CN107207595A - T细胞重靶向性异源二聚体免疫球蛋白 - Google Patents

T细胞重靶向性异源二聚体免疫球蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明描述结合CD3和疾病相关抗原的新异源二聚体免疫球蛋白或其片段。这些异源二聚体免疫球蛋白已经被工程化改造，以利于异源二聚体在表达过程中形成并且可以使用蛋白A差异纯化技术纯化至高纯度。

Description

T细胞重靶向性异源二聚体免疫球蛋白
技术领域
本发明涉及靶向人CD3抗原组分和疾病相关抗原的异源二聚体免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术
T细胞重定向杀伤是许多治疗领域中期望的作用模式。在临床前和临床研究中已经证实多种双特异性抗体形式可以介导T细胞重定向(May C等,(2012)BiochemPharmacol,84(9):1105-12；Frankel SR&Baeuerle PA,(2013)Curr Opin Chem Biol,17(3):385-92)。所有的T细胞重靶向性双特异性抗体或其片段经工程化而具有至少两个抗原结合位点，其中一个位点结合靶细胞上表面抗原，而另一位点结合T细胞表面抗原。在T细胞表面抗原中，TCR蛋白复合物中的人CD3ε亚基是最常被靶向以实现T细胞杀伤重定向的抗原。
许多双特异性抗体形式已经用于重定向T细胞杀伤，主要包括串联的scFv片段和基于双抗体(diabody)的形式，仅有少数基于Fc的双特异性抗体形式的例子被报道(MoorePA等,(2011)Blood,117(17):4542-51；May C等,(2012)同上引文；Frankel SR&BaeuerlePA,(2013)同上引文)。包含人Fc区的双特异性形式将具有更长的循环半衰期，这可以导致增强的功效和/或更低频率的给药方案。在可能的基于Fc的双特异性形式中，用于重定向T细胞杀伤的一个优选形式是所谓的重链异源二聚体形式。该形式是尤其有意义的，因为它不允许多个拷贝的人CD3分子聚集在T细胞表面，从而防止了任何的T细胞失活(Klein C etal.,(2012)MAbs,4(6):653-63)。
第一个描述的用于工程化构建重链异源二聚体的方法是称作“杵臼”(knob-into-hole)法的方法(PCT公布号WO199627011；Merchant AM等(1998)Nat Biotechnol,16(7):677-81)。近来报道了一种称作FAB-臂交换法的化学方法，其中两个抗体通过还原和半免疫球蛋白的体外改组而组合成一个双特异性抗体(PCT公布号WO2008119353(Schuurman J等)和WO2013060867(Gramer M等)；Labrijn AF等,(2013)Proc Natl Acad Sci USA,110(13):5145-50)。
目前的方法及其衍生方案不足以在哺乳动物细胞宿主中产生基于Fc的双特异性抗体形式。当在哺乳动物细胞宿主中表达“杵臼”重链异源二聚体时，同源二聚体的存在对双特异性抗体的回收造成不利影响(Jackman J等人，(2010)J Biol Chem，285(27)：20850-9；Klein C等人，同上)。FAB-臂交换法及其衍生方案也存在相同的缺点，此外还存在必须首先分开产生该两种“单特异性”抗体的另一问题。
当开发通过啮合CD3亚基来重定向T细胞杀伤的双特异性抗体时，重要的是在药物终产品中不存在特异于CD3亚基的同源二聚体。在靶向CD3ε亚基的情况下，痕量的抗人CD3ε抗体(针对人CD3ε抗原的单特异性和二价抗体)就可能在导致T细胞凋亡前触发瞬时T细胞活化和细胞因子释放，从而干扰受控的和特异性的T细胞活化的目的。生产有效地重定向T细胞杀伤的稳定且安全的基于Fc的双特异性抗体，对制药工业而言在纯度和产率方面仍然具有挑战性。
因此，仍然需要一种技术来有效地生产不含抗人CD3同源二聚体的基于抗人CD3的重链异源二聚体，其中分泌的双特异性抗体产物可以容易地从重组哺乳动物宿主细胞系的细胞培养物上清液中分离。
已经描述了基于对试剂的不同亲和力而使重链异源二聚体优于同源二聚体获得纯化的技术。已知的差异亲和纯化技术的第一个实例涉及使用来自两种不同动物物种的两个不同重链，其中一个重链不结合亲和试剂蛋白A(Lindhofer H等人，(1995)J Immunol，155(1)：219-225)。该作者还描述了使用源自两种不同人免疫球蛋白同种型(IGHG1和IGHG3)的两个不同重链，其中一个重链不结合亲和试剂蛋白A(IGHG3；见US6,551,592Lindhofer H等人)。最近，Davis S等人报道了该技术的一种变型方式(PCT公开号：WO2010151792)，在异源二聚体重链之一中利用Jendeberg(1997)(Jendeberg等人(1997)JImmunol Methods，201(1)：25-34)描述的两个氨基酸取代H435R和Y436F来消除对试剂蛋白A的亲和力。
本发明中优选的已知差异蛋A白亲和纯化技术对应于这样一种技术，其中所有三个物质，即，两个同源二聚体和一个目的异源二聚体，在蛋白A结合位点总数上相差至少一个位点，并且其中两个同源二聚体之一没有蛋白A结合位点，因此不结合蛋白A(如图1所示)。
药物稳定性是药物开发成功的重要方面，而基于VH3的免疫球蛋白或其片段对生物药物行业至关重要。基于VH3亚类的治疗性抗体，由于框架结合蛋白A并有助于在抗体片段形成免疫球蛋白之前测试抗体片段，因此已经被广泛开发；例如，用于发现抗体的许多合成抗体噬菌体展示文库是基于VH3亚类的。此外，基于VH3的抗体常因其良好的表达和稳定性而优于其他已知的重链可变结构域亚类被选择。
与具有两个亲和力较强的位点的Fc区比较时，VH3结构域仅具有一个亲和力较弱的蛋白A结合位点(Roben PW等人，(1995)J Immunol，154(12)：6437-45)，但是亲和力足以干扰已知的差异蛋白A亲和纯化技术。在处理重链异源二聚体的纯化时，对于在Fc区中经工程化而不具有蛋白A结合的重链，当其包含一个基于VH3的抗原结合位点时，蛋白A结合可以通过VH3结构域而得以恢复，如图1和上述的优选技术不再有用(图2A)。在这种情况下，在基于VH3的抗原结合位点中消除蛋白A结合可以提供直接的解决方案，其允许保持期望异源二聚体的初始构造(图2B)。或者，可以对重链异源二聚体进行重新工程化，以使基于VH3的抗原结合位点位于在其Fc区中结合蛋白A的重链上(图2C；注意，VH3结构域与Fc单体相比对蛋白A具有较弱的亲和力，因此，相对于其他同源二聚体物质，目的异源二聚体仍可以在分开的不同pH值洗脱(通常在pH 4)，而结合蛋白A的同源二聚体物质现包含两个另外的蛋白A结合位点，在pH值≤3时洗脱)。
更重要的是，在纯化重链异源二聚体时，如果两条重链都包含基于VH3的抗原结合位点，则上述的重定位策略可能仅部分有用(图2D和图15B)。只有在至少一个(图2E)或两个(图2F)基于VH3的抗原结合位点中的蛋白A结合被消除时，基于蛋白A的差异纯化才是可行的。
因此，在生产包含VH3可变结构域亚类的重链异源二聚体时，仍然需要消除VH3结构域中的蛋白A结合。
发明概述
本发明提供新的抗人CD3双特异性抗体，其包含能识别和结合疾病相关抗原的第二结合臂。
在本发明的上下文中，疾病相关抗原是指与病理状态相关的任何抗原或表位，例如致癌标志物或一些其他代谢或免疫功能障碍的标志物。另外，疾病标志物也可以涉及感染性疾病如致病性病毒或细菌。
根据本发明，抗人CD3结合臂的靶结合部分包含SP34的单链可变片段(scFv)。特别地，与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv-Fc相比，该scFv具有更好的表达谱，同时保持其CD3结合特性。
特别是当表达为scFv-Fc时，与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv-Fc形式的SP34嵌合体相比，其具有至少两倍的表达改善。优选地，该改良的SP34scFv，与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体相比，具有至少六倍的表达改善，最优选地，与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体相比，具有至少十二倍的表达改善。
根据本发明的另一方面，当在BEAT形式的包含FAB臂的双特异性抗体中表达为scFv时，其与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体相比，具有至少二倍的表达改善。优选地，该改良SP34 scFv作为BEAT双特异性抗体的组分，与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体作为BEAT双特异性抗体的组分相比，具有至少五倍的表达改善。
根据本发明，抗人CD3双特异性抗体的两个结合臂各自包含免疫球蛋白恒定区，并且其中第一臂或多肽结合蛋白A，第二臂或多肽不结合蛋白A。
根据本发明，第一多肽与蛋白A结合而第二多肽与蛋白A不结合，并不意味着第二多肽不可以具有一些残余的蛋白A结合，而是指与第一臂相比，第二多肽与蛋白A的结合较差。
根据本发明，异源二聚体免疫球蛋白或其片段的第一和第二多肽，包含具有修饰的CH3区的工程化免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3区具有有利于异源二聚体形成(相比于同源二聚体形成)的蛋白-蛋白界面。在优选的实施方案中，本发明提供异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包含具有修饰的CH3结构域的工程化免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3结构域具有蛋白-蛋白界面，其中第一多肽的蛋白-蛋白界面包含在选自以下位置的氨基酸取代：3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86、88和90(编号)，并且其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含在选自以下位置的氨基酸取代：3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、84.4、85.1、86、88和90(编号)。
优选地，其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含位置84.4的氨基酸取代和在选自以下位置的至少一个另外的取代：3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86、88和90(编号)。
在另一个实施方案中，本发明提供了异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包含具有修饰的CH3结构域的工程化免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3结构域具有蛋白-蛋白界面，其中第一多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置88和在选自位置3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86和90的位置上的氨基酸取代(编号)，并且其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置85.1和/或86以及在选自位置3、5、7、20、22、26、27、79、81、84、84.2、84.4、88和90的位置上的氨基酸取代(编号)。
根据本发明的另一方面，第一多肽的表位结合区结合CD3蛋白复合物和第二多肽的表位结合区结合疾病相关抗原，或其中第一多肽的表位结合区结合疾病相关抗原和第二多肽的表位结合区结合CD3蛋白复合物；并且其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：200的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：201的的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：202的重链CDR3；和包含氨基酸序列SEQ ID NO：203的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：204的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：205的轻链CDR3；或者
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：352的重链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：353的重链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：354的重链CDR3；和包含氨基酸序列SEQ ID NO：355的轻链CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO：356的轻链CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO：357的轻链CDR3。
这些新的抗人CD3双特异性抗体的用途不限于但包括治疗各种人癌症和自身免疫性和炎性疾病。相对健康细胞和组织，对癌细胞的特异性破坏是肿瘤学的主要目标。可以安全地将T细胞杀伤重定向于肿瘤相关细胞表面抗原的治疗剂，可提供改善的临床疗效。肿瘤学中尚未满足临床需求的已知领域包括但不限于乳癌、转移性乳癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在自身免疫性和炎性疾病如银屑病、多发性硬化和糖尿病的治疗中，消除引起疾病的T细胞可能比抑制T细胞分化更有利。
一组优选的疾病相关抗原来自基因产物CCR3、CCR6、CRTH2、PDL1、BLUT1、PirB、CD33、TROP2、CD105、GD2、GD3、CEA、VEGFR1、VEGFR2、NCAM、CD133、CD123、ADAM17、MCSP、PSCA、FOLR1、CD19、CD20、CD38、EpCAM、HER2、EGFR、PSMA、IgE、整合素a4b1、CCR5、LewisY、FAP、MUC-1、Wue-1、MSP、EGFRvIII、P糖蛋白、AFP、ALK、BAGE蛋白、CD30、CD40、CTLA4、ErbB3、ErbB4、间皮素(Mesothelin)、OX40、CA125、CAIX、CD66e、cMet、EphA2、HGF/SF、MUC1、磷脂酰丝氨酸、TAG-72、TPBG、β-联蛋白(β-catenin)、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、胱天蛋白酶-8、CDK4、细胞周期蛋白-B1、CYP1B1、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、GAGE-1、GAGE-2、GloboH、磷脂酰肌醇聚糖-3、GM3、gp100、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4、MAGE6、MAGE12、MART-1、ML-IAP、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR-85、NY-ESO1、p15、p53、PAP、PAX3PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、生存素(survivin)、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、uroplakin-3。
根据本发明的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中结合疾病相关抗原的表位结合区包含重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列，分别选自：
i)SEQ ID NOs:206–211；
ii)SEQ ID NOs:212–217；
iii)SEQ ID NOs:218–223；
iv)SEQ ID NOs:224–229；
v)SEQ ID NOs:230–235；
vi)SEQ ID NOs:236–241；
vii)SEQ ID NOs:242–247；
viii)SEQ ID NOs:248–253；
ix)SEQ ID NOs:254–259；
x)SEQ ID NOs:260–265；
xi)SEQ ID NOs:266–271；和
xii)SEQ ID NOs:272–277。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段的第二多肽的恒定区，包含IgG3 CH3区。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段的第二多肽的恒定区，包含非来自IgG的CH3区，并且该非IgG3 CH3区包含至少一个取代以降低/消除蛋白A结合。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段的第二多肽的表位结合区包含VH3区，该VH3区包含至少一个降低蛋白A结合的修饰。
本发明人已经证明，基于VH3的抗原结合位点可以容易地在单个蛋白A色谱步骤中以高纯度产生和纯化。除了其易于生产之外，这些抗体可表现出比现有疗法更高的功效。
本发明还提供，从重组哺乳动物宿主细胞系生产抗人CD3双特异性重链异源二聚体的方法，所述抗人CD3双特异性重链异源二聚体具有至少一个基于VH3的抗原结合位点，其中该双特异性抗体产物可以容易地在单个蛋白A色谱步骤之后以高纯度分离。
特别地，该修饰的VH3区包含选自以下的氨基酸取代：57,65,81,82a和组合19/57/59(Kabat编号)；甚至更优选地，该修饰的VH3区包含选自以下的氨基酸取代：57A,57E,65S,81E,82aS和组合19G/57A/59A(Kabat编号)。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段，可以包含其它取代，其中重链可变框架区包含选自以下的氨基酸取代：I34M,V48I,A49G,R58N/Y,I69L,A71T和T73K(Kabat编号)，且轻链可变框架区包含选自以下的氨基酸取代：M4L,V33M,A34N,L46R,L47W,T51A,R66G,F71Y和P96F(Kabat编号)；或者其中重链可变框架区包含氨基酸取代I34M,A49G和A71T(Kabat编号)，且轻链可变框架区包含氨基酸取代M4L,L46R,L47W和F71Y(Kabat编号)。
在另一个实施方案中，结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含重链可变框架区，其是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类。优选地，重链可变框架区是人IGHV3-23的产物或衍生自人IGHV3-23。更优选地，重链可变框架区是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。该重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：60的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
在一个优选的实施方案中，结合CD3蛋白复合物的第一多肽的表位结合区包含轻链可变框架区，其是人VK1亚类或人VK3亚类的产物或衍生自人VK1亚类或人VK3亚类。优选地，轻链可变框架区是人VK1-39或VK3-20的产物或衍生自人VK1-39或VK3-20。更优选，轻链可变框架区是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)或IGKV3-20*01(SEQ ID NO：24)的产物或衍生自人IGKV1-39*01或IGKV3-20*01(SEQ ID NO：24)。该轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：61的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
在一个优选实施方案中，结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含具有选自以下的回复突变的人源化重链可变结构域：I34M,V48I,A49G,R58N/Y,I69L,A71T和T73K(Kabat编号)，和具有选自以下的回复突变的人源化轻链可变结构域：M4L,V33M,A34N,L46R,L47W,R66G,F71Y和P96F(Kabat编号)。更优选地，结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含具有回复突变I34M,A49G和A71T(Kabat编号)的人源化重链可变结构域，和具有回复突变M4L,L46R,L47W和F71Y(Kabat编号)的人源化轻链可变结构域。
根据本发明的另一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段中结合CD3蛋白复合物的表位结合区，
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：101的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：105的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：103的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：106的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：104的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：106的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：104的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：401的轻链可变区；或者
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：104的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO：402的轻链可变区。
CD3蛋白复合物包含多个亚基，例如δ、ε和γ。在一个优选实施方案中，结合CD3蛋白复合物的表位结合区结合CD3的ε亚基。
本文描述的表位结合区包括一个或多个重链可变结构域和一个或多个互补轻链可变结构域的组合，其一起形成允许异源二聚体免疫球蛋白或其片段特异性结合一个或多个表位的结合位点。在本发明的一个实施方案中，第一多肽的表位结合区包含FAB，第二多肽的表位结合区包含scFv。或者，第一多肽的表位结合区包含scFv，第二多肽的表位结合区包含FAB。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合HER2。该表位结合区包含重链可变框架区和轻链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，优选是人VH3-23的产物或衍生自人VH3-23、更优选是人IGHV3-23*04(SEQ IDNO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)，所述轻链可变框架区是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，优选是人VK1-39的产物或衍生自人VK1-39，更优选是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)。
在一个优选的实施方案中，结合疾病相关抗原HER2的表位结合区包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO：20的重链可变结构域和包含氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变结构域。在另一个优选的实施方案中，结合HER2的表位结合区可以包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其通过G4S接头连接形成scFv片段，所述scFv片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：107。优选地，scFv片段的可变结构域包含消除蛋白A结合的修饰，其中该氨基酸取代为65S(Kabat编号)并且其中scFv片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：109，或其中该氨基酸取代是82aS(Kabat编号)并且其中scFv片段包含氨基酸序列SEQ ID NO：111。
特别地，其中所述赫赛汀(Herceptin)结合臂包含由SEQ ID NO：20编码的重链可变区和由SEQ ID NO：21编码的轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合CD38。该表位结合区包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，优选是人VH3-23的产物或衍生自人VH3-23，更优选是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。该重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：112或114或122的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。该表位结合区还可以包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，优选是人VK1-39的产物或衍生自人VK1-39，更优选是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)。该轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：113或115或123的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
特别地，CD38结合多肽包含由SEQ ID NO：116/117、129/130、133/134和135/136编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合OX40。该表位结合区包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，优选是人VH3-23的产物或衍生自人VH3-23，更优选是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。该重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：139的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。该表位结合区还可以包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，优选地是人VK1-39的产物或衍生自人VK1-39，更优选是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)。该轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：140的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
最优选地，人源化重链可变结构域包含消除蛋白A结合的修饰，所述修饰包含取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，OX40结合多肽包含由SEQ ID NO：141/142、278/280和279/281编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合CD19。该表位结合区包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，优选地是人VH3-23的产物或衍生自人VH3-23，更优选地是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)，最优选包含氨基酸序列SEQ ID NO：296。表位结合区还可以包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，优选地是人VK1-39的产物或衍生自人VK1-39，更优选地是人IGKV1-39*01(SEQ IDNO：23)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)，最优选包含氨基酸序列SEQ IDNO：297。在一个优选的实施方案中，重链可变结构域包含消除蛋白A结合的修饰，所述修饰包含取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，CD19结合多肽包含由SEQ ID NO：296/297编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合CD20。该表位结合区包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，优选地是人VH3-23的产物或衍生自人VH3-23，更优选是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。该重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：143的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。表位结合区还可以包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，优选是人VK1-39的产物或衍生自人VK1-39，更优选是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)。轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：144的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
最优选地，人源化重链可变结构域包含消除蛋白A结合的修饰，所述修饰包含取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，CD20结合多肽包含由SEQ ID NO：143/144、282/284、283/285编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合EGFR。该表位结合区包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，优选地是人VH3-23的产物或衍生自人VH3-23，更优选是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：145的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。表位结合区还可以包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，优选地是人VK1-39的产物或衍生自人VK1-39，更优选是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)。轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：146的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
最优选地，人源化重链可变结构域包含消除蛋白A结合的修饰，所述修饰包含取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，EGFR结合多肽包含由SEQ ID NO：145/146、286/288、287/289、290/291、292/294编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
在一个实施方案中，结合疾病相关抗原的表位结合区结合IgE。该表位结合区包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，优选地是人VH3-23产物或衍生自人VH3-23，更优选是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：298的相应人源化抗体或包含氨基酸序列SEQ ID NO：304的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。表位结合区还可以包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，优选地是人VK1-39的产物或衍生自人VK1-39，更优选是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ IDNO：23)。轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：299的相应人源化抗体或包含氨基酸序列SEQ ID NO：305的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
最优选地，重链可变结构域包含消除蛋白A结合的修饰，所述修饰包含取代G65S或取代N82aS(Kabat编号)。
特别地，IgE结合多肽包含由SEQ ID NO：298/299、300/302、301/303、304/305、306/308、307/309编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
已经发现，抗CD3抗体可以通过直接和间接制剂触发毒性。间接机制由CD3抗体的Fc区介导，其与表达Fc受体的免疫细胞作用，导致瞬时T细胞活化和细胞因子释放。因此，为了改善本文所述异源二聚体免疫球蛋白或其片段的安全性，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区对效应免疫细胞和/或补体C1q具有降低的结合或没有结合。优选地，工程化免疫球蛋白恒定区，以消除下铰链区(lower hinge region)中的Fc受体结合。更优选地，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区包含取代L234A和/或L235A(EU编号)。最优选地，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区包含取代L234A和L235A(EU编号)。
在另一方面，本发明的公开还描述了异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中表位结合区结合CD3蛋白复合物的CD3ε亚基并且包含FAB，如通过差示扫描量热法(DSC)所测量(如表1)，该FAB具有的FAB热稳定性优于SP34嵌合体的FAB热稳定性，其中所述SP34嵌合体包含氨基酸序列SEQ ID NO：60的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO：61的轻链可变结构域。这种增加的热稳定性意味着，这些改进的SP34结合臂将具有增加的体内和体外稳定性，意味着作为治疗剂以及在稳定性/储存期限/保存期限方面更好的性能。
根据本发明的另一方面，提供了改善包含SP34的可变重链和轻链结构域序列SEQID NO：60和61的scFv的表达的方法，包括以下步骤：
a)修饰由SEQ ID NO：60和61编码的重链或轻链可变结构域中的至少一个残基；
b)表达来自步骤a)的修饰的构建体；
c)将修饰构建体的表达水平与包含SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69编码的重/轻链可变结构域的scFv进行比较；
d)如果修饰构建体比包含SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62和SEQID NO：63或SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：69编码的重/轻链可变结构域的scFv更多地表达，则选择该修饰的构建体。
根据本发明，至少在位置100e修饰重链可变结构域。
特别地，将残基100e取代为具有疏水侧链的氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸残基。
根据本发明，至少在位置29、30、91、95之一上修饰轻链可变结构域。
根据本发明，残基被随机突变。
根据本发明，通过定点诱变，将残基突变为所有标准氨基酸和/或非标准氨基酸或其子集。
根据本发明的一个优选方面，通过定点诱变，将残基突变为在可变重链和轻链结构域的其他已表征过的版本中位于相同位置上的其他残基。
特别地，将残基29取代为丙氨酸、谷氨酸或丝氨酸残基；将残基30取代为丙氨酸或天冬氨酸残基；将残基91取代为苯丙氨酸残基，将残基95取代为甘氨酸或苏氨酸残基。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中一个表位结合区结合CD3蛋白复合物的CD3ε亚基，结合疾病相关抗原的另一表位结合区结合HER2。这种异源二聚体免疫球蛋白或其片段重定向T细胞杀伤的效力可以在体外测定法中使用流式细胞术(RDL-FACS)或基于比色的方法(RDL-MTS)在表达HER2的细胞系如JIMT-1、BT-474和MDA-MB-231上测量，如实施例中所述。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其结合：
i)CD3蛋白复合物和HER2，其中第一多肽具有选自SEQ ID NO：359的氨基酸序列、并与氨基酸序列SEQ ID NO：399或400的轻链组装并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有SEQID NO：167的氨基酸序列并结合HER2；
ii)CD3蛋白复合物和HER2，其中第一多肽具有选自SEQ ID NO：359的氨基酸序列、并与氨基酸序列SEQ ID NO：399或400的轻链组装并结合CD3ε，并且其中第二多肽具有SEQID NO：167的氨基酸序列并结合HER2；
iii)CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有选自SEQ ID NO：359的氨基酸序列、并与氨基酸序列SEQ ID NO：399或400的关连轻链组装并结合CD38，并且其中第二多肽具有SEQ ID NO：162的氨基酸序列、并结合CD3ε；
iv)CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有选自SEQ ID NO：170的氨基酸序列、并与氨基酸序列SEQ ID NO：138的关连轻链组装并结合CD38，并且其中第二多肽具有SEQID NO:361、SEQ ID NO:311、SEQ ID NO:394和SEQ ID NO:396的氨基酸序列并结合CD3ε；
v)CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO：176的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：119的关连轻链组装并结合CD38，并且其中第二多肽具有SEQ IDNO：SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
vi)CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：128的关连轻链组装并结合CD38，并且其中第二多肽具有SEQ IDNO：SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
vii)CD3蛋白复合物和OX40，其中第一多肽具有选自SEQ ID NO：359的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：399或400的关连轻链组装并结合OX40，并且其中第二多肽具有SEQ ID NO：162的氨基酸序列并结合CD3ε；
viii)CD3蛋白复合物和EGFR，其中第一多肽具有SEQ ID NO：174的氨基酸序列，并且与氨基酸序列SEQ ID NO：175的关连轻链组装并结合EGFR，并且其中第二多肽具有SEQID NO：SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
ix)CD3蛋白复合物和CD20，其中第一多肽具有SEQ ID NO：180的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：181的关连轻链组装并结合CD20，并且其中第二个多肽具有SEQ IDNO：SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε。
在另一个实施方案中，本发明提供了异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其结合：
CD3蛋白复合物和HER2，其中第一多肽具有SEQ ID NO：310的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：3的轻链组装并结合HER2，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO：312或404的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：132的轻链组装并结合CD38，并且其中第二多肽具有选自SEQ IDNO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO：313的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：138的轻链组装并结合CD38，并且其中第二多肽具有其选自SEQ IDNO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和OX40，其中第一多肽具有SEQ ID NO：314的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：315的轻链组装并结合OX40，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和OX40，其中第一多肽具有SEQ ID NO：316的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：317的轻链组装并结合OX40，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和CD20，其中第一多肽具有SEQ ID NO：318的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：319的轻链组装并结合CD20，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和CD20，其中第一多肽具有SEQ ID NO：320的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：321的轻链组装并结合CD20，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和EGFR，其中第一多肽具有SEQ ID NO：322的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：323的轻链组装并结合EGFR，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和EGFR，其中第一多肽具有SEQ ID NO：324的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：325的轻链组装并结合EGFR，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和EGFR，其中第一多肽具有SEQ ID NO：326的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：327的轻链组装并结合EGFR，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和EGFR，其中第一多肽具有SEQ ID NO：328的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：329的轻链组装并结合EGFR，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和CD19，其中第一多肽具有SEQ ID NO：330的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：331的轻链组装并结合CD19，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和IgE，其中第一多肽具有SEQ ID NO：332的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：333的轻链组装并结合IgE，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和IgE，其中第一多肽具有SEQ ID NO：334的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：335的轻链组装并结合IgE，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和IgE，其中第一多肽具有SEQ ID NO：336的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：337的轻链组装并结合IgE，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和IgE，其中第一多肽具有SEQ ID NO：338的氨基酸序列并与氨基酸序列SEQ ID NO：339的轻链组装并结合IgE，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和OX40，其中第一多肽具有SEQ ID NO：340的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：173的轻链组装并结合OX40，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和CD20，其中第一多肽具有SEQ ID NO：341的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：181的轻链组装并结合CD20，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和EGFR，其中第一多肽具有SEQ ID NO：342的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：175的轻链组装并结合EGFR，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和EGFR，其中第一多肽具有SEQ ID NO：343的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：344的轻链组装并结合EGFR，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和IgE，其中第一多肽具有SEQ ID NO：345的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：346的轻链组装并结合IgE，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和IgE，其中第一多肽具有SEQ ID NO：347的氨基酸序列，并与氨基酸序列SEQ ID NO：348的轻链组装并结合IgE，并且其中第二多肽具有选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的氨基酸序列并结合CD3ε。
根据本发明的另一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中所述CD3结合多肽包含选自以下的重链和轻链可变区中的至少一个或其组合：SEQ ID NOs:101/105、103/106、104/106、104/401、104/402。
如上文针对双特异性抗体产生所讨论的，需要有效地产生不含抗人CD3同源二聚体的基于抗人CD3的重链异源二聚体，其中分泌的双特异性抗体产物可以容易从重组哺乳动物宿主细胞系的细胞培养物上清液中分离出来。为此，基于蛋白A的差异纯化技术可用于分离包含VH3可变结构域亚类的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中消除至少一个但优选两个基于VH3的表位结合区中的蛋白A结合位点。因此，在另一方面，本发明提供用于产生如本文所述的异源二聚体免疫球蛋白或其片段的体外方法，包括以下步骤：
ia)制备编码第一多肽的重链的DNA载体和编码第二多肽的重链的DNA载体，其中一个或两个DNA载体或第三DNA载体任选地编码共同的轻链或与第一或第二多肽的重链组装的轻链；或者
ib)制备编码第一和第二多肽的重链的一个DNA载体，其中该DNA载体任选地编码共同的轻链或与第一或第二多肽的重链组装的轻链；和
其中所述DNA载体适于在哺乳动物宿主细胞中瞬时或稳定表达；
ii)在哺乳动物宿主细胞系中转染或共转染来自(i)的DNA载体；
iii)培养转染的细胞系或从其稳定选择的克隆，并收获细胞培养物上清液；
iv)使细胞培养物上清液与蛋白A亲和色谱树脂接触；
v)洗脱和收集目的异源二聚体免疫球蛋白。
优选，在来自步骤(v)的纯化物质中异源二聚体免疫球蛋白或其片段为至少95％纯。更优选地，在步骤(v)的纯化物质中发现的异源二聚体免疫球蛋白或其片段至少为96％纯。甚至更优选地在步骤(v)的纯化物质中发现的异源二聚体免疫球蛋白或其片段至少为97％纯。在纯化物质中异源二聚体免疫球蛋白或其片段的纯度可以通过毛细管电泳测定。
附图简述
图1：使用蛋白A的优选差异亲和纯化技术的示意图。重链都不包含基于VH3的抗原结合位点。图例：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点，[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。示出pH洗脱。
图2A-F：示意图，举例说明使用差异蛋白A色谱法纯化包含一个或多个VH3结构域的重链异源二聚体时所面临的问题。示出了基于突变异源二聚体的至少一个VH3结构域内的蛋白A结合位点的解决方案实例。图2A：当重链异源二聚体在Fc区不结合蛋白A的重链中包含VH3结构域时所面临的问题。图2B：图2A中描述的纯化问题的解决方案，Fc区不结合蛋白A的异源二聚体的重链包含已被突变消除了其蛋白A结合位点的VH3结构域。图2C：图2A中描述的问题的替代解决方案，异源二聚体仅包含一个VH3结构域，并且对异源二聚体进行工程化以使其VH3结构域位于在Fc区中结合蛋白A的重链上(VH3域再定位策略作为解决方案)。图2D：当异源二聚体的两个重链都包含VH3结构域时面临的问题。图2E：图2D中描述的纯化问题的解决方案，Fc区不结合蛋白A的异源二聚体的重链包含已被突变消除了其蛋白A结合位点的VH3结构域。图2F：图2D中描述的纯化问题的替代解决方案，每个VH3结构域的蛋白A结合位点都被消除。加框的物质表明这些物质在差异蛋白A色谱过程中共洗脱。pH值A和B差异约一个pH单位，允许有效分离结合蛋白A的物质。通常，pH A和pH B的pH值分别为4和3。所有图的图例：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点，[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图3：Fc133的蛋白A梯度模式色谱曲线(HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱)。实线表示280nm吸光度vs.流动相总体积的曲线。虚线和点划线分别表示流动相pH的曲线和洗脱缓冲液(B)在流动相中的存在百分比的曲线。
图4A-C：蛋白A梯度模式色谱曲线。实线表示280nm吸光度vs.流动相总体积的曲线。虚线和点划线分别表示流动相pH的曲线和洗脱缓冲液(B)在流动相中的存在百分比的曲线。图4A：抗HER2 FAB-Fc 133(HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱)。图4B：抗HER2scFv-Fc 133(HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱)。图4C：抗HER2 FAB(HiTrapTMMabSelect SuReTM蛋白A柱和HiTrapTM MabSelectTM蛋白A柱)。
图5：七种已知人VH框架亚类的各自代表性氨基酸序列。根据Kabat编号对序列进行比对。与蛋白A结构域D相互作用的人VH3-23框架亚类中的位置以粗体显示。
图6A-I：蛋白A梯度模式色谱曲线(HiTrapTM MabSelectTM蛋白A柱)。实线表示280nm吸光度vs.流动相总体积的曲线。虚线和点划线分别表示流动相pH的曲线和洗脱缓冲液(B)在流动相中的存在百分比的曲线。图6A：抗HER2 FAB。图6B：抗HER2 FAB T57A。图6C：抗HER2 FAB T57E。图6D：抗HER2 FAB G65S。图6E：抗HER2 FAB R66Q。图6F：抗HER2 FABT68V。图6G：抗HER2 FAB Q81E。图6H：抗HER2 FAB N82aS。图6I：抗HER2 FAB R19G/T57A/Y59A。
图7：选择的抗HER2 FAB变体对HER2抗原的平衡解离常数(KD)。
图8A-D：蛋白A梯度模式色谱曲线(HiTrapTMMabSelect SuReTM蛋白A柱)。实线表示280nm吸光度vs.流动相总体积的曲线。虚线和点划线分别表示流动相pH的曲线和洗脱缓冲液(B)在流动相中的存在百分比的曲线。图8A：抗HER2 scFv(G65S)-Fc 133。图8B：抗HER2scFv(N82aS)-Fc 133。图8C：抗HER2 FAB(G65S)-Fc 133。图8D：抗HER2 FAB(N82aS)-Fc133。
图9A-F：这些图都与在稳定的人框架上的OKT3人源化有关。图9A-C：人IgG1抗体形式的人源化候选物的总结。相对于嵌合OKT3抗体的HPB-ALL染色：(-)表示没有结合，(+)表示较弱的结合，(++)表示中度结合，(+++)表示相似的结合。图9D：选择的候选抗体的DSC谱。图9E：scFv-Fc融合形式的人源化候选物的总结。相对于嵌合OKT3抗体的HPB-ALL染色：(-)表示没有结合，(+)表示较弱的结合，(++)表示中度结合，(+++)表示相似的结合。图9F：选择的scFv-Fc候选物的DSC谱。
图10A-B：这些图都与在稳定的人框架上的SP34人源化有关。图10A：人IgG1抗体形式的人源化候选物的总结。图10B：scFv-Fc融合蛋白形式的人源化候选物的总结(人IgG1同种型的Fc)。对于人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白，相对于嵌合SP34抗体的SPR数据：(-)表示没有结合，(+)表示较弱的结合，(++)表示中度结合，(+++)表示强但不相似的结合，(++++)表示相似的结合。
图11A-J：这些图都与抗人CD38抗体有关。
图11A：嵌合HB-7抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的嵌合HB-7抗体。以125、31、7.8、3.9、1.9、1和0.5nM、以30μl/min的流速在HBS-P中注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38细胞外结构域)。图11B：人源化HB-7最适配(best-fit)抗体与人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的人源化HB-7最适配抗体。在HBS-P中以50、25、12.5、6.25和0.39nM、以30μl/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38细胞外结构域)。图11C：人源化9G7最适配抗体与人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的人源化9G7最适配抗体。在HBS-P中以25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19和0.1nM、以30μl/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38细胞外结构域)。图11D：人源化9G7最佳框架抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获了200RU的人源化9G7最佳框架抗体。在HBS-P中以50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19,和0.1nM、以30μL/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图11E：人767抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的人767抗体。在HBS-P中以500、250、125、62.5、31.25和15.6nM、30μl/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38细胞外结构域)。根据以下公式从平衡反应(Req)vs.分析物浓度(C)的图获得亲和力：Req＝KA*C*Rmax/(KA*C*n+1)，KD为50％饱和的浓度。所有SPR数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。图11F：嵌合HB-7和人源化HB-7最适配抗体的DSC谱。图11G：嵌合9G7和人源化9G7最适配抗体的DSC谱。图11H：人源化9G7最佳框架抗体的DSC谱。图11I：人克隆767抗体的DSC谱。图11J：9G7人源化抗体的总结表。
图12A-C：替代形式的BEAT HER2/CD3抗体的示意图。图12A：BEAT HER2/CD3-1(形式A)和BEAT HER2/CD3-2(形式B)抗体。图12B：BEAT HER2/CD3-3(形式C)和BEAT HER2/CD3(SP34)(形式D)抗体。图12C：BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)(形式E)抗体。图例：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图13：BEAT HER2/CD3-1抗体的蛋白A纯化图谱(280nm吸光度曲线)。柱：1mlMabSelect SuRe。流速：1ml/min。运行缓冲液：0.2M NaH2PO4 pH 6。洗脱缓冲液No 1：20mM醋酸钠pH4(20ml)。洗脱缓冲液No 2：0.1M甘氨酸pH 3(20ml)。中和：1/10体积的1M Tris pH8。
图14：BEAT HER2/CD3-1抗体制剂的毛细管电泳图谱。
图15A：N82aS取代的BEAT HER2/CD3-1抗体的SDS-PAGE分析。图15B：N82aS非取代的BEAT HER2/CD3-1抗体变体的SDS-PAGE分析。图例：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点，[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。示出洗脱的pH。
图16A：BEAT HER2/CD3-1抗体与人CD3ε抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与7400Ru的人CD3γ-ε-Fc融合蛋白共价偶联。在HBS-P中以5000、2500、1250、625、312.5和156.25nM、以10μl/min的流速注射BEAT HER2/CD3-1抗体。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。根据以下公式从平衡反应(Req)vs.分析物浓度(C)图获得亲和力：Req＝KA*C*Rmax/(KA*C*n+1)，KD为50％饱和的浓度。图16B：BEAT HER2/CD3-1抗体与人HER2抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价偶联蛋白G，捕获150RU的BEAT HER2/CD3-1抗体。在HBS-P中以1000、333、111、37、12、4.1、1.4、0.5和0.15nM、以30μl/min的流速注射HER2-his。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。图16C：在图A和B中分别显示的BEAT HER2/CD3-1和-2抗体的DSC谱。
图17A-G：通过BEAT HER2/CD3抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-MTS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均值，48小时孵育。抗体浓度以nM表示。图17A：BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体，靶细胞：BT-474。图17B：BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体，靶细胞：JIMT-1。图17C：BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体，靶细胞：MDA-MB-231。图17D：BEAT HER2/CD3(SP34)抗体，靶细胞：NCI-N87。图17E：BEAT HER2/CD3(SP34)抗体，靶细胞：HT-1080。图17F：BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体，靶细胞：NCI-N87。图17G：BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体，靶细胞：HT-1080。
图18A-C：JIMT-1异种移植物以及人PBMC补充。图18A：人PBMC不干扰肿瘤生长。图18B-C：BEAT HER2/CD3-1处理和未处理的小鼠的肿瘤体积(mm3)，四个人PBMC供体，五只小鼠的组。
图19：BEAT CD38-HB7最适配/CD3(形式A)和BEAT CD38-767/CD3(形式B)抗体的示意图。[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图20A：BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价偶联蛋白G，捕获200U的BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体。在HBS-P中以50、25、12.5、6.25和0.39nM、以30μl/min的流速注射人CD38蛋白(多组氨酸标记的蛋白)。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。图20B：BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体DSC谱。
图21：通过BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：纯化的人T细胞。效应细胞与靶细胞的比为10:1。两个供体的平均值，48h孵育。靶细胞：RPMI 8226。抗体浓度以nM表示。
图22：通过BEAT CD38-767/CD3(SP34)抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均值，24小时孵育。靶细胞：Daudi。抗体浓度以nM显示。
图23：BEAT OX40/CD3抗体的示意图。图例：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图24：BEAT OX40/CD3抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-MTS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为20:1。三个供体的平均值，48小时孵育。靶细胞：重组稳定的CHO[OX40]细胞。抗体浓度以nM显示。
图25：BEAT EGFR/CD3抗体的示意图。图例：[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图26：通过BEAT EGFR/CD3抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-MTS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10:1。四个供体的平均值，48小时孵育。靶细胞：HT-29细胞。抗体浓度以nM显示。
图27：BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)(形式A)和BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)(形式B)抗体的示意图。[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。
图28：通过BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均，24小时孵育。靶细胞：Daudi细胞。抗体浓度以nM表示。
图29：BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体与人CD3ε1-26_Fc融合蛋白之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价偶联500RU的人CD3ε1-26_Fc融合蛋白。在HBS-P中以50、25、12.5、6.2、3.1、0.8和0.4nM、以30μl/min的流速注射BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。
图30：通过BEAT CD38/CD3(SP34-κ2)抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均,24小时孵育。靶细胞：Daudi细胞。抗体浓度以nM显示。
图31：BEAT CD20/CD3(SP34)抗体的示意图。[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。
图32：通过BEAT CD20/CD3(SP34)抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均，24小时孵育。靶细胞：Daudi细胞。抗体浓度以nM显示。
图33显示，对于SP34嵌合体以及Sp34H1L21，从IgG1形式重新格式化为scFv-Fc形式后的相对表达水平，其中观察到显著的表达损失。
图34显示在位置：T27、G27a、V27c、T28、T29、S30、N31、Y32、N52、K53、R54、P56、L90、Y92、S93、N94和L95上丙氨酸扫描对SP34H1L21ScFv-Fc表达水平的影响。
图35a显示SP34H3L23ScFv-Fc的位置29上的随机突变对表达水平的影响；b显示SP34H3L23ScFv-Fc的位置30上的随机突变对表达水平的影响；c显示SP34H5L23ScFv-Fc的位置95上的随机突变对表达水平的影响。
图36显示了几种人源化SP34的归一化的表达水平。
图37显示了RDL测定法中几种CD38/CD3双特异性抗体的性能，其中CD3结合臂包含：重新格式化为scFv(SEQ ID NO：403)的原始小鼠SP34、或包含重链/轻链组合H1/L21(SEQ ID NO：361)、H5/L32(SEQ ID NO：311)、H5/L65(SEQ ID NO：394)和H5/L67(SEQ IDNO：396)的修饰的人源化SP34 scFv。
图38显示了CD3-利妥昔单抗(Rutiximab)BEAT双特异性对RAJI细胞群的作用。
图39显示了在RDL测定法中爱必妥(Erbitux)对MCF-7、HCT116和A549细胞群的作用。
图40显示了在RDL测定法中CD3-爱必妥BEAT双特异性抗体对MCF-7、HCT116和A549细胞群的作用。
图41显示使用EGFR PharmDx免疫组织化学试剂盒(Dako，Cambridge，UK)测定的细胞系的EGFR状态。
图42显示了在RDL测定法中维克替比(Vectibix)对MCF-7、HCT116和A549细胞群的作用。
图43显示了在RDL测定法中CD3-维克替比BEAT双特异性抗体对MCF-7、HCT116和A549细胞群的作用。
发明详述
本发明一般涉及结合CD3蛋白复合物和疾病相关抗原的新型异源二聚体免疫球蛋白。而且，这些异源二聚体免疫球蛋白具有降低的或消除的蛋白A结合，并因此可以使用亲和色谱纯化至非常高的纯度。
为解释本说明书的目的，应用以下定义，并且在适用时，以单数使用的术语也涵盖其复数形式且反之亦然。应当理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案，而不旨在构成限制。
术语“多肽”和“蛋白”是指，氨基酸残基聚合物，其中氨基酸通过肽键组合形成氨基酸链，在该链中氨基酸已经通过脱水合成而连接在一起。多肽和蛋白可以通过化学合成或重组表达方式合成，并且没有最小氨基酸长度的限制。
根据本发明，当蛋白质由单个多肽链组成时，多肽涵盖“蛋白质”。多肽还可以形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即，由一个以上多肽分子组成。形成二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。相应地，这些多聚体的对应高级结构被称为同源-或异源-二聚体、同源-或异源-三聚体等等。异源多聚体的一个例子是抗体分子，其天然形式由两个相同的轻链多肽和两个相同的重链多肽组成。术语“多肽”和“蛋白”也指天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰可以通过例如翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等实现。这些修饰是本领域已知的。此外，出于本发明目的，“多肽”可以指相对于天然序列包括修饰的蛋白质，例如缺失、添加和取代(在性质上可以是保守的)。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变引起，或可以是偶然的，例如由于产生蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增错误引起。
本文中，术语“CD3复合物”指称作CD3(分化簇3)T细胞共受体的蛋白质复合物(Wucherpfennig KW等,(2010)Cold Spring Harb Perspect Biol,2(4):a005140)。CD3蛋白复合物由四条分开的链组成。在哺乳动物中，该复合物含有CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。这些链与称作T细胞受体(TCR)的分子及ζ-链缔合，在T淋巴细胞中产生活化信号(vander Merwe PA&Dushek O(2011)Nat Rev Immunol,11(1):47-55)。TCR、ζ-链和CD3分子一起组成TCR复合物。CD3γ,CD3δ,和CD3ε链是免疫球蛋白超家族中高度相关的细胞表面蛋白，含有单个细胞外免疫球蛋白结构域。CD3分子的胞内尾含有一个保守基序，称作免疫受体酪氨酸激活基序或缩写为ITAM，其是TCR的信号传导能力所必需的。由于CD3是T细胞活化所必需的，故靶向CD3的药物(常常是单克隆抗体)一直以来以及目前都被作为免疫抑制剂疗法进行研究。
本文所用的术语“疾病相关抗原”是指参与疾病过程的分子。疾病相关抗原的实例存在于广泛的治疗领域中，如炎症、癌症和自身免疫性疾病。在肿瘤学中，疾病相关抗原是可广泛用于患者群体中筛选和/或监测和/或治疗性靶向癌症的分子，例如***癌中的EpCAM抗原。肿瘤抗原可以由肿瘤直接产生或可以作为对肿瘤存在的应答由非肿瘤细胞产生，优选的肿瘤抗原是细胞表面分子。炎性疾病相关抗原是已知的，其包括但不限于，促炎细胞因子如TNF-α和IL-1。自身免疫性疾病相关抗原也是已知的，其实例包括但不限于***性红斑狼疮中抗双链DNA的抗体和阿尔茨海默病中的淀粉样β肽。
本文中使用的术语“免疫球蛋白”可以与“抗体”互换使用。免疫球蛋白包括全长抗体、及其任何抗原结合片段或单链。免疫球蛋白可以是同源二聚体或异源二聚体。免疫球蛋白，特别是天然存在的抗体，是以一或多拷贝的Y形单元存在的糖蛋白，所述单元由四条多肽链组成。每个“Y”形含有2个相同的重链(H)拷贝和2个相同的轻链(L)拷贝，重链和轻链因其相对分子量而得名。每条轻链与重链配对，而每条重链与另一条重链配对。共价的链间二硫键和非共价相互作用将这些链连接在一起。免疫球蛋白，特别是天然存在的抗体，含有可变区，其是两个拷贝的抗原结合位点。木瓜蛋白酶(一种蛋白水解酶)将“Y”形切割成3个独立的分子，2个被称为“Fab”或“FAB”片段(Fab＝抗原结合片段)，一个被称为“Fc”片段或“Fc区”(Fc＝可结晶的片段)。Fab片段由完整的轻链和部分重链组成。重链含有1个可变区(VH)和3或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4，取决于抗体类型或同种型)。在CH1和CH2区之间的区域被称为铰链区，其使得Y形抗体分子的2个Fab臂之间具有柔性，允许其打开和闭合以适应于结合相隔固定距离的2个抗原决定簇。本文中提及的“铰链区”是长度为6-62个氨基酸的序列区，仅存在于IgA、IgD和IgG中，涵盖了桥接2条重链的半胱氨酸残基。IgA、IgD和IgG的重链都具有4个区，即，1个可变区(VH)和3个恒定区(CH1-3)。IgE和IgM的重链具有1个可变区和4个恒定区(CH1-4)。免疫球蛋白的恒定区可以介导与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和补体***经典通路的第一成分(C1q)。每条轻链通常通过1个共价二硫键与重链连接。每条轻链含有1个可变区(VL)和1个轻链恒定区。轻链恒定区是κ轻链恒定区，在本文中称为IGKC，或者是λ轻链恒定区，在本文中称为IGLC。IGKC在本文中与Cκ或CK等价使用，具有相同的含义。IGLC在本文中与Cλ或CL等价使用，具有相同的含义。本文中使用的术语“IGLC区”指所有的λ轻链恒定区，例如，选自IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7的所有λ轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为命名为互补决定区(CDR)的超变区，其间散布了更保守的、命名为框架区(FR或FW)的区域。每个VH和VL都包括3个CDR和4个FR，按下列顺序从氨基端至羧基端排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的表位结合区。工程化的免疫球蛋白可以包含不同的表位结合区形式，例如scFv、FAB或dAb片段。这些片段通常通过与IgGFc区遗传融合而组装在抗体样结构中。工程化的免疫球蛋白可以通过使用或不使用异源二聚体化增强技术而构建为同源或异源二聚体，并可以具有单或双特异性结合性质。
本文中使用的术语“全长抗体”包含构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大多数哺乳动物(包括人和小鼠)中，IgG类的全长抗体是四聚体，由相同的2对组成，每对两条免疫球蛋白链，每一对具有1条轻链和1条重链，每条轻链包含免疫球蛋白区VL和轻链恒定区，每条重链包含免疫球蛋白区VH、CH1(Cγ1)、CH2(Cγ2)、CH3(Cγ3)和CH4(Cγ4，取决于抗体类型或同种型)。在一些哺乳动物中，例如骆驼和羊驼，IgG抗体可以仅由2条重链组成，每条重链包含与Fc区连接的可变区。
由恒定区的基因决定，抗体被分类，也称为同种型。人恒定轻链分为κ(CK)和λ(Cλ)轻链。重链分为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)或epsilon(ε)，分别定义了抗体的同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。因此，本文中使用的“同种型”意指通过恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白类别和/或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型是IGHG1(IgGl)、IGHG2(IgG2)、IGHG3(IgG3)、IGHG4(IgG4)、IGHA1(IgA1)、IGHA2(IgA2)、IGHM(IgM)、IGHD(IgD)和IGHE(IgE)。所谓的人免疫球蛋白假-γIGHGP基因代表了另外的人免疫球蛋白重链恒定区基因，该基因已被测序，但由于改变的转换区而不编码蛋白质(Bensmana M等人，(1988)Nucleic Acids Res.16(7):3108)。尽管具有改变的转换区，人免疫球蛋白假-γIGHGP基因仍具有所有的重链恒定区(CH1-CH3)和铰链的可读框。其重链恒定区的所有可读框编码与具有预测的结构特征的所有人免疫球蛋白恒定区良好对齐的蛋白质结构域。该另外的假-γ同种型在本文中被称为IgGP或IGHGP。还报道了其他的假免疫球蛋白基因，如人免疫球蛋白重链恒定区P1和P2假基因(IGHEP1和IGHEP2)。IgG类是最常用于治疗目的的。在人中，该类别包括亚类IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括亚类IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。
本文使用的术语“免疫球蛋白片段”包括但不限于(i)区域，包括例如CH1、CH2或CH3区，(ii)由VL、VH、CL或CK、和CH1区组成的Fab片段，包括Fab′和Fab′-SH，(ii)由VH和CH1区组成的Fd片段，(iii)由单可变区组成的dAb片段(Ward ES等人，(1989)Nature,341(6242):544-6)，(iv)F(ab')2片段，一种包含2个相连的Fab片段的二价片段，(v)单链Fv分子(scFv)，其中VH区和VL区通过肽接头相连，所述接头允许2个区缔合形成抗原结合位点(Bird RE等人(1988)，Science、242(4877):423-6；Huston JS等人，(1988)Proc Natl AcadSci U S A,85(16):5879-83)，(vi)“双抗体(diabody)”或“三抗体(triabodies)”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Holliger P等人，(1993)Proc Natl Acad Sci U S A、90(14):6444-8；Tomlinson I和Holliger P,(2000)Methods Enzymol,326:461-79)，(vii)scFv，与Fc区融合的双抗体或区域抗体，和(viii)与相同或不同抗体融合的scFv。
术语“可变区”是指介导抗原结合并定义特定抗体对特定抗原的特异性的区域或结构域。在天然抗体中，抗原结合位点由定义特异性的两个可变区组成：一个位于重链中，在本文中称作重链可变区(VH)，另一个位于轻链中，在本文中称作轻链可变区(VL)。在人类中，重链可变区(VH)可以分为7个亚组或亚类：VH1,VH2,VH3,VH4,VH5,VH6和VH7。一些情况下，特异性可以仅存在于两个区域的仅一个中，例如在来自驼科动物(camelids)的重链抗体的单域抗体中。这些V区通常大约110个氨基酸长度，由称作框架区(FR或“非CDR区”)的15-30个氨基酸的相对不变氨基酸序列链和称作“高变区”的7-17个氨基酸长度的极度可变的较短区域组成，其中框架区被高变区分隔开。天然重链和轻链的可变结构域包含4个FR,这些FR大部分采取β片层构型，通过形成环的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR而紧靠在一起，与来自另一链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat EA等，同上引文)。本文中术语“高变区”是指，负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，后者具有最大的序列变异性和/或参与抗原识别。对于所有可变区，根据Kabat(Kabat EA等，同上引文)进行编号。
有多种CDR定义在使用，并包括在本文中。Kabat定义基于序列的变异性，是最常使用的CDR定义(Kabat EA等，同上引文)。Chothia则是指结构环的位置(Chothia&Lesk J.(1987)Mol Biol,196:901-917)。AbM定义是Kabat和Chothia定义的折中，用于OxfordMolecular的AbM抗体模建软件(Martin ACR等,(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:9268–9272；Martin ACR等,(1991)Methods Enzymol,203:121–153；Pedersen JT等,(1992)Immunomethods,1:126–136；Rees AR等,(1996)In Sternberg M.J.E.(ed.),ProteinStructure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141–172)。近来引入了接触定义(MacCallum RM等,(1996)J Mol Biol,262:732-745)，其基于对蛋白数据库中可得的复合物结构的分析。(国际ImMunoGeneTics)的CDR定义(http://www.imgt.org)基于对所有物种的所有免疫球蛋白和T细胞受体V-REGIONs的IMGT编号(国际ImMunoGeneTicsLefranc MP等,(1999)Nucleic Acids Res,27(1):209-12；Ruiz M等,(2000)Nucleic Acids Res,28(1):219-21；Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res,29(1):207-9；Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res,31(1):307-10；Lefranc MP等,(2005)Dev Comp Immunol,29(3):185-203；Kaas Q等,(2007)Briefings inFunctional Genomics&Proteomics,6(4):253-64)。在本发明中提及的所有互补决定区(CDR)优选按如下进行定义(根据Kabat EA等人的编号，同上引文)：
LCDR1:24-34,LCDR2:50-56,LCDR3:89-98,HCDR1:26-35,HCDR2:50-65,HCDR3:95-102。
可变结构域的“非CDR区”称作框架区(FR)。在本文中VL区的“非CDR区”包含氨基酸序列：1-23(FRl),35-49(FR2),57-88(FR3)和99-107(FR4)。在本文中VH区的“非CDR区”包含氨基酸序列：1-25(FRl),36-49(FR2),66-94(FR3)和103-113(FR4)。
本发明CDR可以包含基于上述定义的“延长的CDR”，具有如下可变结构域残基：LCDR1:24-36,LCDR2:46-56,LCDR3:89-97,HCDR1:26-35,HCDR2:47-65,HCDR3:93-102。这些延长的CDR也根据Kabat等人(同上引文)编号。本文中VL区的“非延长CDR区”包含氨基酸序列：1-23(FR1),37-45(FR2),57-88(FR3)和98-大约107(FR4)。本文中VH区的“非延长CDR区”包含氨基酸序列：1-25(FR1),37-46(FR2),66-92(FR3)和103-大约113(FR4)。
本文使用的术语“Fab”或“FAB”或“Fab区”或“FAB区”包括包含VH、CH1、VL和轻链恒定免疫球蛋白区的多肽。Fab可以指分离的这一区域，或位于全长抗体或抗体片段中的这一区域。
本文使用的术语“Fc”或“Fc区”包括这样的多肽，所述多肽包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体重链恒定区。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后2个恒定区免疫球蛋白区域，或IgE和IgM的最后3个恒定区免疫球蛋白区域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白区域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)，和Cgammal(Cγl)和Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为包括残基C226或P230至其羧基端，其中根据EU索引编号。Fc可以指分离的这一区域，或位于Fc多肽(例如抗体)环境中的这一区域。
术语“免疫球蛋白恒定区”在本文中指，来自人或动物物种的免疫球蛋白或抗体重链恒定区，涵盖所有同种型。优选地，免疫球蛋白恒定区是人源的，选自但不限于：IGHG1CH1,IGHG2 CH1,IGHG3 CH1,IGHG4 CH1,IGHA1 CH1,IGHA2 CH1,IGHE CH1,IGHEP1 CH1,IGHM CH1,IGHD CH1,IGHGP CH1,IGHG1 CH2,IGHG2 CH2,IGHG3 CH2,IGHG4 CH2,IGHA1CH2,IGHA2 CH2,IGHE CH2,IGHEP1 CH2,IGHM CH2,IGHD CH2,IGHGP CH2,IGHG1 CH3,IGHG2CH3,IGHG3 CH3,IGHG4 CH3,IGHA1 CH3,IGHA2 CH3,IGHE CH3,IGHEP1 CH3,IGHM CH3,IGHDCH3,IGHGP CH3,IGHE CH4和IGHM CH4。优选的“免疫球蛋白恒定区”选自：人IGHE CH2,IGHMCH2,IGHG1 CH3,IGHG2 CH3,IGHG3 CH3,IGHG4 CH3,IGHA1 CH3,IGHA2 CH3,IGHE CH3,IGHMCH3,IGHD CH3和IGHGP CH3。最优选的“免疫球蛋白恒定区”选自：人IGHG1 CH3,IGHG2 CH3,IGHG3 CH3,IGHG4 CH3,IGHA1 CH3,IGHA2 CH3,IGHE CH3,IGHM CH3,IGHD CH3和IGHGPCH3。
术语“表位结合区”包括具有允许免疫球蛋白分子与一个或多个表位特异性结合的最小氨基酸序列的多肽或其片段。天然抗体具有两个表位结合区，也称作抗原结合位点或抗原结合部位或抗原互补位。天然抗体中的表位结合区局限于VH和/或VL结构域的CDR区内，其中存在介导表位结合的氨基酸。除了天然抗体外，可以工程化构建人工VH结构域或VL结构域或其片段及其组合，提供表位结合区(Holt LJ et al.,(2003)Trends Biotechnol,21(11):484-490；Polonelli L et al.,(2008)PLoS ONE,3(6):e2371)。基于非免疫球蛋白的表位结合区的实例可以见于作为“支架”用于工程化表位结合区的人工蛋白结构域(BinzHK et al.,(2005)Nat Biotechnol,23(10):1257-1268)或肽模拟物(Murali R&Greene MI(2012)Pharmaceuticals,5(2):209-235)。优选地，术语“表位结合区”包括一个或多个重链可变结构域和一个或多个互补轻链可变结构域的组合，其一起形成允许免疫球蛋白分子与一个或多个表位特异性结合的结合位点。在本发明中示例的表位结合区实例包括scFv和FAB。
本文中，术语“表位”包括多肽或蛋白或非蛋白分子的片段，其在动物中，优选在哺乳动物中且最优选地在人类中，具有抗原性或免疫原性活性。具有免疫原性活性的表位是可以在动物中引起抗体应答的多肽或蛋白的片段。具有抗原性活性的表位是，通过本领域技术人员熟知的任何方法测定，例如通过免疫测定法测定，可以与抗体或多肽特异性结合的多肽或蛋白的片段。抗原性表位无需一定是免疫原性的。优选地，术语“表位”在本文中指至少约3-5，优选约5-10或15至不超过约1,000(或之间的任何整数)个氨基酸的多肽序列，这些氨基酸定义的序列，自身或作为更大序列的一部分，可以与响应于该序列而产生的抗体结合。对于该片段的长度，没有关键性的上限，其可以包含近乎全长的蛋白序列，或甚至包含一个或多个表位的融合蛋白。用于本发明的表位不限于这样的多肽，所述多肽具有其所源自的亲本蛋白的该部分的确切序列。因此，术语“表位”涵盖与天然序列相同的序列、以及对天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(通常在性质上保守)。蛋白抗原的表位，基于其结构和与表位结合位点的相互作用，可以分为两类，构象表位和线性表位(Goldsby R etal.,(2003)“抗原(第3章)”Immunology(第5版),New York:W.H.Freeman andCompany.pp.57-75,ISBN 0-7167-4947-5)。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分组成。这些表位基于抗原的3-D表面特征和形状或三级结构，与互补位相互作用。大多数表位是构象表位。相对地，线性表位基于其一级结构与互补位相互作用。线性表位由来自抗原的一段连续氨基酸序列形成。
本文使用的术语“异源二聚体免疫球蛋白”或“异源二聚体片段”或“异源二聚体”或“重链异源二聚体”包括，至少包含第一和第二多肽(如第一和第二区)的免疫球蛋白分子或其部分，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽不同。优选的，异源二聚体免疫球蛋白包含2条多肽链，其中第一链与第二链具有至少一个不同的区域，且其中两条链通过其不同区域组装，即，相互作用。更优选地，异源二聚体免疫球蛋白对至少2个不同配体、抗原或结合位点具有结合特异性，即，是双特异性的。本文使用的异源二聚体免疫球蛋白包括但不限于全长双特异性抗体、双特异性Fab、双特异性F(ab’)2、与Fc区融合的双特异性scFv、与Fc区融合的双抗体和与Fc区融合的结构域抗体。
本文使用的术语“同源二聚体免疫球蛋白”或“同源二聚体片段”或“同源二聚体”或“重链同源二聚体”包括，至少包含第一和第二多肽(如第一和第二区)的免疫球蛋白分子或其部分，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽相同。优选的，同源二聚体免疫球蛋白包括2条多肽链，其中第一链与第二链具有至少一个相同的区域，且其中两条链通过其相同区域组装，即，相互作用。优选的，同源二聚体免疫球蛋白片段包含至少2个区域，其中第一区与第二区相同，且其中两个区通过其蛋白质-蛋白质界面组装，即相互作用。
对于本发明中包括的所有免疫球蛋白恒定区，可以根据(同上引文)编号。
对于选自IGHG1、IGHG2、IGHG3和IGHG4的所有的人CH1、CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，可以根据“EU编号体系”编号(Edelman GM等人，(1969)Proc Natl Acad Sci U SA,63(1):78-85)。对于IGHG1的人CH1、铰链、CH2和CH3恒定区，完整的对应性可见于IMGT数据库(同上引文)。
对于人κ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGKC)，可以根据“EU编号体系”编号(Edelman GM等人，同上引文)。人CK结构域的完整对应性可见于IMGT数据库(同上引文)。
对于人λ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7)，可以根据“Kabat编号体系”编号(Kabat EA等人，同上引文)。人IGLC区的完整对应性可见于IMGT数据库(同上引文)。
本文所述的人IGHG1免疫球蛋白重链恒定区的区边界如下：CH1区[EU编号：118-215]、铰链γ1[EU编号：216-230]、CH2区[EU编号：231-340]和CH3区[EU编号：341-447]。本文所述的人CK区跨残基108至214(EU编号)。本文所述的人IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7区跨残基108-215(Kabat编号)。
本文使用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然氨基酸和非天然氨基酸。优选包括天然氨基酸。
本文中的术语“修饰”或“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸取代、***和/或缺失。本文中术语“氨基酸取代”或“取代”或“氨基酸残基取代”意指，一个氨基酸序列中第一氨基酸残基被第二氨基酸残基替代，其中第一氨基酸残基与第二氨基酸残基不同，即，替代氨基酸残基与被替代的氨基酸不同。例如，取代R94K指这样的变体多肽，其中第94位的精氨酸被赖氨酸替代。例如，94K表示第94位被赖氨酸取代。出于本文的目的，通常用斜线或逗号分开多个取代。例如，“R94K/L78V”或“R94K，L78V”指包含取代R94K和L78V的双重变体。本文使用的术语“氨基酸***”或“***”意指在亲代多肽序列的特定位置添加氨基酸。例如，***-94表示在第94位的***。本文使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲代多肽序列的特定位置上的氨基酸。例如，R94-表示缺失第94位的精氨酸。
在一些实施方案中，在蛋白A结合中术语“减少”、“降低”或“下降”是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合，总体减少了至少25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,85％,90％,95％,97％,或99％至多达100％(消除)。在一些实施方案中，这些术语备选地可以指总体减少10倍(即，1log),100倍(2logs),1,000倍(或3logs),10,000倍(或4logs),或100,000倍(或5logs)。
术语“消除”或“废除”蛋白A结合是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合，总体下降100％，即修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合完全丧失。
类似地，在与亲和试剂的结合中术语“减少”、“降低”或“下降”是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合，总体减少了至少25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,85％,90％,95％,97％,或99％至多达100％(消除)。在一些实施方案中，这些术语备选地可以指总体减少10倍(即，1log),100倍(2logs),1,000倍(或3logs),10,000倍(或4logs),或100,000倍(或5logs)。
术语“消除”或“废除”与亲和试剂的结合是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合，总体下降100％，即修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合完全丧失。
“双特异性抗体”是对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是，相对于亲本抗体，在VH区中具有一个或多个氨基酸修饰的双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体可以是人或人源化抗体。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达靶抗原的细胞。这些抗体具有靶-抗原结合臂和结合细胞毒性剂的臂，细胞毒性剂是例如皂草素(saporin)、抗干扰素α、长春花生物碱(vincaalkaloid)、蓖麻毒蛋白A链、氯甲蝶呤或放射性同位素半抗原。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于的是共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello,(1983)Nature,305:537-40)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组配，这些杂交瘤(四重瘤)产生不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，通常通过亲和色谱步骤进行，十分繁琐且低产率。相似的程序公开在WO1993/08829和Traunecker et al.,(1991)EMBO J,10:3655-9中。根据不同方法，具有期望结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合部位)与免疫球蛋白恒定区序列融合。例如融合包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)，存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物、以及如果期望的话，免疫球蛋白轻链的DNA，***分开的表达载体，共转染合适的宿主生物。在不等比率的三个片段用于构建可以提供最佳产率的实施方案中，这使得可以灵活地调整三个多肽片段的相互比例。然而，当至少两个多肽链的等比率表达可以导致高产率或当比率不是特别重要时，可以将两个或全部三个多肽链的编码序列***一个表达载体中。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中抗体之一可以与亲和素偶联，而另一可以与生物素偶联。这样的抗体已经例如被提出用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(US4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO1991/00360,WO1992/00373和EP03089)。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域熟知的(参见US4,676,980)，多种交联技术也是已知的。也考虑具有二价以上效价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(参见Tutt A et al.(1991)J.Immunol.147:60-9)。
在一些实施方案中，本公开提供了双特异性异源二聚体免疫球蛋白或其片段或双特异性全长抗体，其结合CD3和选自以下的疾病相关抗原：肿瘤抗原、细胞因子、血管生长因子和淋巴-血管生成性生长因子。优选地，双特异性异源二聚体免疫球蛋白或其片段或双特异性抗体结合CD3和选自以下的疾病相关抗原：CCR3、CCR6、CRTH2、PDL1、BLUT1、PirB、CD33、TROP2、CD105、GD2、GD3、CEA、VEGFR1、VEGFR2、NCAM、CD133、CD123、ADAM17、MCSP、PSCA、FOLR1、CD19、CD20、CD38、EpCAM、HER2、HER3、EGFR、PSMA、IgE、整合素a4b1、CCR5、LewisY、FAP、MUC-1、Wue-1、MSP、EGFRvIII、P糖蛋白、AFP、ALK、BAGE蛋白、CD30、CD40、CTLA4、ErbB3、ErbB4、间皮素、OX40、CA125、CAIX、CD66e、cMet、EphA2、HGF/SF、MUC1、磷脂酰丝氨酸、TAG-72、TPBG、β-联蛋白、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、胱天蛋白酶-8、CDK4、细胞周期蛋白-B1、CYP1B1、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、GAGE-1、GAGE-2、GloboH、磷脂酰肌醇聚糖-3、GM3、gp100、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE4、MAGE6、MAGE12、MART-1、ML-IAP、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR-85、NY-ESO1、p15、p53、PAP、PAX3PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、生存素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、uroplakin-3、PSMA。优选地，双特异性异源二聚体免疫球蛋白或其片段或双特异性抗体结合CD3和HER2或CD3和CD38或CD3和OX40或CD3和CD19或CD3和CD20或CD3和爱必妥或CD3和维克替比。
蛋白A：蛋白A是细胞壁成分，由几个金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株产生，为单个多肽链。蛋白A基因产物由5个同源重复组成，其以串联方式附着到该病原体的细胞壁上。这5个结构域大约58个氨基酸长，命名为EDABC，每一个都显示出免疫球蛋白结合活性(Tashiro M&Montelione GT(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.,5(4):471-481)。这5个同源免疫球蛋白结合结构域折叠成三螺旋捆。每个结构域都能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白质，最显著的是IgG(Hober S et al.,(2007)J.Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.Life Sci.,848(1):40-47)。蛋白A与大多数免疫球蛋白的重链在Fc区中结合，但在人VH3家族的情况中也可以在Fab区中结合(Jansson B et al,(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol.,20(1):69-78)。蛋白A结合来自各种物种，包括人、小鼠、兔和豚鼠的IgG，但不结合人IgG3(Hober S et al.,(2007)同上引文)。人IgG3不能结合蛋白A，可以由人IgG3 Fc区中H435R和Y436F替代来解释(EU编号,Jendeberg等,(1997)J.Immunol.Methods,201(1):25-34)。除了IgG外，蛋白A还与IgM和IgA相互作用。
在人VH亚类中，VH3是唯一结合蛋白A的亚类(Graille M et al.,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(10):5399-5404)，蛋白A的所有5个结构域已知都结合该可变结构域亚类(Jansson B et al,(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol.,20(1):69-78)。基于VH3的免疫球蛋白或其片段对生物技术行业至关重要。由于其结合蛋白A的能力有利于其功能性预筛选，故基于VH3的分子已经被广泛地开发，并且由此用于抗体开发的许多基于合成的或供体的噬菌体展示文库或转基因动物技术都基于VH3亚类。此外，由于其良好的表达和稳定性，基于VH3的抗体常优于其他已知的重链可变结构域亚类而被选择。
蛋白A以高亲合力结合抗体的能力是其在生物制药中工业规模应用的驱动力。用于在生物制药中生产抗体的蛋白A通常在大肠杆菌中重组生产，并具有与天然蛋白A基于上相同的功能(Liu HF et al.,(2010)MAbs,2(5):480-499)。最通常的，重组蛋白A与固定相色谱树脂结合用于纯化抗体。最佳结合发生在pH8.2，但在中性或生理条件(pH 7.0-7.6)也发生良好的结合。洗脱通常通过将pH迁移至酸性pH(甘氨酸-HCl,pH2.5-3.0)实现。这可以有效地解离大多数蛋白-蛋白和抗体-抗原结合相互作用，而不会永久地影响蛋白质的结构。然而，一些抗体和蛋白会因低pH而被破坏，最好在回收后通过加入十分之一体积的碱性缓冲液例如1M Tris-HCl,pH 8.0进行立即中和，以最小化在低pH条件中的持续时间。
有多种商业可得的蛋白A色谱树脂。这些介质之间的主要差别在于支持基质的类型、蛋白A配体修饰、孔径和粒径。这些因素的差异造成在可压缩性、化学和物理稳健性、扩散阻力和吸附剂结合能力方面的差别(Hober S et al.,(2007),同上引文)。蛋白A色谱树脂的实例包括但不限于用于实施例中的MabSelect SuReTM蛋白A树脂和MabSelectTM蛋白A树脂(来自GE Healthcare)。
术语“色谱”是指蛋白液相色谱，包括快速蛋白液相色谱(FPLC)——常用于分析或纯化蛋白混合物的一种液相色谱形式。如在其它形式的色谱中一样，由于混合物的不同成分对两个物质——流动液体(流动相)及其通过的多孔相(固定相)——具有不同亲合力，分离是可能的。在FPLC中，流动相是水性溶液或“缓冲液”。缓冲液流速可以在重力流下运行，或通过正排量泵(通常保持在恒定速度)控制，而缓冲液的组成可以通过从两个或两个以上外在贮库抽取不同比率的液体来改变。固定相可以是由珠子组成的树脂，通常为交联琼脂糖，装填在圆柱形玻璃或塑料柱中。取决于应用，可以获得宽范围的珠子大小和表面配体的FPLC树脂。
“亲和色谱”方法涉及使用亲和试剂作为配体，其与固定相交联，对特定的分子或一类分子具有结合亲合力。配体可以是生物分子，如蛋白配体，或可以是合成的分子。两类配体都倾向于具有良好的特异性。生产中最常用的蛋白配体是亲和试剂蛋白A。在亲和色谱中，当溶液(例如含有目的蛋白的粗制细胞上清液)上样到柱上后，通常靶蛋白被吸附，而允许杂质(其它蛋白、脂质、碳水化合物、DNA、色素等)通过柱子。吸附剂本身通常被装填在色谱柱中；但吸附阶段也可以通过以搅拌浆的形式使用吸附剂以分批结合模式进行。吸附后的下一阶段是洗涤阶段，其中洗涤吸附剂以去除残余杂质。然后以半纯或纯形式洗脱结合的蛋白质。洗脱通常通过如下方式进行：改变缓冲液或盐组成，以便蛋白质不再与固定化的配体相互作用并被释放。在一些情况中，目的蛋白可以不结合亲和树脂，亲和色谱定向于结合不需要的杂质，由此可以收集未结合的级分以分离目的蛋白。亲和色谱可以在固定床或流化床中进行。
术语“梯度模式色谱”是指这样的色谱方法，其中“洗脱”缓冲液(缓冲液B)的比例以逐步或逐渐升高的方式从0％增加到100％。
术语“捕获-洗脱模式色谱”或“捕获-洗脱纯化模式”或“捕获-洗脱纯化”是指这样的色谱方法，其中“洗脱”缓冲液(缓冲液B)的比例不是以逐步或逐渐升高的方式从0％增加到100％，而是在捕获和任选地以运行缓冲液(缓冲液A)洗涤步骤后直接地以100％施加。
靶向CD3的异源二聚体免疫球蛋白的开发
本发明提供结合CD3蛋白复合物的表位结合区，其包含如上所述的重链和轻链CDR，并且还包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人基因IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)的产物或衍生自人基因IGHV3-23*04(SEQ ID NO：22)。重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：18的相应鼠抗体OKT3的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。优选地，氨基酸修饰是氨基酸取代。通常，在框架区内进行不超过7个、优选不超过6个、优选不超过5个、优选不超过4个、更优选不超过3个、甚至更优选不超过2个、最优选不超过1个氨基酸修饰。在一些实施方案中，本公开提供结合CD3蛋白复合物的表位结合区，其中重链可变区的框架区的氨基酸修饰包括在选自以下组的氨基酸位置的氨基酸取代：34、48、49、58、69、71和73，并且其中每个组成员的氨基酸位置根据Kabat编号来指示。优选地，重链可变区的框架区的氨基酸取代选自：I34M、V48I、A49G、R58N、R58Y、I69L、A71T和T73K。重链可变区的框架区的优选氨基酸取代位于选自34、49和71的氨基酸位置。重链可变区的框架区的更优选氨基酸取代选自I34M、A49G和A71T。
在另一方面，结合CD3蛋白复合物的第一多肽的表位结合区包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自以下的人基因的产物或衍生自选自以下的人基因：IGKV1-39*01(SEQ ID NO：23)和IGKV3-20*01(SEQ ID NO：24)。轻链可变框架区包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：19的相应鼠抗体OKT3的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。优选地，氨基酸修饰是氨基酸酸取代。通常，在框架区内进行不超过8个、优选不超过7个、优选不超过6个、优选不超过5个、优选不超过4个、更优选不超过3个、甚至更优选不超过2个、最优选不超过1个的氨基酸修饰。在一些实施方案中，本公开提供结合CD3蛋白复合物的表位结合区，其中轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰包括在选自以下氨基酸位置的氨基酸取代：4、33、34、46、47、66、71和96。优选地，轻链可变区的框架区的氨基酸取代选自：M4L、V33M、A34N、L46R、L47W、R66G、F71Y和P96F。轻链可变区的框架区的优选氨基酸取代位于选自4、46和47的氨基酸位置。轻链可变区的框架区的更优选氨基酸取代选自M4L、L46R、L47W和F71Y。在一些实施方案中，结合CD3蛋白复合物的第一多肽的表位结合区可以包含如上所述的重链可变区序列的框架区的氨基酸修饰和如上所述的轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰。
本公开还提供了结合CD3蛋白复合物的抗体或其片段，其包含选自SEQ ID NO：27至38、64-68和359的重链序列，优选选自SEQ ID NO：359的重链序列。本公开还提供了结合CD3蛋白复合物的抗体或其片段，其包含选自SEQ ID NO：39至47、69至90、360、339和400的轻链序列，优选SEQ ID NO：360的轻链序列。
鉴于这些重链和轻链可变区序列每一个都结合CD3蛋白复合物，故可以将这些重链和轻链可变区序列进行“混配”以产生本发明的抗CD3结合分子。可以使用例如实施例中描述的结合测定法，测试该“混配”的抗体的CD3结合。
工程化改造免疫球蛋白恒定区以促进异源二聚体形成超过同源二聚体形成
本领域已知产生异源二聚体免疫球蛋白的方法，最简单的一个方法依赖于在一个细胞中表达两个不同的免疫球蛋白链(WO95/33844,Lindhofer H&Thierfelder S)。不经工程化改造，该直接方法存在同源二聚体的形成超过目的异源二聚体形成的局限性(Kufer Pet al.,(2004)Trends Biotechnol.,22(5):238-244)。当使用增强重链异源二聚体化的互补技术(Merchant AM et al.,(1998)Nat.Biotechnol.,16(7):677-681)时，可以实现较多的异源二聚体产生，但仍有显著量的不期望的同源二聚体生成(Jackman J et al.,(2010)J Biol Chem.,285(27):20850-9,Klein C et al.,(2012)MAbs,4(6):653-63)。因此，本发明利用技术方法(PCT公布号WO2012/131555)，该方法基于生物模拟的独特概念，其在异源二聚体化方面显示出优于现有技术方法。BEAT技术基于在天然的同源或异源二聚体免疫球蛋白结构域对之间的界面交换来产生新的异源二聚体，该新的异源二聚体可以用作基于Fc的双特异性抗体的构件。
一方面，本发明提供包含第一和第二多肽的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包含具有修饰的CH3结构域的工程化免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3结构域具有蛋白-蛋白界面，其中第一多肽的蛋白-蛋白界面包含在选自以下位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,85.1,86,88和90(编号)，并且其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置84.4和在选自以下位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,85.1,86,88和90(编号)。
在再一实施方案中，本发明提供异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包含具有修饰的CH3结构域的工程化免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3结构域具有蛋白-蛋白界面，其中第一多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置88和在选自下组的位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,85.1,86和90(编号)，并且其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置85.1和/或86以及在选自下组的位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,84.4,88和90(编号)，其中第一工程化免疫球蛋白恒定区中位置88的取代氨基酸残基与第二工程化免疫球蛋白恒定区中位置85.1和/或86的取代氨基酸残基相互作用，其中每个组成员的氨基酸位置根据编号表示。
优选地，第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置88的取代氨基酸残基是88W及其保守氨基酸取代，其中氨基酸位置根据编号给出。更优选地，第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置88的取代氨基酸残基是88W，且其中第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中另外的取代氨基酸残基选自：3A,20V,20T,20A,20N,20Q,20E,20S,20K,20W,22A,22G,22T,22L,22I,22V,26R,26Q,26T,26K,26V,26S,26N,26E,79Y,85.1T,85.1M,85.1A,85.1S,85.1R,85.1H,85.1K,85.1F,85.1C,85.1N,85.1W,86S,86I,86T,86H,86Q,86V,86W,86Y,86F和90N,其中氨基酸位置根据编号表示。
优选地，在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中在位置85和86进行取代的氨基酸残基选自：85.1A,85.1S,85.1C和86S及其保守氨基酸取代(编号)。更优选地，在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中进行取代的氨基酸残基选自：85.1A,85.1S,85.1C和86S，且其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中进行取代的其他氨基酸残基选自：3E,5A,7F,20T,22V,26T,81D,84L,84.2E,88R和90R及其保守氨基酸取代(编号)。
在优选的实施方案中，在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中在位置88进行取代的氨基酸残基为88W，并且其中在第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中进行取代的其他氨基酸残基是：3A、20K、22V、26T、79Y、85.1S、86V和90N，且其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中在位置85.1和86进行取代的氨基酸残基为85.1A、85.1S或85.1A和86S，并且其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中进行取代的其他氨基酸残基是：3E、5A、7F、20T、22V、26T、81D、84L、84.2E、84.4Q、88R和90R(编号)。
在替代的实施方案中，本发明提供了异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包含具有修饰的CH3结构域的工程化的免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3结构域具有蛋白-蛋白界面，其中第一多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置20和在选自下组的位置的氨基酸取代：3、5、7、22、26、27、79、81、84、84.2、85.1、86、88和90，以及其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置26和在选自下组的位置的氨基酸取代：3、22、27、79、81、84、85.1、86和88，其中在第一工程化免疫球蛋白恒定区中位置20进行取代的氨基酸残基与在第二工程化免疫球蛋白恒定区中位置26进行取代的氨基酸残基相互作用，
其中每个组成员的氨基酸位置根据编号表示。
优选地，在第一工程化免疫球蛋白链的蛋白-蛋白界面中进行取代的氨基酸残基包含位置20和22上的氨基酸残基和任选地在选自以下的位置上的其它氨基酸残基：3、5、7、26、27、79、81、84、84.2、84.4、85.1、86、88和90，其中在第二工程化免疫球蛋白链的蛋白-蛋白界面中进行取代的氨基酸残基包含在位置26和选自3、5、7、20、22、27、79、81、84、84.2、84.4、85.1、86、88和90的其他位置上的氨基酸残基，其中每个组成员的氨基酸位置根据编号表示。优选地，在第一工程化的免疫球蛋白链的蛋白-蛋白界面中进行取代的氨基酸残基包含位置20和22上的氨基酸残基、以及任选地在选自以下位置上的其它氨基酸残基：3、5、7、26、27、79、81、84、84.2、84.4、85.1、86、88和90，其中在第二工程化的免疫球蛋白链的蛋白-蛋白界面中进行取代的氨基酸残基包含位置26和86上的氨基酸残基和任选地在选自3、5、7、20、22、27、79、81、84、84.2、84.4、85.1、88和90的其他位置上的氨基酸残基，其中每个组成员的氨基酸位置根据编号表示。
更优选地，在第一工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置20上进行取代的氨基酸残基选自20V、20T、20A、20N、20Q、20K、20S、20W和20E，其中在第一工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中取代的其他氨基酸残基选自3A、22A、22G、22L、22I、22V、22T、26K、26R、26Q、26T、26V、26S、26N、26E、79Y、85.1W、85.1F、85.1T、85.1M、85.1A、85.1S、85.1R、85.1H、85.1K、85.1C、85.1N、86W、86Y、86S、86I、86H、86Q、86V、86T、86F、88Q、88L、88V、88R、88E、88T、88I、88Y、88K、88W和90N，其中在第二工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置26上取代的氨基酸残基选自26T和26E及其保守氨基酸取代，其中氨基酸位置根据编号表示。
在最优选的实施方案中，在第一工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置20上取代的氨基酸残基是20K，并且其中在第一工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中取代的其他氨基酸残基是3A、22V、26T、79Y、85.1S、86V、88W和90N，并且其中在第二工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置26上取代的氨基酸残基是26T，其中在第二工程化的免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中取代的其他氨基酸残基是3E、5A、7F、20T、22V、81D、84L、84.2E、84.4Q、85.1C/S/A、86S、88R和90R(编号)。
靶向CD3和疾病相关抗原的异源二聚体免疫球蛋白的开发
第一步(实施例1)，在基于FAB或scFv片段的同源二聚体免疫球蛋白中测定降低或消除蛋白A结合的取代。已经发现，在具有降低蛋白A结合或消除蛋白A结合的取代的重链中存在VH3亚类的可变重链结构域，会阻碍基于蛋白A的任何差异亲和方法。发现对于基于蛋白质A的差异亲和力方法，这些主要障碍的解决方案在于形成降低或消除蛋白A与VH3亚类结合的框架取代。
第二步(实施例2.1)，通过将鼠抗CD3抗体的CDR嫁接到IGVH3-23和IGVK1或IGVK3人种系框架上产生靶向人CD3(ε亚基)的人源化抗体。最好的人源化变体使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除了在其VH结构域中存在的蛋白A结合位点。这些变体被制备成FAB或scFv片段形式。
第三步，产生靶向疾病相关抗原的抗体的抗原结合位点。可将鼠抗体的CDR嫁接到人种系框架IGVH3-23和IGVK1上(实施例2.3、2.4和2.6-2.10)。或者，从噬菌体展示文库分离的抗体的CDR可以基于VH3可变结构域亚类或嫁接到人种系框架IGVH3-23和IGVK1上(实施例2.5和2.6)。使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除了表位结合区的VH结构域中的蛋白A结合位点。
第四步，基于技术(如WO2012/131555中所述)制备了异源二聚体抗体，其中来自实施例2.1 2 2的抗CD3抗体和如实施例2.2-2.10中描述的疾病相关抗原的表位结合区以scFv-FAB形式使用，或反之亦然(实施例3.1)。由于同源和异源二聚体物质之间蛋白A结合位点数量的差异可用于通过蛋白A色谱法分离异源二聚体物质，故对本发明的双特异性抗体进行了工程化，导致两个同源二聚体之一不具有蛋白A结合位点，因此不与蛋白A树脂结合。此外，为了改善BEAT抗体的安全谱，通过将两个取代L234A和L235A(EU编号)工程化到Fc区的下铰链区，以降低或消除Fc受体结合。
实施例
材料和方法
构建用于瞬时哺乳动物细胞表达的表达载体
首先编码不同多肽链的cDNA部分或全部由GENEART AG(Regensburg,Germany)合成，并使用标准分子生物学技术修饰。用合适的DNA限制酶消化PCR产物，纯化，连接入之前已经用相同的DNA限制酶消化的修饰的pcDNA3.1质粒(Invitrogen AG,Zug,瑞士)中，所述质粒带有CMV启动子和牛激素多聚腺苷酸化序列(poly(A))。所有的多肽链独立地连接入该表达载体中，其中由鼠源VJ2C前导肽驱动多肽链的分泌。
重组蛋白的表达
抗体、ScFv-Fc融合蛋白、BEAT抗体和抗原，除非另行说明，否则如下述进行表达。对于瞬时表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；Sigma,Buchs,瑞士)，将各工程化链载体以等量共转染至悬浮适应化的HEK293-EBNA细胞(ATCC-LGL标准,Teddington,UK；Cat.No:CRL-10852)中。典型地，100ml悬浮细胞(密度0.8-1.2百万个细胞/ml)用DNA-PEI混合物转染。在将编码各工程化链基因的重组表达载体引入宿主细胞中后，进一步培养细胞4至5天以允许免疫球蛋白构建体分泌到培养基(EX-CELL 293,HEK293-无血清培养基(Sigma),补充了0.1％pluronic acid,4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素)中，产生免疫球蛋白构建体。通过离心制备含有分泌的免疫球蛋白的无细胞培养物上清液，之后无菌过滤并用于进一步的分析。
差异蛋白A亲和色谱(实施例1)
Fc133片段和同源二聚体scFv-Fc免疫球蛋白的纯化
捕获-洗脱模式色谱
将上清液在纯化前用0.1体积(V)1M Tris-HCl pH8.0进行调节。将蛋白GSepharoseTM 4 Fast Flow(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士；目录号17-0618-01)加入到调节的上清液中。混合物在4℃下孵育过夜。孵育后，用10CV PBS pH7.4洗涤结合的蛋白质，用4个柱体积(CV)的0.1M甘氨酸，pH3.0洗脱，并用0.1V的1M Tris-HClpH8.0中和。通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，Basel，瑞士)在非还原条件下分析上清液、流通液(flow through)和洗脱级分。
梯度模式色谱
生成后，使用蛋白G SepharoseTM 4 Fast Flow(上文)、在捕获-洗脱模式色谱中首先纯化含有Fc133片段的细胞培养物上清液。随后将来自捕获-洗脱模式色谱的洗脱物质加载到1ml HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱(蛋白A结合位点突变体)上。柱在0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH8.0中预平衡，并在色谱***(柱和仪器都来自GEHealthcare Europe GmbH；柱目录号：11-0034-93)上以1ml/分钟的流速操作。组合不同量的两种缓冲液(运行缓冲液(A)：0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH8.0和洗脱缓冲液(B)：0.04M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH3.0)以pH线性梯度进行洗脱。线性梯度在五个柱体积(CV)中从0％B至100％B。洗脱的级分用0.1V的1M Tris-HCl pH 8.0中和。上清液、流通液和洗脱级分在非还原条件下通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，Basel，瑞士)分析。
同源二聚体FAB-Fc免疫球蛋白和FAB片段的纯化。
生成后，细胞培养物上清液用0.1V的1M Tris-HCl pH 8.0调节。将蛋白L树脂(Genescript，Piscataway，USA)加入到调节的上清液中，并在4℃孵育过夜。孵育后，用10CV的PBS，pH7.4洗涤结合的蛋白质，用4CV的0.1M甘氨酸，pH3.0洗脱，最后用0.1V的1M Tris-HCl pH8.0中和。为了评估蛋白A结合，将蛋白L纯化的FAB在pH8.0(柠檬酸/Na2HPO4缓冲液)注射到1ml HiTrap MabSelectTM柱(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)上。组合不同量的两种缓冲液(运行缓冲液(A)：0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH8.0和洗脱缓冲液(B)：0.04M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH3.0)用pH线性梯度进行洗脱。线性梯度在5CV中从0％B到100％B。洗脱的级分用0.1V的1M Tris-HCl pH8.0中和。通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，Basel，瑞士)在非还原条件下分析上清液、流通液和洗脱级分。
基于VH3的同源二聚体FAB-Fc和scFv-Fc免疫球蛋白(在其Fc和VH3结构域中消除了与蛋白A的结合)的纯化和测试。
纯化方案包括根据上述程序进行捕获-洗脱模式色谱、然后进行梯度模式色谱。
差异蛋白A亲和色谱(实施例1和3)
产生后，将无细胞上清液加载到在0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH6.0中预平衡的1ml HiTrapTM MabSelect SuReTM蛋白A柱上，并在色谱***上(两者均来自GE Healthcare Europe GmbH；柱目录号:11-0034-93)以1ml/min流速运行。运行缓冲液是0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH6。使用20mM柠檬酸钠缓冲液pH4洗脱目的异源二聚体，而使用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱同源二聚体物质。
通过280nm的OD读数，跟踪洗脱；合并含有目的异源二聚体的级分，用0.1体积的1MTris pH 8.0(Sigma)中和。
通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，Basel，瑞士)在非还原条件下分析上清液、流通液和洗脱级分。
差示扫描量热法(DSC)
使用量热测量，比较抗体的热稳定性。在VP-DSC差式扫描微量热仪(MicroCal-GEHealthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)上，进行量热测量。细胞体积是0.128ml，加热速度是1℃/min，保持过压在64p.s.i.。所有蛋白片段均以浓度1-0.5mg/ml在PBS(pH 7.4)中使用。通过与含有相同缓冲液但已经省去了蛋白的重复样品进行比较，估计每个蛋白的摩尔热容。使用标准程序分析了偏摩尔热容和熔解曲线。温谱图进行了基线校正和浓度标化后，使用非二态模型(Non-Two State model)在软件Origin v7.0中进一步分析。
人IgG亚类的预期熔解曲线是已知的(Garber E&Demarest SJ(2007)BiochemBiophys Res Commun,355(3):751-7)，并且所有曲线均显示出含有三个解折叠过渡，相应于CH2、CH3和FAB结构域的独立解折叠。在4个人IgG亚类中，IGHG1具有最稳定的CH3结构域(～85℃)；而其它亚类CH3结构域较不稳定，但已知无一在70℃以下熔解。类似地，已知所有亚类的CH2结构域具有～70℃的熔解温度。
通过毛细管凝胶电泳进行的纯度评估(实施例3.2)
非还原样品制备
将40μg脱盐的蛋白样品缓冲在含有5mM碘乙酰胺(Sigma)的SDS样品缓冲液(Beckman Coulter International S.A.,Nyon,瑞士；IgG Purity Kit,Cat.No:A10663)中。在样品中加入10-kDa内标。样品混合物在70℃加热10分钟。
毛细管凝胶电泳
样品制备后，在配备有设定在220nm的光电二极管阵列检测器(DAD)的ProteomeLab PA 800(Beckman Coulter International S.A.,Nyon,瑞士)上，运行样品。使用裸露的熔融石英毛细管50μm ID×30.2cm(至检测器的20.2cm有效长度)作为分离介质。样品注射和分离分别在5和15kV恒压进行，在SDS分子量凝胶缓冲液中反转极性。以2Hz的速度记录数据，在分离过程中电流稳定。毛细管和样品被恒温调节在25℃。
通过SPR的亲和力测量(实施例1)
消除了对蛋白A的结合的FAB片段的SPR检测
将编码与IGHG1 Fc片段融合的人HER2细胞外区的cDNA克隆到与上述重链和轻链表达载体相似的表达载体中，使用PEI方法瞬时转染到HEK293E细胞中(参见PCT公开号：WO2012131555)。用0.1V的1M Tris-HCl pH8.0调节上清液，通过蛋白A捕获-洗脱色谱法纯化抗原，如实施例1所述。对于SPR实验，使用单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体传感器芯片，这允许在正确的方向捕获Fc融合的重组HER2抗原(人抗体捕获试剂盒，目录号BR-1008-39，GEHealthcare Europe GmbH)。测量值记录在BIAcoreTM2000仪器(GE Healthcare EuropeGmbH，Glattbrugg，瑞士)上。将抗HER2 FAB的不同稀释液(50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39nM)以30μl/min注射到传感器芯片上，持续4分钟。对于每次测量，在解离7分钟后，以30μl/min注射3M MgCl2溶液1分钟以进行再生。数据(传感图：fc2-fc1)拟合1:1Langmuir。为了解决在每次测量开始时捕获的HER2-Fc的实验变异，在所有拟合中将Rmax值设置为局部的。测量进行一式两份，包括用于参考的零浓度样品。使用Chi2和残差值来评估实验数据和各结合模型之间拟合的质量。
通过SPR的亲和力测量(实施例2和3)
使用SPR分析测量不同抗体(鼠源和人源化抗体)结合动力学的结合和解离速度常数。在BIAcore 2000仪器(BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)上室温测量抗体的结合动力学，用BiaEvaluation软件(4.1版,BIAcore-GE Healthcare EuropeGmbH)分析。
在CM5传感器芯片(GE Healthcare Europe GmbH,Cat.No:BR-1000-14)上进行测量，所述芯片使用商业胺偶联试剂盒(GE Healthcare Europe GmbH,Cat.No:BR-1000-50)分别偶联了目的配体。蛋白G配体来自Pierce(Thermo Fisher Scientific-PerbioScience S.A.,Lausanne,瑞士,Cat.No:21193)。
数据(传感图：fc2-fc1)拟合1:1Langmuir模型(如所示的，有或无传质)。在捕获实验中，为了解决在每次测量开始时的实验变异性，在所有拟合中将Rmax值设置为局部的(local)。解离时间为至少350秒。一式三份进行测量，测量包括零浓度样品作为参照。使用Chi2和残差值来评估实验数据和各结合模型之间拟合的质量。
通过FACS在HPB-ALL细胞上的亲合力测量
HPB-ALL细胞(DSMZ,Braunschweig,德国,Cat.No:ACC483)作为CD3阳性细胞系用于FACS染色。HPB-ALL维持在补充了10％FCS和100U/ml青霉素及100ug/ml链霉素的RPMI1640中。将嵌合OKT3抗体和人源化变体的100μl系列稀释物与4x105HPB-all细胞在补充了1％BSA和0.1％叠氮化钠(称作FACS缓冲液)的PBS中于冰上孵育45分钟。无关人IgG1用作同种型对照，并且嵌合OKT3抗体用作阳性对照。洗涤后，细胞与1/200稀释的抗人Fc-PE(EBioscience,Vienna,Austria)在冰上孵育45分钟。然后再次洗涤细胞并重悬在200ulFACS缓冲液中。在FACSCalibur(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)上测量了每个样品的相对平均荧光。结果总结在图9中，表示为与嵌合OKT3抗体相比，HBP-ALL的相对染色。
用于体外测定法的细胞系
人HER2阳性细胞系
表达HER2抗原的人细胞已经在PCT公开号WO2010108127中描述。本文使用的HER2阳性人细胞系如下：
BT474(ATCC-LGL标准品；目录号：HTB-20)
培养条件：在150cm2组织培养瓶(TPP，Trasadingen，瑞士；目录号：90150)中补充了10％热灭活FBS、1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号：10378-016)、1％丙酮酸钠溶液(PAA Laboratories，Pasching，Austria；目录号：S11-003)、1％MEM非必需氨基酸(PAALaboratories，目录号：M11-00dsmz3)和1％GlutaMAX-1(Invitrogen AG，目录号：35050-038)的RPMI培养基。细胞每周传代两次。
JIMT-1(DSMZ，Braunschweig，德国，目录号：ACC589)
培养条件：补充了10％热灭活的FBS、1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号：10378-016)、1％丙酮酸钠溶液(PAA实验室，目录号：S11-003)、1％MEM非必需氨基酸(PAA实验室,目录号:M11-003)和1％GlutaMAX-1(Invitrogen AG，目录号：35050-038)的Dulbeco改良的必需培养基(DMEM(1X))+GlutaMAX-1(Invitrogen AG，目录号：31966-012)。细胞每周传代2-3次。
MDA-MB-231(ATCC-LGL标准品；目录号：HTB-26)。
培养条件：与JIMT-1相同的培养条件。
HT-1080(ATCC-LGL标准品；目录号：CCL-121)。
培养条件：将HT1080细胞在补充了10％热灭活FBS、1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号:10378-016)和1％谷氨酰胺(Invitrogen AG，目录号：25030-024)的EMEM培养基中培养。细胞每周三次(1/6稀释)传代培养。
NCI-N87(ATCC-LGL标准品；目录号：CRL-5822)。
培养条件：将NCI-N87细胞在具有10％热灭活FBS、1％青霉素-链霉素(InvitrogenAG，目录号：10378-016)、1％丙酮酸钠溶液(PAA实验室，Pasching，奥地利；目录号：S11-003)、1％MEM非必需氨基酸(PAA实验室，目录号：M11-00dsmz3)和1％谷氨酰胺(InvitrogenAG，目录号：25030-024)的RPMI 1640培养基中培养。细胞每周两次(1/3稀释)传代。
人CD38阳性细胞系
表达CD38抗原的人细胞描述在PCT公布号WO2005103083,WO2008047242,WO2011154453和WO2012092612中。在此使用的CD38阳性人细胞系如下：
稳定的重组CHO[CD38]细胞
在Source Biosciences(Berlin,Germany,Cat.-No.:IRAU37D11,4309086)订购了编码人CD38的基因。人CD38使用引物扩增，在5’端添加kozak序列、起始密码子、及随后的信号肽(鼠V前导序列)，并在3’端添加NheI限制性位点。使用NheI和HindIII切割扩增子，克隆至pT1(内部开发的pcDNA3.1(Invitrogen AG)衍生载体)的表达盒中。pT1的表达盒使用两个IRES(内部核糖体进入位点)将目的基因的表达和GFP和PAC(嘌呤霉素抗性基因)的表达连接在一个多顺反子mRNA上。制备质粒的小量制备物，通过DNA测序验证了克隆的CD38开发阅读框。在50ml生物反应器(TubeSpin 50生物反应器,TPP,Trasadingen,瑞士)中，使用聚乙烯亚胺(Polyplus-transfection,Illkirch,法国)转染悬浮CHO-S细胞(Invitrogen AG)。为此目的，将指数生长的细胞接种在OptiMEM培养基(Invitrogen AG,Cat.No.:31985-047)中。向细胞中加入DNA复合物。细胞和DNA复合物在37℃振摇(200RPM)孵育5h进行内吞后，向细胞悬浮液中加入一体积补充了4mM Gln的培养基PowerCHO2(Lonza,distributor RUWAG Lifescience,Bettlach,瑞士,Cat.No:BE12-771Q)。然后，将细胞在摇床上在37℃、5％CO2和80％湿度下孵育。转染后一天，将细胞以不同浓度接种在96孔板中于含有嘌呤霉素的选择培养基(Sigma,Cat.No:P8833-25mg)中。在静止条件下选择大约14天后，使用TubeSpin 50生物反应器，以悬浮培养物形式扩增46个高GFP表达细胞合并物。一旦成功地适应悬浮后，通过FACS分析细胞的CD38。选择具有同质CD38染色谱的稳定CHO[CD38]克隆，并用于本文中。
其它CD38阳性细胞系包括：
NCI-H929(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CRL-9068).
Namalwa(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CRL-1432)
U266(ATCC-LGL标准品；Cat.No:TIB-196)
RPMI 8226(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CCL-155)
培养条件:RPMI 1640培养基，补充10％热灭活的FBS,1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG)和1％GlutaMAX-1(Invitrogen AG)
Raji(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CCL-86)
Daudi(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CCL-213)
人OX40阳性细胞系
表达OX40抗原的人细胞已经在PCT公开号：WO2013008171中描述了。
外周血单核细胞(PBMC)和HBP-ALL是人OX40阳性细胞系的实例。
本文使用稳定的重组CHO[OX40]细胞。使用与上述用于稳定的重组CHO[CD38]细胞系类似的方案，工程化携带编码人OX40的合成cDNA的重组CHO细胞系。
人CD20阳性细胞系
表达CD20抗原的人细胞已经在PCT公开号：WO2010095031中描述了。CD20+癌细胞的实例是Daudi癌细胞系(ATCC-LGL标准品；目录号:CCL-213)，将这些B淋巴母细胞癌细胞培养在补充有20％FBS和1％P/S；1％L-Glut；1％Na-Pyr和1％NEAA的RPMI 1640培养基(Sigma)中。细胞在37℃和补充5％CO2下培养。
人EGFR阳性细胞系
表达EGFR抗原的人细胞已经在PCT公开号：WO2010108127中描述。EGFR+癌细胞的例子是HT-29癌细胞系(ATCC-LGL标准品；目录号：HTB-38)，将这些结肠直肠癌细胞培养在补充有10％FBS和1％P/S；1％L-Glut；1％Na-Pyr和1％NEAA的McCoy's 5A培养基(Sigma)中。细胞在37℃和补充5％CO2下培养。
人CD19阳性细胞系
表达CD19抗原的人细胞在PCT公开号：WO2010/095031中描述。Namalwa(ATCC-LGL标准品；目录号：CRL-1432)和Raji(ATCC-LGL标准品；目录号：CCL-86)是人CD20阳性细胞系的实例。
人膜IgE阳性细胞系
PCT公开号：WO2010/033736的第71页描述了通过加入白细胞介素-4(IL-4)和抗CD40抗体将人PBMC转化成产生IgE的B细胞的方法。
重组靶抗原
人CD3γ-ε-Fc融合蛋白
首先由GENEART AG(德国雷根斯堡)合成cDNA，其编码通过26个残基肽接头(序列：GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS；SEQ ID NO:186)与人CD3ε胞外区(UniProt登录号：P07766，残基22-118(SEQ ID NO：185))融合的人CD3γ胞外区(UniProt登录号：P09693残基23-103(SEQ ID NO：184)；UniProt Consortium(2013)Nucleic Acids Res.,41(Databaseissue):D43-7；http://www.uniprot.org/)。使用标准重叠PCR技术以及从Geneart AG得到的人IgG1 Fc cDNA模板，将该合成基因与人IgG1 Fc部分融合。将得到的cDNA克隆到上述修饰的pcDNA3.1质粒中。
对于CD3γ-ε-Fc蛋白(SEQ ID NO：187)的瞬时表达，如上所述，使用聚乙烯亚胺(PEI)将重组载体转染到悬浮适应的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)中。然后使用重组Streamline rProtein A培养基(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)，将CD3γ-ε-Fc构建体从无细胞的上清液中纯化，并用于进一步分析。
人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白
分别从获自GENEART AG的人和猕猴CD3ε胞外区的合成cDNA，PCR扩增编码人CD3ε肽1-26(UniProt登录号：P07766，氨基酸23-48，SEQ ID NO：188)的cDNA和编码猕猴CD3ε肽1-26(UniProt登录号：Q95LI5，氨基酸22-47，SEQ ID NO：189)的cDNA。随后使用标准重叠PCR技术，将扩增产物与人IgG1 Fc部分融合。人IgG1 Fc cDNA模板获自Geneart AG。将得到的cDNA克隆到上述修饰的pcDNA3.1质粒中。
对于人和猕猴CD3ε构建体(分别为SEQ ID NO：190和191)的瞬时表达，如上所述使用聚乙烯亚胺(PEI)将重组载体转染入悬浮适应的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)。然后使用重组Streamline rProtein A培养基(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)从无细胞上清液中纯化CD3ε融合构建体，并用于进一步分析。这两种融合蛋白在本文中被称为人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白。
人HER2胞外区
已经在PCT公开号WO2012131555中描述了HER2可溶性胞外区的制备。制备了融合至多组氨酸标签(本文称为HER2-his)或融合至人IgG1 Fc区(本文称为HER2-Fc)的人HER2可溶性胞外区。
人和猕猴CD38胞外区
人CD38的cDNA获自Source Biosciences(Erwin-Negelein-Haus，Germany，目录号：IRAU37D11，4309086)，PCR扩增其胞外区(UniProt登录号：P28907残基43-300)并克隆到源自pcDNA3.1(Invitrogen AG)的内部表达载体。该表达载体包含在其多克隆位点5'端的kozak序列和起始密码子及随后的鼠VJ2C前导肽和在3'端的6-His标签。融合至6-His-标签的人CD38可溶性胞外区(SEQ ID NO：192)如下表达和纯化：在摇瓶中在37℃、5％CO2和80％湿度下孵育1体积的含有HEK细胞、0.1％pluronic acid(Invitrogen AG)、表达载体和聚乙烯亚胺(Polyplus-transfection，Illkirch，France)的RPMI 1640培养基(PAA实验室，目录号：E15-039)。4小时后，将1体积的补充有6mM谷氨酰胺的ExCell293培养基加入到混合物中，并进一步孵育共5天。生产后，通过离心并使用0.2μm过滤器过滤，制备无细胞上清液，使用Tris 1M pH8.7将pH调节至7.4(4℃)。将Ni-Sepharose Excell珠(GEHealthcare，目录号：17-3712-03)加入到溶液中并在4℃下搅拌过夜。将溶液装载至Econo-Column(Bio-Rad Laboratories AG，Reinach，瑞士，目录号737-4252)上用于重力流纯化。将珠子在PBS(2x)、20mM咪唑中洗涤，蛋白质在PBS、500mM咪唑中洗脱。合并洗脱的级分并在4℃下用两个透析步骤将缓冲液交换为PBS。使用0.22μm注射过滤器过滤纯化的人CD38胞外区。
使用如上所述的方法，克隆、表达和纯化融合至6-His标签(SEQ ID NO：193)的猕猴CD38抗原的可溶性胞外区。
人OX40胞外区
PCT公开号：WO2013008171中描述了制备人OX40的可溶性胞外区的方法。
人EGFR胞外区
EGFR可溶性胞外区抗原制备的实例已经在PCT公开号：WO2012131555中描述。
体外T细胞重定向杀伤试验
制备外周血单核细胞
为了制备外周血单核细胞(PBMCs)，从瑞士La Chaux-de-Fonds的血液采集中心(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Sérologie,rue Sophie-Mairet29,CH-2300)，收集了含有人白细胞的血液过滤物。通过用含有10U/ml肝素(liquemin)(Drossapharm AG,Lucern,瑞士)的60ml PBS反洗，从过滤物分离细胞。然后用50mL Blood-Sep-Filter管(Brunschwig,Basel,瑞士)，按照生产商的说明书，纯化PBMCs。800g室温离心(无制动)管子20分钟，从界面收集细胞。用Roswell Park Memorial Institute(RPMI,PAALaboratories,Pasching,Austria)培养基(无FBS或磷酸缓冲盐水PBS)，洗涤细胞3次。以10e6细胞/mL将PBMCs重悬在RDL培养基(补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的RPMI)中，37℃在5％CO2温箱中培养过夜，之后用于试验。
T细胞制备
直接在PBMC分离后，使用pan-T细胞分离试剂盒II(Myltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,Germany,Cat.No:130-091-156)，按照生产商的说明书，纯化T细胞。纯化后，以10e6细胞/mL将T细胞重悬在RDL培养基中，37℃在5％CO2温箱中培养过夜。
试验读数
使用给出高度相当结果的两个不同读出来定量重定向的杀伤。
流式细胞术，在此处称作RDL-FACS法，基于Schlereth B等((2005)Cancer Res,65:2882-2889),Moore PA等((2011)Blood,117(17):4542-51)和Friedrich M等((2012)Mol Cancer Ther,11:2664-2673)中描述的荧光-细胞术。收获靶细胞，计数，洗涤一次，以5x10e6细胞/mL重悬在PBS+1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE,Sigma)中。细胞在37℃孵育15分钟，每5分钟轻柔振荡一次。用RDL培养基洗涤CFSE加载的细胞，并以2x10e5细胞/mL重悬在RDL培养基中。收获PBMCs，计数并以2x10e6细胞/mL重悬在RDL培养基中。在RDL培养基中制备抗体系列稀释物(3x溶液)。将靶细胞(50μl/孔),T细胞(50μl/孔)和3x抗体溶液(50μl/孔)分配到平底96孔板(TPP,Trasadingen,瑞士)中。效应物:靶比率是10:1。平板在5％CO2温箱中37℃孵育48h。孵育后，300g离心平板3分钟，通过轻敲平板，弃去上清液。用200μlPBS洗涤平板一次，再次离心，并弃去PBS。加入预温的accutase(Invitrogen AG)溶液，37℃孵育平板10分钟。加入100μL RDL培养基后，通过吹打将脱壁的贴壁细胞重悬。将溶液转移到U形底96孔板(TPP)中。300g离心U形底板3分钟。弃去上清液，细胞以1/40稀释度重悬于补充有7-AAD(Becton Dickinson AG,Allschwil,瑞士)的200μl冷FACS缓冲液(PBS+2％FBS+10％Versene)中。立即在Guava easyCyteTM流式细胞计数器(Millipore AG,Zug,瑞士)上读取平板。对于每孔，通过门控CFSE阳性7ADD阴性群，使用软件(Miltenyi BiotecGmbH,Bergisch Gladbach,Germany)，确定活靶细胞的绝对数量。使用仅孵育靶细胞的条件作为基线，确定每个样品的比细胞毒性的百分数。使用非线性变斜率回归方法和Prism软件(GraphPad software,La Jolla,CA,USA)，确定EC50值。通过从加有测试抗体的条件下的比细胞毒性百分数中扣除无抗体条件下的比细胞毒性百分数，计算比重定向裂解(RDL)的百分数。
细胞存活力方法，在此为RDL-MTS法，基于比色法来评估细胞存活力，参见BühlerP等((2008)Cancer Immunol Immunother,57:43–52,Labrijn AF等((2013)Proc NatlAcad Sci USA,110(13):5145-50)和PCT公布号WO2012143524中的描述。收获靶细胞，计数，洗涤一次，并以2x10e5细胞/ml重悬在RDL培养基中。收获PBMC，计数，并以2x10e6细胞/mL重悬在RDL培养基中。在RDL培养基中制备抗体系列稀释物(3x溶液)。将靶细胞(50μl/孔),T细胞(50μl/孔)和3x抗体溶液(50μl/孔)分配到平底96孔板(TPP)中。效应物:靶比率是10:1。平板在5％CO2温箱中37℃孵育48h。孵育后，弃去上清液，用200μl PBS洗涤平板3次以移出PBMC，然后每孔加入100μl RDL培养基。使用CellTiter试剂盒(Promega AG,Dübendorf,瑞士)，根据厂商说明书，进行读数。简言之，向每孔加入10-20μl MTS试剂，平板在5％CO2温箱中37℃孵育2-6h。然后在BioTek synergy平板读取器(BioTek AG,Luzern,瑞士)上，读取490nm吸光度。使用下面公式计算比杀伤百分数：比杀伤＝100x[(SD-Sp)/(SD-MD)]。SD是在孵育单独靶细胞的自发死亡条件下测量的吸光度。Sp是在每个测试条件(靶细胞+PBMCs+抗体)下测量的吸光度。MD是在以3个冻融循环裂解靶细胞的最大死亡条件下测量的吸光度。通过从加入测试抗体的条件下的比细胞毒性百分数中扣除无抗体条件下的比细胞毒性百分数，计算了比重定向裂解(RDL)百分数。使用非线性变斜率回归法和Prism软件(GraphPad software)，确定EC50值。
异种移植物模型
JIMT-1异种移植物
细胞系和试剂
从DSMZ(目录号：ACC589)获得乳腺癌JIMT-1细胞系。在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)(AMIMED，London，UK，目录号：Z10834P)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG，目录号：10378-016)、1％丙酮酸钠溶液(PAA实验室，目录号：S11-003)、1％MEM非必需氨基酸(PAA实验室，目录号：M11-003)和1％GlutaMAXTM-1(Invitrogen AG，目录号：35050-038)的、具有GlutaMAXTM-1(Invitrogen AG，目录号：31966-021)的DMEM(1X)中维持细胞。使用StemPro Accutase(Invitrogen AG，目录号:A11105-01)每周传代细胞两次。
从来自瑞士La Chaux-de-Fonds的血液采集中心(Centre de TransfusionSanguine et Laboratoire de Sérologie,rue Sophie-Mairet 29,CH-2300)的含有人白细胞的血液过滤器，收集外周血单核细胞(PMBC)。通过用60ml含有10U/mL肝素(Drossapharm AG，Lucern，瑞士)的PBS反冲洗，将细胞从过滤器中移出。然后用50mlBlood-Sep-Filter Tubes(Brunschwig，Basel，瑞士)，根据制造商的说明，分离PBMC：将管在室温(无制动)下以800g离心20分钟，并从界面收集细胞。将细胞用无FBS的Roswell ParkMemorial Institute培养基(RPMI，Invitrogen AG，目录号：21875-091)洗涤3次。将PBMC以10e6细胞/ml重悬于补充有10％FBS(AMIMED)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG)的RPMI培养基中，并在37℃、5％CO2下培养过夜。收获靶细胞，计数，洗涤一次，并以5×10e6细胞/ml重悬于PBS中。
小鼠和实验条件
在以T细胞、B细胞和自然杀伤细胞缺陷为特征的5周龄免疫缺陷NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)雌性小鼠(Janvier Labs，St Berthevin，France)中进行体内实验。小鼠保持在标准的啮齿动物微隔离室笼(20+/-1℃室温、50±10％相对湿度、12小时光暗度节律)中在无菌和标准化的环境条件下。小鼠接受辐射的食物、垫草(bedding)和0.22μm过滤的饮用水。所有实验都是根据瑞士动物保护法，由负责的州政府(NeuchatelCanton,瑞士)批准。根据动物保护法，当肿瘤体积超过2000mm3时，小鼠必须进行安乐死。采用ANOVA单因素方法和Bonferroni参数检验，进行相应治疗组相对于媒介物对照组的平均肿瘤体积的统计学分析。
所有小鼠在植入前用VEET霜剂(Reckitt Benckiser AG，Wallisellen，瑞士)在右侧肋去毛。在植入当天和之后每周一次对小鼠拍照和体重测量。对于每只动物，将5×10e6人PBMC与5×10e6JIMT-1乳腺癌细胞在最终体积0.2ml PBS中混合。包括四个不同的PBMC供体。将PBMC/JIMT-1混合物皮下注射到每只NOD/SCID小鼠的右侧肋。对照组使用终体积0.2ml PBS中5×10e6JIMT-1乳腺癌细胞，而不包含任何人PBMC。对于每组10只JIMT-1/PBMC植入动物(每个PBMC供体一组)，5只动物在植入后3小时用100μl体积、0.05mg/kg的HER2/CD3-1双特异性抗体静脉内处理。处理每周重复3次，每两天一次、持续两周。每周两次用卡尺在两个垂直维度上测量肿瘤，根据下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝[(宽2×长)/2]。
实施例1：确定在VH3亚类中减少或消除蛋白A结合的突变
消除免疫球蛋白恒定区中蛋白A结合的方法是已知的(Lindhofer H.等人,(1995)J Immunol,155(1):219-225；US6,551,592；Jendeberg L.等人,(1997)J ImmunolMethods,201(1):25-34；PCT公开号:WO2010151792)。为了评估在全长同源二聚体免疫球蛋白中蛋白A消除方法的应用，制备了基于混合IGHG1-IGHG3 Fc形式的抗HER2同源二聚体免疫球蛋白和相应的Fc 133对照片段。该抗HER2同源二聚体免疫球蛋白的形式与天然存在的抗体类似，由具有抗HER2特异性的FAB片段融合至Fc 133片段组成(来源于天然存在的人IGHG3同种型的Fc序列，其中铰链序列被替代为天然存在的人IGHG1同种型的整个铰链序列，缩写为Fc133，具有SEQ ID NO：1——该名称中的数字按铰链/CH2/CH3的顺序对应于每个结构域的免疫球蛋白γ同种型亚型；相应的全长抗HER2免疫球蛋白在本文中称为抗HER2FAB-Fc133；具有SEQ ID NO：2的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)。转染后，根据材料和方法部分中描述的方案，通过梯度色谱法分析抗HER2FAB-Fc133同源二聚体和Fc133片段的蛋白A结合。如图3和图4A所示，Fc133片段不结合商业MabSelect SuReTM蛋白A树脂(GEHealthcare Europe GmbH)，而抗HER2 FAB-Fc 133同源二聚体能够结合。
为了评估FAB恒定结构域的贡献，将上述抗HER2同源二聚体重新制成抗HER2scFv-Fc分子的形式，其中scFv单元由通过15氨基酸的接头融合的亲本免疫球蛋白可变结构域组成(本文缩写为抗HER2 scFv-Fc133；具有SEQ ID NO：4的重链)。因此，除了缺少CH1和CK恒定结构域外，所得抗HER2 scFv-Fc133同源二聚体与亲本抗HER2 FAB-Fc133同源二聚体免疫球蛋白相同。如图4B所示，与用亲本抗HER2同源二聚体免疫球蛋白观察到的相同，scFv-Fc133同源二聚体显示出蛋白A结合。从此发现，得出：对于在同源二聚体免疫球蛋白Fc部分中消除蛋白A结合的这些方法，抗HER2 FAB片段的可变结构域构成了阻碍这样方法发挥功效的原因。更重要的是，得出结论：同源二聚体免疫球蛋白的可变结构域内的蛋白A结合将阻止基于蛋白A差异纯化技术制备异源二聚体免疫球蛋白。
已知蛋白A的所有五个结构域都结合来自VH3可变结构域亚类的可变重链结构域(Jansson B等人，(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol，20(1)：69-78)，该特征已知可以妨碍在全抗体分子的木瓜蛋白酶消化后制备基于VH3的FAB片段，原因是蛋白A不仅结合基于VH3的FAB也结合Fc片段。在所述的同源二聚体抗HER2免疫球蛋白或其scFv-Fc版本中的重链可变结构域属于VH3-23亚类，这解释了为什么这些同源二聚体分子，尽管在其工程化的Fc区没有蛋白A结合位点，仍可以结合蛋白A。
基于VH3的免疫球蛋白或其片段对生物技术行业至关重要。基于VH3的分子因为其结合蛋白A的能力有利于其功能性预筛选，而已经获得广泛开发，例如，用于抗体开发的许多合成的或基于供体的噬菌体展示文库或转基因动物技术均基于VH3结构域亚型。此外，由于具有良好的表达和稳定性，基于VH3的分子也常优于其他已知的重链可变结构域亚类而被选择。已经开发了不结合基于VH3的FAB片段的蛋白A重组版本，并由GE Healthcare以商品名MabSelect SuReTM商业化。
如上讨论MabSelect SuReTM树脂在本文中用于两种同源二聚体抗HER2免疫球蛋白的蛋白A结合评估，由此得出结论：当使用蛋白A差异纯化技术时，MabSelect SuReTM树脂不适用于制备具有至少一个VH3可变结构域的异源二聚体免疫球蛋白——因为在其Fc区中没有蛋白A结合的同源二聚体物质仍可以通过其VH3结构域结合蛋白A。
为了研究可以消除或降低基于VH3的同源二聚体免疫球蛋白或其片段的蛋白A结合的取代，需要分析基于VH3的FAB变体的蛋白A结合。尽管已知MabSelect SuReTM树脂类型缺乏VH3结构域亚类结合，但是称作MabSelectTM的另一种商业蛋白A树脂确实结合VH3结构域亚类(也来自GE Healthcare)，并且被选择用于分析基于VH3的FAB变体对蛋白A的结合。
通过以下验证了MabSelectTM树脂的使用：制备源自前述亲本抗HER2同源二聚体免疫球蛋白(已知具有VH3-23可变结构域亚类)的重组抗HER2 FAB片段(本文缩写为抗-HER2FAB；具有SEQ ID NO：5的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)，在MabSelectTM和MabSelectSuReTM柱上分析所述片段(具有基于VK亚类I的轻链，首先使用蛋白L色谱法在捕获-洗脱模式下纯化FAB片段，之后在MabSelectTM或MabSelect SuReTM柱上进行蛋白A梯度色谱，用于两个柱的方案均按照材料和方法部分描述的方案进行)。如图4C所示，基于VH3的抗HER2FAB仅与MabSelectTM柱结合，确认MabSelect SuReTM树脂不与基于VH3的FAB片段结合(至少就单体的基于VH3的FAB片段而言，并进一步与先前观察到的具有不结合蛋白A的工程化Fc区的基于VH3的同源二聚体免疫球蛋白的结果形成对比)。相反，抗HER2 FAB显示出与MabSelectTM柱的强结合，这使得可以测定与蛋白A不结合或具有降低的结合的基于VH3的FAB变体。
为了消除基于VH3的FAB片段中的蛋白A结合，从与蛋白A的D结构域复合的人FAB片段的晶体结构(PDB代码：1DEE；www.pdb.org；Graille M等人，(2000)Proc Natl Acad SciUSA，97(10)：5399-5404)，鉴定了VH3结构域中关键的蛋白A结合残基。该分析被用作合理设计的起点，其中基于蛋白A结合性和非蛋白A结合性人源VH亚类之间的序列比较，确定实施的取代的性质。图5显示了每种人重链可变结构域亚类各一个代表性框架的比对。氨基酸位置15、17、19、57、59、64、65、66、68、70、81、82a和82b(Kabat编号)被鉴定为在1DEE结构中蛋白A的D结构域和基于VH3的FAB片段之间的蛋白-蛋白相互作用界面的一部分。在人VH亚类中，VH3是结合蛋白A的唯一亚类，选择其他亚类中等同氨基酸序列位置的残基作为取代的来源，以期消除或降低蛋白A结合，同时潜在地降低免疫原性——因为这些取代涉及将一个残基替代为在非蛋白A结合性人VH亚类中相同的等同氨基酸位置上的另一个天然存在的残基替换。
通过基于标准PCR的诱变技术，在上述抗HER2 FAB片段的序列中引入突变，进行以下取代：G65S(具有SEQ ID NO：6的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)、R66Q(具有SEQ ID NO：7的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)、T68V(具有SEQ ID NO：8的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)、Q81E(具有SEQ ID NO：9的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)、N82aS(具有SEQ ID NO：10的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)和组合R19G/T57A/Y59A(具有SEQ ID NO：11的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)。
此外，制备T57A取代(具有SEQ ID NO：12的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)和T57E取代(具有SEQ ID NO：13的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)。先前在WO2010075548中已经证明T57A可以消除蛋白A结合，设计T57E以引入可能破坏VH3-蛋白A相互作用的带电残基。首先使用蛋白L色谱法在捕获-洗脱模式中纯化具有基于VK亚家族I的轻链的FAB突变体，并且如在材料和方法部分中描述的，使用在梯度模式下操作的MabSelectTM柱进一步分析蛋白A结合。图6显示仅T57A、T57E、G65S、Q81E、N82aS和组合R19G/T57A/Y59A消除或降低抗HER2 FAB与MAbSelectTM树脂的结合。对于消除基于VH3的FAB片段中的蛋白A结合，优选取代G65S、Q81E和N82aS，因为这些突变导致了在非蛋白A结合性VH亚类中的序列等同残基取代，从而潜在地降低免疫原性。
抗体亲和力和特异性基本上限于CDR区，然而，框架取代可影响抗体特性，如几种人源化抗体的情况。为了评估上述取代是否可能影响VH3衍生的抗体的特异性和/或亲和力，通过表面等离子共振(SPR)测定了优选FAB突变体中的两种对HER2抗原的结合。如材料和方法部分所述，使用重组HER2抗原进行了SPR测量。当与原始FAB分子(图7)相比时，两个优选的突变体都显示了相同的HER2抗原结合，表明这些取代在特异性或亲和力方面没有影响。因此，预期这些取代可以广泛用于工程化去除VH3衍生的抗体分子中的蛋白A结合，而不显著损失抗原结合。
将这些优选取代中的两个引入前述抗HER2同源二聚体免疫球蛋白和抗HER2scFv-Fc分子中，并测定变体在MabSelect SuReTM树脂上的结合。制备以下变体：抗HER2scFv(G65S)-Fc 133(具有SEQ ID NO：14的重链)、抗HER2 scFv(N82aS)-Fc 133(具有SEQID NO：15的重链)、抗HER2 FAB(G65S)-Fc 133(具有SEQ ID NO：16的重链和具有SEQ IDNO：3的轻链)和抗HER2 FAB(N82aS)-Fc 133(具有SEQ ID NO：17的重链和具有SEQ ID NO：3的轻链)。
图8显示了所有四种突变体的MabSelect SuReTM色谱图。所有变体现显示出降低至几乎没有的MabSelect SuReTM柱结合，表明用先前鉴定的取代成功地去除蛋白A结合。更重要的是，得出结论：当与蛋白A差异纯化技术组合时，通过消除或降低基于VH3的FAB对蛋白A的亲和力的取代，可以制备其中存在至少一个VH3可变结构域的异源二聚体免疫球蛋白。
实施例2：靶向人CD3抗原、肿瘤相关抗原和炎性细胞表面抗原的抗原结合位点
针对人CD3抗原的抗原结合位点
选择人CD3ε亚基，以通过双特异性结合来驱动T细胞重定向杀伤。
2.1A小鼠OKT3抗体的人源化变体
本文使用的抗人CD3ε抗原结合位点来源于小鼠OKT3抗体(Muromonab-CD3，商品名为Orthoclone OKT3，由Janssen-Cilag销售，随后停止；鼠可变重链和轻链结构域分别具有SEQ ID NO：18和19)。将OKT3鼠可变结构域人源化并形成为scFv和FAB片段。
人源化遵循Jung S&PlückthunA(1997，Protein Eng，10(8)：959-66)描述的方法，以产生适合于FAB和scFv形式的高度稳定的人源化变体。该方法利用抗体(rhuMAbHER2、huMAB4D5-8、曲妥珠单抗或商品名美国专利公开号5,821,337；分别具有SEQ ID NO：20和21的可变重链和轻链结构域)中的高度稳定的VH/VL结构域对，并遵循在固定的框架区上的人源化过程的工作流程(Almagro JC&Fransson J(2008),FrontBiosci,13:1619-33)。由于抗体最初来源于高度稳定的人种系框架VH3和VK1家族，所以来自这两个家族的种系框架可以同等地用作固定框架的来源。或者，可以使用人VK3种系轻链框架家族替代VK1，因为它也具有良好的稳定性(Ewert S等人,(2003)J MolBiol,325:531-553)。除了小鼠抗体之外，可以使用该固定框架方法来设计人抗体以改善稳定性。优选使用分别具有SEQ ID NO：22、23和24的人种系框架IGHV3-23*04、IGKV1-39*01和IGKV3-20*01(根据(国际ImMunoGeneTics信息***提及(Lefranc MP等人(1999)Nucleic Acids Res,27(1):209-12；Ruiz M等人(2000)Nucleic Acids Res,28(1):219-21；Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res,29(1):207-9；Lefranc MP(2003)NucleicAcids Res,31(1):307-10；Lefranc MP等人,(2005)Dev Comp Immunol,29(3):185-203；Kaas Q等人,(2007)Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64；http://www.imgt.org)。
为此目的，构建了第一人源化抗体，其中抗体的可变结构域中的CDR分别被来自小鼠OKT3抗体的CDR替代，并以小鼠OKT3抗体的嵌合体(具有SEQ ID NO：25和26的可变重链和轻链，并且在本文中称为嵌合OKT3抗体)作为参照基准。
原型抗体(具有SEQ ID NO：27和39的可变重链和轻链，缩写为VH/VL)在瞬时表达测试中具有增加的生产水平并具有增加的FAB稳定性(如通过差示扫描量热法所测量)，但是不结合HPB-ALL细胞(人CD3ε阳性T细胞肿瘤细胞系)(在FACS实验中通过中值荧光强度评估，参见材料和方法部分)(图9A)。
基于该第一对原型可变结构域的3D模型，选择并测试了一组回复突变(从CDR嫁接的原型至小鼠OKT3序列)：可变重链结构域中I34M,V48I,A49G,R58N,R58Y,I69L,A71T和T73K；和可变轻链中M4L,V33M,A34N,L46R,L47W,R66G,F71Y和P96F(Kabat编号)。注意，R58N取代相应于CDR嫁接的原型至小鼠OKT3的突变，而R58Y取代相应于CDR嫁接的原型至人IGHV3-23*04种系的替代。有关组合取代的工程化策略是基于不同取代在如下方面的互补性：不同取代对CDR区和/或可变结构域组装和/或免疫原性的推定影响。
在第一个方法中，所有候选物制备为人IgG1抗体形式。根据表达水平、FAB片段的热稳定性、和结合HPB-ALL细胞的能力(通过FACS),选择最佳变体。使用G65S或N82aS取代，消除最佳人源化变体在其VH结构域中存在的蛋白A结合位点。需要该工程化步骤以进一步产生无抗CD3同源二聚体的安全的T细胞重定向BEAT抗体。
在VH中的回复突变I34M、A49G和A71T以及在VL中的回复突变M4L、L46R、L47W和F71Y使亲和力恢复。可变结构域的最佳组合是VH8/VL4、VH8/VL8、VH11/VL4和VH11/VL8，因为其保留了大部分的亲本细胞结合(图9A-C)。此外，组合VH8/VL8(分别具有SEQ ID NO：48和51的可变结构域)和VH11/VL8(分别具有SEQ ID NO：49和51的可变结构域)具有增强的FAB稳定性(分别为+2.8℃和+1.6℃，图9D)。
最后，也将最佳人源化变体重新形成为scFv-Fc融合物形式，并瞬时表达。根据在该形式中的相对亲和力、稳定性、瞬时转染的表达水平，排序变体(图9E)。scFv-Fc融合形式中可变结构域的最佳组合与在抗体形式中鉴定的组合类似：VH8-VL4(具有SEQ ID NO：58的scFv片段)和VH8-VL8(具有SEQ ID NO：59的scFv片段)。两种scFv片段与scFv-Fc融合形式具有良好的热稳定性(图9F)。
2.1B小鼠SP34抗体的人源化变体
小鼠抗体SP34首先在1985年被描述(Pessano S等人,(1985)EMBO J,4(2):337-44)。它是由杂交瘤产生，所述杂交瘤从使用HPB-ALL细胞的变性蛋白提取物免疫的小鼠获得，该抗体具有人特异性和对猕猴的交叉反应性。人和猕猴CD3ε亚基上的SP34表位是已知的(分别为SEQ ID NO：195和196)。
按照以上实施例所述的方法和程序，通过将CDR嫁接到VH3-23和VK3种系框架，工程化构建了鼠SP34抗体的人源化VH和VL结构域(具有SEQ ID NO：60的VH结构域和具有SEQID NO：61的VL结构域)。根据其在BEAT抗体形式中的用途，可以使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。
为此目的，构建了第一人源化抗体，其中具有种系VH3重链结构域和种系VK3轻链结构域的人抗体的可变结构域中的CDR分别被来自小鼠SP34抗体的CDR替代。使用所得的人源化抗体作为起点进一步改善亲和力，并以SP34抗体的嵌合体(分别具有SEQ ID NO：62和63的重链和轻链，在本文中称为嵌合SP34抗体)作为参照基准。
原型抗体(具有SEQ ID NO：64和69的可变重链和轻链，缩写为VH1/VL1)对人CD3ε1-26_Fc融合蛋白具有低的结合(通过SPR评估，参见材料和方法部分和图10A)。
基于该第一对原型可变结构域的3D模型，选择了一组取代，对应于CDR嫁接的人种系VH3/VK3原型和小鼠SP34序列之间的回复突变(人至小鼠或小鼠至人取代)或对应于合理设计的氨基酸变化。进行了以下改变并测试了各种组合：可变重链结构域中的W100eF和W100eY；以及可变轻链中的A2I、S25A、T27A、G27aA、V27cA、T28A、T29A、S30A、N31A、Y32A、E38Q、F44P、G46L、T51A、N52A、K53A、R54A、P56A、L66G、D69T、F87Y、Q89A、W91F、Y92A、S93A、N94A和Q100G(Kabat编号；参见图10A)。关于组合取代的工程化策略是基于不同取代在如下方面的互补性：对CDR区和/或可变结构域组装和/或免疫原性的推定影响、和/或对哺乳动物细胞中瞬时表达的影响。
在第一种方法中，所有候选物形成为人IgG1抗体，并且随后以scFv-Fc融合蛋白形式(图10B)进一步测试，其中一些变体使用G65S消除了在其VH结构域中存在的蛋白A结合位点。根据表达水平和通过SPR测定的与人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白结合的能力，选择了最佳人源化候选物。
令人惊讶的是，当重新形成为scFv时，与IgG1形式相比，SP34嵌合体和H1L21导致了表达的显著丧失(图33)。然而，通过VH中取代W100eY和VL中W91F的组合，增强了scFv-Fc表达(图10B)。
为了进一步改善基于CD3的双特异性的可制造性，进一步设计了人源化SP34scFv。为了鉴定影响SP34 scFv-Fc表达的关键位置，在VL21 CDR中进行丙氨酸扫描。进行以下改变：T27A、G27aA、V27cA、T28A、T29A、S30A、N31A、Y32A、N52A、K53A、R54A、P56A、L90A、Y92A、S93A、N94A和L95A。有趣的是，只有位置29、30(VH1/VL26 SEQ ID NO：351)和95(VH1/VL34 SEQ ID NO：363)的取代导致了scFv-Fc表达的显著增加(图34)，而且这些突变体是保持与人和猕猴CD3ε完全结合的仅有那些突变体。
基于这些结果，在轻链中在位置29、30和95测试了更多的取代。
由于位置29和30在所有不同的可变轻链家族中显示出高变异性，故通过定点PCR随机突变这两个位置。在产生的所有突变体中，只有取代T29A、T29E、T29S、S30A和S30D在维持与人CD3ε结合的同时，显著改善了瞬时表达水平，图35a和35b。
在一个不同的方法中，L95(本领域中已知的规范结构残基)被取代为在可变λ家族中在该相同位置处最常见的残基。进行以下变化：L95A、L95G、L95T、L95S、L95D和L95N。意外的是，只有L95G和L95T在维持与靶标结合的同时显著改善表达(图35c)。
基于这项工作，设计了几种基于人源化SP34的BEAT，并测试其表达和与CD3ε的结合。在所有这些构建体中，含有H5L65(SEQ ID NO：394)和H5L67(SEQ ID NO：396)scFv的双特异性显示出，比基于H5L32 scFv的BEAT对照，增加2倍的表达(图36)。
通过DSC进一步表征了IgG1或scFv-Fc形式的H5L65和H5L67，并与H5L32、H1L21和SP34嵌合体进行比较。H5L65以IgG1形式显示出优异的热稳定性，但更有意义的是，在scFv-Fc形式中与其他人源化变体相比，增加了5至2℃(表1)。因此，改良抗体的体内稳定性增加了，体外稳定性也增加了。
表1
就抗原结合和重组表达而言，重链和轻链可变结构域的优选组合如下：VH1(SEQID NO:101)或VH2(SEQ ID NO:102)或VH3(SEQ ID NO:103)或VH5(SEQ ID NO:104)与轻链结构域VL21(SEQ ID NO:105),VL32(SEQ ID NO:106)、VL65(SEQ ID NO:401)和VL67(SEQID NO:402)配对。
2.2 HER2
重定向T细胞以杀伤HER2阳性癌细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人乳腺癌。已经描述了抗HER2抗体(Blumenthal GM等人,(2013)Clin Cancer Res,19(18):4911-6)，其中一些目前用于临床或目前在人体临床研究中(Tsang RY&Finn RS(2012)Br JCancer,106(1):6-13)。
本文所用的抗HER2抗原结合位点来自重组人源化抗HER2抗体 (见第1.1节)，其形式为FAB片段(具有SEQ ID NO：5的FAB重链片段和轻链SEQ ID NO：3)或scFv片段(SEQ ID NO：107)。在一些形式中，使用G65S取代(重链具有SEQ ID NO：108和轻链具有SEQID NO：3的FAB片段或具有SEQ ID NO：109的scFv片段)或N82aS取代(重链具有SEQ ID NO：110和轻链具有SEQ ID NO：3的FAB片段或具有SEQ ID NO：111的scFv片段)，消除了人源化抗HER2抗体4D5的VH结构域(VH3结构域亚类)中存在的蛋白A结合。
2.3 CD38
CD38是II类跨膜糖蛋白，其正常存在于造血细胞上和实体组织中。CD38也在各种恶性血液学疾病中表达。重定向T细胞以杀伤CD3阳性癌细胞的双特异性抗体可以用于治疗各种恶性血液学疾病，包括多发性骨髓瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、B细胞急性淋巴细胞性白血病、氏巨球蛋白血症、原发性***性淀粉样变性、套细胞淋巴瘤、前淋巴细胞/髓细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、滤泡性淋巴瘤、NK细胞白血病和浆细胞白血病。几种抗CD38抗体已经被描述为研究试剂或治疗剂候选物(PCT公布号:WO2006099875)。OKT-10和HB-7小鼠杂交瘤是表征最好的抗人CD38抗体(Hoshino S etal.,(1997)J Immunol,158(2):741-7)。
在第一种方法中，抗人CD38抗原结合位点可来自小鼠杂交瘤OKT10(分别具有SEQID NO：112和113的可变重链和轻链)或HB-7(分别具有SEQ ID NO：114和115的可变重链和轻链)和其人源化版本，其可进一步制备为FAB或scFv片段形式。按照实施例2.1中描述的方法和程序，通过将CDR嫁接到VH3-23和VK1种系框架上，可以工程化构建HB-7杂交瘤的人源化VH和VL结构域。
在第二种方法中，根据Almagro JC&Fransson J(Front Biosci,(2008)13:1619-33)描述的所谓最适配人源化方法(best-fit humanization method)，通过将CDR嫁接到人IGHV4-59*03和IGKV1-NL1*01种系框架(根据上述提及)上，工程化构建了HB-7杂交瘤的最适配人源化VH和VL结构域。在计算机上(in silico)研究了具有不同程度的回复突变的人源化VH和VL变体，将一个优选选择的人源化VH和VL瞬时表达为人IgG1形式，并且在本文中称为人源化HB-7最适配VH(SEQ ID NO：116)和VL(SEQ ID NO：117)结构域。引入以下小鼠回复突变：(VH)S35H、I37V、I48L、V67L、V71K、T73N、F78V、Y91F和(VL):M4L、L48I、Y49S、T69K(Kabat编号)。
通过FACS，人源化HB-7最适配抗体(具有SEQ ID NO：118的重链和具有SEQ ID NO：119的轻链)染色CHO[CD38]重组细胞(数据未显示)。当通过SPR分析时，人源化HB-7最适配抗体具有与嵌合HB-7抗体(具有SEQ ID NO：120的重链和具有SEQ ID NO：121的轻链)类似的CD38胞外区结合亲和力(KD分别为3.6和2.5nM；图11A(嵌合)和图11B(人源化))。令人吃惊的是，如从量热谱确定的，人源化HB-7最适配抗体与嵌合HB-7抗体相比，显示显著增强的FAB片段稳定性(+14.6℃)(76.4℃(嵌合)与91.0℃(人源化)，图11F)。
在第三种方法中，以人CD38胞外结构域和人CD38+细胞免疫小鼠，用于产生针对人CD38的新型杂交瘤候选物。产生杂交瘤的方法是已知的，并且本文使用的方法类似于PCT公开号：WO2013008171中公开的方法。9G7小鼠抗体候选物对人和猕猴CD38两者(分别具有SEQID NO：122和123的可变重链和轻链)具有高亲和力。该小鼠抗体首先按照以上实施例所述的方法人源化。使用最适配方法，选择种系VH框架IGHV2-5*09和VK框架IGKV1-33*01(根据上述提及)作为人源化过程的起点。CDR嫁接后，第一抗体原型(人IgG1同种型形式，重链SEQ ID NO：124和轻链SEQ ID NO：125)显示出与人CD38的强结合，比小鼠亲本抗体仅低三倍，如通过SPR确定的(具有重链SEQ ID NO：126和轻链SEQ ID NO：127的嵌合9G7抗体；嵌合9G7抗体(数据未显示)和第一人源化原型(数据未显示)的KD分别为0.3nM和1nM)。在抗体可变轻链中引入F36Y回复突变时(Kabat编号)，亲和力提高了两倍(所得抗体在本文中称为人源化9G7最适配抗体，其具有重链SEQ ID NO：124和轻链SEQ ID NO：128；人CD38的KD为0.5nM，图11C)。人源化9G7最适配抗体还显示对猕猴CD38抗原的高亲和力(KD为3.2nM，数据未显示)，以及比嵌合9G7抗体增强的FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)(对于人源化9G7最适配抗体和嵌合9G7抗体分别为94℃与82.2℃；参见图11G)。人源化9G7最适配抗体具有SEQ ID NO：129的重链可变结构域和SEQ ID NO：130的轻链可变结构域。
此外，通过将CDR嫁接至VH3-23和VK1种系框架上，按照最佳框架方法(best-framework approach)，对9G7小鼠抗体进行了人源化。在计算机上研究了具有不同程度回复突变的人源化VH和VL变体，并且将一个优选选择的人源化VH和VL组合瞬时表达为人IgG1抗体(所得抗体在本文中称为人源化9G7最佳框架抗体，其具有重链SEQ ID NO：131和轻链SEQ ID NO：132)。引入以下小鼠回复突变：(VH)A24F、V37I、V48L、S49A、F67L、R71K、N73T、L78V和K94R；和(VL)F36Y(Kabat编号)。该抗体表现出与人CD38和猕猴CD38的强结合，亲和力常数与人源化9G7最适配抗体相似(对人和猕猴CD38的KD分别为0.4和1nM；图11D)。FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)也非常类似于9G7最适配F36Y人源化变体(89.2℃，参见图11H)。图11J总结了上述不同的人源化9G7抗体。人源化9G7最佳框架抗体具有SEQ ID NO：133的重链可变结构域和SEQ ID NO：134的轻链可变结构域。
在第四种方法中，筛选抗体噬菌体文库以产生针对人CD38的另外scFv片段。该文库具有基于天然人V基因的多样性。该供体衍生的抗体噬菌体展示文库使用从48位人供体的血液淋巴细胞扩增的cDNA，48位人供体中70％具有自身免疫性疾病(血管炎、***性红斑狼疮、脊椎关节病、类风湿性关节炎和硬皮病)。文库构建遵循Schofield等人(2007,GenomeBiol.,8(11):R254)描述的方案，其中总多样性为2.53×10e10克隆。如下从该供体衍生的噬菌体展示文库中分离识别人和/或猕猴CD38的ScFv片段。在一系列重复选择循环中在重组来源的人和/或猕猴CD38抗原上分离ScFv片段(参见材料和方法部分)。筛选抗体噬菌体展示文库的方法是已知的(Viti F等人，(2000)Methods Enzymol,326:480-505)。简言之，在与文库孵育后，回收与固定化的抗原结合的噬菌体，而洗去未结合的噬菌体，其中所述固定化抗原之前已经包被在塑料免疫管上(以20μg/ml浓度在PBS中过夜)或捕获在链霉亲和素珠上(当使用抗原的生物素标记形式时，在整个选择过程中以50nM的浓度捕获抗原)。如Marks等人(Marks JD等人，(1991)J Mol Biol,222(3):581-97)所述，拯救结合的噬菌体，选择过程重复三次。表达来自第二和第三轮淘选的一千多个克隆，并通过针对人和猕猴CD38抗原的ELISA进行分析。对阳性克隆进行DNA测序，并进一步分析一些独特克隆结合人CD38表达细胞系的能力。使用固定在链霉亲和素珠上的人CD38抗原的生物素标记版本进行第一轮淘选和使用固定在链霉亲和素珠上的猕猴CD38抗原的生物素标记版本进行第二轮淘选之后，基于结合人和猕猴CD38的能力，选择了一个优选的scFv片段(克隆号767)，其具有SEQ ID NO：135的可变重链序列和SEQ ID NO：136的可变轻链。当形成为人IgG1抗体时，克隆767对人CD38的KD为约300nM(图11E)，对猕猴CD38的KD为约1.2μM(数据未显示)(克隆767IgG1抗体在本文中称为人767抗体，其具有重链SEQ ID NO：137和轻链SEQ ID NO：138)。FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)为70.2℃(图11I)。克隆767VH结构域属于VH3结构域亚类。
2.4 OX40
靶向CD3和OX40的双特异性抗体将允许靶向和消耗活化的T淋巴细胞。在这种组合中，表达CD3和OX40分子的活化的T淋巴细胞将参与相互杀伤过程，导致快速的细胞消失。双特异性抗体与人CD3和OX40的共结合可以在短时间内实现对病原性T细胞的有效消除。OX40是受体TNFR-超家族的成员，并且在1987年首次被鉴定为在来自大鼠的活化CD4+T细胞上表达的50kDa糖蛋白(Paterson DJ等人，(1987)Mol.Immunol.24:1281-90)。与CD28不同，OX40不在幼稚T细胞上组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)结合后被诱导。OX40是第二共刺激分子，活化后24至72小时后表达；其配体OX40L也不在静息的抗原呈递细胞上表达，而在其活化后表达。
PCT公开号：WO2013008171中公开的小鼠抗人OX40抗体(分别具有SEQ ID NO：139和140的重链和轻链结构域)可以用作抗人OX40抗原结合位点的来源。PCT公开号：WO2013008171中也公开了基于最适配人源化方法的该抗体的人源化版本(分别具有SEQ IDNO：141和142的重链和轻链结构域)，并且两种抗体均适于重新制备成BEAT形式。
遵循实施例2.1中描述的方法和程序，通过将CDR嫁接至VH3-23和VK1种系框架，工程化构建抗人OX40杂交瘤的人源化VH和VL结构域。根据其在BEAT抗体形式中的用途，使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。只研究了两个人源化VH和VL结构域，其具有不同程度的回复突变。从亲本抗体可变结构域和类似于第一原型抗体的CDR嫁接的VH3和VK1之间的序列比对和在实施例2.1中描述的方法，鉴定回复突变。这些CDR嫁接的可变结构域没有回复突变，在本文中称为最小嫁接(mingraft)。然后进一步修饰这些序列以包括从先前比对鉴定的所有回复突变，并得到本文称为最大嫁接(maxgraft)的修饰的可变结构域序列。得到的序列总结如下：
没有回复突变的人源化和稳定的抗OX40VH；缩写为人源化抗OX40/最小嫁接VH(SEQ ID NO：278)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的抗OX40VH；缩写为人源化抗OX40/最大嫁接VH(SEQ ID NO：279)。
没有回复突变的人源化和稳定的抗OX40VL；缩写为人源化抗OX40/最小嫁接VL(SEQ ID NO：280)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的抗OX40VL；缩写为人源化抗OX40/最大嫁接VL(SEQ ID NO：281)。
2.5 CD20
重定向T细胞以表杀伤达CD20的B细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人淋巴瘤癌症。已经将几种抗人CD20抗体描述为研究试剂或治疗候选物。其中最佳表征的抗人CD20抗体有嵌合的利妥昔单抗抗体及其人源化变体(嵌合利妥昔单抗，商品名PCT公开号：WO1994011026；SEQ ID NO：143的小鼠VH结构域和SEQ ID NO：144的VL结构域)。
遵循实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR嫁接至VH3-23和VK1种系框架上，工程化构建利妥昔单抗嵌合抗体的人源化VH和VL结构域。根据其在BEAT抗体形式中的用途，使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。研究了两个人源化VH和VL结构域，其具有不同程度的回复突变。从亲本抗体可变结构域和类似于第一原型抗体的CDR嫁接的VH3和VK1之间的序列比对和在实施例2.1中描述的方法，鉴定回复突变。这些CDR嫁接的可变结构域没有回复突变，在本文中称为最小嫁接(mingraft)。然后进一步修饰这些序列以包括从先前比对鉴定的所有回复突变，并得到本文称为最大嫁接(maxgraft)的修饰的可变结构域序列。得到的序列总结如下：
没有回复突变的人源化和稳定的利妥昔单抗VH；缩写为人源化利妥昔单抗/最小嫁接VH(SEQ ID NO：282)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的利妥昔单抗VH；缩写为人源化的利妥昔单抗/最大嫁接VH(SEQ ID NO：283)。
没有回复突变的人源化和稳定的利妥昔单抗VL；缩写为人源化的利妥昔单抗/最小嫁接VL(SEQ ID NO：284)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的利妥昔单抗VL；缩写为人源化的利妥昔单抗/最大嫁接VL(SEQ ID NO：285)。
2.6 EGFR
重定向T细胞以杀伤EGFR阳性癌细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人癌症，优选人胰腺癌和人结肠癌。已经将几种抗人EGFR抗体描述为研究试剂或治疗候选物。其中最佳表征的抗人EGFR抗体是嵌合西妥昔单抗(cetuximab)抗体及其人源化变体。(嵌合西妥昔单抗抗体，商品名为C225，IMC-C225；PCT公开号：WO199640210；具有SEQID NO：145的小鼠VH结构域和具有SEQ ID NO：146的小鼠VL结构域)。
遵循实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR嫁接至VH3-23和VK1种系框架，工程化构建嵌合抗体的人源化VH和VL结构域。根据其在BEAT抗体形式中的用途，使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。研究了两个人源化VH和VL结构域，其具有不同程度的回复突变。从亲本抗体可变结构域和类似于第一原型抗体的CDR嫁接的VH3和VK1之间的序列比对和在实施例2.1中描述的方法，鉴定回复突变。这些CDR嫁接的可变结构域没有回复突变，在本文中称为最小嫁接(mingraft)。然后进一步修饰这些序列以包括从先前比对鉴定的所有回复突变，并得到本文称为最大嫁接(maxgraft)的修饰的可变结构域序列。得到的序列总结如下：
没有回复突变的人源化和稳定的爱必妥(Erbitux)VH；缩写为人源化的爱必妥/最小嫁接VH(SEQ ID NO：286)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的爱必妥VH；缩写为人源化的爱必妥/最大嫁接VH(SEQ ID NO：287)。
没有回复突变的人源化和稳定的爱必妥VL；缩写为人源化的爱必妥/最小嫁接VL(SEQ ID NO：288)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的爱必妥VL；缩写为人源化的爱必妥/最大嫁接VL(SEQ ID NO：289)。
另一个良好表征的抗人EGFR抗体是人帕尼单抗(panitumumab)抗体及其人源化变体(人帕尼单抗抗体，商品名PCT公开号：WO2012138997；具有SEQ ID NO：290的小鼠VH结构域和具有SEQ ID NO：291的小鼠VL结构域)。
遵循实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR嫁接至VH3-23和VK1种系框架，工程化构建嵌合抗体的人源化VH和VL结构域。根据其在BEAT抗体形式中的用途，使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。研究两个人源化VH和VL结构域，其具有不同程度的回复突变。从亲本抗体可变结构域和类似于第一原型抗体的CDR嫁接的VH3和VK1之间的序列比对和在实施例2.1中描述的方法，鉴定回复突变。这些CDR嫁接的可变结构域没有回复突变，在本文中称为最小嫁接(mingraft)。然后进一步修饰这些序列以包括从先前比对鉴定的所有回复突变，并得到本文称为最大嫁接(maxgraft)的修饰的可变结构域序列。得到的序列总结如下：
没有回复突变的人源化和稳定的维克替比(Vectibix)VH；缩写为人源化的维克替比/最小嫁接VH(SEQ ID NO：292)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的维克替比VH；缩写为人源化的维克替比/最大嫁接VH(SEQ ID NO：293)。
没有回复突变的人源化和稳定的维克替比VL；缩写为人源化的维克替比/最小嫁接VL(SEQ ID NO：294)。
具有所有可能的回复突变的人源化和稳定的维克替比VL；缩写为人源化的维克替比/最大嫁接VL(SEQ ID NO：295)。
2.7 CD19
重定向T细胞以杀伤表达CD19的B细胞的双特异性抗体可用于治疗不同形式的人血液和骨髓癌。人CD19分子是在人B细胞表面上表达的结构独特的细胞表面受体，所述人B细胞包括但不限于前B细胞、早期发育中的B细胞(即未成熟的B细胞)、终末分化为浆细胞的成熟B细胞和恶性B细胞。CD19由大多数前B急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病、毛细胞性白血病、普通型急性淋巴细胞性白血病和一些无标志性急性淋巴母细胞性白血病表达(Nadler LM等人(1983)JImmunol,131:244-250；Anderson KC等人,(1984)Blood,63:1424-1433；Loken MR等人(1987)Blood,70:1316-1324；Uckun FM等人(1988)Blood,71:13-29；Scheuermann RH&Racila E(1995)Leuk Lymphoma,18:385-397)。CD19在浆细胞上的表达进一步表明其可以在分化的B细胞肿瘤如多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、Waldenstrom's氏肿瘤上表达(GrossbardML等人(1998)Br J Haematol,102:509-15；Treon SP等人(2003)Semin Oncol,30:248-52)。
PCT公开号：WO2010/095031中描述的人源化抗人CD19抗体利用VH3-23和VK1可变结构域框架，并可用于产生如实施例2.1中所述的双特异性抗体。可以使用人源化抗人CD19抗体(其具有SEQ ID NO：296的VH结构域和SEQ ID NO：297的VL结构域)，并且根据其在BEAT抗体形式中的用途，使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除对蛋白A的结合。
2.8 IgE
重定向T细胞以杀伤膜结合性IgE阳性B细胞的双特异性抗体可用于治疗不同的炎性疾病如哮喘或纤维化。已经将几种抗人IgE抗体描述为研究试剂或治疗候选物。其中最佳表征的抗人IgE抗体是奥马珠单抗(Omalizumab)抗体(商品名USPTO公开号：US6,761,889、US6,329,509和US20080003218A1；Presta LG等人，(1993)J lmmunol,151:2623-2632；具有SEQ ID NO：298的人源化VH结构域和具有SEQ ID NO：299的VL结构域)及其变体。
遵循实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR嫁接至VH3-23和VK1种系框架上，工程化构建奥马珠单抗抗体的人源化VH和VL结构域。根据其在BEAT抗体形式中的用途，使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。研究两个稳定的VH和VL结构域，其具有不同程度的回复突变。从亲本抗体可变结构域和类似于第一原型抗体的CDR嫁接的VH3和VK1之间的序列比对和在实施例2.1中描述的方法，鉴定回复突变。这些CDR嫁接的可变结构域没有回复突变，在本文中称为最小嫁接(mingraft)。然后进一步修饰这些序列以包括从先前比对鉴定的所有回复突变，并得到本文称为最大嫁接(maxgraft)的修饰的可变结构域序列。得到的序列总结如下：
没有回复突变的稳定的奥马珠单抗VH；缩写为稳定的奥马珠单抗/最小嫁接VH(SEQ ID NO：300)。
具有所有可能的回复突变的稳定的奥马珠单抗VH；缩写为稳定的奥马珠单抗/最大嫁接VH(SEQ ID NO：301)。
没有回复突变的稳定的奥马珠单抗VL；缩写为稳定的奥马珠单抗/最小嫁接VL(SEQ ID NO：302)。
具有所有可能的回复突变的稳定的奥马珠单抗VL；缩写为稳定的奥马珠单抗/最大嫁接VL(SEQ ID NO：303)。
抗人IgE抗体的另一个实例是小鼠抗体Bsw17(Vogel M等人，(2004)J Mol Biol，341(2)：477-89；具有SEQ ID NO：304的小鼠VH结构域和SEQ ID NO：305的小鼠VL结构域)。
遵循实施例2.1中描述的方法和工作流程，通过CDR嫁接到VH3-23和VK1种系框架上，工程化构建人源化的Bsw17抗体的人源化VH和VL结构域。根据其在BEAT抗体形式中的用途，使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。研究两个稳定的VH和VL结构域，两者区别在于不同程度的回复突变。从亲本抗体可变结构域和类似于第一原型抗体的CDR嫁接的VH3和VK1之间的序列比对和在实施例2.1中描述的方法，鉴定回复突变。这些CDR嫁接的可变结构域没有回复突变，在本文中称为最小嫁接(mingraft)。然后进一步修饰这些序列以包括从先前比对鉴定的所有回复突变，并得到本文称为最大嫁接(maxgraft)的修饰的可变结构域序列。得到的序列总结如下：
没有回复突变的稳定的Bsw17VH；缩写为稳定的Bsw17/最小嫁接VH(SEQ ID NO：306)。
具有所有可能的回复突变的稳定的Bsw17VH；缩写为稳定的Bsw17/最大嫁接VH(SEQ ID NO：307)。
没有回复突变的稳定的Bsw17VL；缩写为稳定的Bsw17/最小嫁接VL(SEQ ID NO：308)。
具有所有可能的回复突变的稳定的Bsw17VL；缩写为稳定的Bsw17/最大嫁接VL(SEQ ID NO：309)。
实施例3：产生T细胞重靶向性异源二聚体免疫球蛋白
3.1技术和内置纯化***
BEAT抗体是基于独特的生物模拟概念的重链异源二聚体，其比“杵臼(knob-into-hole)”技术显示出更优异的异源二聚化(PCT公开号：WO2012131555)。BEAT平台基于天然同源或异源二聚体免疫球蛋白结构域对之间位于3D等同位置的界面氨基酸的交换，以产生新的异源二聚体，其可用作基于Fc的双特异性抗体的构件。该技术允许使用任何类型的抗原结合支架，设计基于Fc的双特异性抗体。本文中使用scFv-FAB形式来设计基于Fc的双特异性抗体，不需要开发共同轻链用于两个抗原结合位点。
由于BEAT抗体是重链异源二聚体，因此需要区分两种不同的重链。其在本文中称为BTA和BTB链。本文所用的BTA和BTB链包含抗原结合位点、人IgG1铰链区、源自人IgG1或IgG3同种型的CH2结构域和源自人IgG1或IgG3同种型的修饰的CH3结构域。一些BTA和BTBCH3结构域与PCT公开号：WO2012131555中描述的结构域相同或是其修饰的变体。BTA和BTBCH3结构域选自：(BTA)SEQ ID NO:147、148、149、153、154和155，和(BTB)SEQ ID NO:150、151、152、156、157和158。优选的BTA-BTB CH3结构域对选自：SEQ ID NO:147与SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:148与SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:149与SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:147与SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:148与SEQ ID NO:152。最优选的BTA-BTB CH3结构域对选自:SEQ ID NO:147与SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:148与SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:154与SEQID NO:150、和SEQ ID NO:154与SEQ ID NO:152。
如上所述，具有与蛋白A不对称结合的BEAT重链异源二聚体，可以使用来自不与蛋白A结合的免疫球蛋白同种型的亲本结构域产生(PCT公开号：WO2012131555)。同源和异源二聚体物之间蛋白A结合位点数量的差异对于通过蛋白A色谱法分离这些分子物类特别有用。为了避免可干扰蛋白A色谱物类分离的残留结合，有必要消除人重链可变结构域的VH3亚类中天然存在的任何次级蛋白A结合位点。当抗原结合位点来自VH3家族时，可以通过G65S或N82aS取代(Kabat编号)实现其蛋白A结合位点的消除。
当使用VH3来源的一个抗原结合位点和来自非VH3来源的一个抗原结合位点来制备本发明的双特异性抗体时，VH3来源的抗原结合位点需要位于在其Fc区结合蛋白A的重链上。或者，可以使用N82aS取代或G65S取代或其等价取代，对VH3来源的抗原结合位点进行取代以消除蛋白A结合。当使用一对VH3来源的抗原结合位点制备本发明的双特异性抗体时，唯一的可能性是通过上述氨基酸取代消除至少一个基于VH3的抗原结合位点中的蛋白A结合。优选地，来自本发明的双特异性抗体被工程化以产生没有蛋白A结合位点的两个同源二聚体之一。更优选地，来自本发明的双特异性抗体被工程化，以产生一个没有蛋白A结合位点的同源二聚体、和另一个在蛋白A结合位点数上与感兴趣的异源二聚体实质上不同的(至少一个蛋白A结合位点，优选两个蛋白A结合位点)的同源二聚体。
对单特异性抗人CD3ε抗体触发的毒性机制已经有广泛的研究；直接机制与抗体的亲和力、表位和效价相关，间接毒性机制也已被描述。间接毒性机制由抗人CD3ε抗体的Fc区介导，其与表达Fc受体的免疫细胞相互作用并导致瞬时T细胞活化和细胞因子释放。为了提高安全性的目的，消除了靶向人CD3ε的BEAT抗体在其下铰链区中对Fc受体的结合。使用L234A和L235A取代消除或减少Fc受体结合(EU编号；Strohl WR等人，(2009)Curr OpinBiotechnol,20(6):685-91)；这些取代通常被称为LALA取代。
包含至少一个消除了蛋白A结合的VH3结构域的BEAT抗体的实例
HER2/CD3靶向BEAT抗体的实例
抗HER2和抗CD3ε臂可形成为由融合至BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链，或由融合至BEAT链的FAB片段组成的重链(与天然抗体相似)。基于FAB的重链需要与其关联轻链缔合以组装成功能性抗原结合位点。
在CH2区引入L234A和L235A取代，并且酌情使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除残留的蛋白A结合。靶向人HER2抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例形成如下：
通过如实施例和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂)，工程化构建了第一BEAT HER2/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：47)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：159)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：159)包含具有N82aS取代(Kabat编号)的可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以VH结构域被突变以包括N82aS取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人HER2臂由BEAT重链(SEQ ID NO：160)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：160)包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3-1抗体(图12A的形式A)。
使用如实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂)，工程化构建了第二BEAT HER2/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人HER2臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：3)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：161)组成，所述BEAT重链(SEQID NO：161)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由BEAT重链(SEQ ID NO：162)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：162)包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括N82aS取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3-2抗体(图12A的形式B)。
使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂)，工程化构建第三BEAT HER2/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：47)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：163)组成，所述BEAT重链(SEQID NO：163)包含具有G65S取代(Kabat编号)的可变重链结构域、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人HER2臂由BEAT重链(SEQ ID NO：164)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：164)包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域。如PCT公开号WO 1994029350中所述，使用在Kabat位置重链44(G44C)和轻链100(Q100C)上在重链和轻链结构域之间的工程化二硫键，进一步稳定双特异性抗体的scFV部分。该双特异性抗体在本文中称为BEATHER2/CD3-3抗体(图12B的形式C)。
使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂)，工程化构建了第四BEAT HER2/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：166)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：165)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：165)包含可变重链结构域、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该组装的重链和轻链包含如PCT公开号WO2008119565中描述的抗人CD3ε抗体(SP34)的人源化版本。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人HER2臂由BEAT重链(SEQ ID NO：167)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：167)包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、基于γ3的BEATCH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括N82aS取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3(SP34)抗体(图12B的形式D)。
使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人HER2臂)，工程化构建了第五BEAT HER2/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：89)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：168)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：168)包含可变重链结构域、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该双特异性抗体的该臂包含实施例2.1中描述的人源化SP34 VH1/VL21抗体的可变结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人HER2臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：167)组成。该臂等同于上述BEAT HER2/CD3(SP34)抗HER2臂(参见图12B的形式D)。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括N82aS取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体(图12C的形式E)。
瞬时表达BEAT HER2/CD3-1、BEAT HER2/CD3-2、BEAT HER2/CD3-3、BEAT HER2/CD3(SP34)和BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体，纯化并体外测试其对HER2和CD3ε抗原的亲和力、其稳定性以及其重定向T细胞杀伤的能力。所有BEAT抗体的瞬时表达产量在5-15mg/l培养物上清液的范围内。重要的是，在单个蛋白A色谱步骤后，所有双特异性抗体在其制备物中显示了非常低水平的同源二聚体污染。
由于所有这些BEAT抗体都设计成具有包含VH3结构域的两个臂，所以仅消除至少一个VH3结构域中的蛋白A结合已使得可以容易地使用优选的差异纯化方法之一纯化感兴趣的异源二聚体(参见图2E)。图13显示了BEAT HER2/CD3-1抗体的差异蛋白A纯化曲线实例。图14显示纯化的异源二聚体的毛细管电泳图谱。从该图谱中仅能够鉴定到微小量的同源二聚体污染。没有发现携带FAB部分的重链同源二聚体形式，因为其不结合蛋白A。携带scFv片段的重链同源二聚体形式以微小比例(2.5％)存在，导致在单个蛋白A色谱步骤后异源二聚体含量为97％。在单个蛋白A色谱步骤后BEAT HER2/CD3-2、BEAT HER2/CD3-3、BEATHER2/CD3(SP34)和BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体被纯化至相似水平的均质性和纯度。BEATHER2/CD3-3抗体在蛋白A色谱后显示出一定比例的二硫键合的异源二聚体聚集体(27％)，其通过阳离子交换色谱法去除。
为了进一步证明在基于VH3的重链异源二聚体中消除蛋白A结合对蛋白A色谱后纯度的影响很大，工程化构建不具有前述的N82aS取代的BEAT HER2/CD3-1抗体。图15A和15B分别显示BEAT HER2/CD3-1及其非N82aS取代版本的洗脱蛋白A色谱级分的SDS-PAGE分析。在pH4时，非N82Sa取代版本的洗脱级分显示出对应于携带FAB臂的重链的同源二聚体的额外条带(图15B)，而N82aS取代的BEAT HER2/CD3版本则没有(图15A)，因为携带FAB臂的重链形式在其Fc区(基于人IgG3同种型的Fc区)不结合蛋白A，只能推断：蛋白A的结合由该同源二聚体物中的基于VH3的可变结构域负责。该结果清楚地表明，在基于VH3的重链异源二聚体中消除蛋白A结合的效用。
BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体对人HER2和人CD3ε抗原具有相似的KD值。对于人HER2抗原，KD值在0.50-2nM的范围内；对于人CD3ε抗原，KD值在1-2μM的范围(使用人CD3γ-ε-Fc构建体通过SPR测量(参见材料和方法部分；图16A和16B)。两种双特异性抗体的DSC谱是相似的，在两种情况下，结合人HER2或人CD3ε的scFv部分保持了其良好的热稳定谱，Tm在68℃范围内。两种抗体中的FAB部分具有82-83℃范围内的Tm(图16C)。
使用人源化的赫赛汀VH和VL序列的靶向人HER2抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个例子按如下形成：使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人HER2抗原结合位点)，工程化BEAT HER2/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人HER2臂由与其关联轻链(SEQ ID NO:3)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：310)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：310)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包含G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT HER2/CD3(SP34-κ2)抗体。
体外T细胞杀伤测定法
BEAT HER2/CD3抗体的作用机制是基于：通过桥接细胞毒性T细胞表面上的CD3抗原和靶细胞上表达的HER2抗原，使细胞毒性T细胞杀伤靶向靶细胞。
使用基于流式细胞术的方法(本文称为RDL-FACS方法)或基于比色的方法(本文称为RDL-MTS方法)，测量BEAT HER2/CD3-1和BEAT HER2/CD3-2抗体重定向T细胞杀伤的效力。
高表达HER2的细胞系JIMT-1(一种(曲妥珠单抗)抗性乳腺癌细胞系)、高表达HER2的细胞系BT-474(一种(曲妥珠单抗)敏感性乳腺癌细胞系)和低表达HER2的乳腺癌细胞系MDA-MB-231分别在人PBMC和系列稀释的BEAT HER2/CD3-1或-2抗体或对照抗体的存在下培养48小时。
在这些测定中，来自血液供体的人PBMC被用作细胞毒性T淋巴细胞的来源。在所有测定中使用10：1的效应物对靶细胞比例。以没有抗体处理的样品形式(仅靶细胞和人PBMC)提供阴性对照。在孵育期后使用RDL-FACS或RDL-MTS方法测定细胞毒性(参见材料和方法部分)。结果表明，对照抗体不触发特异性T细胞介导的细胞毒性。相反，BEAT HER2/CD3-1和-2抗体诱导了非常有效的剂量依赖性的肿瘤靶细胞死亡。最大杀伤接近100％。两种读取方法给出了接近的结果。在两种方法之间，供体与供体的差异性解释了EC50的约十倍差异。测量的EC50与靶细胞系的HER2抗原表达水平相关。
BT-474细胞表达最多的HER2抗原，BEAT HER2/CD3-1和-2抗体的EC50在亚皮摩尔至皮摩尔范围内(分别为0.6和2pM，图17A)。JIMT-1细胞在其细胞表面上具有掩藏的HER2抗原(Nagy P等人(2005),Cancer Res,65(2):473-482)，因此尽管具有高的HER2表达，但是表现出低的结合。令人吃惊的是，如通过RDL-MTS方法测量的，BEAT HER2/CD3-1和-2抗体针对JIMT-1细胞均具有皮摩尔范围的EC50(分别为21和16pM，图17B)。当用RDL-FACS方法测量时，BEAT HER2/CD3-1抗体的EC50为1.4pM。低表达HER2的乳腺癌细胞系MDA-MB-231比前两种细胞系敏感性低，两种抗体均显示亚纳摩尔的EC50(两者的值均接近0.2nM；图17C)。当用RDL-FACS方法测量时，BEAT HER2/CD3-1抗体的EC50为0.08nM。总之，这些结果表明，BEAT HER2/CD3-1和-2抗体在重定向T细胞杀伤各种表达HER2的乳腺癌细胞系方面是高度有效的。
BEAT HER2/CD3(SP34)抗体包含PCT公开号：WO2008119565中描述的抗人CD3ε抗体(SP34)的人源化版本。在体外研究了该BEAT抗体形式将T细胞杀伤重定向到HER2+细胞的能力。两种不同的HER2+细胞系用于杀伤测定，高表达HER2的细胞系(NCI-N87)和低表达HER2的细胞系(HT-1080)(参见材料和方法部分)。图17D-E分别显示BEAT HER2/CD3(SP34)抗体引起的对NCI-N87和HT-1080细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用10:1的效应细胞与靶细胞比例，以及48小时孵育期后RDL-MTS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，当分别靶向NCI-N87和HT-1080细胞时，BEAT HER2/CD3(SP34)抗体在重定向T细胞杀伤HER2+细胞系方面高度有效，其中EC50为0.35和29pM。
BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体包含实施例2.1中描述的抗人CD3ε抗体(SP34-κ1)VH1/VL21的人源化版本。在体外研究了该BEAT抗体形式将T细胞杀伤重定向到HER2+细胞的能力。两种不同的HER2+细胞系用于杀伤测定，高表达HER2的细胞系(NCI-N87)和低表达HER2的细胞系(HT-1080)(参见材料和方法部分)。图17F-G分别显示BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体引起的对NCI-N87和HT-1080细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用10比1的效应细胞与靶细胞比例，以及48小时孵育期后的RDL-MTS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT HER2/CD3(SP34-κ1)抗体在重定向T细胞杀伤HER2+细胞系方面高度有效，其中靶向NCI-N87和HT-1080细胞时EC50分别为0.46和338pM。
体内功效研究
JIMT-1异种移植
使用JIMT-1/PBMC异种移植模型研究BEAT HER2/CD3-1抗体的体内功效。使用来自血液供体的人PBMC作为细胞毒性T淋巴细胞的来源。抗性乳腺癌JIMT-1细胞以1：1的比例与未刺激的人PBMC(四个不同供体)混合，随后皮下注射至免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中。植入后，在两周期间每周三次用BEAT HER2/CD3-1抗体静脉内处理动物。抗体处理于植入后3小时开始，并在此后第2、4、7、9和11天继续进行。
为了评估没有PBMC的肿瘤生长，五组中的一组皮下接种不含有人PBMC的5×10e6个JIMT-1细胞，而剩余组皮下注射5×10e6个JIMT-1细胞与来自健康供体的5×10e6个未刺激的人PBMC的混合物。
在不存在抗体的情况下，人PBMC对肿瘤生长不显示负面影响(图18A)。在人效应细胞存在下，用BEAT HER2/CD3-1抗体进行处理，在大多数动物中诱导了完全的肿瘤生长抑制(18/20肿瘤，图18B-C)。处理最后一天后18天，只有11％的肿瘤(2/18)再次开始生长。这些数据非常清楚地显示了BEAT HER2/CD3-1抗体的强抗肿瘤功效。
靶向CD38/CD3的BEAT抗体的实例
抗CD38和抗CD3ε臂可以形成为由融合至BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链，或由融合至BEAT链的FAB片段组成的重链(与天然抗体相似)。基于FAB的重链需要与其关联轻链缔合以组装成功能性抗原结合位点。
在CH2区引入L234A和L235A取代，并且酌情地使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除残留的蛋白A结合。靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
使用人源化HB7最适配VH和VL序列，按如下形成靶向人CD38抗原和人CD3ε的第一BEAT抗体实例：使用实施例2.1和2.3中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建了BEAT CD38/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联的轻链(SEQ ID NO:119)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：169)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：169)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：162)组成。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括N82aS取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该臂等同于上述BEAT HER2/CD3-2的抗CD3ε臂(参见图12A的形式B)。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体(图19的形式A)。
瞬时表达BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体，纯化并在体外测试其对CD38和CD3ε抗原的亲和力、其稳定性及其重定向T细胞杀伤的能力。对人CD38抗原，KD值为3.2nM(通过SPR测量；图20A)。该双特异性抗体的DSC谱显示了良好的热稳定谱，scFv部分的Tm约68℃。FAB部分具有约91℃的Tm(图20B)。
在类似实施例3.2.1所述的测定法中使用表达CD38的细胞系(参见材料和方法部分)来评估重定向的T细胞杀伤。图21显示了使用BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体对RPMI8226骨髓瘤细胞的T细胞重定向杀伤。注意，该测定法使用纯化的T细胞作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1。当用RDL-FACS方法测量时，BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体具有2.2pM的EC50(2个供体的平均值，孵育48小时)。
使用人克隆767VH和VL序列的、靶向人CD38抗原和人CD3ε的第二BEAT抗体实例如下形成：使用实施例2.1和2.3中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建BEAT CD38/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联的轻链(SEQ ID NO:138)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：170)组成，所述BEAT重链(SEQID NO：170)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：171)组成。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-767/CD3抗体(图19的形式B)。
瞬时表达BEAT CD38-767/CD3抗体，纯化并在体外测试其对CD38和CD3ε抗原的亲和力、其稳定性及其重定向T细胞杀伤的能力。在类似实施例3.2.1所述的测定法中使用表达CD38的细胞系(参见材料和方法部分)来评估重定向的T细胞杀伤。图22显示了使用BEATCD38-767/CD3抗体对Daudi细胞的T细胞重定向杀伤。注意测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1。当用RDL-FACS方法测量时，BEAT CD38-767/CD3抗体具有244pM的EC50(3个供体的平均值，孵育24小时)。
使用人源化的9G7最佳框架VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.3中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38抗原结合位点)，工程化构建BEAT CD38/CD3抗体。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联的轻链(SEQ ID NO:132)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：312或404)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：312或404)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEATCD38-9G7最佳框架/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人克隆767VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.3中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38抗原结合位点)，工程化构建BEAT CD38/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联的轻链(SEQ ID NO:138)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：313)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：313)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-767/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向OX40/CD3的BEAT抗体的实例
抗OX40和抗CD3ε臂可以形成为由融合至BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链，或由融合至BEAT链的FAB片段组成的重链(与天然抗体相似)。基于FAB的重链需要与其关联轻链缔合以组装成功能性抗原结合位点。
在CH2区引入L234A和L235A取代，并且酌情地使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除其中残留的蛋白A结合。靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
使用实施例2.1和2.4中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人OX40臂)，工程化构建BEAT OX40/CD3抗体实例。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人OX40臂使用PCT公开号WO2013008171公开的人源化抗人OX40抗体的可变结构域(可变重链和轻链结构域分别具有SEQ ID NO：141和142)，并且由与其关联轻链(SEQ ID NO：173)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：172)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：172)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：162)组成。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括N82aS取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。该臂等同于上述BEAT HER2/CD3-2的抗CD3ε臂(参见图12A的形式B)。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40/CD3抗体(图23)。
在体外研究了BEAT OX40/CD3抗体将T细胞杀伤重定向到OX40+细胞的能力。将稳定的重组CHO[OX40]细胞系用于杀伤测定。图24显示BEAT OX40/CD3抗体引起的对稳定的重组CHO[OX40]细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用人PBMC作为效应细胞(其中效应细胞与靶细胞的比例为20比1)，以及48小时孵育期后的RDL-MTS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT OX40/CD3抗体在重定向T细胞杀伤稳定的重组CHO[OX40]细胞方面是高度有效的，其中EC50为0.5nM(3个供体的平均值)。
使用人源化抗OX40/最大嫁接VH和VL序列的靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.4中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人OX40抗原结合位点)，工程化构建BEAT OX40/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人OX40臂由与其关联轻链(SEQ ID NO:315)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：314)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：314)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40最大嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化抗OX40/最小嫁接VH和VL序列的靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.4中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人OX40抗原结合位点)，工程化构建BEAT OX40/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人OX40臂由与其关联轻链(SEQ ID NO:317)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：316)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：316)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1 CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40最小嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向CD20/CD3的BEAT抗体实例
使用小鼠利妥昔单抗抗体VH和VL序列的靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
使用实施例2.1和2.5中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD20臂)，工程化构建BEAT CD20/CD3。
使用人源化的利妥昔单抗/最大嫁接VH和VL序列的靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：使用实施例2.1和2.5中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD20抗原结合位点)，工程化构建BEAT CD20/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD20臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：319)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：318)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：318)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。此双特异性抗体在本文中称为BEAT CD20最大嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化利妥昔单抗/最小嫁接VH和VL序列的靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.5中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD20抗原结合位点)，工程化构建BEAT CD20/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD20臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：321)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：320)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：320)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。这种双特异性抗体在本文中称为BEAT CD20最小嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向EGFR/CD3的BEAT抗体的实例
抗EGFR和抗CD3ε臂可以形成由融合至BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链、或由融合至BEAT链的FAB片段组成的重链(与天然抗体相似)。基于FAB的重链需要与其关联的轻链缔合以组装成功能性抗原结合位点。
在CH2区引入L234A和L235A取代，并且酌情地使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除残留的蛋白A结合。靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
靶向人EGFR和人CD3ε抗原的BEAT抗体的实例如下形成：使用实施例2.1和2.6中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR臂)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：175)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：174)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：174)基于小鼠爱必妥抗体可变结构域(小鼠可变重链和轻链结构域分别具有SEQ ID NO:145和146)，包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：171)组成。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。该臂等同于上述BEAT CD38-767/CD3的抗CD3ε臂(参见图19的形式B)。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFR/CD3抗体(图25)。
瞬时表达BEAT EGFR/CD3抗体、纯化并在体外测试其重定向T细胞杀伤人EGFR+细胞系的能力。HT-29细胞系用于杀伤测定中。图26显示BEAT EGFR/CD3抗体引起的对HT-29细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1，以及使用48小时孵育期后的RDL-MTS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT EGFR/CD3抗体在重定向T细胞杀伤HT-29细胞方面具有很高的效力，其中EC50为70.6pM(4个供体的平均值)。
使用人源化的爱必妥/最大嫁接VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：
使用实施例2.1和2.6中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：323)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：322)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：322)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。这种双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRcetux-最大嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化的爱必妥/最小嫁接VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：
使用实施例2.1和2.6中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：325)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：324)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：324)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε部分由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。这种双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRcetux-最小嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化的维克替比/最大嫁接VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.6中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：327)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：326)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：326)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRpani-最大嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人源化的维克替比/最小嫁接VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.6中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人EGFR臂由其关联轻链(SEQ ID NO：329)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：328)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：328)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内任何其他蛋白A结合位点。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT EGFRpani-最小嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
CD19/CD3 BEAT抗体的实例
抗CD19和抗CD3重链可形成为由融合至第一BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链，或由融合至第一BEAT链的FAB片段组成的重链(与天然抗体相似)。基于FAB的重链需要与其关联轻链结合以组装成功能性抗原结合位点。在CH2区引入L234A和L235A取代，并且酌情使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除残留的蛋白A结合。使用WO2010095031中描述的抗CD19VH和VL序列的靶向人CD19抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例形成如下：
使用实施例2.1和2.7中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD19抗原结合位点)，工程化构建BEAT CD19/CD3的实例。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD19臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：331)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：330)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：330)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD19/CD3(SP34-κ2)抗体。
在PCT公开号：WO2010/095031中描述的表达CD19的细胞系在类似于实施例3.2.1中所述的测定法中用于评估重定向的T细胞杀伤。
IgE/CD3 BEAT抗体的实例
抗IgE和抗CD3重链可形成为由融合至第一BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链，或由融合至第一BEAT链的FAB片段组成的重链(与天然抗体相似)。基于FAB的重链需要与其关联轻链结合以组装成功能性抗原结合位点。在CH2区引入L234A和L235A取代，并且酌情地使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除残留的蛋白A结合。
使用实施例2.1和2.8中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人IgE抗原结合位点)，工程化构建BEAT IgE/CD3抗体。
在PCT公开号：WO2010/033736中描述了在其细胞表面上表达IgE的细胞系，并且可将其用于在类似于实施例3.2.1中描述的测定法中评估重定向的T细胞杀伤。
使用稳定化的奥马珠单抗/最大嫁接VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：333)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：332)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：332)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgEomali-最大嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用稳定化的奥马珠单抗/最小嫁接VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：335)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：334)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：334)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgEomali-最小嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用稳定化的Bsw17/最大嫁接VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：337)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：336)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：336)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgEbsw17-最大嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用稳定化的Bsw17/最小嫁接VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：339)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：338)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：338)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3 Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而去除重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT IgE bsw17-最小嫁接/CD3(SP34-κ2)抗体。
仅包含一个VH3结构域的BEAT抗体的实例
靶向CD38/CD3的BEAT抗体的实例
使用人源化的HB7/最适配VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：使用实施例2.1和2.3中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建BEAT CD38/CD3。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：119)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：176)组成，所述BEAT重链(SEQ IDNO：176)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以该重链不与蛋白A结合。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：177)组成。该重链和轻链组装物包含如PCT公开号WO2008119565中描述的抗人CD3ε抗体(SP34)的人源化版本。该BEAT抗体形式在本文中称为BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体(图27的形式A)。
在体外研究了BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体重定向T细胞杀伤CD38+细胞的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定中。图28显示了BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体引起的对Daudi细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1，以及使用24小时孵育期后的RDL-FACS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体在重定向T细胞杀伤Daudi CD38+细胞系方面具有高度的功效，其中EC50为1.8pM(3个供体的平均值)。
使用人源化的9G7最适配VH和VL序列(分别为SEQ ID NO:129和130)的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的第二个实例如下形成：使用实施例2.1和2.3中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建BEAT CD38/CD3。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：128)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：178)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：178)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以其不与蛋白A结合。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ IDNO：179)组成。该双特异性抗体的臂包含实施例2.1中描述的人源化的SP34VH5/VL32抗体的可变结构域。该BEAT抗体形式在本文中称为BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体(图27的形式B)。CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体具有针对人CD3 1-26_Fc融合蛋白的18nMKD值(图29)。
在体外研究了BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体重定向T细胞杀伤CD38+细胞的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定中。图30显示了BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体引起的对Daudi细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1，以及使用24小时孵育期后的RDL-FACS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体在重定向T细胞杀伤Daudi CD38+细胞系方面具有高度的功效，其中EC50为2pM(3个供体的平均值)。
靶向OX40/CD3的BEAT抗体的实例
使用人源化抗-OX40抗体VH和VL序列(PCT公开号：WO2013008171)的靶向人OX40抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
使用实施例2.1和2.4中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人OX40抗原结合位点)，工程化构建BEAT OX40/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人OX40臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：173)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：340)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：340)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3 CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以其不与蛋白A结合。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT OX40/CD3(SP34-κ2)抗体)。
上述表达人OX40的细胞系用于在类似于实施例3.2.4中描述的测定法中评估重定向的T细胞杀伤。
靶向CD20/CD3的BEAT抗体的实例
使用小鼠利妥昔单抗抗体VH和VL序列的靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
使用实施例2.1和2.5中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD20臂)，工程化构建BEAT CD20/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD20臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：181)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：180)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：180)基于小鼠利妥昔单抗抗体可变结构域(小鼠可变重链和轻链结构域分别具有SEQ ID NO：143和144)，包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEATCH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，该重链不与蛋白A结合。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：177)组成。该臂等同于上述BEAT CD38-HB7最适配/CD3的抗CD3ε臂(参见图27的形式A)。该scFv片段包含如PCT公开号：WO2008119565中描述的抗人CD3εSP34抗体的人源化版本(VH和VL结构域分别具有SEQ ID NO：182和183)。该BEAT抗体形式在本文称为BEAT CD20/CD3(SP34)抗体(图31)。
瞬时表达BEAT CD20/CD3(SP34)抗体、纯化、并在体外测试其重定向T细胞杀伤人CD20+细胞系的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定中。图32显示了BEAT CD20/CD3(SP34)抗体引起的对Daudi细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1，以及使用24小时孵育期后的RDL-FACS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT CD20/CD3(SP34)抗体在重定向T细胞杀伤Daudi细胞方面具有高效力，其中EC50为25pM(3个供体的平均值)。
使用嵌合利妥昔单抗抗体VH和VL序列的靶向人CD20抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：
使用实施例2.1和2.5中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD20抗原结合位点)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD20臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：181)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：341)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：341)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，该重链不与蛋白A结合。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文称为BEAT CD20/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向EGFR/CD3的BEAT抗体的实例
使用小鼠爱必妥抗体VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：使用实施例2.1和2.6中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：175)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：342)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：342)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，该重链不与蛋白A结合。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文称为EGFRcetux/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人维克替比抗体VH和VL序列的靶向人EGFR抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.6中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人EGFR抗原结合位点)，工程化构建BEAT EGFR/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人EGFR臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：344)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：343)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：343)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，该重链不与蛋白A结合。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文称为BEAT EGFRpani/CD3(SP34-κ2)抗体。
靶向IgE/CD3的BEAT抗体的实例
使用人源化奥马珠单抗抗体VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：使用实施例2.1和2.8中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人IgE抗原结合位点)，工程化构建BEAT IgE/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：346)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：345)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：345)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，该重链不与蛋白A结合。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文称为BEAT IgEomali/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用小鼠Bsw17抗体VH和VL序列的靶向人IgE抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.8中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人IgE抗原结合位点)，工程化构建BEAT IgE/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人IgE臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：348)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：347)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：347)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3 Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，该重链不与蛋白A结合。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：311)组成。该双特异性抗体在本文称为BEAT IgEbsw17/CD3(SP34-κ2)抗体。
所述表达膜IgE的细胞系用于类似于以上描述的测定法中评估重定向的T细胞杀伤。
scFv形式中改进的SP34的功能性等同物
-双特异性CD38xCD3抗体
为了确定为改善表达而对各种SP34 scFv进行的修饰是否也影响其功能性质，即与CD3的结合，在CD38xCD3双特异性背景中测试了这些修饰。作为FAB存在的CD38结合臂包含由SEQ ID NO：133编码的重链可变区和由SEQ ID NO：134编码的轻链可变区。CD3结合臂包含重新格式化scFv的原始小鼠SP34(SEQ ID NO：403)、或修饰的人源化SP34 scFv(包含重链/轻链组合H1/L21(SEQ ID NO：361)、H5/L32(SEQ ID NO：311)、H5/L65(SEQ ID NO：394)和H5/L67(SEQ ID NO：396))。
瞬时表达和纯化使用不同SP34版本的每种CD3/CD38 BEAT。在体外测试这些CD3/CD38 BEAT，以比较其重定向T细胞杀伤的能力。Raji CD38表达细胞系(参见材料和方法部分)用于评估重定向的T细胞杀伤。该测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10:1。
当用RDL-FACS方法测量时，所有BEAT显示6至10pM的相当EC50(2个供体的平均值，孵育24小时)图37。
-双特异性CD20xCD3抗体
还测试了，包含H5/L65重链/轻链组合(SEQ ID NO：394)的SP34 scFv，当与CD20FAB结合臂(利妥昔单抗，VH和VL结构域分别具有SEQ ID NO：282和283)联合时，的性质。
瞬时表达和纯化CD3/CD20 BEAT，然后在体外测试以比较其重定向T细胞杀伤的能力。Raji CD20表达细胞系(参见材料和方法部分)用于评估重定向的T细胞杀伤。该测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为5:1，孵育24小时。
当使用RDL-FACS方法测量时，所有BEAT显示与包含H1/L21(SEQ ID NO：361)的CD3xCD20 BEAT(见上文)相当的EC50，37.56pM(4个供体的平均值，24小时孵育)，图38。
-双特异性EGFRxCD3抗体
ο爱必妥/CD3
携带KRAS突变的患者表现出不能得益于单克隆抗体西妥昔单抗(商品名：爱必妥)治疗(Karapetis C等人，N Engl J Med 359：1757(2008)。
为了进一步评估改进的SP34 scFv的性质，并且为了确立杀伤EGFR高表达细胞系和克服KRAS抗性的可能性，构建了双特异***必妥(重链SEQ ID NO：174和轻链SEQ ID NO：175)-hSP34(SEQ ID NO：394)BEAT，并在KRAS突变的癌细胞系A549(肺)和HCT116(结肠直肠癌)上进行体外重定向的T细胞裂解测定。此外，为了证明爱必妥-hSP34仅杀伤显示高和中等EGFR表达水平的细胞而非低表达EGFR的细胞，也将低表达EGFR的细胞系MCF-7包括在测定中。使用EGFR PharmDx免疫组化试剂盒(表2)，测定了这些细胞系的EGFR状态。
表2
将IvIg以2.5mg/mL加入每孔以阻断爱必妥效应子功能，以更好地模拟爱必妥的作用模式(抑制EGFR信号传导)。如图39所示，爱必妥对任何细胞系均无作用(不可能评估任何EC50)。
相反，如图40所示，爱必妥/hSP34BEAT可以有效地杀伤KRAS突变的A549和HCT116肿瘤细胞，其中EC50分别为66.97pM和43.3pM，而较低表达EGFR的MCF-7细胞未被有效杀伤。
ο维克替比(Vectibix)
为了进一步评估改进的SP34 scFv的性质，以及为了进一步确定可以用双特异性维克替比(VL SEQ ID NO：291和VH SEQ ID NO：290)以FAB-hSP34 BEAT(SEQ ID NO：394)形式杀伤EGFR高表达细胞系并克服KRAS抗性机制。以ScFv形式，在高EGFR表达的肺癌细胞系HCC827以及在KRAS突变的肺癌细胞系A549和结肠直肠癌KRAS阳性细胞系HCT116和SW480上，进行了体外重定向的T细胞裂解测定。
为了证明维克替比/hSP34BEAT仅杀伤显示高和中等EGFR表达水平的细胞而不杀伤低EGFR表达的细胞，也将低表达EGFR的细胞系MCF-7包括在杀伤测定中。使用EGFRPharmDx免疫组织化学试剂盒(Dako，Cambridge，UK)测定了细胞系的EGFR状态(图41)。
如图42所示，维克替比对所评估的任何细胞系均没有作用(2个供体的平均值，效应物：靶细胞的比例为20:1)。读取：48小时后用MTS)。
对于维克替比/hSP34BEAT，使用10：1的效应物:靶细胞比例，数据为4个供体的平均值呈现。
如图43所示，维克替比/hSP34BEAT可以有效地杀伤高表达EGFR的细胞系HCC827和KRAS突变的A549、HCT116和SW480肿瘤细胞，其中EC50分别为0.1557、0.6127、0.3406和6.986pM，而较低EGFR表达的MCF-7细胞没有被有效地杀伤(EC50＝627.4pM)。
表3
在表3中，测定了4个供体的平均EC 50，并计算了治疗窗口(EC50(X)/EC50(HCC827)维克替比-CD3)。

Claims (10)

1.一种结合人CD3的表位结合蛋白或其片段，其至少包含选自SEQ ID NO：101、SEQ IDNO：102、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104的重链可变结构域和选自SEQ ID NO：105、SEQ IDNO：106、SEQ ID NO：401和SEQ ID NO：402的轻链可变结构域。
2.根据权利要求1所述的表位结合蛋白或其片段，其包含选自SEQ ID NO：101和SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：401、SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：402的重链可变结构域和轻链可变结构域对。
3.根据权利要求1所述的表位结合蛋白或其片段，其包含选自SEQ ID NO：359和SEQ IDNO：399、SEQ ID NO：359和SEQ ID NO：400的重链和轻链对。
4.根据权利要求1、2或3所述的表位结合蛋白或其片段，其中所述抗原结合蛋白或片段是异源二聚体免疫球蛋白或其片段。
5.根据权利要求4所述的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中所述异源二聚体免疫球蛋白或片段与第二表位结合。
6.根据权利要求4或5所述的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一多肽的表位结合区是FAB，第二多肽的表位结合区是scFv，或者其中第一多肽的表位结合区是scFv，第二多肽的表位结合区是FAB。
7.根据权利要求6所述的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中scFv与人CD3结合并且包含选自SEQ ID NO：361、SEQ ID NO：311、SEQ ID NO：394和SEQ ID NO：396的序列。
8.根据权利要求6或7所述的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv-Fc形式的SP34嵌合体相比，所述scFv在表达方面具有至少两倍的提高。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中，所述scFv在包含FAB臂的双特异性抗体中表达时，与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体在包含FAB臂的双特异性抗体中表达时相比，具有至少两倍的表达改善。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的表位结合蛋白或其片段或异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中所述表位结合蛋白或其片段或异源二聚体免疫球蛋白或其片段，与包含SEQ ID NO：60和61编码的重链和轻链可变区的表位结合蛋白或其片段或异源二聚体免疫球蛋白或其片段相比，具有更大的热稳定性。
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