CN107302867A - 无菌培养牛樟芝子实体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无菌培养牛樟芝子实体的方法，包括：将牛樟芝菌种接菌至经灭菌的琼脂培养基，进行继代培养，以产生次级菌丝体，并于该继代培养过程中筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体，以及，以该经筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体进行该继代培养，以产生子实体。

Description

无菌培养牛樟芝子实体的方法

技术领域

本发明关于一种培养牛樟芝子实体的方法，尤指一种无菌培养牛樟芝子实体的方法。

背景技术

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属、樟芝种，乃多年生蕈菌类。樟芝为一种木材腐朽真菌，只生长在台湾本土的老龄牛樟树上。菇体表面孔状，初生时鲜红色，渐长变为乳白色、淡红褐色、淡褐色或淡黄褐色，子实体于牛樟树干的中空内部长出，亦有自倒伏牛樟树枯木底部长出者，有强烈的牛樟香味。

牛樟芝一直以来被视为珍贵的真菌类药材，在许多研究中发现，三帖类化合物(Triterpenoids)是牛樟芝最重要的成分之一，并且牛樟芝的三帖类化合物含量远超过灵芝。此外，牛樟芝中所含有的其他化合物，例如多糖体、超氧歧化酶、腺苷、β-D-葡聚糖等生理活性成分，皆对于人体生理机能可发挥均衡保健的功效。三萜类的主要功能有抑制癌细胞的生长、抑制组织胺的释放，防止过敏、促进肝功能、促进血小板凝集、以及降血脂等作用。三萜类的含量及种类愈多，则愈有医疗价值。从实验证实：三萜类化合物能抑制肝癌细胞的增殖。高血压患者往往因为血压高，导致脑血管破裂而中风，三萜类化合物能有效的抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，进而降低血压。另外三萜类也具有抗发炎的功用。

由于牛樟树已列入国家保育类植物，不准砍伐，牛樟芝采集不易，且品质不一。另外由于环境污染日渐严重，天然野生樟芝可能多少含有重金属污染。因此近年来多以人工栽培方法来培养牛樟芝。根据TWI422680揭示，习知的人工栽培方法包括椴木栽培法、固态栽培法以及液态发酵法。

然而，椴木栽培法无法在无菌的环境中进行，因此容易受到其他微生物的污染，且椴木来源不易控管，也有受到污染的可能。椴木栽培法的牛樟芝在动物实验结果中显示具有肾上腺毒性，也会造成老鼠肝脏与卵巢的重量增加。

固态培养法主要是利用含有营养物质的太空包来培养牛樟芝(即既有栽培香菇的方法)，所得到的牛樟芝其外观虽然与野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，但其三帖类化合物的含量低，并且其他主要成分与野生及/或椴木栽培的牛樟芝子实体并不相同。

再者，一般藉由液态发酵法培养牛樟芝虽然可在短时间内收成牛樟芝液体发酵产品，但其主要产物为多糖类，并不含有三帖类化合物，并且其他主要成分与野生及/或椴木栽培的牛樟芝子实体相去甚远。

有鉴于此，必须提供一种新颖的牛樟芝子实体培养方法，在无菌的环境下可有效的培养出牛樟芝子实体，并且其主要成分如三帖类化合物与野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，以有效达到人体保健的效果。

发明内容

本发明提供一种培养牛樟芝子实体的方法，包括：将牛樟芝菌种接菌至经灭菌的琼脂培养基，以继代培养产生次级菌丝体，并于该继代培养过程中筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体，以及，以该经筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体进行该继代培养，以产生子实体。

前述琼脂培养基包含：YM琼脂培养基质；食用油，且以该琼脂培养基总重计，该食用油的含量为大于0％至1％；以及酵母提取物，且以该琼脂培养基总重计，该酵母提取物的含量为大于3％至5％。前述琼脂培养基中的其余组份为水。

本发明还提供一种培养牛樟芝子实体的方法，是在该琼脂培养基继代培养，以产生无变种及无毒性的次级菌丝体及子实体以后，又自该琼脂培养基筛选出该无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体，并接种该无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体至容器内的经灭菌的固态培养基继续培养出次级菌丝体及子实体。

前述固态培养基包含至少一种谷物的固态部分；以及含有糖类化合物、酵母提取物、及食用油的液态部分，其中，以该液态部分总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％，且该液态部分在该容器内的高度为自该固态部分的半高处至与该固态部分顶面等高处。前述固态培养基中的其余组份为水。

本发明还提供一种培养牛樟芝子实体的方法，是在该琼脂培养基继代培养，以产生无变种及无毒性的次级菌丝体以后，自该琼脂培养基取出该无变种及无毒性的次级菌丝体，并接种该无变种及无毒性的次级菌丝体至容器内的经灭菌的液态培养基培养出子实体，其中，该液态培养基包含：糖类化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以该液态培养基总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％。

本发明还提供一种培养牛樟芝子实体的方法，包括将该固态培养基培养出的无变种及无毒性的次级菌丝体接种至容器内的经灭菌的液态培养基培养出子实体，其中，该液态培养基包含：糖类化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以该液态培养基总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％。

本发明无菌培养牛樟芝子实体的方法是在无菌环境中将牛樟芝菌种接种于琼脂培养基，继代培养，产生无变种及无毒性的次级菌丝体后，藉此可由该无变种及无毒性的次级菌丝体直接培养得到无毒和无污染的牛樟芝子实体，且该牛樟芝子实体具有与野生及/或椴木栽培的牛樟芝相同的指标性成分。

附图说明

图1为继代培养所得的牛樟芝子实体的照片；

图2为固态培养所得的牛樟芝子实体的照片；

图3为固态培养所得的牛樟芝子实体的照片；

图4为液态培养所得的牛樟芝子实体的照片；

图5为市售牛樟芝子实体标准品(含11种标准品)的HPLC图谱；

图6为野生(及/或椴木培养)5.5年龄牛樟芝子实体的HPLC图谱；

图7为本案实施例2固态培养所得的牛樟芝子实体的HPLC图谱；

图8为本案实施例3固态培养所得的牛樟芝子实体的HPLC图谱；

图9为本案实施例4液态培养所得的牛樟芝子实体的HPLC图谱。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，该领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明亦可藉由其它不同的实施方式加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明所揭示的精神下赋予不同的修饰与变更。

本文所述“基质”指在整体重量含量中占50％以上者。

一般，当菌种于适当的环境时可萌发出菌丝，此菌丝细胞含单细胞核，即为初级菌丝体。本文所述“次级菌丝体”指，当两个可亲和的单核菌丝相遇时，接触的菌丝壁会融解，双方的一个细胞核会相互移动到对方的细胞内，进行有丝***，形成双核的菌丝，并以共轭***的方式成长，即称为次级菌丝体。

本发明提供的培养牛樟芝子实体的方法，可于继代培养时获得牛樟芝子实体，或者在继代培养后，接续进行固态培养或液态培养，皆可获得牛樟芝子实体。

在继代培养的部分，包括：将牛樟芝菌种接菌至经灭菌的琼脂培养基，进行继代培养以产生次级菌丝体，并于该继代培养过程中筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体，以及，以该经筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体进行该继代培养，以产生子实体。

琼脂培养基的准备，是以YM琼脂培养基质为基底，混合食用油及酵母提取物，使该琼脂培养基中所含的食用油以该琼脂培养基总重计的含量为大于0％至1％；而该酵母提取物以该琼脂培养基总重计的含量为大于3％至5％。此外，前述酵母提取物可选择一般市售的产品，并无特别限制。

接着将琼脂培养基的溶液置入可灭菌容器中，进行一般常用的灭菌程序，如使用一般实验室微生物培养常见的灭菌釜，藉由于密闭高压下，产生高温饱和的蒸汽进行湿热灭菌，灭菌后，将该琼脂培养基的溶液倒入至少一个培养皿中，静置及待冷却后，形成固态的琼脂培养基。之后，将牛樟芝菌种接菌至该琼脂培养基进行继代培养，发明人意外地发现于特定环境下继代培养，可生长出牛樟芝的次级菌丝体，接着生长出颗粒状牛樟芝子实体，该牛樟芝子实体所含的三萜类成份，非常接近于野生及/或椴木培养的牛樟芝的三萜类成份。

于继代培养过程中，该无变种及无毒性的次级菌丝体是在培养出至少第1继代后(包含第1继代)筛选的，并继续进行该继代培养以产生牛樟芝子实体。

于继代培养的过程中，例如在第1继代时，即可筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体，继续进行该继代培养以产生牛樟芝子实体。

此外，本发明培养牛樟芝子实体的方法中，该食用油为任何可食用的油脂，如植物油、动物油或食用精油，优选牛樟芝精油。优选地，以该琼脂培养基总重计，该食用油的含量为0.5％。

于一具体实施例中，是在该琼脂培养基继代培养，以产生无变种及无毒性的次级菌丝体及子实体以后，自该琼脂培养基筛选出该无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体，并接种该无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体至容器内经灭菌的固态培养基，培养出无变种及无毒性的次级菌丝体及子实体。此外，可自该琼脂培养基取出不同继代的无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体进行杂交培养。

前述固态培养基包含至少一种谷物的固态部分；以及含有糖类化合物、酵母提取物、及食用油的液态部分。于一具体实施例中，该固态部分包含复数种谷物，例如二种谷物，且以该固态部分总重计，各该谷物的含量为40至60％。在非限制性的实例中，谷物选自如黑糯米的米或可选自燕麦米。

于一具体实施例中，该固态部分包含40至60％黑糯米及40至60％燕麦米，优选50％黑糯米及50％燕麦米。

该糖类化合物的选择上并没有特别限制，可选自单糖或双糖，于一具体实施例中，该糖类化合物为选自葡萄糖、甘露糖及海藻糖所组成组的至少一者。

该固态培养基中，以该液态部分总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％，且该液态部分在该容器内的高度为自该固态部分的半高处至与该固态部分顶面等高处。于一具体实施例中，该液态部分包含20％酵母提取物、20％葡萄糖、20％甘露糖、20％海藻糖及0.5％牛樟芝精油。

在进行固态培养前，先将该固态培养基置入可灭菌容器中，进行一般常用的灭菌程序，接着，自该琼脂培养基筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体，并接种该无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体至容器内该经灭菌的固态培养基继续培养出子实体。通常，自该琼脂培养基筛选出的无变种及无毒性的次级菌丝体，经固态培养20天至1个月，可继续生成次级菌丝体，进行变种及毒性的筛选，仅筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体再继续培养1个月到3个月，可生成牛樟芝子实体。若自该琼脂培养基筛选出无变种及无毒性的子实体，经培养3个月至6个月，可生成牛樟芝子实体。

于另一具体实施例中，是在该琼脂培养基继代培养，以产生无变种及无毒性的次级菌丝体后，自该琼脂培养基取出该无变种及无毒性的次级菌丝体，并接种该无变种及无毒性的次级菌丝体至容器内经灭菌的液态培养基培养出子实体，其中，该液态培养基包含：糖类化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以该液态培养基总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％。

于又一具体实施例中，包括将该固态培养基培养出的无变种及无毒性的次级菌丝体接种至容器内经灭菌的液态培养基培养出子实体，其中，该液态培养基包含：糖类化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以该液态培养基总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％。

于该容器内的液态培养基培养出子实体的步骤包括：在培养至停止期前，搅拌该液态培养基；以及停止搅拌该液态培养基，提升该液态培养基浓度，使该无变种及无毒性的次级菌丝体浮至该液态培养基的液面，以静置培养出子实体。

该停止期指一般皆知的菌丝体的生长随时间变化呈现菌丝体数目无净增加的期间，根据本发明的方法，可于培养过程检测以判断是否达到停止期。于部分具体实施例中，该停止期为培养后的第20天至1个月。

另外，可使用各种方法提升该液态培养基浓度，于一具体实施例中，通过提升该酵母提取物及糖类的浓度，使该无变种及无毒性的次级菌丝体浮至该液态培养基的液面，以静置培养出子实体。此外，于非限制性实施例中，提升该液态培养基浓度5倍，并可经3个月至6个月的培养，生成牛樟芝子实体。

另外，于一具体实施例中，该液态培养基包含4％的酵母提取物、4％的糖类及0.5％的食用油，优选为4％的酵母提取物、4％的葡萄糖及0.5％的牛樟芝精油。由于牛樟芝精油含量较低，提升该液态培养基浓度时，亦可仅提高酵母提取物及糖类的浓度，例如使酵母提取物和葡萄糖的浓度提升为20％的酵母提取物和20％的葡萄糖。

根据本发明的方法，该特定环境指于60至70％的相对湿度环境进行该继代培养。

于一具体实施例中，该特定环境指于60至70％的相对湿度环境进行培养，且每天至少10至14小时的时间控制培养的温度在24至27℃；每天至少10至14小时的时间控制培养的温度在19至23℃。

于另一具体实施例中，该特定环境指于60至70％的相对湿度环境进行培养，且每天至少10至14小时的时间控制培养的温度在24至27℃，优选令该温度对应在日照，例如白天的时间；每天至少10至14小时的时间控制培养的温度在19至23℃，并令该温度对应在非日照，例如晚上的时间。

于一具体实施例中，不以地理位置不同所造成的差异为限制，当白天的时间为6点至18点，则对应该时段，每天至少10至14小时的时间控制培养的温度在24至27℃，并施以天然或人工日照，尤其至少90％的控温时间对应在白天的时间。

于一具体实施例中，不以地理位置不同所造成的差异为限制，当晚上的时间为18点至6点，则对应该时段，每天至少10至14小时的时间控制培养的温度在19至23℃，且不施以日照，尤其至少90％的控温时间对应在晚上的时间。

此外，本发明的培养牛樟芝子实体的方法中，可于任何步骤中针对牛樟芝次级菌丝体及/或牛樟芝子实体进行无变种及无毒性的筛选。

实施例1-继代培养

以YM琼脂培养基质(YM agar，购自acumedia)作为基底，混合食用油及酵母提取物(购自丰味通)，使琼脂培养基包含0.5％牛樟芝精油及4％酵母提取物(其余组份为水)，将混合后的琼脂培养基的溶液置入可灭菌容器中，将可灭菌容器及其内含的琼脂培养基的溶液以灭菌釜进行灭菌程序，将灭菌后的琼脂培养基的溶液倒入多个培养皿中，静置该琼脂培养基的溶液，待冷却后便形成固态琼脂培养基。

将牛樟芝菌种接菌至该固态琼脂培养基，接着将含有该牛樟芝菌种的固态琼脂培养基放置于特定环境下培养，以生成牛樟芝次级菌丝体，该特定环境为白天(6点至18点)时保持温度24至27℃，晚上(18点至6点)时保持温度19至23℃，且相对湿度范围为60至70％。

在该继代的过程中，在第1继代就进行变种及毒性的筛选，仅挑出无变种及无毒性的次级菌丝体继续进行继代，其中，继代1代需要20天至1个月。最后由该无变种及无毒性的次级菌丝体长出子实体，并于采收时，再次进行变种及毒性的筛选。图1为继代培养所得的牛樟芝子实体的照片。

实施例2-固态培养

预先准备固态培养基至可灭菌容器中，该固态培养基包括固态部分及液态部分，该固态部分包含50％黑糯米及50％燕麦米，该液态部分包含20％酵母提取物、20％葡萄糖、20％甘露糖、20％海藻糖及0.5％牛樟芝精油，其中，该液态部分在该容器内的高度为达该固态部分顶面等高处。将可灭菌容器及其内含的固态培养基以灭菌釜进行灭菌程序，自实施例1取出无变种及无毒性的次级菌丝体于该固态培养基培养，该固态培养基放置于如实施例1的环境下培养20天至1个月，以生成牛樟芝次级菌丝体，仅筛选出无变种及无毒性的牛樟芝次级菌丝体再继续培养1个月到3个月，以生成牛樟芝子实体。最后长出子实体要采收时，再次进行变种及毒性的筛选。图2为固态培养所得的牛樟芝子实体的照片。

实施例3-固态培养

使用与实施例2相同的固态培养基及灭菌步骤，自实施例1筛选出无变种及无毒性的子实体于该固态培养基培养，该固态培养基放置于如实施例1的环境下培养3个月至6个月，以生成牛樟芝子实体。最后长出子实体要采收时再次进行变种及毒性的筛选。图3为固态培养所得的牛樟芝子实体的照片。

实施例4-液态培养

预先准备液态培养基，该液态培养基包含4％酵母提取物、4％葡萄糖及0.5％牛樟芝精油，将该液态培养基置入可灭菌容器中，将可灭菌容器及其内含的液态培养基以灭菌釜进行灭菌程序，自实施例1取出无变种及无毒性的次级菌丝体于该液态培养基搅拌培养，该液态培养基放置于如实施例1的环境下培养至停(静)止期时(20天至1个月)停止搅拌，接着将该液态培养基浓度提高5倍(即提高酵母提取物的浓度至20％，提高葡萄糖的浓度至20％，且不增加牛樟芝精油脂浓度)，此时该无变种及无毒性的次级菌丝体因液体浓度增加而浮至液面，再继续培养3个月至6个月，以生成牛樟芝子实体。最后长出子实体要采收时，再次进行变种及毒性的筛选。图4为液态培养所得的牛樟芝子实体的照片。

测试例1-三萜类化合物的种类与含量测试

为了证实经由本发明培养方法所得到的牛樟芝子实体确实具有功能性成分的三帖类化合物，藉由HPLC图谱比对市售牛樟芝子实体标准品(a)及野生及/或椴木培养5.5年龄牛樟芝子实体(b)、本案实施例2固态培养所得的牛樟芝子实体(c)、本案实施例3固态培养所得的牛樟芝子实体(d)与本案实施例4液态培养所得的牛樟芝子实体(e)。

受试样本三萜类化合物的萃取

分别称取50毫克的(a)至(e)，加入5毫升去离子水，至于80℃水浴槽中萃取两次(每次3小时)。接着进行离心并去除上清液(含水溶性物质)，将下层固体物进行冷冻干燥并称重。干燥后的物质，加入50倍体积的绝对乙醇(购自SIGMA NO.32221)，进行三萜类化合物萃取1.5小时，再离心收集上清液(含三萜类化合物)，重复进行三次。将收集的上清液，进行冷冻干燥，干燥后以10毫升绝对乙醇覆溶成水溶液(a)至(e)，使用HPLC仪器进行三萜类化合物种类分析。

HPLC分析方法

吸取2微升(ul)的水溶液(a)至(e)，打入HPLC仪器中，以流速200微升/分钟(ul/min)的速率，通过C18管柱(2.1x 100mm，粒径3微米)，以侦测波长244纳米进行分析比对。

HPLC分析结果

市售牛樟芝子实体标准品-水溶液(a)：

市售牛樟芝子实体标准品包含11种标准品，如图5所示各标准品保留时间为(1)樟芝酸K(Antcin K)为22.94与23.43分钟，(2)苯并二恶茂(Benzodioxole)为25.82分钟，(3)樟芝甲酯K(Methylantcinate K)为31.47与31.77分钟，(4)樟芝酸C(Antcin C)为35.34与36.27分钟，(5)樟芝酸H(Antcin H，Zhankuic acid C)为36.99与37.49分钟，(6)去氢硫色多孔菌酸(Dehydrosulphurenic acid)为41.86分钟，(7)樟芝酸B(Antcin B)为44.82与45.10分钟，(8)齿孔酸(Eburicoic acid)为50.17分钟，(9)樟芝酸A(Antcin A)为52.41分钟，(10)樟芝甲酯b(Methyl antcinate b)为57.40分钟，(11)去氢齿孔酸(Dehydroeburicoic acid)为73.05分钟。

野生(及/或椴木培养)5.5年龄牛樟芝子实体-三萜类萃取液(b)：

比对市售标准品，如图6所示，野生(及/或椴木培养)5.5年龄牛樟芝子实体的三萜类种类包含9种(1)Antcin K为24.15与24.65分钟，(3)Methyl antcinate K为32.61与32.64分钟，(4)Antcin C为36.67与37.62分钟，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)为38.29与38.78分钟，(6)Dehydrosulphurenic acid为43.17分钟，(7)Antcin B为46.28分钟，(8)Eburicoic acid为51.20分钟，(9)AntcinA为54.03分钟，(11)Dehydroeburicoic acid为74.97分钟。

比对出的三萜类化合物的种类含量百分比。计算方式为，计算出图谱中每个峰(peak)的面积大小，将每个峰(peak)面积相加后为总含量。将比对到的三萜化合物面积除以总含量面积，即可得含量百分比。所得的三萜含量约为：(1)13.26％、(3)1.32％、(4)3.98％、(5)11.94％、(6)33.16％、(7)4.14％、(8)1.32％、(9)2.65％以及(11)21.22％。

本案实施例2固态培养所得的牛樟芝子实体-三萜类萃取液(c)：

比对市售标准品，如图7所示，本案实施例2固态培养所得的牛樟芝子实体的三萜类种类包含7种(1)Antcin K为25.28与25.95分钟，(4)Antcin C为36.83与38.01分钟，(5)Antcin H(Zhankuic acidC)为38.69与38.94分钟，(6)Dehydrosulphurenic acid为43.35分钟，(7)Antcin B为46.53分钟，(9)Antcin A为54.18分钟，(11)Dehydroeburicoic acid为75.05分钟。

比对出的三萜类化合物的种类含量百分比，计算方式如前述。所得的三萜含量约为：(1)27.62％，(4)24.86％，(5)15.19％，(6)6.90％，(7)5.52％，(9)1.65％以及(11)2.76％。本案实施例3固态培养所得的牛樟芝子实体-三萜类萃取液(d)：

比对市售标准品，如图8所示，本案实施例3固态培养所得的牛樟芝子实体的三萜类种类包含7种(1)Antcin K为24.533与25.179分钟，(2)Benzodioxole 4.97％为26.88分钟，(5)Antcin H(Zhankuicacid C)为39.57与40.06分钟，(6)Dehydrosulphurenic acid为43.95分钟，(7)Antcin B为47.21分钟，(8)Eburicoic acid为51.58分钟，(10)Methyl antcinate b为61.87分钟(11)Dehydroeburicoicacid为75.42分钟。

比对出的三萜类化合物的种类含量百分比，计算方式如前述。所得的三萜含量约为：(1)Antcin K 3.98％，(2)Benzodioxole 4.97％，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)4.97％，(6)Dehydrosulphurenic acid9.95％，(7)Antcin B 7.96％，(8)Eburicoic acid 5.97％，(10)Methylantcinate b 1.99％以及(11)Dehydroeburicoic acid 8.95％。本案实施例4液态培养所得的牛樟芝子实体-三萜类萃取液(e)：

比对市售标准品，如图9所示，本案实施例4液态培养所得的牛樟芝子实体的三萜类种类包含8种(1)Antcin K为23.15与23.65分钟，(3)Methyl antcinate K为34.51与34.78分钟，(4)Antcin C为37.58与37.72分钟，(5)Antcin H(Zhankuic acid C)为39.14与39.52分钟，(6)Dehydrosulphurenic acid为44.09分钟，(7)Antcin B为47.32分钟，(9)Antcin A为55.16分钟，(11)Dehydroeburicoic acid为75.85分钟。

比对出的三萜类化合物的种类含量百分比，计算方式如前述。所得的三萜含量约为：(1)22.76％，(3)5.20％，(4)20.81％，(5)11.38％，(6)16.26％，(7)1.62％，(9)1.30％以及(11)6.50％。

藉由本发明所提供的培养方法，可有效控制牛樟芝子实体在无菌的环境下生长，并藉由模拟野生及/或椴木培养的牛樟芝的生长环境，使本发明的牛樟芝子实体的内含最重要的三萜类成份能非常接近于野生及/或椴木培养的牛樟芝，以达到与野生及/或椴木培养的牛樟芝同样的功效，具相当的保健效果。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何该领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，举凡所属技术领域中具有此项专业知识者，在未脱离本发明所揭示的精神与技术原理下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由权利要求书范围所涵盖。

Claims (17)

1.一种培养牛樟芝子实体的方法，包括：

将牛樟芝菌种接菌至经灭菌的琼脂培养基，进行继代培养以产生次级菌丝体，并于该继代培养过程中筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体；以及

以该经筛选出无变种及无毒性的次级菌丝体进行该继代培养，以产生子实体，其特征在于，该琼脂培养基包含：

YM琼脂培养基质；

食用油，且以该琼脂培养基总重计，该食用油的含量为大于0％至1％；以及

酵母提取物，且以该琼脂培养基总重计，该酵母提取物的含量为大于3％至5％。

2.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，该无变种及无毒性的次级菌丝体是在该继代培养过程中培养出至少第1继代后，自该第1继代以后的次级菌丝体筛选者。

3.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，该食用油是食用精油。

4.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，该食用油是牛樟芝精油。

5.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，该食用油为植物油或动物油。

6.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，以该琼脂培养基总重计，该食用油的含量为0.5％。

7.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，还包括将该无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体接种至容器内经灭菌的固态培养基培养出无变种及无毒性的次级菌丝体及子实体，其特征在于，该固态培养基包含：

固态部分，包含至少一种谷物；以及

液态部分，含有糖类化合物、酵母提取物、及食用油，其特征在于，以该液态部分总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％，且该液态部分在该容器内的高度为自该固态部分的半高处至与该固态部分顶面等高处。

8.如权利要求7所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，该固态部分包含二种谷物，且以该固态部分总重计，各该谷物的含量为40至60％。

9.如权利要求7所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，该糖类化合物为选自葡萄糖、甘露糖及海藻糖所组成组的至少一者。

10.如权利要求7所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，该接种的无变种及无毒性的次级菌丝体及/或子实体取自该琼脂培养基中的不同继代。

11.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，还包括将该无变种及无毒性的次级菌丝体接种至容器内经灭菌的液态培养基培养出子实体，其特征在于，该液态培养基包含：

糖类化合物；

酵母提取物；以及

食用油，其特征在于，以该液态培养基总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％。

12.如权利要求7所述培养牛樟芝子实体的方法，还包括将该固态培养基培养出的无变种及无毒性的次级菌丝体接种至容器内经灭菌的液态培养基培养出子实体，其特征在于，该液态培养基包含：

糖类化合物；

酵母提取物；以及

食用油，其特征在于，以该液态培养基总重计，该糖类化合物的含量为3％至5％，该酵母提取物的含量为3％至5％，及该食用油的含量为大于0％至1％。

13.如权利要求11或12所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，于该容器内的液态培养基培养出子实体的步骤包括：

在培养至停止期前，搅拌该液态培养基；以及

停止搅拌该液态培养基，提升该液态培养基浓度，使该无变种及无毒性的次级菌丝体浮至该液态培养基的液面，以静置培养出子实体。

14.如权利要求13所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，通过提升该酵母提取物及糖类的浓度，使该无变种及无毒性的次级菌丝体浮至该液态培养基的液面。

15.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，是在60至70％的相对湿度环境进行该继代培养。

16.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，于该继代培养的过程中以每天为单位，至少10至14小时控制该继代培养的温度在24至27℃，以及至少10至14小时控制该继代培养的温度在19至23℃。

17.如权利要求1所述培养牛樟芝子实体的方法，其特征在于，对应在日照的时间，控制该继代培养的温度在24至27℃，以及对应在非日照的时间，控制该继代培养的温度在19至23℃。