原:CD29,CD44,CD73,CD90,CD105(其中CD29,CD44作为抽检指标,1次/年),阳性指标表达率≥95%;阴性抗原:CD14,CD19,CD34,CD45,HLA-DR,阴性指标表达率≤2%;
S24、取细胞末次洗涤上清液30ml,依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测,检测结果应符合规定;
S25、取细胞悬液100μl,依《支原体检测标准操作程序》进行支原体检测,检测结果应符合规定;
S26、内毒素检测:取细胞悬液0.5ml,依《内毒素检测标准操作程序》检测,应符合规定;
S27、取细胞悬液,依《核型分析标准操作程序》进行核型分析,细胞应在染色体水平保持稳定;
S28、取细胞悬液,依《基因组甲基化检测标准操作程序》进行基因组甲基化检测,基因组的甲基化水平应无变化;
S29、取细胞悬液,依《端粒酶活性检测标准操作程序》进行端粒酶活性检测,细胞端粒酶活性应无变化。
其中,所述步骤S3具体包括如下步骤:
S31、消化收集细胞,以氯化钠注射液制成终浓度为1~2×106/ml的单细胞悬液,吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀,取10μl混合悬液,与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘,重复该动作,将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满;将计数板平放在显微镜的载物台上计数;单室计数细胞不得少于400个;观察蓝染细胞占总细胞数比例。蓝染细胞数应小于15%,细胞活率应大于85%;
S32、取细胞末次洗涤上清液30ml,依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测,结果应符合规定;
S33、每次发放的细胞,分装结束后,从(最后一步)分装容器中取残余的细胞悬液少许,进行革兰氏染色检测,应无革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
其中,所述步骤S21采用台盼蓝染色法,具体包括如下步骤:消化收集细胞,以氯化钠注射液制成终浓度为1~2×106/ml的单细胞悬液,吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀,取10μl混合悬液,与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘,重复该动作,将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满;将计数板平放在显微镜的载物台上计数;单室计数细胞不得少于400个;观察蓝染细胞占总细胞数比例;蓝染细胞数应小于15%,细胞活率应大于85%。
其中,所述步骤S21采用CASY-TT快速细胞分析仪检测,细胞活率应大于85%。
本发明具有以下有益效果:
使得脐带间充质干细胞质量的评估全过程能够标准化、规范化、程序化,产品能被质量管理体系所控制。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例
一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,包括如下步骤:
S1、抽取一定量(约15ml)脐血样本,进行传染病六项检测;所述六项检测包括HbsAg、抗-HCV、***抗体、抗-HIV、巨细胞病毒和ALT的检测;其中前四者采用酶联免疫法检测,检测结果应为阴性;巨细胞病毒采用酶联免疫法检测,IgG和IgM的检测结果应为阴性;ALT采用速率法检测,检测结果应≤40单位。
S2、将通过六项检测后的脐血样本进行冻存细胞制品(P2代)检定;具体包括如下步骤:
S21、细胞活率的检测;
方法一:采用台盼蓝染色法,具体包括如下步骤:消化收集细胞,以氯化钠注射液制成终浓度为1~2×106/ml的单细胞悬液,吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀,取10μl混合悬液,与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘,重复该动作,将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满;将计数板平放在显微镜的载物台上计数;单室计数细胞不得少于400个;观察蓝染细胞占总细胞数比例;蓝染细胞数应小于15%,细胞活率应大于85%。
方法二、采用CASY-TT快速细胞分析仪检测,细胞活率应大于85%。
S22、通过倒置显微镜进行细胞形态的观察,收集的贴壁细胞应为成纤维状梭形细胞;
S23、间充质干细胞表型特征的检测
将样本按条码号顺序排列好,每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支,分别标记好同型对照管和抗体管;将样本移入专用流式管,500g离心5分钟;弃上清,再加入1ml PBS,充分混匀,500g离心5分钟,弃上清,再加入适当体积的PBS悬浮细胞沉淀;在两管中分别加入样本100μl细胞悬液;在相应的管中分别加入相应量抗体以及相应的同型对照试剂;充分混匀,置4℃冰箱避光孵育30分钟。加入1ml PBS,充分混匀,500g离心5分钟;弃上清液,然后加入1mL PBS清洗,充分混匀,500g离心5分钟;弃上清液,加入适量PBS,充分混匀,调整细胞至合适浓度,随后上机检测;在复苏冻存细胞直接检测或必要时复苏冻存细胞再培养72h后检测中,至少有一个检测点的结果应完全符合以下要求:阳性抗原:CD29,CD44,CD73,CD90,CD105(其中CD29,CD44作为抽检指标,1次/年),阳性指标表达率≥95%;阴性抗原:CD14,CD19,CD34,CD45,HLA-DR,阴性指标表达率≤2%;
S24、取细胞末次洗涤上清液30ml,依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测,检测结果应符合规定;
S25、取细胞悬液100μl,依《支原体检测标准操作程序》进行支原体检测,检测结果应符合规定;
S26、内毒素检测:取细胞悬液0.5ml,依《内毒素检测标准操作程序》检测,应符合规定;
S27、取细胞悬液,依《核型分析标准操作程序》进行核型分析,细胞应在染色体水平保持稳定;
S28、取细胞悬液,依《基因组甲基化检测标准操作程序》进行基因组甲基化检测,基因组的甲基化水平应无变化;
S29、取细胞悬液,依《端粒酶活性检测标准操作程序》进行端粒酶活性检测,细胞端粒酶活性应无变化。
S3、进行发放(复苏)细胞检定;具体包括如下步骤:
S31、消化收集细胞,以氯化钠注射液制成终浓度为1~2×106/ml的单细胞悬液,吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀,取10μl混合悬液,与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘,重复该动作,将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满;将计数板平放在显微镜的载物台上计数;单室计数细胞不得少于400个;观察蓝染细胞占总细胞数比例。蓝染细胞数应小于15%,细胞活率应大于85%;
S32、取细胞末次洗涤上清液30ml,依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测,结果应符合规定;
S33、每次发放的细胞,分装结束后,从(最后一步)分装容器中取残余的细胞悬液少许,进行革兰氏染色检测,应无革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
S4、按要求完成包装:使用前根据医嘱,分别取一定数量的细胞悬浮于保存液,终体积及包装如下:
2ml一次性使用细胞冻存管包装,1±0.2ml/管,供腰穿使用;50ml一次性使用塑料血袋包装,其中:30±5ml/袋,供>12岁患者静脉注射用;25±3ml/袋,供≤12岁患者静脉注射用。
S5、进行冻存,保存,运输及有效期
-196℃冻存,有效期暂定10年;6.2 4~10℃冷藏保存及运输。有效期12小时
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、抽取一定量脐血样本,进行传染病六项检测;
S2、将通过六项检测后的脐血样本进行冻存细胞制品检定;
S3、进行发放(复苏)细胞检定;
S4、按要求完成包装、冻存、运输及有效期的标定。
2.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,其特征在于,所述六项检测包括HbsAg、抗-HCV、***抗体、抗-HIV、巨细胞病毒和ALT的检测;其中前四者采用酶联免疫法检测,检测结果应为阴性;巨细胞病毒采用酶联免疫法检测,IgG和IgM的检测结果应为阴性;ALT采用速率法检测,检测结果应≤40单位。
3.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,其特征在于,所述步骤S2具体包括如下步骤:
S21、细胞活率的检测;
S22、通过倒置显微镜进行细胞形态的观察,收集的贴壁细胞应为成纤维状梭形细胞;
S23、间充质干细胞表型特征的检测
将样本按条码号顺序排列好,每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支,分别标记好同型对照管和抗体管;将样本移入专用流式管,500g离心5分钟;弃上清,再加入1ml PBS,充分混匀,500g离心5分钟,弃上清,再加入适当体积的PBS悬浮细胞沉淀;在两管中分别加入样本100μl细胞悬液;在相应的管中分别加入相应量抗体以及相应的同型对照试剂;充分混匀,置4℃冰箱避光孵育30分钟。加入1ml PBS,充分混匀,500g离心5分钟;弃上清液,然后加入1mL PBS清洗,充分混匀,500g离心5分钟;弃上清液,加入适量PBS,充分混匀,调整细胞至合适浓度,随后上机检测;在复苏冻存细胞直接检测或必要时复苏冻存细胞再培养72h后检测中,至少有一个检测点的结果应完全符合以下要求:阳性抗原:CD29,CD44,CD73,CD90,CD105,阳性指标表达率≥95%;阴性抗原:CD14,CD19,CD34,CD45,HLA-DR,阴性指标表达率≤2%;
S24、取细胞末次洗涤上清液30ml,依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测,检测结果应符合规定;
S25、取细胞悬液100μl,依《支原体检测标准操作程序》进行支原体检测,检测结果应符合规定;
S26、内毒素检测:取细胞悬液0.5ml,依《内毒素检测标准操作程序》检测,应符合规定;
S27、取细胞悬液,依《核型分析标准操作程序》进行核型分析,细胞应在染色体水平保持稳定;
S28、取细胞悬液,依《基因组甲基化检测标准操作程序》进行基因组甲基化检测,基因组的甲基化水平应无变化;
S29、取细胞悬液,依《端粒酶活性检测标准操作程序》进行端粒酶活性检测,细胞端粒酶活性应无变化。
4.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,其特征在于,所述步骤S3具体包括如下步骤:
S31、消化收集细胞,以氯化钠注射液制成终浓度为1~2×106/ml的单细胞悬液,吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀,取10μl混合悬液,与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘,重复该动作,将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满;将计数板平放在显微镜的载物台上计数;单室计数细胞不得少于400个;观察蓝染细胞占总细胞数比例。蓝染细胞数应小于15%,细胞活率应大于85%;
S32、取细胞末次洗涤上清液30ml,依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测,结果应符合规定;
S33、每次发放的细胞,分装结束后,从最后一步分装容器中取残余的细胞悬液少许,进行革兰氏染色检测,应无革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
5.如权利要求3所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,其特征在于,所述步骤S21采用台盼蓝染色法,具体包括如下步骤:消化收集细胞,以氯化钠注射液制成终浓度为1~2×106/ml的单细胞悬液,吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀,取10μl混合悬液,与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘,重复该动作,将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满;将计数板平放在显微镜的载物台上计数;单室计数细胞不得少于400个;观察蓝染细胞占总细胞数比例;蓝染细胞数应小于15%,细胞活率应大于85%。
6.如权利要求3所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法,其特征在于,所述步骤S21采用CASY-TT快速细胞分析仪检测,细胞活率应大于85%。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171107 |
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