CN107299104A - Revoluta基因在调控豆科植物小叶片数目和叶茎比中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了REVOLUTA基因(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)在调控豆科植物小叶片数目和叶茎比中的应用。本发明首次分离得到了蒺藜苜蓿HD‑ZIP III基因家族成员MtREVOLUTA基因的敲除突变体株系，发现植株的小叶片数目由三个变为四个或五个(多达81.5％的叶片的小叶片数目得到了提高)，同时叶茎比显著提高(提高了约11％)，这证明，该基因参与了调控豆科植物的小叶片数目和叶茎比，敲除该基因，可以得到小叶片数目和叶茎比高于野生型植株的转基因豆科植物，预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物，可用于后续的牧草品质，对我国草业生产具有重大意义。

Description

REVOLUTA基因在调控豆科植物小叶片数目和叶茎比中的应用

技术领域

本发明涉及蒺藜苜蓿转录因子HD-ZIPIII基因家族的MtREVOLUTA基因在调控小叶片数目和叶茎比中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

豆科牧草苜蓿是世界上栽培最早，分布最广，也是最为重要的一种多年生优质牧草。但是，国产苜蓿产量少、品质差、货源不稳定，这已成为限制我国草食畜牧业和奶业发展的一个不可忽视的因素。目前我国苜蓿的商业生产正在迅速增长，但由于国内对高质量苜蓿日益增长的巨大需求，国产苜蓿的短缺情况并没有得到缓解。因此苜蓿的产量和品质改良是我国草业、畜牧业和奶业发展的重大迫切需求。

苜蓿是以收获叶、茎为主的牧草，叶对苜蓿产草量的贡献率最多可达60％。叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是栽培管理及病虫害监测的主要研究对象。在苜蓿品质评价体系中，叶茎比(叶片与茎秆重量的比值)是其中一个重要的指标。苜蓿70％的蛋白质储藏于叶片中，而且叶片纤维含量仅为茎秆的1/3。因此叶茎比值越大，苜蓿的营养价值就越高，适口性就越好，同时利用价值也就相对越高。苜蓿多叶性状目前已被作为一种形态学标记，被认为具有高产和优质的潜力。选育叶量丰富、叶茎比高的苜蓿新品种一直是育种工作者追求的目标。

植物的叶发育模式分为单叶和复叶。单叶结构指得是在一个叶柄上只有一个小叶片，而复叶结构指得是在一个叶柄上有多个小叶片生成。蒺藜苜蓿的叶为复叶结构，包括三个小叶片。苜蓿的多叶性状是由多基因控制的，其产生是一个复杂的过程而且同时受环境和基因两方面的影响。到目前为止，只有少数多叶苜蓿品种被商业化。这些品种中大部分植株具有多叶性状，但植株个体多叶频率高低不均：有的植株仅数个复叶为多叶型，多数复叶仍为三出复叶；也有植株不同枝条上混杂出现多叶型复叶和三出复叶，而多叶频率高的植株则非常少见。这些缺陷导致现有的多叶型苜蓿品种在生产性能方面并未表现出明显优势。

因此，基于以上原因，对苜蓿复叶发育分子机制进行研究，通过基因工程直接提高苜蓿小叶片数量可为苜蓿优质新品系的分子设计改良和育种提供理论基础和技术手段，有助于高效、优质、高产的苜蓿新品种的培育。

同源域亮氨酸拉链第三类基因家族(class III homeodomain-leucine zipper，HD-ZIP III)在叶片极性建立过程中起关键作用。目前尚未见到有关于蒺藜苜蓿HD-ZIPIII基因家族成员MtREVOLUTA基因在复叶物种中调控小叶片数目和叶茎比的报道。

发明内容

针对上述现有技术，针对现有多叶苜蓿品种多叶频率不高的问题，本发明发现了一种调控豆科植物小叶数目和叶茎比的基因，并提供了一种敲除该基因以获得可提高小叶片数目和叶茎比的转基因豆科植物的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明首次分离得到了蒺藜苜蓿HD-ZIP III基因家族成员MtREVOLUTA基因的敲除突变体株系，并通过实验证明，该基因参与了调控豆科植物的小叶片数目和叶茎比，并可通过敲除该基因的方式以得到小叶片数目和叶茎比高于野生型植株的转基因豆科植物。

所述MtREVOLUTA基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述豆科植物，优选苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。

本发明利用特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示)，通过RT-PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtREVOLUTA基因；利用构建的突变体群体，筛选出了MtREVOLUTA基因的敲除突变体株系，发现植株的小叶片数目由三个变为四个或五个(多达81.5％的叶片的小叶片数目得到了提高)，这一数据远高于目前现有的多叶苜蓿品种(约40％)，同时叶茎比显著提高(提高了约11％)，这证明，该基因参与了调控豆科植物的小叶片数目和叶茎比，敲除该基因，可以得到小叶片数目和叶茎比高于野生型植株的转基因豆科植物，可显著提高小叶片数目和叶茎比，预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物，可用于后续的牧草品质，对我国草业生产具有重大意义。

附图说明

图1：蒺藜苜蓿MtREVOLUTA基因的克隆和表达分析，其中，A.MtREVOLUTA的基因结构，方框代表外显子，实线代表内含子；Tnt1***在第六个外显子区域。B-I.蒺藜苜蓿MtREVOLUTA基因的表达分析；通过对启动子：GUS转基因植株的染色，表明MtREVOLUTA基因在顶芽、叶片、叶柄、茎、花、果荚、根尖和种皮中都有表达。

图2：蒺藜苜蓿MtREVOLUTA基因突变体的鉴定，其中，A.基因组PCR扩增野生型和突变体的MtREVOLUTA序列，表明突变体基因中***了一个5.3Kb的Tnt1序列。B.qRT-PCR检测MtREVOLUTA的表达水平，表明在突变体中MtREVOLUTA的表达水平显著下降。

图3：蒺藜苜蓿MtREVOLUTA基因突变体的小叶数量和叶茎比统计，其中，A.野生型的复叶结构，包括三个小叶片。B-C.MtREVOLUTA突变体的的复叶结构，包括四个或五个小叶片。D.野生型和MtREVOLUTA突变体不同数目小叶片的百分比统计。E.野生型和MtREVOLUTA突变体的叶茎比统计。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1克隆蒺藜苜蓿基因MtREVOLUTA

1.蒺藜苜蓿MtREVOLUTA基因的克隆

通过生物信息学网站NCBI获得拟南芥REVOLUTA的序列，然后利用BLAST进行序列比对搜索，获得MtREVOLUTA的基因组序列。根据序列设计SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物。利用TRIzol试剂盒提取蒺藜苜蓿RNA，RT-PCR方法扩增MtREVOLUTA基因的全长CDS序列。利用Gateway技术将基因序列连入pEARLEYGATE201载体，然后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。

2.蒺藜苜蓿MtREVOLUTA基因的序列信息与特性分析

MtREV1基因的编码区CDS为2520bp，包含18个外显子和17个内含子，编码839个氨基酸，包含有保守的HD-ZIP，MEKHLA和START脂结合区域(图1A)。

蒺藜苜蓿MtREVOLUTA基因的表达分析

MtREVOLUTA启动子驱动GUS表达：为了定位MtREVOLUTA基因表达的精细部位，将MtREVOLUTA启动子区域2.1kb的片段构建到pHGWFS7。通过农杆菌EHA105转化蒺藜苜蓿，最后筛选获得MtREVOLUTA启动子：GUS的转基因植株。GUS染色分析发现，MtREVOLUTA在叶芽、成年叶、叶柄、茎、花、荚果以及正在萌发的种子的根尖中均有较强表达(图1B-I)。

实施例2蒺藜苜蓿MtREVOLUTA突变体的获得和鉴定

利用Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)技术，筛选了蒺藜苜蓿Tnt1标记的突变体库，在22000个突变体株系中筛选出Tnt1***到MtREVOLUTA基因中的突变体株系(图2A)。分子生物学鉴定结果表明，Tnt1***到MtREVOLUTA基因的第六个外显子，导致该基因表达水平显著下降(图2B)。

实施例3蒺藜苜蓿MtREVOLUTA突变体的小叶数量统计

对突变体的表型进行分析，结果表明，敲除MtREVOLUTA突变体的小叶片数目显著增多。野生型的复叶中包括三个小叶片，而突变体中约81.5％(n＝300)的复叶中包含有4个或5个小叶片(图3A-D)。进一步分析表明，突变体的叶茎比与野生型相比，提高了约11％(n＝10)(图3E)。

序列表

<110> 山东大学

<120> REVOLUTA基因在调控豆科植物小叶片数目和叶茎比中的应用

<141> 2017-08-08

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4380

<212> DNA

<213> Medicago truncatula

<400> 1

atggctatgg ctgttgcaca acaacaaaga gataacagca ttgagagaca ccttgattcg 60

tctggcaaat atgtgaggta cactgctgaa cagattgaag ctttggaaaa ggtttatgtg 120

gaatgcccta agcctagttc attgagaagg caacagctga ttcgggagtg cccggttctg 180

gccaacattg agcctaagca gatcaaggtt tggtttcaga ataggaggta atggagattc 240

tgattcacct ttttttgttt gttttgaatt tgtgtcgtgt ggaagggttt ggctcttttt 300

ggttgtgtga tttgatttgt gtctttcttg ttttgcaggt gtagggagaa gcagagaaaa 360

gaggcttctc agcttcagag tgtgaacagg aaactttctg cgatgaataa gctgttgatg 420

gaggaaaatg agaggctgca gaagcaggtt tcacagctgg tgaatgagaa tggatttatg 480

cgccagcaac tacaccctgt aagccctatc attgttcatt ttcattcact actatacatt 540

ttttttttgt gaaatggtaa ttatcattgt ttggttgagg catgtagttg ttgtatgata 600

tgatatgatt tgggttattt tgaatgtaaa tttgtattgt tacttactgt catgtcattg 660

cagaccccag cagctccaaa tgctgacggt agtggcgttg attccgcggc tgctgctcct 720

atgaactcat tgagagatgc taatagccct gctgggtaat tttgaagttc ttgatttgag 780

tgctttttat tttattttaa ttatttcgct tgttgagctt tctttgattg atctttgcag 840

attcctatca attgcggagg agacattgac agagttcctt tcaaaggcta caggaactgc 900

tgtcgattgg gtccagatgc ctgggatgaa ggtagagaat catgtttcta gtggacaatt 960

ggtttttgct tttacaattt tgatactgtg atgattatga catggaggtt aatttccttc 1020

cactaatatc tcatactata tttactttca accattgttt gttagcctgg tccggattcg 1080

gttgggatat ttgccatttc tcaaggtggc aacggagtgg cagctcgagc ctgtggtctt 1140

gttagtttag aacctactaa ggtaattaaa aaggacatgt ggatggatat tttcagtaat 1200

ttcttttgat gttatttatg tagtttgtaa gctatctgaa ttttgaattg ctgaaaaatt 1260

tcaatagatt gtggagatat taaaagatcg cccaacttgg taccgtgatt gtcggagttc 1320

agaagttttc acaatgttcc cagctggaaa tggaggaaca attgaacttg tttacacaca 1380

ggtgaagaat caaatgtgaa taggatgctt tatttattat ttaatgagca ttttgcataa 1440

acgtttagtt tgctgcagac atatgctcca atgacactgg cttctgctcg cgacttctgg 1500

actctaagat acactacaaa tttggaaaac ggaagtgttg tggtgagtat atttgctgtc 1560

aaaagcgtta ctattgttgc atgggattat atatctagct gcatcgattt aatataattg 1620

cactttggaa ggtttgtgaa aggtcactgt ctggtactgg tgctggccct aatgctgcag 1680

ccgcctcaca gtttgagagg gctgaaatgc tccctagtgg ctatttgatt cgaccatgtg 1740

aaggtggagg atcgatcatc cacattgtag accacctaaa cctgcaggtt tgagttcttg 1800

accattagct agaataccta ctatattctt attttctttt catatacatt tttttttttg 1860

accaaaatcc agaattttct tttcatatac attaattaac atgattaaca ttttcttcta 1920

ggcatggagt gtgccagaag tgctgcggcc gatctatgaa tcgtcgcaaa tggtagctca 1980

gagactgaca attgcggtaa gcatagtatt attaattcac gatgtaggat tctattgcaa 2040

gctttggtgg actaatgtga tcaatattat ggcttttgtg caggcacttc gctatatcag 2100

gcaagtagct caagaaacaa gtggtgacgt ggtgtatagc atgggtcggc aacctgcagt 2160

tcttagaact tttagccaac ggttgagcag gtacgtcacg tgaaataaat ttatgcctca 2220

aaacctattt cagccttgct ttttacagaa cgatctgttg tgtttggtaa aaataaattt 2280

aaacatcatt cttgcagagg tttcaatgac gctgtcaatg gattcaatga taatggttgg 2340

tctgttctga actgtgatgg tgctgagggt gttactattt cagtaaattc aatcaagaat 2400

ttgagtggca cttctaatcc agcaagttcc ctttcactcc ttggaggaat tgtctgtgca 2460

aaagcttcta tgttactcca agtaagtgcg taaatccatt ggcatggcgc agtaatcggt 2520

ccttctataa tttaacattt agttcttcta atcgttacac ggaaagtttt cactttgttt 2580

tacttgcaga acaccactcc tgctgtttta gttcgctttc tgagggagca tcgctcggag 2640

tgggctgatt ttagtgttga tgccttttct gctgcatcac ttaaagctgg ctcctatggc 2700

tatcctggaa tgaggtctac aaagttcacc ggcaatcaag caatcatgcc tcttggacat 2760

acaattgaac atgaagaggt atgagagatt ttttgcttgc ttgaccttga ccatgtcttt 2820

ttaagatggt agattcatat ttgcatttgg ctaagatttg gtttatatac tttctatgat 2880

ttggtttata ctgatttctg ttgaaattcc agatgctaga aattatccgc cttgaaggtc 2940

ttgctcaaga tgattctttt gtttctaggg atgttcatct cttacaggtg cttcctctga 3000

cccttgttat ggtttgttta cctgcatgtt tatcggtttt ttgttgttgc ttaattctta 3060

tgatcaccat catcatcgtt tgaacagtta tgtactggaa ttgatgagaa tgctgtgggg 3120

gcttgttccg agctcatatt tgctccaatt gatgacatgt tcccagaaga tgctccctta 3180

gtgccttctg gtttccgcat tgtcctgttg aattctcaac cagttgagtc ccgtttcttg 3240

tatttgattt ttctctaatc ggtactgttc atatatgaag catagtaatc tagttgacat 3300

catattgtgt ttcagggtga tacaaagaac acaacaacag caaatcgaac cttggatttg 3360

acatctggtc ttgaagtaag cccggcaaca gctcatgcta acggagacgc atcgtgtcct 3420

aacaatcgat gtgtgttgac tgttgccttt cagtttcctt ttgagagcgg tctgcaggat 3480

aatgttgcag ccatggcacg tcaatatgtc cggcgtgtag tttctgccgt gcaggcggtt 3540

gcaacggcta tatctccatc cagtgttaac acttctggtg gagcaaagct ctcccctggc 3600

actccagaag cacttacact agctcaatgg atctgccaga gttataggta aagtctgcat 3660

gaatctctga tgttctcttt caaagtttct aacatgattc tctatttacc tctctttcta 3720

tatctcttgt ccgaaagcag tcatcatctg ggcgcgcaac tgctgagatc tgattctctt 3780

attggtgata tgctactgaa acatttgtgg catcatccag atgctatttt atgctgctct 3840

ttgaaggtat gtccatgatc tcattttatg gtacaattga atctggaagt gtataaataa 3900

tgcagtactt cgaagatttt aatgtaactt ctctatcctt gtttggtttt gcagcaagtg 3960

cccgtattca tctttgctaa ccaggctggc cttgacatgt tggaaacaac tctagtggct 4020

ctacaagata tcacactgga caaaatattt gatgagtctg cacgcaagaa tttgattgca 4080

tattttgcga agttaatgca gcaggtaatt tcctggagtt tggcatcatt agcttagctt 4140

ttttttatcg ttacaacctc aaatttgttt taaacaacac accatgctct taagtaaatg 4200

tctgaattgt tgcacggatt ttttttcgtt caggggtttg cttgtatgcc agctgggatc 4260

tgcatgtcaa caatggggcg acatgcttca tatgatcaag ccgtcgcgtg gaaagtgcat 4320

gctgaagaca acagtgttca ttgcttggct ttctcattca ttaattggtc atttatatga 4380

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggctatgg ctgttgcaca ac 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcatataaat gaccaattaa tg 22

Claims (7)

1.REVOLUTA基因在调控豆科植物小叶片数目和叶茎比中的应用，所述MtREVOLUTA基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述豆科植物选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。

3.REVOLUTA基因在制备转基因豆科植物中的应用，所述MtREVOLUTA基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述豆科植物选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：具体应用时，敲除豆科植物种子或植株中的REVOLUTA基因，从而获得转基因豆科植物，其小叶片数目和叶茎比高于野生型豆科植物。

6.一种通过敲除REVOLUTA基因获得转基因豆科植物的方法，其特征在于：敲除豆科植物种子或植株中的REVOLUTA基因，从而获得转基因豆科植物，其小叶片数目和叶茎比高于野生型豆科植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述豆科植物选自苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。