CN111793619B

CN111793619B - 一种单链环状dna的制备方法

Info

Publication number: CN111793619B
Application number: CN202010500803.9A
Authority: CN
Inventors: 梁兴国; 刘梦琴; 王伟男; 隋哲; 安然
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN111793619A

Abstract

本发明属于核酸技术领域，涉及一种单链环状DNA的制备方法，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，然后将环化反应所需的中等长度的单磷酸化双链DNA与辅助环化的模板DNA按照一定比例混合，加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的多次循环，制得只有一条链环化的双链产物；从中纯化分离出已环化的单链环状DNA，并进行电泳检测。该方法不需要制备单链DNA，直接以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接反应高效制备中等长度单环DNA；酶法连接成环能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度单链环状DNA的产率。

Description

一种单链环状DNA的制备方法

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种单链环状DNA的制备方法。

背景技术

单链环状DNA，是一种由单链DNA首尾相接形成的环状结构，具有稳定性和灵活性较强、无游离的末端、且不易被常见的核酸酶降解等特性，单链环状DNA逐渐成为构建DNA折纸和分子机器等高级纳米结构的重要元件。此外，单链环状DNA也可以应用于食品、生物、医药等领域；在分子生物学领域，单链环状DNA可用作滚环扩增、转录的模板；在检测领域，可将环状分子机器上设计上G-四聚体及DNAzyme，进行样品中离子等物质的检测；单链环状DNA有着重要的应用价值。

目前，对单链环状DNA的研究多集中在小于100nt的小型单链环和数千nt的天然噬菌体分离出来的大型单链环的应用上。其中，Sleiman等人利用小单环DNA作为自组装基本元件制备纳米材料(Nucleic Acids Research,2017,45(9):e74-e75)；Rothemund等利用M13mp18噬菌体DNA(天然存在的大型单链环状DNA，长度为6407nt)作为脚手架制备各种纳米材料。相较于小型单环DNA与大型单环DNA，中等长度单链环状DNA，即长度为100～1000nt的单链环状DNA具有柔韧性好、携带信息量大、易于观察等优点，且序列信息及长度可根据实验需要进行编辑，因此，中等长度单链环状DNA的制备对DNA纳米技术以及其他相关研究的发展具有重要意义。

当前，常用的成环方法为恒温单链连接，但是恒温单链连接法制备中等长度单环DNA难度较大。首先，游离的中等长度单链DNA本身难以制备；其次，由于单链具有复杂的二级结构，在恒温连接过程中很难打开，甚至会存在单链两端自身配对的情况，导致与成环链两端互补的辅助模板DNA，即splint很难找到单链DNA模板的两端；第三，长于100nt的单链制备困难，成本高，而一般DNA扩增的产物是双链(如PCR技术等)。这些因素很大程度上增加了制备单环DNA的难度。因此，如果能提高中等长度单链环状DNA的产率并得到几乎无副产物的环状DNA或RNA，使其研究和应用大大简化，不但有助于对其拓扑结构的详细研究，也可为环状DNA纳米技术和医疗诊断等研究提供大量的研究材料。

发明内容

本发明针对传统中等长度单环DNA制备过程中，作为重要原料的中等长度单链DNA难以制备、且恒温连接难以打开单链复杂二级结构而导致连接效率较低的问题，提出了一种单链环状DNA的制备方法，以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接反应高效制备中等长度单环DNA。该方法不需要制备中等长度单链DNA，并且在酶法连接成环过程中，能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度单环DNA的产率。

本发明的技术方案是：

一种单链环状DNA的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的中等长度的单磷酸化双链DNA，并采用单链核酸外切酶切除PCR反应物；

步骤一中双链DNA的制备方法为使用只有其中一条引物的5′端带有磷酸基团的一对引物进行PCR，PCR双链产物中只有以这条带有磷酸基团的引物生成的DNA链的末端带有磷酸基团；

步骤二，将环化反应所需的中等长度的单磷酸化双链DNA与辅助环化的模板DNA(下统称splint)按照一定比例混合，然后加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的多次循环，稳定一段时间后缓慢降温至常温，制得只有一条链环化的双链产物；

步骤三、从步骤二制备得到的产物中分离纯化出已环化好的单链环状DNA，并进行电泳检测。当对单链环状DNA的纯度要求很高时，需要纯化，纯化方法包括：用外切酶去除互补链DNA和未环化的成环链、酚-氯仿抽提除蛋白、乙醇沉淀浓缩、PAGE切胶回收或HPLC纯化。

设计一种基于热循环的连接反应，即中等长度双链DNA在splint辅助下，进行高温变性和降温连接的多次循环，最后稳定一段时间后缓慢降温至常温，此方法称为中等长度单环的变温循环连接反应。该反应在高温下将游离中等长度的双链DNA二级结构打开，随后降至Splint结合和连接酶反应温度进行DNA连接，多次循环。值得注意的是，在连接过程中由于仅有双链中的一条链的5′端带有磷酸基团，故仅有5′端带磷酸基团的这条链也就是成环链能够发生连接，而互补链因不含有磷酸基团且没有与之相对应的Splint而不发生连接。这种升降温循环的连接方法可有效减小序列的复杂二级结构对连环的影响，以提高连接效率。

进一步的，所述步骤二中环化反应所需的单磷酸化双链DNA包括一条用于成环的5′端带有磷酸基团的单链DNA，称为成环链，另一条单链DNA为成环链的互补链；所述splint为与成环链两端互补的短链DNA；所述步骤二中加入50-100nt长的同成环链的中间部分具有相同序列，即与互补链的中间部分互补的单链DNA，该单链DNA防止在升温降温时，双链快速复性，用于促进连接。

进一步的，所述步骤一制备的单磷酸化双链DNA的长度为100-1000bp；优选的，所述单磷酸化双链DNA的长度为250-1000bp。

进一步的，所述单磷酸化双链DNA与splint的摩尔浓度比为1:10-1:50。Splint过少时，多条DNA链共用一条splint，会促进大分子副产物的产生；splint过多时，一条成环链两端带有两条splint会影响连接的效率。具体的说，环化底物是双链，连接时涉及到splint与成环链的互补链一起竞争成环链的问题，因此splint浓度提高，能够提高splint的竞争力，从而使splint更好地与成环链杂交，进而辅助成环。

进一步的，所述splint的长度为30～60nt。

进一步的，所述步骤二中的升温降温循环次数为10～40。循环次数太多，容易增加副产物生成且浪费时间，循环数太少，不易获得较高成环率，因此循环次数控制在10～40。

进一步的，所述步骤二中的连接温度为50～80℃。

进一步的，所述耐热连接酶包括Taq DNA ligase、Tba连接酶和9°N^TMDNA ligase；所述步骤二中的反应缓冲液的组成为耐热连接酶相应的反应缓冲液。

进一步的，Taq DNA ligase的反应缓冲液组成为20mM Tris-HCl(pH 7.6@25℃)，25mM Potassium Acetate，10mM Magnesium Acetate，1mM NAD⁺，10mMDTT，0.1％

X-100；9°N^TMDNA ligase的反应缓冲液组成为10mM Tris-HCl(pH 7.5@25℃)，600μM ATP，2.5mM dithiothreitol，2.5mM MgCl₂，0.1％Triton X-100。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的一种单链环状DNA的制备方法，以中等长度双链DNA为原料，采用双链变温循环连接法高效制备中等长度单环DNA，该方法不需要制备中等长度单链DNA，原料易得，并且在酶法连接成环过程中，能够打开中等长度双链DNA复杂的二级结构，提高中等长度DNA单环的产率；相较于传统的双链只能制备双链环状DNA的方法，本发明采用双链制备单环的应用范围更广。

(2)采用现有的恒温循环连接方法(如图2所示)，由于二级结构的形成会使Splint难以结合，连接效率很低，针对这一现有方法制备中等长度单链环状DNA难以连接成环的问题，本发明采用双链变温循环连接反应(如图1所示)，制备中等长度单环状DNA的连接率较高，因此可以为纳米结构或滚环扩增等以环状DNA为研究对象的研究项目提供充足的实验材料。

附图说明

图1为基于双链变温循环连接制备中等长度单链环状DNA示意图；

图2为恒温循环连接制备中等长度单链环状DNA示意图；

图3为实施例1提供的恒温循环连接法、单链变温循环连接法以及双链变温循环连接法的凝胶电泳图；

图4为实施例2提供的不同温度及splint长度的双链变温循环连接单环的凝胶电泳图；

图5为实施例3提供的不同splint与双链DNA浓度比的双链变温循环连接单环的凝胶电泳图；

图6为实施例4提供的不同循环数的双链变温循环连接单环的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例所用DNA序列均由英潍捷基(上海)有限公司合成；TaqDNA连接酶及缓冲液购自美国New England Biolabs(NEB)生物技术有限公司；核酸外切酶ExonucleaseIII(ExoIII)、大肠杆菌质粒pUC 18、GeneRulerTM Low Range DNA Ladder(LR)均购自美国Thermo Fisher Scientific生物技术有限公司；PCR聚合酶2×Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)均购自北京索莱宝科技有限公司。

实施例1

1)原料

aPCR引物链F(358EX-F)(5’→3’)：GTCTTGAGTCCAACCCGG(长度为18nt，SEQ ID NO：1)

aPCR引物链R(358EX-R)(5’→3’)：ATGACCAAAATCCCTTAACG(5’-磷酸化，长度为20nt，SEQ ID NO：2)

splint(5’→3’)：CGTTAAGGGATTTTGGTCATGTCTTGAGTCCAACCCGGTA(长度为40nt，SEQ ID NO：3)

模板来源：大肠杆菌质粒pUC 18(Thermo Fisher Scientific生物技术有限公司)

2)制备中等长度单链和双链DNA

采用不对称PCR(aPCR)制备358nt单链DNA，采用PCR制备358bp双链DNA。PCR体系为：[pUC 18]＝2×10⁴copies/μL，[358EX-F]＝0.2μM，[358EX-R]＝0.2μM，[Phanta MaxMaster Mix]＝1×，总体积20μL；95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，进行38次循环，最终72℃延伸10min。aPCR体系：PCR产物(稀释100倍)2μL，[358EX-F]＝0.05μM，[358EX-R]＝0.5μM，[Phanta Max Master Mix]＝1×，总体积20μL；95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，进行38次循环，最终72℃延伸10min。在连接反应前对制备的模板进行抽提处理，去掉反应中的PCR聚合酶；具体抽提方法为：向1.5mL离心管中加入200μL样品，再加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混匀，12000rpm离心5min；小心取上清移入另一新的1.5mL离心管中，加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rpm离心5min，取上清液备用。

3)连接成环

(1)恒温循环连接法成环(单链成环与双链成环操作一致)：体系中成环链(单链和双链DNA)的浓度为40nM，成环链与splint的摩尔比为1:20倍，40UTaqDNALigase，1×TaqDNA连接酶缓冲液，总体积20μL；95℃预变性5min，65℃连接4h。

(2)单链变温循环连接法成环：体系中成环链(aPCR产物358nt单链DNA)的浓度为40nM，成环链与splint的摩尔比为1:20倍，40UTaqDNALigase，1×TaqDNA连接酶缓冲液，总体积20μL。反应条件为：90℃预变性5min；90℃变性15s，65℃连接5min，30次循环；循环结束后80℃稳定10min，0.1℃/s降温到30℃稳定10min。

(3)双链变温循环连接法成环：体系中单磷酸化DNA双链(PCR产物358bp双链DNA)的浓度为40nM，成环链与splint的摩尔比为1:20倍，40UTaqDNALigase，1×TaqDNA连接酶缓冲液，总体积20μL。反应条件为：90℃预变性5min；90℃变性15s，65℃连接5min，30次循环；循环结束后80℃稳定10min，0.1℃/s降温到30℃稳定10min。

1×Taq DNA连接酶缓冲液组成：20mM Tris-HCl(pH7.6@25℃)，25mM PotassiumAcetate，10mM Magnesium Acetate，1mM NAD⁺，10mM DTT，0.1％

X-100。

4)外切酶酶切纯化

为确认单链变温循环连接法和双链变温循环连接法得到的条带为DNA环，使用ExoIII对DNA环进行酶切。ExoIII酶切体系：20nM纯化后DNA环，1×ExoIII反应缓冲液，40UExoIII，总体积7μL，37℃酶切1h，75℃加热10min灭活。

5)电泳检测

对不同反应条件的成环结果进行6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并使用Image Lab软件通过条带亮度对DNA环的产率进行定量。

图3A为恒温连接法制备中等长度单环DNA，L：LR DNA Ladder；Lane1：PCR制备双链DNA的产物；Lane2：双链DNA恒温条件下连接结果；Lane3：aPCR制备单链DNA的产物；Lane4：单链DNA恒温条件下连接结果。由单磷酸化DNA双链在恒温条件下打开的区域是随机的，并不一定位于双链DNA末端，用于连接的splint不易***单磷酸化DNA双链末端之间与成环链结合，因此在恒温连接条件下双链DNA并不能连接成环(Lane2)；aPCR产物中的双链DNA存在一样的情况，产生的单链DNA可以与splint结合并连接(Lane4)，但连接效率很低。

图3B为变温循环连接法制备中等长度单环DNA，L：LR Ladder；Lane1：aPCR制备单链DNA的产物；Lane 2：单链DNA变温循环制备得到的单环DNA，用于位置对照；Lane3：PCR制备双链DNA的产物；Lane4：双链DNA变温循环连接的结果；Lane5：将双链DNA变温循环连接产物的外切酶酶切结果。结果表明，双链DNA经变温循环连接后，大部分底物被消耗，连接后的产物条带基本都滞留在胶孔(Lane4)，说明连接反应中生成了大量结构复杂的中间产物。将连接产物经ExoⅢ酶切后，产物条带(Lane5)与单链DNA变温循环制备得到的单环DNA条带(Lane2)相近，但产量更多，由于Lane2中单链DNA连接产物未切掉与其互补的splint，因此比Lane5中的产物偏移率略慢。通过条带位置验证可知，将PCR产物连接后的中间产物用ExoⅢ酶切后可以得到目的单环DNA，且方法简单收率较高。

由图3A与图3B所示，变温循环连接法制备中等长度单环DNA产量明显多于恒温连接法，并且直接使用双链DNA作为连接底物制备更简便，具有明显优势。

实施例2

1)原料

splint(5’→3’)：

358B-S-20：CGTTAAGGGATTTTGGTCATGTCTTGAGTCCAACCCGGTA(40nt，SEQ ID NO：3)

358B-S-25：ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACA(50nt，SEQID NO：4)

358B-S-30：

CGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACAC GAC(59nt，SEQID NO：5)

模板来源：大肠杆菌质粒pUC18(Thermo Fisher Scientific生物技术有限公司)

2)制备中等长度双链DNA

采用PCR制备358nt双链DNA。PCR体系：[pUC18]＝2×10⁴copies/μL，[358EX-F]＝0.2μM，[358EX-R]＝0.2μM，[Phanta Max Master Mix]＝1×，总体积20μL；95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，进行38次循环，最终72℃延伸10min。在连接反应前对PCR产物(单磷酸化DNA双链)进行抽提处理，去掉反应中的PCR聚合酶；具体抽提方法为：向1.5mL离心管中加入200μL样品，再加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀，12000rpm离心5min；小心取上清移入另一新的1.5mL离心管中，加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rpm离心5min，取上清液备用。

3)变温循环连接法对PCR双链产物进行成环

体系中单磷酸化DNA双链(PCR产物358bp双链DNA)的浓度为40nM，单磷酸化DNA双链与不同长度splint(40nt，50nt和59nt)的摩尔比为1:20倍，40U TaqDNA Ligase，1×TaqDNA连接酶缓冲液，总体积20μL；90℃预变性5min；90℃变性15s，不同温度(60℃，65℃和70℃)连接5min，30次循环；循环结束后80℃稳定10min，0.1℃/s降温到30℃稳定10min。待连接反应结束后，将40UExoⅢ，1×ExoⅢ反应缓冲液直接加入至连接产物中，37℃过夜温育，可获取较为单一的单环DNA产物。

1×TaqDNA连接酶缓冲液组成：20mM Tris-HCl(pH7.6@25℃)，25mM PotassiumAcetate，10mM Magnesium Acetate，1mMNAD⁺，10mMDTT，0.1％

X-100。

4)电泳检测

图4为不同温度及splint长度的双链变温循环连接单环的结果图，图4中c-DNA表示已证实为单环DNA的标准对照，作用是为连接产物作位置对照及相对定量参考条带，Lane1-9分别为PCR产物在不同温度及不同长度的splint的条件下连接产物，温度及splint长度在图中已标注(图中标注的splint长度为splint与成环链两端分别互补的长度，比如“20+20”表示splint与成环链两端分别互补20nt，splint总长度为40nt)；Lane11-19分别为Lane1-9中连接产物相应的ExoⅢ酶切结果。图4中显示，splint长度40-59nt时都能有效成环；连接温度在60-70℃时，都能有效成环。

实施例3

1)原料

splint(5’→3’)：

358B-S-20：CGTTAAGGGATTTTGGTCATGTCTTGAGTCCAACCCGGTA(40nt，SEQ ID NO：3)

2)制备中等长度双链

采用PCR制备358bp双链。PCR体系：[pUC18]＝2×10⁴copies/μL，[358EX-F]＝0.2μM，[358EX-R]＝0.2μM，[Phanta Max Master Mix]＝1×，总体积20μL；95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，进行38次循环，最终72℃延伸10min。在连接反应前对PCR产物(单磷酸化DNA双链)进行抽提处理，去掉反应中的PCR聚合酶；具体抽提方法为：向1.5mL离心管中加入200μL样品，再加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀，12000rpm离心5min。小心取上清移入另一新的1.5mL离心管中，加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rpm离心5min，取上清液备用。

3)变温循环连接法对PCR双链产物进行成环

体系中单磷酸化DNA双链(PCR产物)的浓度为40nM，splint(长度为40nt)与单磷酸化DNA双链成环链的摩尔比分别设置为10:1、20:1、30:1、40:1、50:1倍，40U Taq DNALigase，1×Taq DNA连接酶缓冲液，总体积20μL；90℃预变性5min；90℃变性15s，65℃连接5min，30次循环；循环结束后80℃稳定10min，0.1℃/s降温到30℃稳定10min。待连接反应结束后，将40U ExoⅢ，1×Exo Ⅲ反应缓冲液直接加入至连接产物中，37℃过夜温育。可获取较为单一的单环DNA产物。

1×Taq DNA连接酶缓冲液组成：20mM Tris-HCl(pH 7.6@25℃)，25mM PotassiumAcetate，10mM Magnesium Acetate，1mM NAD⁺，10mM DTT，0.1％

X-100。

4)电泳检测

图5为不同splint与单磷酸化DNA双链的摩尔浓度比条件下，双链变温循环连接单环的结果图，图5中c-DNA表示已证实为单环DNA的标准样品，作用是为连接产物作位置对照及相对定量参考条带，Lane1-5分别为splint与单磷酸化DNA双链在不同摩尔浓度比的条件下连接产物，浓度比例在图中已标注；Lane7-11分别为Lane1-Lane5中连接产物相应的ExoⅢ酶切结果。图5中显示，splint与单磷酸化DNA双链的比例在10:1～50:1的范围内均有较好的连接效果。

实施例4

1)原料

splint(5’→3’)：

358B-S-20：CGTTAAGGGATTTTGGTCATGTCTTGAGTCCAACCCGGTA(40nt，SEQ ID NO：3)

2)制备中等长度双链

3)变温循环连接法对PCR双链产物进行成环

体系中单磷酸化DNA双链(PCR产物)的浓度为40nM，单磷酸化DNA双链与splint的摩尔比为1:20倍，40U Taq DNA Ligase，1×Taq DNA连接酶缓冲液，总体积20μL；90℃预变性5min；90℃变性15s，65℃连接5min，设置不同循环次数，循环次数分别为10、20、30、40次；循环结束后80℃稳定10min，0.1℃/s降温到30℃稳定10min。待连接反应结束后，将40U ExoⅢ，1×Exo Ⅲ反应缓冲液直接加入至连接产物中，37℃过夜温育，可获取较为单一的单环DNA产物。

X-100。

4)电泳检测

图6为不同循环数的双链变温循环连接单环的结果图，图6中c-DNA表示已证实为单环DNA的标准对照，作用是为连接产物作位置对照及相对定量参考条带，Lane1-4分别为不同循环次数的连接产物，循环次数在图中已标注；Lane6-9分别为Lane1-4中连接产物相应的ExoⅢ酶切结果。图6中显示，循环次数在10～40的范围内均有较好的连接效果。

上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，凡在本发明的内容范围内所做出的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种单链环状DNA的制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcttgagtc caacccgg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaccaaaa tcccttaacg 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgttaaggga ttttggtcat gtcttgagtc caacccggta 40

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actcacgtta agggattttg gtcatgtctt gagtccaacc cggtaagaca 50

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gtcttgagtc caacccggta agacacgac 59

Claims

1.一种单链环状DNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，通过PCR制备出其中一条链的5′端带有磷酸基团的长度为100-1000bp的单磷酸化双链DNA；

步骤二，将环化反应所需的长度为100-1000bp的单磷酸化双链DNA与辅助环化的splint按照摩尔浓度比为1:10-1:50的比例混合，然后加入耐热连接酶和反应缓冲液混合配制成连接反应体系，进行高温变性和降温连接的循环，循环次数为10～40，稳定一段时间后缓慢降温至常温，并采用核酸外切酶对连接产物进行酶切，制得只有一条链环化的双链产物；其中，连接温度为60～70℃，环化反应所需的单磷酸化双链DNA包括一条用于成环的5′端带有磷酸基团的单链DNA，称为成环链，另一条单链DNA为成环链的互补链；所述splint为与成环链两端互补的短链DNA；所述splint的长度为40～59nt；

步骤三，从步骤二制备得到的产物中分离纯化出已环化的单链环状DNA，并进行电泳检测。

2.根据权利要求1所述的单链环状DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤二中加入50-100nt长的同成环链的中间部分具有相同序列的单链DNA。

3.根据权利要求1所述的单链环状DNA的制备方法，其特征在于，所述单磷酸化双链DNA的长度为250-1000bp。

4.根据权利要求1所述的单链环状DNA的制备方法，其特征在于，所述耐热连接酶包括Taq DNA ligase、Tba连接酶和9°N^TMDNA ligase；所述步骤二中的反应缓冲液的组成为耐热连接酶相应的反应缓冲液。

5.根据权利要求4所述的单链环状DNA的制备方法，其特征在于，Taq DNA ligase的反应缓冲液组成为20mM Tris-HCl，25mM Potassium Acetate，10mM Magnesium Acetate，1mMNAD⁺，10mM DTT，0.1％

X-100；9°N^TMDNA ligase的反应缓冲液组成为10mM Tris-HCl，600μM ATP，2.5mM dithiothreitol，2.5mM MgCl₂，0.1％Triton X-100。