CN102154202A - 储存宫内膜干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种储存宫内膜干细胞的方法，依次包括以下步骤：1）准备采集套装和配制培养基；2）经血收集；3）无菌检查；4）宫内膜干细胞分离培养：将步骤2）所得的采集管1内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；将上述所得的单个核细胞接种于Chang完全培养基中，单个核细胞的接种密度为1*10⁵~1*10⁶/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂培养箱中进行培养；5）细胞扩增和纯化；6）细胞冻存。采用本发明的方法能获得纯度较高、数量较大的目标细胞即宫内膜干细胞。

Description

储存宫内膜干细胞的方法

技术领域

本发明属于细胞分离培养与保存相关技术，尤其是从经血中分离宫内膜间充质干细胞，宫内膜干细胞株的建立，以及相应的培养和保存技术。

背景技术

干细胞技术是当今生命科学中最热门的技术之一，其研究内容几乎涉及所有生命科学的生物医学领域，除了在细胞治疗、组织/器官移植和基因治疗中发挥重要作用外，还在发现新基因、基因功能分析、发育生物学模型及新药开发等方面产生重要影响。近几年来，干细胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最权威的美国《Science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的10大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列为第一位。干细胞很可能在医学领域引发革命性进步，因而具有不可估量的医学价值，引起了全世界的广泛关注和研究，美国《时代》周刊认为干细胞和人类基因组计划将同时成为新世纪最具有发展和应用前景的领域。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。其中，研究最为广泛的MSCs是来源于骨髓的间充质干细胞，尽管其伦理问题与胚胎干细胞相比大为减少，但骨髓细胞必须通过侵入的途径获得，而且随着年龄的增长，干细胞数量显著减少。

众所周知，子宫内膜细胞系具有很强的自我更新能力。在每个***都会有组织和血管的大量增长，这一增长过程会随着***的结束而停止。美日中等多国科学家的最新研究显示在随女性经血脱落的子宫内膜组织中，具有相当数量的间充质干细胞(基质干细胞)——宫内膜干细胞，数量为骨髓来源的30倍；这些干细胞活力更强，更强的自我更新和增殖能力(如心肌细胞的培育效率为传统利用骨髓细胞培育的100倍)，分化潜能更接近胚胎干细胞。有研究发现子宫内膜的再生细胞(ERC)不仅具有几乎每24小时复制一次的惊人速率，而且它们产生独特生长因子的速率，比来自于脐带血的干细胞要大上10万倍。如果把这些干细胞通过科学的方法储存起来，在女性未来的一生中，一旦发生肿瘤等重大疾病或意外严重伤害时，就可立即做自体干细胞的移植，恢复健康，减轻自己及家人的经济负担，减轻社会负担，还有可能实现女性梦寐以求的“青春常在”、“红颜永驻”的美好愿望，拥有高品质的人生。女性的宫内膜干细胞不但可用于本人，还可为她的子女、相关亲属(如堂表弟妹，甚至父母)等人的临床应用。

由于国内所实行的独生子女政策，一旦患血液***恶性疾病和遗传性疾病，就只能采用异基因干细胞移植，宫内膜干细胞是异基因干细胞移植最丰富最好的资源。一旦储存了宫内膜干细胞，就相当于为其整个家族建立了一个预防和***及其它相关需干细胞治疗疾病的生命银行。储存的宫内膜干细胞还可供全国和全世界患者选择作干细胞移植用，并逐步替代价格昂贵、难以找到配型相合的骨髓干细胞。全世界等待干细胞移植的患者数以亿计，仅白血病在我国的发病率就达十万分之三、四，即每年新增四万名左右的患者，而累计的白血病患者约有四百万，其中大部分是儿童，他们都急需通过干细胞移植来救治。

目前有经血标本的储存方法是获得经血标本后，经过初步分离，去除大部分的红细胞，然后直接添加冻存液冻存。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种储存宫内膜干细胞的方法。本发明针对现有干细胞来源困难或受伦理限制等问题，寻找一种更为高效的来源广泛且不受伦理限制的宫内膜干细胞分离和培养方法。在此基础上，扩增和纯化干细胞，并对所培养的干细胞进行形态和功能鉴定，从而建立具有干细胞特性的新型干细胞株，然后再将优质的干细胞资源储存。本发明的优越之处在于女性废弃的月经血来源广泛，干细胞含量丰富，先通过高效的分离方法能够保证被储存的干细胞的质量。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种储存宫内膜干细胞的方法，依次包括以下步骤：

1)、准备采集套装和配制培养基：

采集管1：装有20ml Hank′s平衡盐溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素(Vancomycin)60～100μg/mL、头孢氨苄(Claforan)150～350μg/mL、卡那霉素(Amikacin)50～150μg/mL、庆大霉素(Gentamycin)80～160μg/mL、两性霉素B(Amphotericin B)2～3μg/mL及300～500单位肝素；

采集管2：装有10ml Hank′s平衡盐溶液(HBSS)，并添加150～250单位肝素；

配制Chang完全培养基：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL MEM-alpha培养基(MEM alpha，Invitrogen公司)、16～20mL Chang B基液(Irvine Scientific公司)、1～3mL Chang C基液(Irvine Scientific公司)、1～3mL青霉素或者链霉素(Penicillin/Streptomycin，Invitrogen公司，或者为青霉素硫酸盐或者链霉素硫酸盐)、1～3mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen公司)、10～20mL的胎牛血清(ES-FBS，Invitrogen公司)，充分混匀，置4℃冰箱待用；

2)、经血收集：

收集月经开始的第二或第三天的经血；在采集管1内加入15～20ml的经血，在采集管2内加入5～10ml的经血；并于0～4℃的低温下保存，所述保存期≤48h；

3)、无菌检查：

将采集管2将离心处理后，得上清液；将上清液按照血培养法进行厌氧菌和需氧菌检查，并鉴定；若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序；

4)、宫内膜干细胞分离培养：

将步骤2)所得的采集管1内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；

将上述所得的单个核细胞接种于Chang完全培养基中，单个核细胞的接种密度为1*10⁵～1*10⁶/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养；

5)、细胞扩增和纯化：

待步骤4)的单个核细胞接种于Chang完全培养基中开始细胞培养的4～5天后，更换Chang完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3～4天全量换液一次(可根据细胞生长状况而定，全量换液即指换掉全部的Chang完全培养基)；待细胞生长达到80％～90％融合时，用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶(一般每1～20ml的细胞中使用1ml的所述胰蛋白酶)消化收集细胞，然后按5000-6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代；

6)、细胞冻存：

待步骤5)的P1代细胞铺满容器底部后，用质量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1～2*10⁶/ml；冻存液为：在9体积份的Chang完全培养基中加入1体积份的DMSO(calbiochem公司)制备而得(即为含有10％DMSO的Chang完全培养基)；

将上述被冻存液重悬的细胞进行冻存，冻存步骤如下：

第一步：4℃，等待(即温度降至4℃后，进入第二步)；

第二步1.0℃/分钟降至-3.0℃(箱体，即为箱体温度)；

第三步10.0℃/分钟降至-20.0℃(箱体)；

第四步1.0℃/分钟降至-40.0℃(箱体)；

第五步10.0℃/分钟降至-90.0℃(箱体)；

第六步 结束；

取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

作为本发明的储存宫内膜干细胞的方法的改进：步骤4)中的密度梯度离心法为：将过滤后所得的混合液离心(例如1600g离心10分钟)，去除上清后，得血液；

用PBS稀释血液，PBS与血液的体积比为：1.5～2.5∶1；将稀释后的血液加至人淋巴细胞分离液上，稀释后的血液与人淋巴细胞分离液的体积比为1.5～2.5∶1，离心(例如600g离心15分钟)，离心完毕后，离心管内出现明显的分层，吸出中间白膜层即单个核细胞。

在本发明中，步骤3)的无菌检查和步骤4)的内膜干细胞分离培养可同步进行，原因是：无菌检查需要较长周期，因此，不能等到无菌培养出结果后再进行细胞的分离培养。如步骤3)的监测结果为阳性，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序。

现在世界上大部分干细胞库的做法是从人体取得干细胞(或混有干细胞的其他组织，人脐带、羊水、外周血等)后，稍加分离即进行冻存，等到需要时再将冻存的细胞复苏、培养增殖。

本发明的优越之处在于从人体取得经血标本后，经过密度梯度分离后，去除大部分红细胞，再进行纯化扩增培养，获得纯度较高、数量较大的目标细胞即宫内膜干细胞，再进行冻存，这样就保证了冻存细胞的质量，且以后需要用到该份细胞，复苏后的培养时间也较其他方法短得多。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是实施例1中培养不同时间的宫内膜干细胞放大100倍的显微照片；

A为P0代换液4天，100X；B为P1代3天，100X；C为P2代3天，100X；D为P7代3天，100X；E为P22代3天，100X；

图2是实施例1中流式细胞分析结果图。

具体实施方式

实施例1：储存宫内膜干细胞的方法，即人宫内膜干细胞的分离、培养、扩增及冻存、复苏；依次进行以下步骤：

1)、准备采集套装和配制培养基：

采集管1：装有20ml Hank′s平衡盐溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素(Vancomycin)70μg/mL、头孢氨苄(Claforan)200μg/mL、卡那霉素(Amikacin)100μg/mL、庆大霉素(Gentamycin)140μg/mL、两性霉素B(Amphotericin B)2.5μg/mL及添加400单位肝素。

采集管2：装有10ml HBSS(Hank′s平衡盐溶液)，并添加180单位肝素。

在开始步骤2)的收集经血以前，要将上述采集管1和采集管2在4℃环境下存放。

配制Chang完全培养基：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL MEM-alpha培养基(MEM alpha，Invitrogen公司)、16mL Chang B基液(Irvine Scientific公司)、2.5mL Chang C基液(Irvine Scientific公司)、1mL青霉素(内含0.25g作为有效成分的青霉素钾盐)、1mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen公司)、15mL ES-FBS(胎牛血清，Invitrogen公司)，充分混匀，置4℃冰箱待用。

2)、经血收集：

在志愿者(42岁，已签订知情同意书)月经开始的第二天，采取半蹲或全蹲的姿势，将月事杯对折两次后，放入***内。两小时后小心取出，将月事杯中的经血20ml倒入采集管1(事先含有步骤1)所述的特定采集液)中；再按照以上步骤重复操作，在采集管2(事先含有步骤1)所述的特定采集液)内加入10ml的经血。

将所得的采集管1和采集管2放入摇床孵育，温度设置为4℃。

3)、无菌检查：

将摇床孵育24小时后的采集管2进行离心处理(1600g离心10分钟)后，得上清液；将所述上清液按照常规的血培养法进行厌氧菌和需氧菌检查，并按照常规方法进行鉴定。若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序。

4)、宫内膜干细胞分离培养：

将摇床孵育24小时后的采集管1中的样品用电动移液器吹打混匀，再过滤样品中的血块及粘液，接着转移至50ml离心管中；配平离心管，1600g离心10分钟，离心机降速调至最低档；然后密度梯度离心分离单个核细胞，具体如下：

首先去除离心管中的上清；注意小心吸液，不要扰乱细胞层，造成额外的细胞丢失；

用PBS按一定比例(体积比约为2∶1)稀释已转移上清的血细胞，电动移液器吹打混匀；

在超净工作台中取干净离心管，转移15mL人淋巴细胞分离液至每根50ml离心管中；

铺层加样：将稀释后的血液小心的加至已倒好的人淋巴细胞分离液上(加样时动作要轻柔，避免冲散分层液面或与分层液面混合而影响分离效果)，稀释后的血液和人淋巴细胞分离液的体积比为2∶1；

配平离心管，600g离心15分钟，离心机升降速要调至最低速挡，确保离心稳定，分层清晰；

提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上依次为红细胞层、粒细胞层、分离液层、单核细胞(MNC)层和血浆层；

吸出单个核细胞层：把吸管或移液管直接伸入单个核细胞层，先吸该层中央部分细胞，再吸取四周细胞，动作要轻柔，保证不把该层细胞吹散。如果分离液层和MNC层呈乳白色，界面不清楚，提示含有较多单个核细胞，酌情吸取分离液层，速度要缓慢，确保不吸取到红细胞层；

洗涤细胞：吸出的单个核细胞混有部分细胞分离液，需用PBS加以洗涤；用电动移液器加PBS将细胞稀释两倍以上，混匀，200g离心10分钟；离心完毕后，小心取出离心管，去除上清；重复此步骤一次；

细胞计数：将以上所得细胞充分混匀，用台盘蓝染色，计数活细胞；

接种细胞：根据细胞计数结果，调整细胞密度至2*10⁵/ml接种于75cm²培养瓶内(内装10ml的Chang完全培养基)。当然，接种时的细胞密度可采用1*10⁵-1*10⁶/ml。

5)、细胞扩增和纯化：

细胞培养于75cm²培养瓶中(内设含有密度为2*10⁵/ml细胞的Chang完全培养基10ml)，置于培养箱内，瓶盖拧松半圈，确保瓶内空气与培养箱内空气相通，保持培养箱37℃、饱和湿度、CO₂体积浓度5％的状态开始培养。

4天后，从CO₂培养箱中取出细胞培养瓶，在无菌条件下去除瓶中的培养基，弃除未贴壁细胞，添加10mL Chang完全培养基到培养瓶中，再次放入CO₂培养箱培养，根据细胞生长情况，每3-4天全量换液一次(即全量更换Chang完全培养基一次)。待细胞达到80％-90％融合时，在每个培养瓶中加入1mL 0.25％(质量浓度)的胰蛋白酶消化，水平方向轻轻摇晃，使胰酶铺满平底，作用1分钟后，倒置显微镜下观察消化效果，待大部分细胞缩至圆形后，再加入10mL Chang完全培养基终止消化；然后按按5000-6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中，根据细胞生长情况，每3-4天进行全量或半量换液，直至细胞再次融合，铺满平底，重复以上操作进行传代，记为P2代，依此操作进行传代。

细胞原代培养3-4天全量换液后，去除未贴壁细胞，镜下观察，可见较多几个细胞聚集在一起的克隆，细胞增殖迅速，其倍增时间大约为24-36小时，2天后细胞形态呈均匀长梭形，培养4-5天后细胞可达到80％-90％融合，细胞呈漩涡状分布。传代后细胞24小时内完全贴壁，3-4天可铺满瓶底，继续传代。体外培养细胞培养至20代后，细胞的增殖速度明显减慢，细胞出现老化现象。

图1显示了培养传代过程中的细胞形态图：A原代培养4天，换液后2天的细胞形态图，可见细胞形态较多，有圆形、多角形、梭形等，此时细胞较杂；B是P1代细胞传代后3天的图，细胞形态趋于一致；C是P2代细胞传代后3天的图，D是P7代细胞传代后3天的图，细胞呈漩涡状排列，此时细胞纯度较高；E是P22代细胞传代后3天的图，细胞密度较低，增殖速度慢，并呈现老化现象。

以上结果说明，从细胞形态来看，本发明分离培养的细胞符合干细胞的特点，细胞的增殖能力较强，本发明中细胞可传代至20代左右。

6)、细胞冻存

选择P1代细胞进行冻存，既保证了冻存时细胞的原始状态，也能够使细胞扩增到足够数量级。

每个试管内装含有密度为1-2*10⁶/ml的P1代细胞1ml。

待P1代细胞生长至融合80％-90％后，用1ml质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞。用少量Chang完全培养基重悬细胞，台盘蓝染色，计算细胞数量和细胞活率，确定细胞活率在80％以上，用Chang完全培养基调整细胞密度为2-4*10⁶/ml，加入等体积预冷(4℃)的冻存液(10％DMSO)；然后分装于2ml的冻存管中。采用的冻存液是含有10％DMSO(calbiochem公司)的Chang完全培养基(即，冻存前细胞的终浓度为1-2*10⁶/ml)。

将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序。冻存程序设置如下：

第一步：4℃，等待(即温度降至4℃后，进入第二步)；

第二步1.0℃/分钟降至-3.0℃(箱体)；

第三步10.0℃/分钟降至-20.0℃(箱体)；

第四步1.0℃/分钟降至-40.0℃(箱体)；

第五步10.0℃/分钟降至-90.0℃(箱体)；

第六步结束；

取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

实施例2、细胞复苏培养

将上述实施例1所得的冻存的样本从液氮储存罐中取出，立即放入37℃水浴中解冻。当观察到冻存管内的冰核只有黄豆大小的时候，将冻存管取出，立刻放入冰水混合物中。在无菌条件下，将冻存管中样本轻柔吸出，加入一支50mL无菌离心管中，再立即加入10mL的Chang完全培养基，充分混匀洗涤，在4℃、1000rpm的条件下离心10分钟，去除管中上清。重复操作一次。用台盘蓝进行细胞计数及活率分析。按照10000个/cm²的密度(利用Chang完全培养基)将细胞接种到75cm²培养瓶中，放入37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱培养。根据细胞生长情况，每3-4天全量换液一次，待细胞达到80％-90％融合时，用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，以5000-6000个/cm²密度传代，复苏后细胞形态正常，增殖速度没有改变，传代至20代左右，细胞出现老化现象。

实施例3.流式细胞检测

选择实施例1中所得培养P5代的宫内膜间充质干细胞按如下步骤进行流式检测。

每个试管内装有浓度为5*10⁶/ml的P5代细胞2ml。

1)细胞悬液制备：

用1ml的0.25％(质量浓度)的胰酶将细胞消化下来，500rpm，5min离心，弃上清。加PBS洗2遍，然后2ml PBS重悬细胞，从而使细胞浓度为5*10⁶/ml。

2)4％多聚甲醛(PBS配制)固定15min，然后PBS洗2遍(1500rpm，离心5min)。

3)5％的BSA固定40min。

4)根据流式抗体(直标)稀释度要求每10⁶个细胞/200ul分别加入20ul抗体(CD39、CD44、CD90、CD34、HLA(ABC)、HLA(DR-DP-DQ))，避光，37℃孵育30min。

5)用PBS洗一遍，1500rpm，离心5min，弃上清，再加入500ul PBS重悬，准备上机检测。

6)流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司，型号FC-500。所用抗体来自于贝克顿迪肯森公司(Becton，Dickinson & Company，富兰克林湖，NJ)。根据检测的干细胞大小特点利用前向散射光(FS)、侧向散射光(SS)找到目标细胞群。

根据所选择的抗体的荧光素标记选择流式检测通道，对目标细胞的荧光强弱进行分析，计算出细胞表面标记分子的阳性百分比。具体如图2所示。

从以上实施例可见：本发明方法可以成功从女性经血样品中分离获得人宫内膜干细胞，细胞经过扩增和纯化培养可培养至20代；细胞经过冻存后能够复苏继续传代培养，保持干细胞形态。经过流式细胞检测，复苏细胞表达CD39、CD44、CD90，不表达CD34、HLA(ABC)、HLA(DR-DP-DQ)。表明本发明能够建立人宫内膜干细胞株，本发明的人宫内膜干细胞储存方法实际可行，并具有其他细胞库储存方法不具备的优点。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.储存宫内膜干细胞的方法，其特征是依次包括以下步骤： 

1）、准备采集套装和配制培养基：

采集管1：装有20ml Hank's平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素60~100 μg/mL、头孢氨苄150~350 μg/mL、卡那霉素50~150 μg/mL、庆大霉素80~160 μg/mL、两性霉素B 2~3μg/mL及300~500单位肝素；

采集管2：装有10ml Hank's平衡盐溶液，并添加150~250单位肝素； 

配制Chang 完全培养基：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL MEM-alpha 培养基、16~20mL Chang B基液、1~3mL Chang C基液、1~3mL青霉素或者链霉素、1~3mL浓度为 200 mM的L-谷氨酰胺、10~20mL的胎牛血清，充分混匀，置4℃冰箱待用；

 2）、 经血收集：

收集月经开始的第二或第三天的经血；在采集管1内加入15~20ml的经血，在采集管2内加入5~10ml的经血；并于0~4℃的低温下保存，所述保存期　≤48h；

3）、无菌检查： 

 将采集管2将离心处理后，得上清液；将所述上清液按照血培养法进行厌氧菌和需氧菌检查，并鉴定；若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序；

4）、宫内膜干细胞分离培养：

将步骤2）所得的采集管1内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；

将上述所得的单个核细胞接种于Chang 完全培养基中，单个核细胞的接种密度为1*10⁵~1*10⁶/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂培养箱中进行培养；

5）、细胞扩增和纯化：

待步骤4）的单个核细胞接种于Chang 完全培养基中开始细胞培养的4~5天后，更换Chang 完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3~4天全量换液一次；待细胞生长达到80%~90%融合时，用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，然后按5000-6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代；

6）、细胞冻存：

待步骤5）的P1代细胞铺满容器底部后，用质量百分含量为0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1~2*10⁶/ml；所述冻存液为：在9体积份的Chang 完全培养基中加入1体积份的DMSO制备而得；

将上述被冻存液重悬的细胞进行冻存，冻存步骤如下：

第一步 ：4℃，等待；

第二步 1.0℃/分钟降至-3.0℃；

第三步 10.0℃/分钟降至-20.0℃；

第四步 1.0℃/分钟降至-40.0℃；

第五步 10.0℃/分钟降至-90.0℃；

第六步 结束；

取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

2.根据权利要求1所述的储存宫内膜干细胞的方法，其特征是：所述步骤4）中的密度梯度离心法为：将过滤后所得的混合液离心，去除上清后，得血液；

用PBS稀释血液，所述PBS与血液的体积比为：1.5~2.5：1；将稀释后的血液加至人淋巴细胞分离液上，稀释后的血液与人淋巴细胞分离液的体积比为1.5~2.5：1，离心，离心完毕后，离心管内出现明显的分层，吸出中间白膜层即单个核细胞。

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