CN110684796A

CN110684796A - CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用

Info

Publication number: CN110684796A
Application number: CN201910969503.2A
Authority: CN
Inventors: 关跃峰; 王杰; 匡华琴
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Wuhan Aidijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-10-12
Also published as: CN110684796B

Abstract

本发明公开了CRISPR‑Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用，属于大豆分子育种和生物技术领域。该方法包括：在大豆脂肪氧化酶基因编码区设计同时靶向高度同源的GmLox1和GmLox2的sgRNA‑GmLox1/2，以及靶向GmLox3的sgRNA‑GmLox3；针对每个sgRNA单独构建CRISPR‑Cas9基因敲除载体，之后混合侵染大豆子叶节；经大豆稳定遗传转化，植株Gmlox‑28和Gmlox‑60同时敲除3个GmLox基因；自交两代之后，在T₂代植株中筛选到5株T‑DNA与编辑位点分离的GmLox全缺失突变体。该方法为直接且有目标的快速创制无豆腥味大豆新种质提供新策略。

Description

CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用

技术领域

本发明属于大豆分子育种和生物技术领域，具体涉及CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用。

背景技术

大豆（Glycine max (L.) Merr.）起源于中国，是我国乃至世界主要栽培作物之一，也是人类以及家禽和家畜摄取植物蛋白和脂肪的重要来源，在我国农业生产中占有举足轻重的地位（韩立德等, 2003; 毕影东等, 2014; 潘文华和许世卫, 2014; 张亚楠,2017）。但是，在大豆及其制品的储藏、加工过程中大豆子叶中的脂肪氧化酶（Lipoxygenase, LOX）能专一催化具有顺-1.4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，形成过氧化氢衍生物（Axelrod et al., 1981），最后分解成小分子的醛、醇和酮等挥发性物质，产生豆腥味和苦涩味（Brash, 1999; Liavonchanka and Feussner, 2006），严重影响其食用品质以及储藏性和营养价值（Rackis et al., 1979）。大豆生产加工中往往采用加热或微波处理的方法使其脱腥，这一过程耗资费力。去除豆腥味经济而又治本的方法是选育脂肪氧化酶缺失的无豆腥味大豆品种。常规育种中，往往需要lox突变体与优良品种杂交，之后经多代回交或自交而选育出无豆腥味大豆品种，这是一个费时费力的过程。

CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsassociated nuclease 9）是继锌指核酸内切酶（ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）之后出现的新一代基因定点编辑技术，因其操作简单、周期短、效率高等优点，一经问世（Cong et al., 2013; Mali et al., 2013）便迅速发展为基因功能解析、作物遗传改良和新品种培育等领域备受瞩目的技术（Upadhyay et al., 2013; Liang et al., 2014;Sun et al., 2016; Cai et al., 2018）。其工作原理为：CRISPR-Cas9***中，外源单链向导RNA（Single guide RNA, sgRNA）指引内切酶蛋白Cas9在靶点位置进行切割并产生双链DNA断裂（Double-stranded DNA breaks, DSBs）（Jinek et al., 2012）；随后，DSBs诱导DNA自我修复机制，通过非同源末端连接（Nonhomologous End Joining, NHEJ）或同源重组（Homology Directed Repair, HDR）在断裂位置引入小片段的***/缺失或精确的定点替换/***，导致基因功能缺失（Shan et al., 2013; Svitashev et al., 2015）。目前，CRISPR-Cas9***已成功应用于大豆GmFT2a、FAD2-2和GmSPL9等基因突变体的创制（Cai etal., 2018; Amin et al., 2019; Bao et al., 2019），表明利用CRISPR-Cas9技术对大豆农艺性状进行遗传改良是可行的。

大豆脂肪氧化酶包含3种同工酶，即Lox1、Lox2和Lox3，分别由Glyma.13g347600（GmLox1）、Glyma.13g347500 （GmLox2）和Glyma.15g026300（GmLox3）编码合成。通过CRISPR-Cas9***同时敲除3个GmLox基因可以快速创制无豆腥味大豆新种质。CRISPR-Cas9是由人工设计的sgRNA来介导基因组特定位点的切割，因此能否成功设计出精确靶向的sgRNA是该路径的关键技术难题。本发明意在解决该技术难题从而为创制无豆腥味大豆新种质提供新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，包括以下步骤：

（1）在大豆脂肪氧化酶基因编辑位点设计并合成两种sgRNA，sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3；其中，sgRNA-GmLox1/2同时靶向高度同源的GmLox1和GmLox2，sgRNA-GmLox3则靶向GmLox3。

（2）以大豆专用CRISPR/Cas9基因编辑载体pGES201为骨架针对每个sgRNA单独构建CRISPR-Cas9基因敲除载体并转化农杆菌GV3101；

（3）携带CRISPR-Cas9基因敲除载体的农杆菌GV3101以混池的方式混合侵染大豆子叶节，进行大豆的稳定转化；

（4）在T₀代稳定转化苗中进行阳性植株的筛选、sgRNA分布情况的鉴定以及靶向基因编辑情况的检测；

（5）在T₁代-T₂代筛选T-DNA与编辑位点分离的GmLox全缺失突变体。

上述步骤（1）中所述大豆脂肪氧化酶基因编辑位点的准确定位是在大豆基因组（Wm82.a2）13号染色体GmLox1编码区2号外显子（染色体坐标为43769605-43769627）和GmLox2编码区2号外显子（染色体坐标为43762424-4376244），以及 15号染色体GmLox3编码区3号外显子（染色体坐标为2125132-2125154）；所述sgRNA-GmLox1/2的核苷酸序列为：5’-GGAAAGGATACGTTCTTGGAAGG-3’；sgRNA-GmLox3的核苷酸序列为；5’-CCTTTCCTTATCCTCGTAGGGGG-3’；sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3的3’端含有AGG或GGG，作为Cas9核酸内切酶特异识别的PAM序列，能够指引内切酶蛋白Cas9在靶点位置进行切割并产生双链DNA断裂，从而在断裂位置引入小片段的***/缺失或精确的定点替换/***，导致基因功能缺失。

上述步骤（2）中CRISPR-Cas9基因敲除载体的构建为：sgRNA正义和反义寡核苷酸链退火为双链，以CRISPR-Cas9基因编辑载体pGES201为骨架，将sgRNA退火双链连接至载体pGES201上，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，检测获得阳性克隆并提取重组质粒，获得CRISPR-Cas9基因敲除载体；该载体以pGmU6启动子启动sgRNA的表达，大豆内源启动子pM4启动Cas9的表达。

进一步的，上述sgRNA正义和反义寡核苷酸链，其中sgRNA-GmLox1/2的正义寡核苷酸链为：5’-GGATTGGAAAGGATACGTTCTTGGA-3’ ，反义寡核苷酸链为5’-AAACTCCAAGAACGTATCCTTTCCA-3’；sgRNA-GmLox3的正义寡核苷酸链为：5’-GGATTGCCTTTCCTTATCCTCGTAGG-3’ ，反义寡核苷酸链为5’-AAACCCTACGAGGATAAGGAAAGGCA-3’。

上述步骤（3）中侵染大豆子叶节，优选大豆品种为“华春6号”。

上述一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法在选育无豆腥味大豆种质中的应用。

本发明的优点在于：

本发明提供的sgRNA，指引内切酶蛋白Cas9在靶点位置进行较高效率的切割并产生双链DNA断裂，结合sgRNA文库混池转化的方式实现快速、精确、高效、特异性地敲除大豆3个GmLox基因。本发明提供一种方便、高效的策略来构建大豆GmLox全缺失突变体，有效地避免了无腥大豆常规育种中存在的周期长和成本高等问题。

附图说明

图1 CRISPR-Cas9基因编辑载体pGES201载体结构简图。

图2编辑位点在GmLox基因上的位置。

图3 T₀代植株靶点区域DNA测序结果。GmLox-28 和 GmLox-60用圆圈标记。

图4 T₁代植株LOX1酶活性测定结果。A显示各样品显色反应结果；B显示各样品吸光度；C显示各T1代突变体基因编辑情况；CK（water）表示超纯水，HC6表示具有LOX1酶活性的“华春6号”，WX4表示不具有LOX1酶活性的无腥大豆品种（五星4号）；HC6为无色，而CK（water）、WX4以及株系GmLox-28 和 GmLox-60均显示蓝色，表明GmLox-28 和 GmLox-60均不含LOX1酶活性。

图5 T₁代植株LOX2酶活性测定结果。A显示各样品显色反应结果；B显示各样品吸光度；C显示各T₁代突变体基因编辑情况；CK（water）表示超纯水，HC6表示具有LOX2酶活性的“华春6号”，WX4表示不具有LOX2酶活性的无腥大豆品种（五星4号）；HC6为无色，而CK（water）、WX4以及株系GmLox-28 和 GmLox-60均显示蓝色，表明GmLox-28 和 GmLox-60均不含LOX2酶活性

图6 T₁代植株LOX3酶活性测定结果。A显示各样品显色反应结果；B显示各样品吸光度；C显示各T₁代突变体基因编辑情况；CK（water）表示超纯水，HC6表示具有LOX3酶活性的“华春6号”，WX4表示不具有LOX3酶活性的无腥大豆品种（五星4号）；HC6为无色，而CK（water）、WX4以及株系GmLox-28 和 GmLox-60均显示黄色，表明GmLox-28 和 GmLox-60均不含LOX3酶活性。

图7 transgene-free突变体筛选结果。图中***数字表示各株系不同单株编号，“M”表示DNA 分子量标准Marker，“water”表示超纯水，transgene-free突变体用圆圈标记。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：CRISPR-Cas9基因敲除载体的构建及大豆稳定转化

主要试剂与材料来源：

本研究所使用的大肠杆菌DH5α感受态细胞、发根农杆菌K599感受态细胞和农杆菌GV3101感受态细胞均由本实验室保存；所使用的CRISPR-Cas9基因编辑载体pGES201是本实验室由pCAMBIA1300（Cambia，澳大利亚）改造而来，pGmU6启动子启动sgRNA的表达，大豆内源启动子pM4启动Cas9的表达，空载体上带有自身基因“大肠杆菌毒素-抗毒素***毒素蛋白ccdB（control of cell division or death system）”，其两端分别存在酶切位点BsaI（图1）。

PCR Mix酶 PCR Master Mix 购自擎科生物技术有限公司；BsaI限制性内切酶购自NEB（英国）；T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根公司；卡那霉素（kanamycin）、链霉素（streptomycin）、庆大霉素（gentamicin）、利福平（rifampicin）、羧卞青霉素（Carbenicillin）和草铵膦（Basta）等抗生素购自Sigma公司。

细菌培养基试剂：胰蛋白胨和酵母提取物来自OXOID（美国）；其他营养液试剂均为国产或进口分析纯产品。

操作步骤：

1.1 sgRNA设计与合成：sgRNA的设计应在保证与脱靶位点至少1个碱基错配的前提下遵循以下4个原则：1）每个目的基因设计2个以上sgRNA，以便筛选高基因编辑效率的sgRNA；2）保证sgRNA位于目的基因CDS序列的中上游；3）同一个基因的多个sgRNA之间应分布目的基因的不同位置，并尽量保证距离不超过1000bp；4）根据实验需求，选择“单敲sgRNA”或“多敲sgRNA”。“单敲sgRNA”指一个sgRNA仅有一个靶向基因，即此sgRNA仅可敲除一个基因，“多敲sgRNA”指一个sgRNA有多个靶向基因，即可同时敲除多个基因（多个靶向基因大多数为此物种中的同源基因）。本研究利用在线软件CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/home/）设计sgRNA，共设计两种sgRNA，sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3。sgRNA-GmLox1/2同时靶向高度同源的GmLox1和GmLox2，sgRNA-GmLox3则靶向GmLox3。每种sgRNA设计4个，毛根转化实验验证sgRNA的编辑效率，之后选取基因编辑效率高的sgRNA用于农杆菌GV3101的转化以及大豆稳定转化。sgRNA信息如表1：

表1 sgRNA信息

1.2 寡核苷酸退火为双链：

按以下体系配制退火反应体系

正义寡核苷酸（10μM，序列如表2） 5μL

反义寡核苷酸（10μM，序列如表2） 5μL

NaCl 100 mM（终浓度）

Tris‐HCl pH7.4 50 mM（终浓度）

加水补足 50μL

将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置 PCR 仪上，运行以下程序：

95℃ 4min，

RAMP 0.1℃/S ， 95℃ to 16℃

16℃ ∞

退火后的双链Oligo立刻使用或者在‐20℃长期保存。

表2正反义寡核苷酸

1.3 pGES201载体线性化：

酶切体系：

BsaI 2μL

10x cutsmart buffer 5μL

pGES201载体 20μL（≈250 ng/μL）

加水补足至50uL, 放置金属浴中，设置温度为37°C，时间为2小时。

1.4 线性化载体与退火后寡核苷酸链连接：

退火后寡核苷酸链 1μL

线性化pGES201载体 3μL

10x T4 buffer 1μL

T4 连接酶 0.5μL

加水至10ul, 在25°C金属浴中连接反应2小时或16℃过夜。

1.5 大肠杆菌DH5α转化及阳性克隆的鉴定：

将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α感受态)，pGES201载体在原核中抗性为卡那霉素抗性，按照以下实验流程完成转化：

（1）、DH5α感受态细胞从-80°C拿出，迅速***冰中，5分钟后待菌块融化，加入连接产物并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置30分钟；

（2）、42°C水浴热激60秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率；

（3）、向离心管中加入 400 μL 不含抗生素的无菌培养基(LB培养基)，混匀后 37°C，200 rpm 摇床复苏 45-60 分钟；

（4）、取 100-500 μL上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的 LB 培养基上（浓度为50mg/L）；

（5）、将平板倒置放于 37°C培养箱过夜。

采用PCR的方法检测阳性克隆，以人工合成的正义寡核苷酸链为PCR的前引物（如表2所示），并在载体上距离sgRNA后500bp左右的位置设计公用的后引物CRISPR-R（序列为5’-GGCTCACGTTCAAACGTGGC-3’）。将阳性菌液保存并提取质粒，获得CRISPR-Cas9基因敲除载体。

1.6 农杆菌K599转化及毛根转化实验：

CRISPR-Cas9基因敲除载体转化农杆菌K599感受态细胞，抗性为卡那霉素和链霉素抗性。实验流程如下：

（1）、K599感受态细胞从-80℃拿出，迅速***冰中，5分钟后待菌块融化，加入质粒并用手拨打EP管底，轻轻混匀，冰中静置30分钟；

（2）、放入液氮中2分钟，迅速放入37℃水浴锅中静置5分钟，晃动会降低转化效率；

（3）、向离心管中加入 400μL不含抗生素的无菌培养基(LB培养基)，混匀后 28℃，180rpm 摇床复苏4小时；

（4）、取100-500μL上清，轻轻吹打重悬菌块，并涂布到含相应抗生素的LB培养基上（浓度均为50mg/L）。

（5）、将平板倒置放于28℃培养箱过夜。

挑选阳性克隆，采用子叶节侵染法对大豆进行毛根转化。取生长7-10d的毛根提取DNA，以人工合成的正义寡核苷酸链为PCR的前引物（如表2所示），CRISPR-R（序列为5’-GGCTCACGTTCAAACGTGGC-3’）为后引物，检测是否是阳性毛根，挑选条带较亮的9-12个阳性根用编辑引物进行PCR检测并测序，根据测序结果统计编辑效率。如下表所示，最终挑选编辑效率高的sgRNA-GmLox1/2-sg-3和sgRNA-GmLox3-sg-2（图2）进行后续大豆稳定转化试验。

表3 sgRNA编辑效率

1.7 农杆菌GV3101转化及大豆稳定转化：

入选的两种编辑效率高的载体（sgRNA-GmLox1/2-sg-3和sgRNA-GmLox3-sg-2）分别转化农杆菌GV3101感受态细胞（方法同上文1.6），并将两种农杆菌菌液等量混合构成一个“库”，采用农杆菌侵染子叶节法进行大豆稳定转化。大豆稳定遗传转化所用受体品种为南方主栽品种华春6号（华南农业大学选育的国审大豆品种），筛选抗性为Basta。具体过程为：将氯气灭菌后的华春6号种子置于培养皿中，待萌发后取子叶节作为外植体进行农杆菌侵染，外植体经诱导培养、伸长培养、生根培养等过程，获得T₀代稳定转化植株。

实施例2：T-DNA与编辑位点分离的GmLox全缺失突变体筛选

我们利用叶片涂抹Basta、Bar Primer PCR（BPP）、sgRNA Specific PCR（SSP）、PCR产物测序等方法对稳定转化植株进行了阳性植株的筛选、sgRNA分布情况的鉴定以及靶向基因编辑情况的检测。结果显示：76株T₀代稳定转化苗中60株为阳性植株，其中27株仅包含sgRNA-GmLox1/2，22株仅包含sgRNA-GmLox3，11株同时包含sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3；22株阳性植株发生了GmLox基因编辑（基因编辑效率为36.7%），其中阳性植株Gmlox-28和Gmlox-60同时敲除了3个GmLox基因（图3）。

取T₀代阳性植株Gmlox-28和Gmlox-60收获的种子，在生长室内采用盆栽种植，获得T₁代植株。取T₁代植株的叶片提DNA用于检测GmLox基因编辑情况，成熟期收获的种子用于测定LOX酶活性。LOX酶活性采用比色测定法测定，具体流程为：1）把干燥的种子样品分别磨成粉末。2）分别称取种子样品粉末15、30和15 mg，分别在1.5 mL 的0.2 mol L⁻¹硼酸钠缓冲液（pH 9.0）、1.5 mL 的0.2 mol L⁻¹磷酸钠缓冲溶液（pH 6.0）和1.5 mL 的0.2 mol L⁻¹磷酸钠缓冲溶液（pH 6.6）中提取脂肪氧化酶溶液1、2和3（命名为LS1、LS2和LS3，分别用于检测LOX1、LOX2、 LOX3），4°C静止提取1小时，之后离心（12000 rpm， 5分钟，4°C）获得上清液。3）检测LOX1 酶活性：取0.5 mL 的LS1添加到1.0 mL的底物溶液1 （包含pH 9.0的硼酸钠缓冲液0.125 mol L⁻¹，亚甲蓝12.5 μmol L⁻¹，亚油酸钠底物1.375 mmol L⁻¹）。检测LOX2酶活性：取0.5 mL的LS2添加到1.0 mL的底物溶液2（包含pH 6.0的磷酸钠缓冲溶液0.125 molL⁻¹，亚甲蓝12.5 μmol L⁻¹，亚油酸钠底物1.375 mmol L⁻¹，二硫苏糖醇25 mmol L⁻¹，丙酮12.5%）。检测LOX3酶活性：取0.5 mL 的LS3添加到1.0 mL的底物溶液3（包含pH 6.6的磷酸钠缓冲溶液0.125 mol L⁻¹，亚油酸钠底物1.375 mmol L⁻¹，β-胡萝卜素底物12.5%）。混合后，每个反应在透明离心管中孵育15分钟，记录溶液颜色（LOX1和LOX2为无色或蓝色，LOX3为无色或黄色）。4）在660 nm处(用于测量LOX1和LOX2)和452 nm处(用于测量LOX3)，用分光光度计（UV-1600; Shimadzu, Kyoto, Japan）测定各样品吸光度。经检测，Gmlox-28和Gmlox-60 T₁代植株均为GmLox全缺失突变体，均不含LOX酶活性（图4-图6）。

随后，我们从Gmlox-28和Gmlox-60T₁代株系中分别选取两个单株，收获种子，在生长室内采用盆栽种植，获得T₂代植株。取T₂代植株的叶片提DNA，利用CRISPR-Cas9 和sgRNA特异性引物（引物序列如下表所示）检测转基因元件的分离情况。最终从Gmlox-28和Gmlox-60的T₂代植株中筛选到5株transgene-free的GmLox全缺失突变体（图7）。

表4 转基因元件检测引物

以上所述仅为本发明的较佳实施案例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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ggaaaggata cgttcttgga agg 23

<210> 2

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<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3

<400> 2

cctttcctta tcctcgtagg ggg 23

<210> 3

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<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 正义链

<400> 3

ggattggaaa ggatacgttc ttgga 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 反义链

<400> 4

aaactccaag aacgtatcct ttcca 25

<210> 5

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<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 正义链

<400> 5

ggattgcctt tccttatcct cgtagg 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 反义链

<400> 6

aaaccctacg aggataagga aaggca 26

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-1

<400> 7

agaaggttgc ttcctgagaa agg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-2

<400> 8

tacctgcaga tcttatcaag agg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-3

<400> 9

ggaaaggata cgttcttgga agg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-4

<400> 10

tcgttaccaa ctttgggagc agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-1

<400> 11

aaggaaggat taactttcag agg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-2

<400> 12

cctttcctta tcctcgtagg ggg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-3

<400> 13

aatagcgtaa ccagcgttgg ggg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-4

<400> 14

cggttatcac tggtcaacga cgg 23

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-1 正义链

<400> 15

ggattgagaa ggttgcttcc tgagaa 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-1 反义链

<400> 16

aaacttctca ggaagcaacc ttctca 26

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<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-2 正义链

<400> 17

ggattgtacc tgcagatctt atcaag 26

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-2 反义链

<400> 18

aaaccttgat aagatctgca ggtaca 26

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-3 正义链

<400> 19

ggattggaaa ggatacgttc ttgga 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-3 反义链

<400> 20

aaactccaag aacgtatcct ttcca 25

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-4 正义链

<400> 21

ggattgtcgt taccaacttt gggagc 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2 Sg-4 反义链

<400> 22

aaacgctccc aaagttggta acgaca 26

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-1 正义链

<400> 23

ggattgaagg aaggattaac tttcag 26

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-1 反义链

<400> 24

aaacctgaaa gttaatcctt ccttca 26

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-2 正义链

<400> 25

ggattgcctt tccttatcct cgtagg 26

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-2 反义链

<400> 26

aaaccctacg aggataagga aaggca 26

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-3 正义链

<400> 27

ggattgaata gcgtaaccag cgttgg 26

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-3 反义链

<400> 28

aaacccaacg ctggttacgc tattca 26

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-4 正义链

<400> 29

ggattgcggt tatcactggt caacga 26

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3 Sg-4 反义链

<400> 30

aaactcgttg accagtgata accgca 26

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> pGmU6-F

<400> 31

taaactgaag gcgggaaacg acaat 25

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> CRISPR-R

<400> 32

ggctcacgtt caaacgtggc 20

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox1/2-R

<400> 33

aaactccaag aacgtatcct ttcca 25

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> sgRNA-GmLox3-R

<400> 34

aaaccctacg aggataagga aaggca 26

Claims

1.一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在大豆脂肪氧化酶基因编辑位点设计并合成两种sgRNA，sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3；其中，sgRNA-GmLox1/2同时靶向高度同源的GmLox1和GmLox2，sgRNA-GmLox3靶向GmLox3；

2.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于：步骤（1）中所述大豆脂肪氧化酶基因编辑位点的准确定位是在大豆基因组13号染色体GmLox1编码区2号外显子，和GmLox2编码区2号外显子；以及 15号染色体GmLox3编码区3号外显子；所述sgRNA-GmLox1/2的核苷酸序列为：5’-GGAAAGGATACGTTCTTGGAAGG-3’；sgRNA-GmLox3的核苷酸序列为；5’-CCTTTCCTTATCCTCGTAGGGGG-3’；sgRNA-GmLox1/2和sgRNA-GmLox3的3’端含有AGG或GGG，作为Cas9核酸内切酶特异识别的PAM序列，能够指引内切酶蛋白Cas9在靶点位置进行切割并产生双链DNA断裂，从而在断裂位置引入小片段的***/缺失或精确的定点替换/***，导致基因功能缺失。

3.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于：步骤（2）中CRISPR-Cas9基因敲除载体的构建为：sgRNA正义和反义寡核苷酸链退火为双链，以CRISPR-Cas9基因编辑载体pGES201为骨架，将sgRNA退火双链连接至载体pGES201上，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，检测获得阳性克隆并提取重组质粒，获得CRISPR-Cas9基因敲除载体；该载体以pGmU6启动子启动sgRNA的表达，大豆内源启动子pM4启动Cas9的表达。

4.根据权利要求3所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于：所述sgRNA正义和反义寡核苷酸链，其中sgRNA-GmLox1/2的正义寡核苷酸链为：5’-GGATTGGAAAGGATACGTTCTTGGA-3’ ，反义寡核苷酸链为5’-AAACTCCAAGAACGTATCCTTTCCA-3’；sgRNA-GmLox3的正义寡核苷酸链为：5’-GGATTGCCTTTCCTTATCCTCGTAGG-3’ ，反义寡核苷酸链为5’-AAACCCTACGAGGATAAGGAAAGGCA-3’。

5.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法，其特征在于：步骤（3）中侵染大豆子叶节，优选大豆品种为“华春6号”。

6.如权利要求1所述的一种CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法在选育无豆腥味大豆种质中的应用。