CN105732785B - 蛋白质GhDHN1在调控植物抗逆性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蛋白质GhDHN1在调控植物抗逆性中的应用。所述蛋白质GhDHN1为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。实验证明，与野生型拟南芥相比，在植物中过表达GhDHN1基因，植物的抗逆性显著增加。本发明对植物抗逆性的新材料的选育具有重要应用价值。

Description

蛋白质GhDHN1在调控植物抗逆性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白质GhDHN1在调控植物抗逆性中的应用。
背景技术
低温和高盐等非生物胁迫是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。利用基因工程手段改良作物，从而提高农作物和经济作物对逆境的适应能力是新品种培育亟需解决的关键问题和重大问题。近年来，人们从生理、生化、代谢、生态、遗传以及进化等角度对植物响应低温和高盐等非生物胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控和信号传导等分子水平上认识植物对非生物逆境胁迫的抗逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，基因工程手段开辟了植物抗逆育种的新途径。
棉花是我国重要的经济作物，在国民经济和社会发展中占有重要地位，但是我国的基本国情是人多地少，粮棉争地矛盾非常突出。由于低温和高盐等非生物胁迫也是制约棉花生产的主要逆境因子，因此，提高棉花的抗逆能力对于棉花高产具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质GhDHN1在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质GhDHN1为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。
其中，序列表中序列2可由211个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
Figure BDA0000957673270000011
Figure BDA0000957673270000021
上述a3)中的蛋白质GhDHN1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的蛋白质GhDHN1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质GhDHN1的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质GhDHN1的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。
所述编码所述蛋白质GhDHN1的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：
b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质GhDHN1的DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质GhDHN1的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列1由636个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的蛋白质GhDHN1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GhDHN1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GhDHN1且具有蛋白质GhDHN1的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述植物可为如下c1)至c12)中的任一种：
c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)棉花；c5)陆地棉；c6)棉花品种衡棉3号；c7)棉花品种豫2067；c8)棉花品种邯177；c9)陆地棉TM-1；c10)十字花科植物；c11)拟南芥；c12)野生型拟南芥Columbia。
上述应用中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗寒性。
为解决上述问题，本发明还提供了一种培育抗逆性转基因植物的方法。
本发明所提供的培育抗逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入所述蛋白质GhDHN1的编码基因，得到抗逆性高于所述受体植物的转基因植物。
上述方法中，所述蛋白质GhDHN1的编码基因可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：
b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码中所述蛋白质GhDHN1的DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质GhDHN1的DNA分子。
上述方法中，所述受体植物可为如下c1)至c12)中的任一种：
c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)棉花；c5)陆地棉；c6)棉花品种衡棉3号；c7)棉花品种豫2067；c8)棉花品种邯177；c9)陆地棉TM-1；c10)十字花科植物；c11)拟南芥；c12)野生型拟南芥Columbia。
上述方法中，所述“向受体植物中导入所述蛋白质GhDHN1的编码基因”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述蛋白质GhDHN1的编码基因***出发质粒得到的重组质粒。
所述重组载体具体可为重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP。所述重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP具体可为将质粒pBI121::GFP的XbaⅠ和SmaⅠ识别序列间的片段(质粒pBI121::GFP被限制性核酸内切酶XbaⅠ和SmaⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的DNA分子。
上述方法中，所述抗逆性可为抗盐性和/或抗寒性。
上述任一所述的方法在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明所提供的蛋白质GhDHN1能提高植物的抗逆性：与野生型拟南芥相比，T3代纯合转GhDHN1基因拟南芥株系L5和株系L9的抗盐性和/或抗寒性都显著增加。因此，可以利用蛋白质GhDHN1调控植物抗逆性。本发明对植物抗逆性的新材料的选育具有重要应用价值。
附图说明
图1为以陆地棉TM-1的cDNA为模板PCR扩增GhDHN1基因。
图2为重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP的酶切鉴定结果。
图3为GhDHN1基因的亚细胞定位。
图4为蛋白质GhDHN1的编码基因在不同逆境胁迫下的转录表达模式。
图5为蛋白质GhDHN1的编码基因在不同逆境胁迫下的荧光定量表达和组织特异性表达。
图6为转GhDHN1基因拟南芥的分子检测结果。
图7为转GhDHN1基因拟南芥的抗逆性鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)为TaKaRa公司产品。基因枪GDS-80为美国Wealtec Corp公司产品。共聚焦显微镜FV1000为日本Olympus公司产品。pMDTM19(simple)T载体为Takara公司产品，产品目录号为3271。
棉花品种豫2067、棉花品种邯177和衡棉3号均记载在如下文献中：王俊娟，叶武威，王德龙，樊伟莉，王帅.PEG胁迫条件下41份陆地棉种质资源萌发特性研究及其抗旱性综合评价，植物遗传资源学报，2011，12(6)：840-846.公众可以从中国农业科学院棉花研究所(即申请人处)获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。在下文中，棉花品种豫2067简称豫2067，棉花品种邯177简称邯177。
陆地棉TM-1记载在如下文献中：Li F G，Fan G Y，Lu C R，et al.Genomesequence of cultivated Upland cotton(Gossypium hirsutum TM-1)providesinsights into genome evolution.Nature Biotechnology，2015，33，524-U242.Doi，10.1038/nbt.3208.公众可以从中国农业科学院棉花研究所(即申请人处)获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。陆地棉TM-1在下文简称TM-1。
野生型拟南芥Columbia记载在如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，KimM，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A genetic link between cold responses andflowering time through FVE in Arabidopsis thaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.公众可从中国农业科学院棉花研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。野生型拟南芥Columbia在下文中简称野生型拟南芥。
根癌农杆菌GV3101记载在如下文献中：高建强，梁华，赵军.植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展，中国农学通报，2010，2(16)：22-25)，公众可从中国农业科学院棉花研究所(即申请人处)获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
质粒pBI121::GFP记载在如下文献中：赵小洁.棉花VP基因家族鉴定及其表达分析.河南大学硕士论文，2015.
萌发率＝发芽种子数/播种种子数×100％；其中种子发芽的标准为种子长出的下胚轴和胚根。
光暗交替培养即光培养和暗培养交替，光暗交替培养的周期具体可为：14小时光照培养/10小时黑暗培养。
实施例1、蛋白质GhDHN1的编码基因的克隆
本发明的申请人从TM-1中克隆出蛋白质GhDHN1的编码基因。具体方法如下：
1、模板的获得：采用Trizol法提取处于三叶期的陆地棉TM-1的幼嫩叶片的总RNA，然后利用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录出第一链cDNA。
2、人工合成引物GhDHN1-F：5’-ATGGCCGAGGAGCATACCAGTA-3’和GhDHN1-R：5’-TCAAGCCTTTTCTTTTTCTTCA-3’。
3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的GhDHN1-F和GhDHN1-R为引物进行PCR扩增，得到约636bp的双链DNA分子。实验结果见图1。
反应程序：94℃，预变性5min；94℃40s，54℃40s，72℃40s，30个循环；72℃，10min。
4、将步骤3中得到双链DNA分子连接至pMDTM19(simple)T载体，得到重组质粒pMD19-GhDHN1。
根据测序结果，重组质粒pMD19-GhDHN1含有序列表中的序列1所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的GhDHN1蛋白。GhDHN1蛋白的分子量为23.79kD，等电点为5.04。
实施例2、GhDHN1基因的亚细胞定位
一、重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP的构建
1、人工合成引物InGhDHN1-F：5’-CACGGGGGACTCTAGAATGGCCGAGGAGCATACCAGTA-3’(下划线为限制性内切酶XbaⅠ的识别序列)，下游引物为InGhDHN1-R：5’-AGGGACTGACCACCCGGGTCAAGCCTTTTCTTTTTCTTCA-3’(下划线为限制性内切酶SmaⅠ的识别序列)。
2、以实施例1构建的重组质粒pMD19-GhDHN1为模板，以步骤2合成的InGhDHN1-F和InGhDHN1-R为引物进行PCR扩增，得到约666bp的双链DNA分子；然后进行纯化、回收，得到DNA片段。
3、用限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ双酶切质粒pBI121::GFP，回收约13Kb的载体骨架。
4、按照
Figure BDA0000957673270000061
HD Cloning Kit(Clontech公司产品)的操作步骤，将DNA片段与载体骨架连接，得到重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP。
将重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP用限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，酶切结果见图2(泳道1为重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP，泳道2为重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP用限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ双酶切的结果，泳道M为DNA Marker)。根据测序结果，对重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP进行结构描述如下：向质粒pBI121::GFP的限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点之间***核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。
二、GhDHN1基因的亚细胞定位
1、用基因枪GDS-80将重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP转化洋葱的内表皮细胞。
2、取转化后的洋葱，置于MS固体培养基，室温暗培养12h。
3、完成步骤2后，用镊子撕下所述洋葱的内表皮细胞，置于载玻片上，在激光共聚焦显微镜FV1000下观察。
按照上述方法，将重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP替换为质粒pBI121::GFP，其它步骤均不变，在共聚焦显微镜下观察洋葱的内表皮细胞的瞬时表达结果，作为对照。
实验结果见图3(A和D为蓝光，B和E为明场，C和F为蓝光和明场的叠加)。结果表明，GhDHN1蛋白定位在细胞膜上，而质粒pBI121::GFP的绿色荧光分布在整个细胞中。
实施例3、蛋白质GhDHN1的编码基因的表达模式和组织特异性分析
一、蛋白质GhDHN1的编码基因在不同逆境胁迫下的表达模式
1、低温诱导蛋白质GhDHN1的编码基因的表达
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
(1)取28℃培养28天的豫2067幼苗，置于4℃，光暗交替培养24h。
(2)完成步骤(1)后，取所述豫2067幼苗的倒一叶并提取总RNA，命名为4℃处理RNA。
(3)依据A.Mortazavi，B.A.Williams，K.McCue，et al.Mapping and quantifyingmammalian transcriptomes by RNA-Seq.Nat Meth-ods，2008，5(7)：621-628.中记载的方法，评价4℃处理RNA中GhDHN1基因的表达量。
按照上述步骤，将4℃替换为28℃，其它步骤均不变，得到28℃处理RNA中GhDHN1基因的表达量，作为对照。
实验结果见图4中A(CK为对照)，GhDHN1基因在28℃处理RNA中的基因表达量为988.74，在4℃处理RNA中的基因表达量为4327.43。结果表明，GhDHN1基因在低温条件下(如4℃)被诱导表达。
2、干旱诱导蛋白质GhDHN1的编码基因的表达
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
(1)取在沙土含水量为23％(质量百分比)的营养土中正常培养28天的邯177幼苗，然后停止浇水2～3天，使沙土含水量为下降至7％(质量百分比)。
(2)完成步骤(1)后，取所述邯177幼苗的真叶并提取总RNA，命名为干旱处理RNA。
(3)完成步骤(1)后，取所述邯177幼苗，置于沙土含水量为23％(质量百分比)的营养土中复水2天，然后取复水后的邯177幼苗的真叶并提取总RNA，命名为复水处理RNA。
(4)依据A.Mortazavi，B.A.Williams，K.McCue，et al.Mapping and quantifyingmammalian transcriptomes by RNA-Seq.Nat Meth-ods，2008，5(7)：621-628.中记载的方法，评价干旱处理RNA或复水处理RNA中的GhDHN1基因的表达量。
按照上述步骤，将干旱处理RNA替换为对照处理RNA，其它步骤均不变，得到对照处理RNA中的GhDHN1基因的表达量；所述对照处理RNA的制备方法为：取在沙土含水量为23％(质量百分比)的营养土上正常培养30天的邯177幼苗的真叶并提取总RNA，命名为对照处理RNA。
实验结果见图4中B，GhDHN1基因在对照处理RNA中的基因表达量为671.33，在干旱处理RNA中的基因表达量为112.81，在复水处理RNA中的基因表达量为22.74。结果表明，GhDHN1基因受干旱胁迫抑制，在复水后抑制更明显。
二、GhDHN1基因的组织特异性实时荧光定量表达分析
1、低温胁迫条件下GhDHN1基因的组织特异性表达分析
(1)取正常培养28天的TM-1幼苗，置于4℃，光暗交替培养24h，得到低温处理幼苗。
(2)提取所述低温处理幼苗的根组织的RNA、茎组织的RNA和叶片组织的RNA，分别得到低温根组织的RNA、低温茎组织的RNA和低温叶片组织的RNA。
(3)提取正常培养29天的TM-1幼苗(即对照处理幼苗)的根组织的RNA、茎组织的RNA和叶片组织的RNA，分别得到对照根组织的RNA、对照茎组织的RNA和对照叶片组织的RNA。
对上述RNA中的GhDHN1基因的表达量进行实时荧光定量分析，引物为5’-GTTAGCGGTGAAGGAGCAGT-3’和5’-ACTCGGTTACGATCACCTCC-3’。内参为Histone-3(AccessionNO.AF024716)，内参的引物为5′-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3′和5′-GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3′。
以对照处理幼苗的组织中的GhDHN1基因的表达量作为1，低温处理幼苗的相应组织中的GhDHN1基因的相对表达量见图5中A：与对照处理幼苗相比，GhDHN1基因在低温处理幼苗的叶、茎、根中均上调表达，表达倍数分别为15.52、4.30和1.33。结果表明，GhDHN1基因在响应低温胁迫过程中，主要在叶片发挥功能。
2、高盐胁迫条件下GhDHN1基因的组织特异性表达分析
(1)取正常培养28天的TM-1幼苗，置于150mM NaCl水溶液中处理24h，得到高盐处理幼苗。
(2)提取所述高盐处理幼苗的根组织的RNA、茎组织的RNA和叶片组织的RNA，分别得到高盐根组织的RNA、高盐茎组织的RNA和高盐叶片组织的RNA。
(3)提取正常培养29天的TM-1幼苗(即对照处理幼苗)的根组织的RNA、茎组织的RNA和叶片组织的RNA，分别得到对照根组织的RNA、对照茎组织的RNA和对照叶片组织的RNA。
对上述RNA中的GhDHN1基因的表达量进行定量分析，引物为5’-GTTAGCGGTGAAGGAGCAGT-3’和5’-ACTCGGTTACGATCACCTCC-3’。内参为Histone-3(AccessionNO.AF024716)，内参的引物为5′-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3′和5′-GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3′。
以对照处理幼苗的组织中的GhDHN1基因的表达量作为1，高盐处理幼苗的相应组织中的GhDHN1基因的相对表达量见图5中B：与对照处理幼苗相比，GhDHN1基因在高盐处理幼苗的叶上调表达，茎和根中均下调表达，表达倍数分别为4.34、0.83和0.46。结果表明，GhDHN1基因在响应高盐胁迫过程中，在叶片中发挥重要作用，在茎和根中受到抑制，具有表达的空间差异性。
3、干旱胁迫条件下GhDHN1基因的组织特异性表达分析
(1)取在沙土含水量为23％(质量百分比)的营养土中正常培养28天的TM-1幼苗，然后停止浇水4～5天,使沙土含水量为下降至5％(质量百分比)，得到干旱处理幼苗。
(2)提取所述干旱处理幼苗的根组织的RNA、茎组织的RNA和叶片组织的RNA，分别得到干旱根组织的RNA、干旱茎组织的RNA和干旱叶片组织的RNA。
(3)取在沙土含水量为23％(质量百分比)的营养土中正常培养29天的邯177幼苗，得到对照处理幼苗；提取所述对照处理幼苗的根组织的RNA、茎组织的RNA和叶片组织的RNA，分别得到对照根组织的RNA、对照茎组织的RNA和对照叶片组织的RNA。
对上述RNA中的GhDHN1基因的表达量进行定量分析，引物为5’-GTTAGCGGTGAAGGAGCAGT-3’和5’-ACTCGGTTACGATCACCTCC-3’。内参为Histone-3(AccessionNO.AF024716)，内参的引物为5′-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3′和5′-GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3′。
以对照处理幼苗的组织中的GhDHN1基因的表达量作为1，干旱处理幼苗的相应组织中的GhDHN1基因的相对表达量见图5中C：与对照处理幼苗相比，GhDHN1基因在干旱处理幼苗的叶、茎和根中均下调表达，表达倍数分别为0.72、0.34和0.24。结果表明，GhDHN1基因在响应干旱胁迫过程中，在叶、茎和根中均受到抑制。
4、不同材料低温胁迫条件下GhDHN1基因的组织特异性表达分析
(1)取28℃培养28天的豫2067幼苗，置于4℃，光暗交替培养24h。
(2)完成步骤(1)后，取所述豫2067幼苗的真叶并提取总RNA，命名为豫2067-低温叶片组织的RNA。
(3)取28℃培养29天的豫2067幼苗的真叶并提取总RNA，得到豫2067-对照叶片组织的RNA。
按照上述步骤，将豫2067替换为衡棉3号，其它步骤均不变，分别得到衡棉3号-低温叶片组织的RNA和衡棉3号-对照叶片组织的RNA。
对上述RNA中的GhDHN1基因的表达量进行定量分析，引物为5’-GTTAGCGGTGAAGGAGCAGT-3’和5’-ACTCGGTTACGATCACCTCC-3’。内参为Histone-3(AccessionNO.AF024716)，内参的引物为5′-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3′和5′-GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3′。
以对照叶片组织的RNA中的GhDHN1基因的表达量作为1，相应品种的低温叶片组织的RNA中的GhDHN1基因的表达量见图5中D：与对照相比，GhDHN1基因在低温叶片组织中均上调表达，表达倍数分别为14.28和5.77。结果表明，GhDHN1基因在抗冷材料(豫2067)中的相对表达量高于冷敏感材料(衡棉3号)。
实施例4、转GhDHN1基因的植株的获得和抗逆性鉴定
一、转GhDHN1基因的植株的获得
1、将重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pBI121-GhDHN1::GFP。
2、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将步骤1获得的GV3101/pBI121-GhDHN1::GFP转至野生型拟南芥中，获得T1代拟转GhDHN1基因拟南芥种子。
3、将步骤2获得的T1代拟转GhDHN1基因拟南芥种子播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代拟转GhDHN1基因阳性苗，T1代拟转GhDHN1基因阳性苗收到的种子即为T2代拟转GhDHN1基因拟南芥种子。
4、将步骤3筛选得到的不同株系的T2代拟转GhDHN1基因拟南芥种子播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GhDHN1基因***一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代拟转GhDHN1基因拟南芥种子。
5、将步骤4筛选得到的T3代拟转GhDHN1基因拟南芥种子再次播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合拟转GhDHN1基因拟南芥。将其中2个T3代纯合拟转GhDHN1基因拟南芥株系分别命名为L5和L9。
二、转空载体拟南芥的获得
按照上述步骤一的方法，将重组质粒pBI121-GhDHN1::GFP替换为质粒pBI121::GFP，其他步骤均相同，得到T3代纯合拟转空载体拟南芥，简称拟转空载体拟南芥。
三、分子检测
以野生型拟南芥、拟转空载体拟南芥的T3代植株、L5的T3代植株或L9的T3代植株的基因组DNA为模板，以实施例1中人工合成的引物GhDHN1-F和GhDHN1-R为引物，进行PCR扩增。
PCR扩增的实验结果见图6(M为Marker，1为野生型拟南芥，2为拟转空载体拟南芥，3为L5，4为L9)。结果表明，以L5的T3代植株和L9的T3代植株的基因组DNA为模板，均能够扩增得到636bp的条带；而以野生型拟南芥和拟转空载体拟南芥的基因组DNA为模板，则均不能扩增得到636bp的条带。因此，L5的T3代植株和L9的T3代植株均鉴定为T3代纯合转GhDHN1基因拟南芥，拟转空载体拟南芥鉴定为转空载体拟南芥。
四、转GhDHN1基因拟南芥的抗逆性鉴定
1、抗寒性鉴定
实验重复三次取平均值，每个株系每次重复30粒种子。
取野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥的T3代种子、L5的T3代种子或L9的T3代种子，置于4℃处理3天，然后放入-20℃处理8～10h，最后播种于1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养9天，统计萌发率。
实验结果见图7。抗寒性鉴定实验结果如下：L5的萌发率为85.21％，L9的萌发率为79.41％，野生型拟南芥的萌发率为50.12％，转空载体拟南芥和野生型拟南芥的萌发率无显著差异。结果表明，与野生型拟南芥相比，L5和L9的抗寒性显著增加。
2、抗盐性鉴定
实验重复三次取平均值，每个株系每次重复30粒种子。
取野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥的T3代种子、L5的T3代种子或L9的T3代种子，播种于含150mM NaCl的1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养9天，统计萌发率。
实验结果见图7。抗盐性鉴定实验结果如下：L5的萌发率为66.45％，L9的萌发率为62.72％，野生型拟南芥的萌发率为45.33％，转空载体拟南芥和野生型拟南芥的萌发率无显著差异。结果表明，与野生型拟南芥相比，L5和L9的抗盐性显著增加。
3、抗旱性鉴定
实验重复三次取平均值，每个株系每次重复30粒种子。
取野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥的T3代种子、L5的T3代种子或L9的T3代种子，播种于含15％(质量体积比)PEG6000的1/2MS培养基上，20℃光暗交替培养9天，统计萌发率。
实验结果见图7。抗旱性鉴定实验结果如下：L5的萌发率为52.15％，L9的萌发率为51.22％，野生型拟南芥的萌发率为54.13％，转空载体拟南芥和野生型拟南芥的萌发率无显著差异。结果表明，与野生型拟南芥相比、L5和L9的抗旱性无显著差异。
Figure IDA0000957673350000011
Figure IDA0000957673350000021

Claims (6)

1.蛋白质GhDHN1在调控植物抗逆性中的应用；所述蛋白质GhDHN1为序列表中序列2所示的蛋白质；所述抗逆性为抗盐性；所述植物为棉花或拟南芥。
2.编码权利要求1中所述蛋白质GhDHN1的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用；所述抗逆性为抗盐性；所述植物为棉花或拟南芥。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码权利要求1中所述蛋白质GhDHN1的核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。
4.一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入权利要求1中所述蛋白质GhDHN1的编码基因，得到抗逆性高于所述受体植物的转基因植物；所述抗逆性为抗盐性；所述植物为棉花或拟南芥。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述权利要求1中所述蛋白质GhDHN1的编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子。
6.权利要求4或5所述的方法在植物育种中的应用；所述植物为棉花或拟南芥。
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