CN111826471A - 一种n-dhclv实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种N‑DHCLV实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。本发明包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化及结果检测判定。本发明利用所述引物和探针建立的检测N‑DHCLV的实时荧光定量PCR方法，在检测N‑DHCLV上灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测55.93个拷贝，可用于检测临床样本中N‑DHCLV的感染检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，属于动物传染病学领域。
背景技术
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如Eclipse、TAMRA、BHQ1等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
黄病毒科（Flaviviridae Family）是一个基因组为单股正链 RNA 的小包膜病毒科，其中大多数病毒感染哺乳动物和鸟类，且许多病毒具有宿主特异性和致病性。基于RdRP 保守区域氨基酸序列的***发育关系表明，黄病毒科成员聚集在当前指定的4个病毒属中，包括黄病毒属（Flavivirus genus）、瘟病毒属（Pestivirus genus）、丙型肝炎病毒属（Hepacivirus genus）、佩吉病毒属（Pegivirus genus）。其中，塔玛纳蝙蝠病毒（Tamana bat virus）分配于一独立的分支，暂被列为黄病毒属（Flavivirus）的一个潜在成员。近年来，随着高通量测序和血清学方法的广泛应用，不少研究者在不同哺乳动物中发现了多种新型HCV同源病毒（HCV样病毒）。新型鸭源类丙肝样病毒（novel duck hepacivirus-like，N-DHCLV）（Chu L，等. A highly divergent hepacivirus-like flavivirus in domesticducks. J Gen Virol. 2019, 100(8):1234-1240. doi: 10.1099/jgv.0.001298.）是近年来从产蛋遗传鸭群中发现的新发现HCV同源病毒（HCV样病毒）。基因组学研究发现，其基因组为单股正链RNA，基因组长为11422bp，编码一个长度为10824bp的开放阅读框（openreading frame，ORF），编码的多聚蛋白长为3607个氨基酸。遗传进化分析表明，其属于类丙肝样病毒属成员。
当前国内外尚未见实时荧光定量PCR检测N-DHCLV的引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的是填补现有尚未见实时荧光定量PCR检测N-DHCLV的引物和探针的方法相关研究报道空白，提供一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测的引物和探针及其使用方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测39.04个拷贝，可用于对临床样本中N-DHCLV的分子流行病学调查，为明确N-DHCLV的分子流行病学特点提供检测方法和手段。
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物序列如下：
上游引物N-DHCLV-T-F：5’- TGACCCAAACACCAACTTCG-3’，
下游引物N-DHCLV-T-R：5’- TTCAGTCGCTTCCAATCCAG-3’；
所述探针N-DHCLV-T-P为： 5’- AGTCAGAAAATTGTCCCGAGCAGGC-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。
一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述的引物和探针。
建立的N-DHCLV实时荧光定量PCR检测方法，反应体系20μL为：Premix Ex Taq™(Probe qPCR)混合液10μL、上/下游引物（N-DHCLV-T-F、N-DHCLV-T-R）（10 μmol/L）各0.2 μL、探针（N-DHCLV-T-P）（5 μmol/L）0.5 μL、模板1 μL、水补足至终体积20 μL。
反应条件为：95 ℃预变性40 s；95 ℃ 5s，60℃ 25 s，40个循环。
有益效果
本发明采用N-DHCLV实时荧光定量PCR检测的引物和探针进行N-DHCLV检测，具有以下优点和效果：
1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需100min，且一次可以同时进行96个样品检测。
2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中N-DHCLV的Ct值，直接对其感染N-DHCLV进行准确定量。
3、灵敏度高：最低可检测55.93拷贝/μL。
4、特异性强：对鸭群中的常见传染病（如H9-AIV、DuCV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3、ATmV和MDRV）检测均无反应信号，仅对N-DHCLV检测出现荧光信号。
5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行N-DHCLV检测的组内变异系数为0.69-1.62%，组间变异系数0.93-2.41%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。
附图说明
图1 实时荧光定量PCR的扩增曲线，其中：1-5：不同系列浓度5.593×105—5.593×101拷贝/μL模板。
图2 实时荧光定量PCR的标准曲线。
图3 实时荧光定量PCR的敏感性检测，其中1-4：不同系列浓度5.593×103-5.593×100拷贝/μL模板；5：阴性对照。
图4 实时荧光定量PCR的特异性检测， 其中：1：N-DHCLV；C：试验对照（H9-AIV、DuCV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3、ATmV和MDRV），由于均无荧光信号，肉眼无法有效区分。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、相关试验病原
试验用病原新型鸭源类丙肝样病毒（N-DHCLV）、鸭源H9亚型禽流感病毒（H9-AIV）、鸭圆环病毒（DuCV）、鸭细小病毒（MDPV）、鸭1型和3型肝炎病毒（DHAV-1、DHAV-3）、禽坦布苏病毒（ATmV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2、引物和探针的设计与合成
参考新型鸭源类丙肝样病毒（N-DHCLV）基因序列特征，并结合其他源类丙肝样病毒属成员基因组特点，设计实时荧光定量检测N-DHCLV的PCR方法的特异性引物（N-DHCLV-T-F和N-DHCLV-T-R）和探针（N-DHCLV-T-P），其中所述引物为：
上游引物N-DHCLV-T-F：5’- TGACCCAAACACCAACTTCG-3’，
下游引物N-DHCLV-T-R：5’- TTCAGTCGCTTCCAATCCAG-3’；
所述探针N-DHCLV-T-P为： 5’- AGTCAGAAAATTGTCCCGAGCAGGC-3’，
其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。
引物和探针由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。
3、实时荧光定量PCR方法的标准品构建
根据本团队前期鉴定的N-DHCLV（FJ614株）及GenBank中新型鸭源类丙肝样病毒（N-DHCLV）基因（GenBank登录号MK737639）序列特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：N-DHCLV-F3：5′- ACCCTGTTTCTGAAGCGAACGT-3′和N-DHCLV-R3：5′- TCCAGGAACAATTGAAAGGTGT-3′，用于扩增约791bp的基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。
用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取N-DHCLV（FJ614株）核酸RNA，利用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂反转录为cDNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上/下游引物（N-DHCLV-F3和N-DHCLV-R3，10μM）各1μL、制备的核酸cDNA1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。
按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将RT-PCR扩增的特异性聚合酶1b蛋白基因片段克隆到pEASY-T1克隆载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（N-DHCLV-F3和N-DHCLV-R3）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- N-DHCLV-T），其（质粒T-N-DHCLV-T）核苷酸同源性和新型鸭源类丙肝样病毒（GenBank登录号MK737639）核苷酸同源性为99.8%。
利用微量核酸测定仪测定阳性标准品（T-N-DHCLV-T）的浓度，计算其拷贝数为5.593×108拷贝/μL，对其进行10倍连续稀释，质粒含量分别为5.593×107～5.593×100拷贝/μL，分装后置于-20 ℃保存备用。
4、实时荧光定量PCR反应条件
以N-DHCLV阳性标准品（T- N-DHCLV-T）为模板，在不同退火温度（54～64 ℃）、引物（N-DHCLV-T-F、N-DHCLV-T-R）浓度（2.5～20 μmol/L）和探针（N-DHCLV-T-P）浓度（1.25～10 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。结果判定，观察FAM信号有关阳性荧光信号扩增，有阳性荧光信号即可判定待检样品为N-DHCLV感染阳性。
建立的N-DHCLV实时荧光定量PCR检测方法优化出的最佳反应体系20μL为：PremixEx Taq™ (Probe qPCR)混合液10μL、上/下游引物（N-DHCLV-T-F、N-DHCLV-T-R）（10 μmol/L）各0.2 μL、探针（N-DHCLV-T-P）（5 μmol/L）0.5 μL、模板1 μL、水补足至终体积20 μL。
优化出的最佳反应条件为：95 ℃预变性40 s；95 ℃ 5s，60℃ 25 s，40个循环。
用优化后的反应条件，以5.593×105—5.593×101拷贝/μL为模板，获得扩增动力学曲线（见图1）。
以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（Ct值）为纵坐标，获得N-DHCLV实时荧光定量PCR标准曲线（图2），所获得标准曲线斜率为-3.564，Y轴截距为40.06，相关系数为1.000，扩增效率为0.91，符合实验预期。
5 、敏感性检测
用优化后的反应条件，以5.593×103—5.593×100拷贝/μL为模板，获得实时荧光定量PCR的最低检测限。从图3可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为5.593×101拷贝/μL（即55.93拷贝/μL）。
6、特异性检测
对鸭群中的常见传染病（如H9-AIV、DuCV、MDPV、DHAV-1、DHAV-3、ATmV和MDRV）检测均无反应信号，仅对N-DHCLV检测出现荧光信号(图4)。
7、重复性试验
建立的实时荧光定量PCR检测方法进行N-DHCLV检测的组内变异系数为0.69-1.62%，组间变异系数0.93-2.41%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。
表1 实时荧光定量PCR方法的变异系数测定
8、临床应用
使用建立的N-DHCLV实时荧光定量PCR检测方法对临床收集的65份鸭病料进行检测后发现，检测到5份N-DHCLV感染阳性，拷贝数分别为3.503×102拷贝/μL、4.332×103拷贝/μL、9.413×103拷贝/μL和8.003×103拷贝/μL，阳性率为7.69%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgacccaaac accaacttcg 20
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
accctgtttc tgaagcgaac gt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccaggaaca attgaaaggt gt 22
Claims (2)
1.一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：
上游引物N-DHCLV-T-F：5’- TGACCCAAACACCAACTTCG-3’，
下游引物N-DHCLV-T-R：5’- TTCAGTCGCTTCCAATCCAG-3’；
所述探针N-DHCLV-T-P为： 5’- AGTCAGAAAATTGTCCCGAGCAGGC-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。
2.一种N-DHCLV实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
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| CN202010883750.3A CN111826471A (zh) | 2020-08-28 | 2020-08-28 | 一种n-dhclv实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒 |
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2020
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