CN113046341A - 一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法 - Google Patents

一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法，属于微生物发酵技术领域。为扩大现有碱性果胶酶来源，提高烟草废弃物利用率，降低烟草废弃物的处理成本，减少耗能，本发明提供了一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法，将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS‑MEI‑2‑33(菌种保藏编号为CGMCC NO.14826)菌液接入到含有烟草废弃物的固态发酵培养上，静置培养，然后提取获得碱性果胶酶。本发明提高烟草废弃物的利用率，增加烟草废弃物资源的多元化利用，降低了烟草废弃物的处理成本，降低了耗能，而且扩大了碱性果胶酶的来源。

Description

一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶 的方法
技术领域
本发明涉及一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
烟草种植中，除收获烟叶外，也会产生大量烟梗、烟杆等废弃物，常常丢弃在田间或储存霉烂，不仅是资源浪费，且烟草废弃物中含有的烟碱对环境也是一种破坏。
果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，广泛存在于微生物中，如细菌、真菌和放线菌，其中细菌来源的果胶酶一般为碱性果胶酶。细菌繁殖较快，产酶量高，且碱性果胶酶因其在茶叶、咖啡发酵、榨油、造纸及纺织行业的广泛应用，是非常重要的工业酶制剂。
烟梗等烟草废弃物中果胶含量较高，利用细菌液体发酵烟草废弃物生产果胶酶及真菌固态发酵产果胶酶已被实验证实，但细菌固态发酵烟梗等烟草废弃物能降低物料处理成本，减少耗能，目前利用细菌固态发酵烟草废弃物生产果胶酶还未见报道。
发明内容
为扩大现有碱性果胶酶来源，提高烟草废弃物利用率，降低烟草废弃物的处理成本，减少耗能，本发明提供了一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法，将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌液接入到含有烟草废弃物的固态发酵培养上，静置培养，然后提取获得碱性果胶酶；所述特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33，菌种保藏编号为CGMCC NO.14826。
进一步地限定，所述烟草废弃物为烟梗。
进一步地限定，所述烟草废弃物为直径1-2cm烟梗颗粒。
进一步地限定，所述烟草废弃物为直径1-5mm烟梗颗粒。
进一步地限定，所述含有烟草废弃物的固态发酵培养基由如下重量份的原料组成：烟草废弃物颗粒4.5-5.5份，蛋白胨3.5-4.5份，磷酸二氢钾0.013-0.017份，硫酸铵0.15份和蒸馏水13-17份，pH 7.0-7.5。
进一步地限定，所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌液的制备方法如下：将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至LB液体培养基中，在35-37℃，160-200rpm条件下过夜培养8-12h，获得一级种子液；将一级种子液按照体积比1:50-1:100的体积比例接种至LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养8-12h，获得二级种子液。
进一步地限定，所述静置培养是指将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌液喷洒于已灭菌处理的含烟草废弃物的固态发酵培养基中，按照每克干物质喷洒1.0×109-2.0×109个芽孢杆菌，使培养基中的相对湿度达70-80％，将接种后的培养基置于35-37℃隔水式培养箱中静置培养，发酵4-5d，所述干物质为烟草废弃物颗粒。
进一步地限定，碱性果胶酶的提取方法如下：以烟草废弃物质量计，向发酵结束后的培养基中加入pH 10.0-10.2，50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液6-10mL/g，或无菌蒸馏水6-10mL/g中，浸提15-30min，获得果胶酶粗酶液。
进一步地限定，所述浸提为37℃摇床中振荡浸提30min，将浸提液以8000rpm/min离心30min，获得上清液为果胶酶粗酶液。
进一步地限定，所述烟草废弃物的装瓶规格为4.5-5.5g烟草废弃物/150mL三角瓶。
本发明的有益效果
本发明提供了一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法。该方法可利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物，生产碱性果胶酶，在一定程度上，提高烟草废弃物的利用率，增加烟草废弃物资源的多元化利用，降低了烟草废弃物的处理成本，降低了耗能，而且扩大了碱性果胶酶的来源。
附图说明
图1：烟草废弃物处理颗粒图样；A为直径1-5mm的烟草废弃物颗粒；B为直径1-2cm的烟草废弃物颗粒；
图2：特基拉芽孢杆菌固态发酵产果胶酶酶活力结果；其中：1：1-5mm烟草废弃物颗粒静置培养，以水浸提后的粗酶液酶活；2：1-5mm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，以水浸提后的粗酶液酶活；3：1-5mm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液浸提获得粗酶液；4：1-2cm烟草废弃物颗粒静置培养，以水浸提后的粗酶液酶活；5：1-2cm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，以水浸提后的粗酶液酶活；6：1-2cm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液浸提获得粗酶液。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应该视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
本发明所用的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CSA-MEI-2-33，于2017年10月17日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO.14826。
实施例1：特基拉芽孢杆菌发酵菌液制备。
将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至3ml LB液体培养基中，在35-37℃，160-200rpm条件下过夜培养8-12h，获得一级种子液，将一级种子液按照体积比1:50-1:100的体积比例接种至50ml LB液体培养基中，在35℃-37℃、150rpm-180rpm的条件下培养获得二级种子液。
实施例2：特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物的方法。
第一组(实验组)：直径为1-5mm烟草废弃物颗粒的静置发酵。
(1)固体发酵培养基的制备
将40℃烘至干燥的烟草废弃物放置于高速粉碎机中，进行瞬间粉碎，大约运行30s获得直径为1-5mm的烟草废弃物颗粒，按照烟草废弃物颗粒5.0g，蛋白胨4.0g，磷酸二氢钾15mg，硫酸铵0.15g，蒸馏水15mL，pH 7.0的比例进行培养基准备，在115℃下高压蒸汽灭菌30min，获得发酵固态发酵培养基。
(2)接种后培养基的静置培养
将实施例1中培养获得的二级种子液按照每克干物质喷洒1.0×109个芽孢杆菌接种至固态发酵培养基中(所述干物质为烟草废弃物颗粒)，使培养基中的相对湿度达70％，在37℃隔水式培养箱中静置发酵4d，间隔12h摇动一次，获得发酵后烟草废弃物。
第二组(对照组)：直径为1-5mm烟草废弃物颗粒的振荡发酵。
(1)固体发酵培养基的制备
将40℃烘至干燥的烟草废弃物防置于高速粉碎机中，进行瞬间粉碎，大约运行30s获得直径为1-5mm的烟草废弃物颗粒，按照烟草废弃物颗粒5.0g，蛋白胨4.0g，磷酸二氢钾15mg，硫酸铵0.15g，蒸馏水15mL，pH 7.0的比例进行培养基准备，在115℃下高压蒸汽灭菌30min，获得发酵固态发酵培养基。
(2)接种后培养基的振荡培养
将实施例1中培养获得的二级种子液按照每克干物质喷洒1.0×109个芽孢杆菌接种至固态发酵培养基中(所述干物质为烟草废弃物颗粒)，使培养基中的相对湿度达70％，在37℃，180rpm/min水平摇床中振荡发酵4d，获得发酵后烟草废弃物。
第三组(实验组)：直径为1-2cm烟草废弃物的静置发酵。
(1)固体发酵培养基的制备
将40℃烘至干燥的烟草废弃物防置于高速粉碎机中，进行瞬间粉碎，大约运行30s获得直径为1-2cm的烟草废弃物颗粒，按照烟草废弃物颗粒5.0g，蛋白胨4.0g，磷酸二氢钾15mg，硫酸铵0.15g，蒸馏水15mL，pH 7.0的比例进行培养基准备，在115℃下高压蒸汽灭菌30min，获得固态发酵培养基。
(2)接种后培养基的静置培养
将实施例1中培养获得的二级种子液按照每克干物质喷洒2.0×109个芽孢杆菌接种至固态发酵培养基中(所述干物质为烟草废弃物颗粒)，使培养基中的相对湿度达80％，在37℃隔水式培养箱中静置发酵5d，间隔8h摇动一次，获得发酵后烟草废弃物。
第四组(对照组)：直径为1-2cm烟草废弃物的振荡发酵。
(1)固体发酵培养基的制备
将40℃烘至干燥的烟草废弃物防置于高速粉碎机中，进行瞬间粉碎，大约运行15s获得直径为1-2cm的烟草废弃物颗粒，按照烟草废弃物颗粒5.0g，蛋白胨4.0g，磷酸二氢钾15mg，硫酸铵0.15g，蒸馏水15mL，pH 7.0的比例进行培养基准备，在115℃下高压蒸汽灭菌30min，获得固态发酵培养基。
(2)接种后培养基的振荡培养
将二级种子液按照每克干物质喷洒2.0×109个芽孢杆菌接种至固态发酵培养基中(所述干物质为烟草废弃物颗粒)，使培养基中的相对湿度达80％，在37℃，180rpm/min水平摇床中振荡发酵5d，获得发酵后烟草废弃物。
实施例3：发酵后果胶酶粗酶液的获得。
方法1：以纯水浸提发酵后烟草废弃物获得果胶酶粗酶液。
分别向实施例2中各组发酵后的烟草废弃物中添加50mL纯水，于37℃摇床中振荡浸提30min，将浸提液以8000rpm/min离心30min，获得上清液为果胶酶粗酶液。
方法2：以甘氨酸-氢氧化钠缓冲液浸提发酵后烟草废弃物获得粗酶液。
分别向实施例2中各组向发酵后的烟草废弃物中添加50mLpH 10.0，50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，于37℃摇床中振荡浸提30min，将浸提液以8000rpm/min离心30min，获得上清液为果胶酶粗酶液。
实施例4：发酵粗酶液酶活测定。
利用DNS试剂(3,5二硝基水杨酸法)测定粗酶液中碱性果胶酶活性。
1.果胶酶标准曲线绘制
利用D-半乳糖醛酸做标准曲线，标准曲线绘制按照下表方法进行：
半乳糖醛酸溶液(1mg/mL)：精确称取0.1000g半乳糖醛酸，用pH 9.050mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液定容至100mL。
表1标准体系
Figure BDA0002342131070000051
按表1中体系加入试剂，沸水煮沸5min，冷却后定容至25mL。0号作对照测OD540，做标准工作曲线。
经实验确定标准曲线为：y＝0.0679x-0.1079，R2＝0.9992，其中y为吸光值，x为半乳糖醛酸浓度(mg/mL)。
2.粗酶液中果胶酶活测定方法为：
果胶酶活性定义：在反应条件下，每分钟反应生成1μmol半乳糖醛酸所需要的酶量定义为一个酶活单位，用U/mL表示。果胶酶活力计算公式如下：
Figure BDA0002342131070000052
式中：△A-样品与对照的吸光度差值；N-稀释倍数；K-半乳糖醛酸标准曲线斜率；t-反应时间，30min；M-半乳糖醛酸分子量，M＝194.14。
果胶酶活测定体系为：200μL粗酶液+1mL 0.2％果胶底物(pH 10.0、50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制)于10mL离心管中混匀，于50℃水浴反应30min，反应结束后，加入0.5mL DNS试剂，沸水中精确煮沸5min终止反应，置于冰水中冷却，后放置至室温，在波长540nm下测定其吸光度，以灭活处理的等量粗酶液作为空白对照。在反应前将粗酶液进行稀释，使测量吸光值范围在标准曲线数值的范围内。
图2所示为特基拉芽孢杆菌CAS-MEI-2-33固态发酵烟草废弃物产果胶酶结果，其中：
1(处理1)：1-5mm烟草废弃物颗粒静置培养，以水浸提后的粗酶液酶活；
2(处理2)：1-5mm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，以水浸提后的粗酶液酶活；
3(处理3)：1-5mm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液浸提获得粗酶液；
4(处理4)：1-2cm烟草废弃物颗粒静置培养，以水浸提后的粗酶液酶活；
5(处理5)：1-2cm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，以水浸提后的粗酶液酶活；
6(处理6)：1-2cm烟草废弃物颗粒37℃，180rpm/min水平摇床中振荡培养，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液浸提获得粗酶液。
由图可知，菌株特基拉芽孢杆菌可利用固态发酵的方式利用烟草废弃物进行发酵产碱性果胶酶，其中以处理5的条件下果胶酶活最高，为45.23U/ml，但静止培养下的酶活力大小与振荡培养下的酶活力大小差异不大，静止培养能达到发酵产果胶酶的效果(如处理1)。与液态发酵相比，酶活力虽然不及液态发酵下的果胶酶活力，但相比液态发酵，节省了振荡培养以及烟草废弃物粉粹的动力。
虽然本发明已及比较佳是实施例公开如上，但其并用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种利用特基拉芽孢杆菌固态发酵烟草废弃物产碱性果胶酶的方法，其特征在于，将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌液接入到含有烟草废弃物的固态发酵培养上，静置培养，然后提取获得碱性果胶酶；所述特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33，菌种保藏编号为CGMCCNO.14826。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草废弃物为烟梗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草废弃物为直径1-2cm烟梗颗粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草废弃物为直径1-5mm烟梗颗粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有烟草废弃物的固态发酵培养基由如下重量份的原料组成：烟草废弃物颗粒4.5-5.5份，蛋白胨3.5-4.5份，磷酸二氢钾0.013-0.017份，硫酸铵0.15份和蒸馏水13-17份，pH 7.0-7.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)菌液的制备方法如下：将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)CAS-MEI-2-33单菌落接种至LB液体培养基中，在35-37℃，160-200rpm条件下过夜培养8-12h，获得一级种子液；将一级种子液按照体积比1:50-1:100的体积比例接种至LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养8-12h，获得二级种子液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静置培养是指将特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌液喷洒于已灭菌处理的含烟草废弃物的固态发酵培养基中，按照每克干物质喷洒1.0×109-2.0×109个芽孢杆菌，使培养基中的相对湿度达70-80％，将接种后的培养基置于35-37℃隔水式培养箱中静置培养，发酵4-5d，所述干物质为烟草废弃物颗粒。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，碱性果胶酶的提取方法如下：以烟草废弃物质量计，向发酵结束后的培养基中加入pH 10.0-10.2，50mmol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液6-10mL/g，或无菌蒸馏水6-10mL/g，浸提15-30min，获得果胶酶粗酶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述浸提为37℃摇床中振荡浸提30min，将浸提液以8000rpm/min离心30min，获得上清液为果胶酶粗酶液。
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