CN108503700A - 水稻粒型蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了水稻Os01g66970.1蛋白及其编码基因与应用，该蛋白具有如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列，或为SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列；该编码基因具有如SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明还公开了利用该基因培育大粒水稻品种的方法。即通过基因编辑方法对该基因进行编辑，从而获得大粒水稻品种；其次，本发明粒型调控基因调控效果好，与野生型相比，水稻粒长明显增加，可以显著提高水稻产量，在水稻杂种优势利用中具有广阔的应用前景。

Description

水稻粒型蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及水稻粒型蛋白Os01g66970.1及其编码基因与应用。
背景技术
水稻（Oryza sativa. L）作为全球最重要的粮食作物之一，随着耕地面积的减少和人口数量的增长，提高其产量对于解决未来粮食安全问题具有十分重要的战略意义。水稻粒形（包括粒长、粒宽、长宽比与粒厚）不仅是影响水稻产量的重要指标之一，也是影响稻米的外观品质、商品品质和加工品质的重要因素。因此，研究稻米粒形的遗传机制对培育高产优质的水稻品种具有重要指导意义。
水稻全基因组测序的完成和遗传连锁图谱的不断完善，为水稻粒形 QTL定位、重要基因的克隆和功能分析奠定了基础。然而，由于粒形遗传本身的复杂性和研究方法的局限性导致粒形性状的遗传控制机理尚不完善。因此，水稻籽粒粒型相关基因的克隆和功能研究，对于明确水稻中调控籽粒粒型的分子机制和其在杂交育种中的应用具有重要的意义。
近几年，基因组编辑技术的高速发展为水稻基因功能研究和遗传育种改良提供了一种高效的辅助工具。它是利用位点特异性核酸酶在植物基因组DNA序列上造成双链断，激发细胞自身同源重组和非同源末端接合的修复机制，通过随机的添加或删除靶序列的碱基个数来完成对植物基因组的靶向修饰，因此可以实现对目标DNA序列的定点编辑。在水稻上，该技术已经实现了很多负调控基因的敲除以获得有利农艺性状的改良，对水稻分子育种的进程起到了强有力的推进作用。
发明内容
本发明的目的是水稻粒型蛋白Os01g66970.1及其编码基因与应用。
本发明的水稻Os06g26890、1蛋白，来源于水稻(Oryza Sativa)，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或由该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列。
所述的水稻粒型蛋白Os01g66970.1的编码基因，具有如SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列；或由SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列经过添加、取代或缺失一个或几个碱基而生成的，并编码控制水稻粒型蛋白Os01g66970.1的核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供上述水稻粒型相关蛋白或编码基因在控制水稻籽粒粒型、提高水稻产量方面的应用。通过敲除上述基因培育大粒水稻品种，通过CRISPR/Cas9***实现的。用于敲除上述基因的sgRNA靶点序列，所述sgRNA的靶点序列由SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列组成；即5’-GGGTGGGGATGGGGATGGACGGG- 3’。
本发明还提供了用于检测敲除上述基因的转基因植物的引物对，所述的引物对由JC-F和JC-R组成；其中所述的JC-F由SEQ ID NO .4所示的核苷酸序列组成；所述的JC-R由SEQ ID NO .5所示的核苷酸序列组成；即：
JC-F:5’-AAATTCCATCAAAAAGCAGA- 3’(SEQ ID NO .4)；
JC-R:5’-ACAACCAAAAATAACATCGG- 3’(SEQ ID NO .5)。
与现在技术相比，本发明的有益成果在于：
本发明为大粒水稻品种的培育提供了一种通过基因编辑方法打靶水稻粒型相关基因Os01g66970.1来获得大粒水稻品种；(2)本发明粒型调控基因调控效果好，与野生型相比，水稻粒长粒重增加，可以显著提高水稻产量，在水稻杂种优势利用中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1.水稻Os01g66970.1基因的序列分析及基因编辑靶点设计。黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子,白色方框表示非翻译区。Cas9识别序列位于第一外显子的85 bp处。
图2. Cas9介导的Os01g66970.1不同基因型的获得。WT为野生型序列，***数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加），小写字母为添加碱基。
图3.Os01g66970.1基因不同基因型的表型考察。WT为冈优8515野生型对照植株，970-4和970-5为不同基因型突变植株。
图4.Os01g66970.1基因突变体粒型及粒重分析。WT为冈优8515野生型对照植株，970-4和970-5为不同基因型突变植株。
图5.Os01g66970.1基因突变体相关产量性状分析。WT为冈优8515野生型对照植株，970-4和970-5为不同基因型突变植株。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
实施例1：水稻Os01g66970.1基因的克隆
根据水稻数据中心收录的Os01g66970.1基因信息，设计全长引物序列F: 5’ATGGCGCGCACCGAGA 3’ ; R: 5’ CTATGTACAGTTGAGCTTCACGAGG 3’。以冈优8515基因组DNA为模板，扩增Os01g66970.1基因组序列。
实施例2：水稻Os01g66970.1基因的序列分析及基因编辑靶点设计
水稻Os01g66970.1基因如序列SEQ ID NO .1所示。序列分析显示，该基因含有7个外显子，分别为序列表中第1-195（第一外显子）、第1040-1111（第二外显子）、第1375-1442（第三外显子）、第1594-1741（第四外显子）、第1847-1930（第五外显子）、第2358-2444（第六外显子）、第3409-3609（第七外显子）。
本发明所实验品种冈优8515的Os01g66970.1基因在第一外显子85 bp处设计一个Cas9识别位点，如图1。识别靶序列分别为：（sgRNA）GGGTGGGGATGGGGATGGACGGG。
实施例3：打靶载体构建及水稻遗传转化
本实验采用基因编辑技术为第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9，所使用的载体为人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体），骨架载体pCXUN-Cas9为市面上订购的常见线性载体，（本实验购于北京唯尚立德生物科技有限公司），Cas9蛋白序列全长4206个碱基对，编码1401个氨基酸。其表达由Ubiquitin启动子驱动，gRNA由U6启动子驱动。gRNA片段由引物合成公司合成后通过DNA连接酶连接在U6启动子之后形成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体）。
本发明中，将所述载体pCXUN-Cas9-gRNA转化粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，并经抗性愈伤的筛选、分化和生根创制新的红米品种，以下秀水134和冈优8515为例进行介绍，具体步骤如下：
1、将成熟的水稻水稻种子脱壳并消毒后接种于诱导培养基（NB培养基+2 ,4-D 2mg·L-1，pH5 .8）中， 28℃暗培养7天，切除胚根继续培养7天后将胚性愈伤转移到新的诱导培养基中，每隔15天继代一次。继代三次后的自然分散、颜色鲜黄、直径约为3mm的颗粒状愈伤可用于农杆菌转化。
2、取少量重组农杆菌菌液划线于YEB固体培养基（含有卡那霉素50 mg·L-1和利福平50 mg·L-1，pH5 .8）上，28℃暗培养48h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃暗培养培养两天，用AAM培养基（含有100μM·L-1乙酰丁香酮，pH5 .2）洗菌及重悬菌体，调整菌液浓度至OD600nm=1 .5-2 .0，静置1h，得到农杆菌悬浮液。
3、将步骤1得到的胚性愈伤浸泡于步骤2的农杆菌悬浮液中，静置30min后于无菌滤纸上晾干愈伤，并接种于共培养基（NB培养基+2 ,4-D 2 mg·L-1+乙酰丁香酮100μM·L-1，pH5 .8）中，25℃暗培养3d。
4、挑取步骤3共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250 mg·L-1羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干愈伤组织，接种于筛选培养基（NB培养基+2 ,4-D 2 mg·L-1+羧苄青霉素250mg·L-1 + hygromycin 50mg·L-1，pH5 .8）中，28℃暗培养培养，每两周转接1次，约需三周即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。
5、将步骤4获得的抗性愈伤转移至分化培养基（NB培养基+2 ,4-D 2 mg·L-1+KT10mg·L-1 + NAA 0 .4 mg·L-1，pH 5 .8）上，2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基（1/2 MS培养基，pH 5 .8）上，待幼苗生根长成后，洗净根上的培养基，移栽实验基地。
实施例4：Os01g66970.1基因编辑体的基因型检测及表型考察
提取转化植株基因组DNA，用引物CZT-F（5 ' GGGAGATCCAGCTAGAGGTC 3 '）和CZT-R（5'GGAAGGAGGAAGACAAGG3 '）进行PCR扩增鉴定转基因植株。进一步用目的基因的引物970-F:5'AAATTCCATCAAAAAGCAGA3' 和970-R:5'ACAACCAAAAATAACATCGG 3' PCR扩增上述鉴定的转基因植株基因组DNA，获得带有靶序列的Os01g66970.1基因片段，并送往公司测序。对测序结果进行分析，发现Os01g66970.1基因有5种类型的基因型，其中包含了杂合突变、双等位修饰和纯合突变三种类型的编辑方式。进一步观察突变植株970-4和970-5的表型，结果显示，两个突变体的稻米粒长增加，970-5的粒宽有一定程度的增加，而970-4粒宽基本不变（如图3）。称量两个突变体株系的种子干重，得出相比于冈优8515野生型种子，970-4和970-5水稻种子的千粒重分别提高15.1%和14.0%，显著提高水稻产量（如图4）。而在其它产量相关性状如水稻穗长、一次枝梗数、二次枝梗熟以及每穗粒数方面，970-4和970-5突变株系与冈优8515野生型之间差异不显著，性状基本不变（如图5）。
本发明中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Os01g66970.1基因突变体，与TALEN和ZFN技术相比，操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作。本发明获得的大粒水稻品种经过后代自交分离，可筛选去除转基因外源片段，与转基因育种先比具有更广阔的应用前景与常规的杂交育种相比，大大节约了时间成本，是一种新的获得大粒品系的分子育种方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
福建省农业科学院生物技术研究所
<120> 水稻粒型蛋白及其编码基因与应用
<130> 11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcgcgca ccgagaaggt tgccggcgat ggctgctccg gtggtggtgg tggtggtgga 60
gaaggtcagg tggaggtgga ggtcggggtg gggatgggga tggacgggaa gggaatgata 120
gagtgccgga tatgccagga ggaaggggat gagggcgcca tggattcccc ctgcgcctgc 180
actggcacgc tcaagttcgc ccacaggaaa tgcatacaaa gatggtgtga caagaagggg 240
aacatcacat gtgaaatctg caaccaggtt tactctccaa attatgtcct ccctccaacc 300
aagtgttgtt cagctgaaat ggacatggat cttaggcaaa gctgggttgg acgaattgat 360
ccccatgatt cgcattttct tgccattgcc attgcagagc agcagctgct gcaagctgaa 420
tttgatgatt gtgtgtcctc aaattcaagt ggtgccacat gctgccgaac tgttgtttta 480
attttgatgt tacttttgct tgtgcgccat gtagttgtgt ttgtgagaga tgttagcatg 540
ctgcaggatg caacagtgtt gtttagcgca actcttcagt tcgcaggatt ctttcttcca 600
tgttatgtta tagcccgttc ttgttatgct tttcaacacc ggaggcgaag acaggtttag 660
gggccacctg aacctggctg gaagcattta ctcaaaacaa ctcaacacca tcacagagag 720
acgagaggaa aagcttgtga agaagtaact caaactccct ttgcttggag cctctgcgaa 780
agatttggct taatttctcc cccaacaaga tgtagttgcc gatttagacc atgggccctc 840
gtgaagctca actgtacata g 861
<210> 2
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Arg Thr Glu Lys Val Ala Gly Asp Gly Cys Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gln Val Glu Val Glu Val Gly Val Gly Met
20 25 30
Gly Met Asp Gly Lys Gly Met Ile Glu Cys Arg Ile Cys Gln Glu Glu
35 40 45
Gly Asp Glu Gly Ala Met Asp Ser Pro Cys Ala Cys Thr Gly Thr Leu
50 55 60
Lys Phe Ala His Arg Lys Cys Ile Gln Arg Trp Cys Asp Lys Lys Gly
65 70 75 80
Asn Ile Thr Cys Glu Ile Cys Asn Gln Val Tyr Ser Pro Asn Tyr Val
85 90 95
Leu Pro Pro Thr Lys Cys Cys Ser Ala Glu Met Asp Met Asp Leu Arg
100 105 110
Gln Ser Trp Val Gly Arg Ile Asp Pro His Asp Ser His Phe Leu Ala
115 120 125
Ile Ala Ile Ala Glu Gln Gln Leu Leu Gln Ala Glu Phe Asp Asp Cys
130 135 140
Val Ser Ser Asn Ser Ser Gly Ala Thr Cys Cys Arg Thr Val Val Leu
145 150 155 160
Ile Leu Met Leu Leu Leu Leu Val Arg His Val Val Val Phe Val Arg
165 170 175
Asp Val Ser Met Leu Gln Asp Ala Thr Val Leu Phe Ser Ala Thr Leu
180 185 190
Gln Phe Ala Gly Phe Phe Leu Pro Cys Tyr Val Ile Ala Arg Ser Cys
195 200 205
Tyr Ala Phe Gln His Arg Arg Arg Arg Gln Val Gly Pro Pro Glu Pro
210 215 220
Gly Trp Lys His Leu Leu Lys Thr Thr Gln His His His Arg Glu Thr
225 230 235 240
Arg Gly Lys Ala Cys Glu Glu Val Thr Gln Thr Pro Phe Ala Trp Ser
245 250 255
Leu Cys Glu Arg Phe Gly Leu Ile Ser Pro Pro Thr Arg Cys Ser Cys
260 265 270
Arg Phe Arg Pro Trp Ala Leu Val Lys Leu Asn Cys Thr
275 280 285
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggtggggat ggggatggac ggg 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaattccatc aaaaagcaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acaaccaaaa ataacatcgg 20
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggcgcgca ccgaga 16
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctatgtacag ttgagcttca cgagg 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gggagatcca gctagaggtc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaaggagga agacaagg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aaattccatc aaaaagcaga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acaaccaaaa ataacatcgg 20

Claims (5)

1.一种水稻粒型蛋白Os01g66970.1，其特征在于，具有如SEQ ID NO .2所示的氨基酸序列；或由该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的水稻粒型蛋白Os01g66970.1的编码基因，其特征在于，该编码基因为：具有如SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列；或由SEQ ID NO .1所示的核苷酸序列经过添加、取代或缺失一个或几个碱基而生成的，并编码控制水稻粒型蛋白Os01g66970.1的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的基因在控制水稻粒型上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过敲除权利要求2所述基因来培育大粒水稻品种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用于敲除基因的sgRNA靶点序列为5’-GGGTGGGGATGGGGATGGACGGG- 3’。
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