CN1246890A - 抗真菌生物控制剂,制备和处理该控制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过抑制真菌病源体而加强植物生长和降低植物病害的抗真菌生物控制剂以及该控制剂的制备和应用方法。本发明的抗真菌生物控制剂由新分离的链霉菌属的菌株WYE20(KCTCO341BP)和WYE324(KCTC0342BP)之一和携带细胞并且使之稳定的递送介质组成。具体地说,本发明的WYE20和WYE324显示强烈的抗茄属丝核菌和辣椒疫苗的抗真菌活性并且可用于各种方式以降低植物例如黄瓜(Cucumissativus L.),胡椒(Capsicum annuum L.)和高尔夫球场的草皮的真菌病害。

Description

抗真菌生物控制剂，制备和处理该控制剂的方法
发明领域
本发明涉及抗真菌生物控制剂，并且涉及制备和处理该控制剂的方法。具体地说，本发明涉及通过抑制真菌病源体在宿主植物的根际土壤形成菌落而加强植物生长和降低植物病害的链霉菌属的两个抗真菌生物控制菌株WYE20和WYE324以及该控制剂的制备方法和应用方法。
发明背景
土壤滋生的植物病源真菌导致农业和园艺业的巨大的经济损失是人所共知的。特别是，茄属丝核菌是显示强烈的致病性的主要的植物真菌病源体之一；该病源体与幼苗疾病以及叶的疾病如许多植物种类和品种的苗腐烂、根腐烂、矮化、叶和茎的腐烂相关，导致巨大的经济损失。例如，茄属丝核菌AG1(1B)引起作物例如黄瓜(Cucumis sativusL.)和胡椒(Capsicum annuum L.)的植物病害以及高尔夫球场的绿色爬行牧草的棕色斑块，茄属丝核菌AG2-2在大面积的高尔夫球场上引起跑道草皮的大斑块，导致巨大的经济损失。另外，辣椒疫霉是广泛传播和高度破坏性的土壤滋生的植物病源真菌，导致根部和冠部的腐烂以及胡椒(Capsicum annuum L.)的叶、果实和茎的气生的枯萎病。如果受辣椒疫霉的感染，抑制胡椒植物的疫霉枯萎病是非常困难的。辣椒疫霉是特别具有破坏性的植物病源体，在热的和湿的雨季引起胡椒植物的枯萎病，导致杀死胡椒植物并且随后导致巨大的经济损失。如上提到的，茄属丝核菌和辣椒疫霉是显示强烈的致病性的主要的植物真菌病源体并且产生在苛刻条件下长时间存活的孢子。因此，当具有最适的发病条件时，它们重复导致大面积的植物病害。
因此，种植者通常有规律地将杀真菌剂混合物应用到植物以控制茄属丝核菌和辣椒疫霉引起的植物病害。但是，由于对杀真菌剂有抗性的植物病源真菌菌株的出现，控制胡椒植物的疫霉和爬行牧草的丝核菌棕色斑越来越困难。由于对杀真菌剂有抗性的茄属丝核菌在高尔夫球场的广泛传播和辣椒植物的连续的栽培引起的辣椒疫霉的增殖，使得控制这些病害的困难逐渐增加。
农用化学药剂的广泛使用也引起了毒性的残留和环境问题。此外，由于流失和缺乏允许有效地渗透到根际土壤的有效的应用，农用化学药剂被认为对控制土壤滋生的植物病害没有效果。期望通过应用化学杀真菌剂长期保护植物也是非常困难的。因此，利用根际细菌作为生物控制剂不仅可以更有效的和更经济地控制植物病害例如由辣椒疫霉引起的疫霉枯萎病和由茄属丝核菌引起的高尔夫球场牧草疾病，而且也可以加强保护环境。
已经证明拮抗微生物的应用是控制病源增加的有吸引力的途径(Suh，博士论文(Ph.D.Dissertation)，爱达荷州立大学，美国爱达荷州，1991；Crawford等人，环境应用微生物，59：3899-3905，1993；美国专利5403584)。在现有技术中发明人公开了链霉菌菌株可通过在盆栽混合物/土壤中利用含有草炭、沙子和玉米粉的递送介质或通过用含有生物控制剂的海藻酸钠包被植物种子，导致在根部形成菌落，从而用于控制植物病源体(美国专利5403584)。在现有技术中也公开了含有有益的生物控制剂的草炭可用于控制植物病源体(美国专利4595589)。现有技术中的递送介质的方法适用于幼苗/盆栽混合物的使用，但是不十分适用于直接应用到植物种子或植物根部以有效地保护植物抵抗植物病源真菌。
本发明的目的是提供新的链霉菌菌株，该菌株能够通过将特别设计的配方直接应用到植物种子或植物根部而控制植物病源真菌，所述配方包括含有选自于新分离的链霉菌菌株的生物学纯化的培养物的递送介质。
此外，本发明的目的是提供抗真菌生物控制剂并且描述了其在保护植物免受土壤滋生的植物病源真菌引起的感染中的应用。
发明概述
通过分离链霉菌WYE20和WYE324完成了本发明，所述菌株能够保护植物免受茄属丝核菌和辣椒疫霉的侵袭。链霉菌WYE20和WYE324菌株可有效地阻止植物真菌疾病的发生并且加强温室和农业大田试验的植物生长。因此，本发明的一个方面是微生物学纯化的培养物链霉菌WYE20和WYE324。
本发明也包括适用于用链霉菌WYE20和WYE324处理植物种子、幼苗床/苗钵、盆栽混合物/土壤的递送介质。所述递送介质非常适用于携带链霉菌WYE20和WYE324以抑制由植物病源真菌引起的植物病害。
在本发明的一个特定的实施方案中，递送介质由木屑、麦饼、几丁质、脱乙酰壳多糖和Pharmamedia(商品名；由Budkeye油菜籽种子产品公司制造，美国德克萨斯州)与链霉菌WYE20或WYE324一起组成的。在另一个特定的实施方案中，递送介质由果胶和胶体几丁质和水与链霉菌WYE20或WYE324一起组成的。在优选的实施方案中，递送介质包括每克递送介质至少105菌落形成单位的链霉菌WYE20或WYE324。
本发明也包括降低种子、幼苗和/或生长的植株在播种和生长季节之前或生长期间受真菌感染的方法，该方法通过处理植物种子、苗床/苗钵、盆栽混合物/土壤，喷洒或犁田而应用。发明详述
根据本发明，提供了有效地抑制真菌疾病和加强植物如胡椒、黄瓜和牧草生长的链霉菌WYE20和WYE324，虽然其范围不仅限于这些实例。
本发明包括可用于携带链霉菌WYE20和WYE324以抑制由植物病源真菌引起的植物病害的各种递送介质。
在本发明的一个特定的实施方案中，递送介质由占递送介质总重量40-65w/w％的麦饼，1-5w/w％的脱乙酰壳多糖，30-55w/w％的木屑，1-3w/w％的几丁质和1-3w/w％Pharmamedia组成。在优选的实施方案中，递送介质进一步含有作为附加成分的占递送介质总重量0.2-3.5w/w％的孢子形成培养基。优选的孢子形成培养基选自于ATCC#5孢子形成培养基或酵母提取物-葡萄糖-无机盐，但是不排除其它培养基。
在另一个特定的实施方案中，递送介质由溶于水的1.0-3.0w/w％的果胶和0.1-0.6w/w％的胶体几丁质组成。
在优选的实施方案中，递送介质包括每克递送介质至少105-1010，优选的是107-108菌落形成单位的链霉菌WYE20或WYE324。
本发明包括用于生产链霉菌WYE20和WYE324的菌丝体和孢子接种体的方法。通过在酵母提取物-无机盐或改良液体培养基中在适当的条件下培养营养细胞来生产链霉菌WYE20和WYE324活细胞。
制备抗真菌生物控制剂的方法包括如下步骤：
通过在25-33℃的温度下，以130rpm到300rpm培养3-7天来生产链霉菌WYE20或WYE324。
在收获链霉菌WYE20或WYE324细胞之后，将细胞冷冻或直接混合到递送介质中。
此外，根据本发明，制备抗真菌生物控制剂的方法包括下面的步骤：制备含有占递送介质总重量40-65w/w％的麦饼，1-5w/w％的脱乙酰壳多糖，30-55w/w％的木屑，1-3w/w％的几丁质和1-3w/w％Pharmamedia的递送介质；
将获得的递送介质高温蒸汽灭菌；
将链霉菌WYE20(KCTC 0341BP)或链霉菌WYE324(KCTC0342BP)掺入到递送介质中；
在25℃-33℃将掺入的链霉菌WYE20(KCTC 0341BP)或链霉菌WYE324(KCTC 0342BP)培养5-14天；和
无菌干燥所获得的产物以获得抗真菌生物控制剂。
优选的是，该方法进一步包括将所获得的干燥产物无菌混合。
在上述方法中，可将递送介质制成丸并且然后用占递送介质总重量0.2-3.5w/w％的孢子形成培养基包被。
掺入链霉菌WYE20或WYE324到浓度达每克递送介质105-1010，优选达107-108菌落形成单位。
在121℃将递送介质高温蒸汽灭菌30-40分钟。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于制备抗真菌生物控制剂的方法，该方法包括：
制备由溶于水的1.0-3.0w/w％的果胶和0.1-0.6w/w％的胶体几丁质组成的递送介质；
将获得的递送介质高温蒸汽灭菌；和
将链霉菌WYE20(KCTC 0341BP)或链霉菌WYE324(KCTC0342BP)掺入到递送介质中。
在本发明的上述实施方案中，加入链霉菌WYE20或WYE324到递送介质至终浓度为每克递送介质105-1010，优选的是107-108菌落形成单位。
此外，本发明涉及处理抗真菌生物控制剂的方法，该方法包括将所述控制剂包被、混合、喷洒或在犁田时应用于植物种子、盆栽混合物、植物或其土壤。
本发明也涉及抗真菌生物控制剂，该控制剂包括新分离的链霉菌WYE20和WYE324菌株。因此，应认识到含有具有等同于与本发明的递送介质在一起的那些菌株的抗真菌特性的微生物的抗真菌生物控制剂亦在本发明的精神和范围内。
在下面的实施例中将进一步描述本发明。但是本发明不限于下面的实施例。材料和方法
1.微生物的培养基
所有的细菌培养基使用蒸馏水并且在使用之前进行高温蒸汽灭菌。采用标准的无菌试验技术处理所有的细菌样品以保持纯度。
1)CYD(酪蛋白氨基酸/酵母提取物/葡聚糖/琼脂)培养基含有溶于蒸馏水的酪蛋白氨基酸(Difco：0.5克/升)，酵母提取物(Difco：0.8克/升)，D-葡萄糖(0.4克/升)，磷酸氢二钾(2.0克/升；pH7.2-7.4)和琼脂(18克/升)。
2)从Reddi和Rao(1971)改良的WYE(水/酵母提取物/琼脂)培养基含有溶于蒸馏水的酵母提取物(0.25克/升)，磷酸氢二钾(2.0克/升；pH7.2-7.4)和琼脂(18克/升)。
3)YGM(酵母提取物/葡萄糖/无机盐)培养基包括0.6％(w/v)的酵母提取物(Difco实验室，美国密执安州，底特律市)，1.0％(w/v)的葡萄糖和无机磷酸盐溶液(每升去离子水中溶有5.3克磷酸氢二钠，1.98克的磷酸二氢钾，0.2克的7水合硫酸镁，0.2克的氯化钠，0.05克的2水合氯化钙，和1.0毫升的微量元素(Pridham和Gottlieb，细菌学杂志56：107-114，1984)，pH7.1-7.2)。微量元素溶液由溶于100ml蒸馏水的0.64克5水合硫酸铜，0.11克的7水合硫酸亚铁，0.79克的4水合绿化锰，0.15克的7水合硫酸锌组成。
4)CM(几丁质/无机盐/琼脂)培养基包括在每升如上描述的无机磷酸盐溶液中含有0.4％-0.6％(w/v)由以前已知的方法制备的胶体几丁质(Hsu和Lockwood，应用微生物学，第422-426页，1975)，0.6％(w/v)硫酸铵和2.0％(w/v)琼脂；pH7.0-7.2。
5)昆布多糖琼脂培养基包括在每升如上描述的无机磷酸盐溶液中含有0.25％(w/v)昆布多糖，0.6％(w/v)硫酸铵和2.0％(w/v)琼脂；pH7.2-7.4。
6)改良的贝纳特液体培养基含有溶于蒸馏水的酵母提取物(2克/升)，牛肉提取物(2克/升)，蛋白胨(2克/升)，葡萄糖(10克/升)和制霉菌素(5微克/毫升)；pH6.5-7.5。
7)改良的贝纳特琼脂培养基含有溶于蒸馏水的酵母提取物(2克/升)，牛肉提取物(2克/升)，蛋白胨(2克/升)，葡萄糖(10克/升)，制霉菌素(5微克/毫升；pH6.5-7.5)，和琼脂(20克/升)。
8)ISP培养基#2(Difco)。
9)ISP培养基#3(Difco)。
10)ISP培养基#4(Difco)。
11)孢子形成培养基(ATCC培养基#5)含有酵母提取物(1克/升)，牛肉提取物(1克/升)，胰蛋白胨(2克/升)，磷酸亚铁(0.01克/升)，葡萄糖(10克/升)，和琼脂(15克/升)(ATCC细菌和噬菌体目录第17版)。
2.链霉菌WYE20和WYE324的鉴定
根据伯杰氏手册的细菌***分类(1989)、国际链霉菌项目(ISP)(1974)和Williams等人(1983)定义的链霉菌属的形态学、生理学和化学特性，将菌株WYE20和WYE324鉴定为链霉菌属的种的菌株。这些菌株的形态学、生理学和化学特性的概括结果列于表I-V。
3.链霉菌WYE20和WYE324的种子培养基的制备和储存
用接种环将CYD琼脂斜面的孢子接种到含有50毫升的改良的贝纳特液体培养基(pH6.5-7.5)的500毫升的摇瓶中。在接种之前将培养基在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。然后将接种的摇瓶以130-300rpm，在25℃-33℃振荡培养1-4天以提供标准的种菌。
对于短期使用，将链霉菌WYE20和WYE324在CYD或WYE琼脂斜面上，在25℃培养直到孢子形成，然后储存于4℃直到使用。每隔4星期转移培养物一次。悬浮于经高压蒸汽灭菌的甘油(121℃，15分钟)中的孢子(15％-30％)用于在-70℃长期储存。
4.液体培养物中菌丝体和孢子的收获和生产
在含有200毫升的改良的贝纳特液体培养基或200毫升的YGM(pH6.5-7.5)培养基的1升摇瓶中接种8毫升的改各种种子培养物，以产生链霉菌WYE20和WYE324的菌丝体和孢子的活细胞。接种的摇瓶以130-300rpm，在25℃-33℃振荡培养3-7天。通过以4000rpm离心10分钟来无菌收获通过上面方法产生的菌丝体和孢子的活细胞。
5.用递送介质生产菌丝体和孢子的活细胞和抗真菌生物控制剂的制备
(1)将由占培养基总重量40-65w/w％的麦饼，1-5w/w％的脱乙酰壳多糖，30-55w/w％的木屑，1-3w/w％的几丁质和1-3w/w％Pharmamedia(Budkeye油菜籽产品公司，Fortworth，Texas，美国)组成的本发明的递送介质彻底混合。将所获得的递送介质制成团丸并且用0.2-3.5w/w％的孢子形成培养基(ATCC#5或YGM培养基)喷涂包被，然后在121℃高压蒸汽灭菌30-40分钟。当加入的孢子形成培养基低于0.2w/w％时对细胞生长没有作用，而当加入的孢子形成培养基在3.5w/w％以上时则起始细胞生长被延迟。
将100毫升-200毫升的链霉菌WYE20和WY324(105-107cfu/ml)接种到所获得的高压蒸汽灭菌的递送介质中并且然后在30℃培养5-14天。在无菌条件下收获递送介质中的链霉菌WYE20和WY324，并且在用UV灭菌的分层的流动工作台中干燥。将获得的干燥产物在无菌条件下混合以获得包括递送介质和链霉菌WYE20或WYE324的抗真菌生物控制剂。
(2)制备包括链霉菌WYE20或WYE324和液体递送介质的抗真菌生物控制剂
通过将上述所获得的链霉菌WYE20或WYE324的菌丝体和孢子的活细胞接种到经高压蒸汽灭菌的由溶于水的1.0-3.0w/w％果胶和0.1-0.6w/w％的胶体几丁质组成的递送介质中，来完成抗真菌生物控制剂的制备。
6.真菌病源体
下面的真菌病源体可用于抗真菌测试：终极腐霉(Pythiumultimum)，禾生腐霉(Pythium graminicola)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，茄属丝核菌AG1(IB)(Rhizoctonia solani AG1(IB))，茄属丝核菌AG2-2(IV)(Rhizoctonia solani AG2-2(IV))，尖孢镰胞(Fusariumoxysporum)，接骨木镰胞(Fusarium sambucinctum)，茄病镰胞(Fusariumsolani)，辣椒疫霉(Phytophthora capsici)，寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)，油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，葱核盘菌(Sclerotiumcepivarum)和大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)。所有菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(Difco)或玉米粉琼脂(Difco)上在25℃生长，并且在4℃储存。
7.测定递送介质中的细胞数
将1克含有链霉菌WYE20或WYE324的递送介质加入到9毫升无菌蒸馏水中并且用vortexTM彻底混合。将获得的悬浮液连续稀释并且涂布在CMA平板培养基上以测定每克的菌落形成单位(cfu)数量。在30℃培养该平板并且观察菌落的形成。将相同的方法用于测定cfu/毫升液体递送介质。
8.进行体外生物测试以测定链霉菌WYE20和WYE324的抗真菌活性
通过用递送介质中的链霉菌WYE20或WYE324处理黄瓜、胡椒或高尔夫球场牧草，然后将处理的和未处理的种子播种于合适的生长培养基或农田中，以此来测定链霉菌WYE20或WYE324加强植物生长和降低由真菌病源体引起的植物病害的活性。就突出体、植物的生长晕、植物高度和疾病控制能力，测定递送介质中的链霉菌WYE20或WYE324作为生物控制剂的活性。实施例1链霉菌WYE20和WYE324的分离
从韩国Chungbuk省的Goesan的四个不同的根际相关的土壤获得土壤样品。通过连续稀释/在WYE琼脂平板上的铺板技术来分离菌株。对获得的菌株就抗茄属丝核菌和辣椒疫霉的拮抗活性；显示真菌细胞壁降解的酶活性；根际定殖，在低温(4℃，8℃)的生长；和产生大细胞群的可能性进行测试以分离两个新菌株。将两个新菌株分别命名为链霉菌WYE20和WYE324。通过在25℃，在WYE平板培养基上培养菌株4-10天以允许菌株形成孢子，然后分离其菌落，在新的WYE琼脂平板上划线培养来获得纯培养物，从而纯化链霉菌WYE20和WYE324。将链霉菌WYE20和WYE324纯培养物转移到CYD琼脂斜面，在25℃-30℃培养，直到形成孢子并且储存在4℃。每隔4星期转移培养物一次。实施例II链霉菌WYE20和WYE324的鉴定和特征分析
根据***细菌学伯杰氏手册(1989)检查实施例1获得的微生物的形态学、生理学和化学特性。结果显示于表I-V。
                                        表I
培养基   细胞生长   气生菌丝体     基生菌丝体   孢子群的颜色
  WYE20  WYE324  WYE20  WYE324 WYE20   WYE324 WYE20 WYE324
ISP#2   好   好 丰富 丰富 浅黄   浅黄 灰红 灰红
ISP#3   好   好 丰富 丰富 淡黄   淡黄 灰红 灰红
ISP#4   好   好 丰富 丰富 淡黄   淡黄 灰红 灰红
                            表IIa
    特性     WYE20菌株     WYE324菌株
    孢子链形态学孢子链纹饰孢子形状     螺旋状光滑圆柱形     螺旋状光滑圆柱形
    可扩散色素       -        -
    黑色素的产生       +(棕色-深棕色)        +(棕色-深棕色)
抗菌活性黑曲霉枯草芽孢杆菌NCIB3610鼠灰链霉菌白色念珠菌啤酒酵母CBS1172藤黄微球菌NCIB196 +++--+ +++--+
    卵磷脂酶活性       +        +
    果胶水解       -        -
    脱脂***解       +        +
    淀粉水解       +        +
    硝酸盐的还原       +        +
    硫化氢的产生       +4星期        -
                        表IIa(续)
  特性     WYE20菌株     WYE324菌株
  对抗生素的抗性(微克/毫升)：夹竹桃霉素(100)新霉素(50)利福平(50)林肯霉素(100)新生霉素(100)Ganamycin(100)氨苄西林(100)链霉素(100)春雷霉素(100)四环素(100)氯霉素(100) _1毫米giz+_2毫米giz+-_2毫米giz+_3毫米giz++--：生长抑制圈(giz)＞4毫米 _1毫米giz+-+-_3毫米giz+_2毫米giz_1毫米giz+_3毫米giz+：没有生长抑制圈
                             表IIb
特性   WYE20菌株   WYE324菌株
降解活性：黄嘌呤弹性蛋白熊果苷木聚糖L-酪氨酸尿囊素 -+-+++ -+-+++
在45℃生长     -     -
在pH4.3生长     -     -
在化学抑制剂(w/v，％)存在下的生长：氯化钠(7.0)叠氮化钠(0.01)苯酚(0.1)亚碲酸钾(0.001)结晶紫(0.0001)Neolin(0.5)Neolin(1.0)吐温20(0.5)吐温20(1.0)RizoraxTM(0.1)RizoraxTM(1.0)GochutanTM(0.1)SmiraxTM(0.1)Lidomil MGTM(0.125)Lidomil MGTM(0.25)AngcolTM(0.1) --++++++++++-+-- --++-+++++++-±--
                           表IIb(续)
特性   菌株WYE20   菌株WYE324
氮的利用(0.1％w/v)：L-天冬氨酸DL-α-氨基-正丁酸L-半胱氨酸L-缬氨酸L-苯丙氨酸L-组氨酸L-羟基脯氨酸L-精氨酸L-甲硫氨酸硝酸钾L-丝氨酸L-苏氨酸 +-±±-+++±-++ +-++±+++-++
TM商标
                            表IIc
特性   菌株WYE20   菌株WYE24
碳的利用(1.0％w/v)：蔗糖内消旋肌苷甘露醇L-鼠李糖棉籽糖D-松三糖阿东糖醇D-蜜二糖葡聚糖木糖醇L-***糖D-果糖D-半乳糖D-葡萄糖D-水杨苷D-木糖山梨糖D-乳糖D-甘露糖海藻糖麦芽糖纤维二糖菊粉乙酸钠(0.1)柠檬酸钠(0.1)丙二酸钠(0.1)丙酸钠(0.1)丙酮酸钠(0.1) +--+-+-±±±±+++±+++++++-++±++ +----+-±--±+++++++++++-++±++
二氨基庚二酸 LL LL
                                           表IV
    脂肪酸                              链霉菌WYE324
                               含量(％)
    1     2     3     4     最小     最大     平均
  饱和脂肪酸
    14∶0     0.28     0.26     0.42     0.45     0.26     0.45     0.35
    15∶0     2.22     2.19     1.23     1.25     1.23     2.22     1.72
    16∶0     4.34     4.40     5.89     6.19     4.34     6.19     5.21
    17∶0     0.40     0.43      -      -     nd     nd     nd
 不饱和脂肪酸
    15∶1B     0.20     0.15      -      -     nd     nd     nd
    16∶1顺9     6.40     6.39     5.66     5.54     5.54     6.40     6.00
17∶1顺9 1.40 1.43 0.78 0.71 0.71 1.43 1.08
    甲基支链
    13∶0异     0.08     0.10      -      -     nd     nd     nd
    13∶0反异     0.13     0.14      -      -     nd     nd     nd
                                                   表IV(续)
    脂肪酸                                        链霉菌WYE324
                                         含量(％)
    1     2     3     4     最小     最大     平均
    14∶0异     1.64     1.62     2.18     2.30     1.62     2.30     1.94
    15∶0异     7.48     7.48     8.15     8.10     7.48     8.15     7.80
    15∶0反异     30.25     30.10     31.65     31.76     30.10     31.76     30.94
    16∶1异H     2.59     2.57     3.34     3.23     2.57     3.34     2.93
    16∶0异     14.05     14.06     16.67     16.69     14.05     16.69     15.37
    16∶0 9？CH3     3.56     3.56     3.29     3.12     3.12     3.56     3.38
    17∶1反异C     6.68     6.65     5.97     5.90     5.90     6.68     6.30
    17∶0异     1.77     1.82     2.14     2.16     1.77     2.16     1.97
    17∶0反异     10.78     10.95     10.68     10.72     10.68     10.95     10.78
    17∶0 10 CH3     0.18     0.18      -      -     nd     nd     nd
    18∶1异H     0.49     0.50      -      -     nd     nd     nd
    羟基支链
    17∶0异2OH     0.50     0.51       -      -     nd     nd     nd
                                         表III(续)
    脂肪酸                              链霉菌WYE324
                               含量(％)
    1     2     3     4     最小     最大     平均
 未知17.595 SM     0.78     0.82     0.50     0.55     0.50     0.82     0.66
注释：第1和第2次：细胞在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长。
  第3和第4次：细胞在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)中生长。
  -：未检测。nd：未测定。
                                        表IV
    脂肪酸                              链霉菌WYE324
                               含量(％)
    1     2     3     4     最小     最大     平均
  饱和脂肪酸
    14∶0     0.28     0.26     0.42     0.45     0.26     0.45     0.35
    15∶0     2.22     2.19     1.23     1.25     1.23     2.22     1.72
    16∶0     4.34     4.40     5.89     6.19     4.34     6.19     5.21
    17∶0     0.40     0.43      -      -     nd     nd     nd
 不饱和脂肪酸
    15∶1B     0.20     0.15      -      -     nd     nd     nd
    16∶1顺9     6.40     6.39     5.66     5.54     5.54     6.40     6.00
    17∶1顺9     1.40     1.43     0.78     0.71     0.71     1.43     1.08
    甲基支链
    13∶0异     0.08     0.10      -      -     nd     nd     nd
13∶0反异 0.13 0.14 - - nd nd nd
                                                     表IV(续)
    脂肪酸                                       链霉菌WYE324
                                         含量(％)
    1     2     3     4     最小     最大     平均
    14∶0异     1.64     1.62     2.18     2.30     1.62     2.30     1.94
    15∶0异     7.48     7.48     8.15     8.10     7.48     8.15     7.80
    15∶0反异     30.25     30.10     31.65     31.76     30.10     31.76     30.94
    16∶1异H     2.59     2.57     3.34     3.23     2.57     3.34     2.93
    16∶0异     14.05     14.06     16.67     16.69     14.05     16.69     15.37
    16∶0 9？CH3     3.56     3.56     3.29     3.12     3.12     3.56     3.38
    17∶1反异C     6.68     6.65     5.97     5.90     5.90     6.68     6.30
    17∶0异     1.77     1.82     2.14     2.16     1.77     2.16     1.97
    17∶0反异     10.78     10.95     10.68     10.72     10.68     10.95     10.78
    17∶0 10 CH3     0.18     0.18       -       -     nd     nd     nd
    18∶1异H     0.49     0.50       -       -     nd     nd     nd
    羟基支链
    17∶0异2OH     0.50     0.51       -       -     nd     nd     nd
                                                    表IV(续)
    脂肪酸                                          链霉菌WYE324
                                           含量(％)
    1     2     3     4     最小     最大     平均
  17∶0 3OH     0.24     0.19     -     -     nd     nd     nd
  环丙烷
  17∶0环丙烷     3.15     3.14     1.95     1.89     1.89     3.15     2.53
  未知17.595 SM     0.68     0.69      -     -     nd     nd     nd
注释：第1和第2次：细胞在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长。
  第3和第4次：细胞在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)中生长。
  -：没有检测。nd：未测定。
                                                     表V
               特性   链霉菌WYE20   哥伦比亚链霉菌ATCC 27425 链霉菌WYE324   五色链霉菌ATCC 23914
孢子链：直链易弯曲(Rectiflexibles)     -     +     -     -
孢子链：Rectinaculiaperti     -     -     -     -
孢子链：螺旋形     +     +     +     +
孢子链：轮生     -     -     -     -
孢子表面纹饰：光滑     +     +     +     +
孢子表面纹饰：多皱     -     -     -     -
孢子群颜色：红     -     +     -     +
孢子群颜色：灰     -     -     -     -
孢子群颜色：绿     -     -     -     -
可扩散色素：红/桔黄     -     -     -     -
可扩散色素：黄/棕     -     -     -     -
黑色素生产     +     +     +     +
裂殖     -     -     -     -
DL-α-氨基-正丁酸(0.1％w/v)的利用     -     -     -     -
                                               表V(续)
              特性   链霉菌WYE20   哥伦比亚链霉菌ATCC 27425 链霉菌WYE324   五色链霉菌ATCC 23914
  L-组氨酸(0.1％，w/v)的利用     +     -     +     -
  L-羟基脯氨酸(0.1％，w/v)的利用     +     +     +     -
  卵磷脂酶活性     +     +     +     +
  果胶水解     -     -     -     -
  硝酸盐还原     +     +     +     +
  硫化氢的产生     +     +     -     -
  枯草芽孢杆菌NCIB     +     +     +     +
  鼠灰链霉菌     +     +     +     +
  黑曲霉     +     +     +     +
  黄嘌呤降解活性     -     +     -     +
  尿囊素降解活性     +     +     +     +
  熊果苷降解活性     -     +     -     -
  新霉素(50μg/ml)抗性     +     +     +     +
  利福平(50μg/ml)抗性     -     -     -     -
                                             表V(续)
              特性   链霉菌WYE20   哥伦比亚链霉菌ATCC 27425 链霉菌WYE324   五色链霉菌ATCC 23914
  在45℃生长     -     -     -     -
  在氯化钠(7％，w/v)中生长     -     -     -     -
  在叠氮化钠(0.01％，w/v)中生长     -     -     -     -
  在苯酚(0.1％，w/v)中生长     +     +     +     +
  D-木糖(1.0％，w/v)的利用     +     -     +     -
  内消旋肌醇(1.0％，w/v)的利用     -     -     -     -
  甘露醇(1.0％，w/v)的利用     -     -     -     -
  D-果糖(1.0％，w/v)的利用     +     +     +     +
  L-鼠李糖(1.0％，w/v)的利用     +     -     -     -
  棉子糖(1.0％，w/v)的利用     -     -     -     -
  菊粉(1.0％，w/v)的利用     -     -     -     -
  阿东糖醇(1.0％，w/v)的利用     -     -     -     -
  纤维二糖(1.0％，w/v)的利用     +     +     +     +
根据伯杰氏手册的细菌***分类(1989)；国际链霉菌项目(ISP)(1974)；和Williams等人(1983)分析表I-V的数据将实施例1获得的两个菌株鉴定为链霉菌属。
将两个菌株分别命名为WYE20和WYE324。根据链霉菌属的形态学、生理学和化学特性，菌株WYE20属于哥伦比亚链霉菌种或与61簇密切相关的种，但是该菌株被鉴定为链霉菌属的新的菌株。根据链霉菌属的形态学、生理学和化学特性，菌株WYE324属于五色链霉菌种或与61簇密切相关的种，但是该菌株被鉴定为链霉菌属的新的菌株。
按照国际承认的专用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约，于1997年6月18日将WYE20和WYE324菌株寄存于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究院(韩国，Taejon)，保藏号分别为KCTC0341BP和KCTC0342BP。实施例III链霉菌WYE20和WYE324的细胞生长的最适温度
为了调查温度对链霉菌WYE20和WYE324的细胞生长的影响，将WYE20和WYE324菌株的孢子划线接种于改良的贝纳特琼脂平板上。将划线的平板在4℃，8℃，27℃，37℃和45℃的预定的温度下培养3星期。在7，14和21天记录生长。结果显示于表VI，以生长好(+)；生长慢(±)；没有生长(-)表示。
                                                    表VI
菌株     4℃     8℃     27℃     37℃     45℃
    7天    21天    7天  14天   7天  14天     7天  14天 7天  14天
WYE20     ±     +     +    +    +    +      ±    +  -   -
WYE324     -     ±     ±    +    +    +      ±    +  -   -
如表VI显示的，WYE20菌株在4℃培养一星期之后表现为缓慢生长，在培养3星期之后表现为生长良好，而菌株WYE324在4℃培养3星期之后缓慢生长。菌株WYE20在8℃和27℃生长良好。但是菌株WYE324在8℃培养1星期之后缓慢生长和在8℃培养2星期之后生长良好。另外，菌株WYE324在27℃生长良好。菌株WYE20和WYE324在37℃培养1星期之后缓慢生长和在37℃生长2星期之后生长良好，但是它们在45℃均不生长。实施例IV酶活性和拮抗性测试
(1)酶活性测试
为了测试菌株WYE20和WYE324的酶活性，使用了几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶，已知它们是能够寄生于/抑制真菌病源体的酶。
为了测定菌株WYE20和WYE324的几丁质酶活性，将各个菌株在CM琼脂平板上划线培养，然后在30℃培养14天，所述平板包含了胶体几丁质作为唯一的碳源。观察到菌落的形成和生长。上述结果证明菌株WYE20和WYE324具有几丁质酶活性。
为了测定菌株WYE20和WYE324的β-1，3-葡聚糖酶活性，将各个菌株在昆布多糖琼脂平板上划线培养，然后在27℃培养7天，所述平板包含了昆布多糖作为唯一的碳源。观察到菌落的形成和生长。上述结果证明菌株WYE20和WYE324具有β-1，3-葡聚糖酶活性。
(2)拮抗性测试
进行体外平板测试，根据植物病源真菌的生长抑制情况检测菌株WYE20和WYE324的拮抗性。将各个菌株在CMA琼脂平板上划线接种，并且在30℃培养6-10天。然后在无菌状态下将含有活跃生长的真菌菌丝体的PDA(马铃薯-葡萄糖琼脂)块置于平板的中央并且在25℃培养24-192小时。将上述PDA块接种到不含有菌株WYE20或WYE324的CMA平板上并且用作为对照。在三个平板上进行生物测试。将拮抗性记录为抑制真菌病源体的菌丝体生长的抑制的程度，如表VII所示。
                           表VII
    真菌病源体         拮抗活性
    WYE20     WYE324
    终极腐霉1      +      +
    禾生腐霉2     ++     ++
    尖孢镰胞     ++     ++
    接骨木镰胞     ++     nt
    茄病镰胞     ++     ++
    茄属丝核菌     ++     ++
    茄属丝核菌AG1(IB)     ++     ++
    茄属丝核菌AG2-2(IV)     ++     ++
    辣椒疫霉     ++     ++
    寄生疫霉     ++     ++
    油菜核盘菌     ++     ++
    葱核盘菌3     ++     ++
    大丽花轮枝孢3     ++     nt
124小时培养，236小时培养，3192小时培养
其余：96小时培养
++：抑菌圈≥1.0厘米的强烈抑制
+：在菌落附近有明显的抑菌圈，生长明显受阻
-：没有拮抗性，或拮抗性非常弱
nt：没有测试
如表VII所示，菌株WYE20和WYE324显示出抗终极腐霉的明显抑菌圈。菌株WYE20显示对禾生腐霉、尖孢镰胞、接骨木镰胞、茄病镰胞、茄属丝核菌、茄属丝核菌AG1(IB)、茄属丝核菌AG2-2(IV)、辣椒疫霉、寄生疫霉、油菜核盘菌、葱核盘菌和大丽花轮枝孢有强烈的拮抗性。另外，菌株WYE324也显示对禾生腐霉、尖孢镰胞、茄病镰胞、茄属丝核菌、茄属丝核菌AG1(IB)、茄属丝核菌AG2-2(IV)、辣椒疫霉、寄生疫霉、油菜核盘菌、葱核盘菌有强烈的拮抗性。实施例V粉末形式的抗真菌生物控制剂的制备
根据表VIII，通过将麦饼、脱乙酰壳多糖、木屑、几丁质和Pharmamedia混合来制备递送介质。利用挤出机将使递送介质造粒制成团丸。在造粒成团的过程中，测定团丸形成的程度，对于没有碎片和破裂的形成好团丸的情况记录为好；而对于很少形成团丸的情况记录为差。结果显示于表VIII。测定空气渗透性和递送介质的细胞生长，并记录为差、中等和好。结果显示于表VIII。
将在“材料和方法”中获得的链霉菌WYE20或WYE324(105-107cfu/毫升)培养物150毫升接种到所获得的经高压蒸汽灭菌的递送介质中并然后在30℃培养5-14天。无菌收获各个递送介质中的链霉菌WYE20或WYE324培养物并且在UV灭菌的分层流动工作台中干燥。将干燥的产物在无菌条件下混合以获得由递送介质和链霉菌WYE20或WYE324组成的粉末形式的抗真菌生物控制剂。
在递送介质中将链霉菌WYE20或WYE324的细胞数调整到105-1010cfu/克递送介质。将所获得的由递送介质和链霉菌WYE20或WYE324组成的抗真菌生物控制剂在4℃和25℃保持3个月。以一个月为间隔测定递送介质中的WYE20或WYE324的存活性和生长并且在3个月时记录。
将含有WYE20或WYE324的1克递送介质加入到9毫升的无菌蒸馏水并且彻底涡旋混合。通过连续稀释和涂布平板技术测定每克所得的悬浮液的cfu并且列于表VIII和IX。
                                                     表VIII(单位：w/w％)
  递送介质(D.M.)    麦饼 脱乙酰壳多糖    木屑  几丁质 Pharma media 团丸形成 空气渗透   细胞生长
  D.M.1     65     1     30     2     2     好   中等     中等
  D.M.2     65     2     30     1     2     好   中等     中等
  D.M.3     65     2     30     2     1     好   中等     中等
  D.M.4     65     1     30     1     3     好   中等     中等
  D.M.5     65     1     30     3     1     好   中等     中等
  D.M.6     63     5     30     1     1     好   中等     中等
  D.M.7     60     5     30     2     3     好   中等     中等
  D.M.8     50     1     45     2     2     好   好     好
  D.M.9     45     5     45     2     3     好   好     好
  D.M.10     45     3     50     1     1     好   好     好
D.M.11 40 3 55 1 1 好 好 好
  D.M.12     40     1     55     3     1     好   好     好
                                                    表VIII(续)(单位：w/w％)
  递送介质(D.M.)   麦饼 脱乙酰壳多糖   木屑 几丁质 Pharma media 团丸形成 空气渗透   细胞生长
  D.M.13     40     1     55     1     3     好     好     好
  对照1     90     2     5     2     1     好     差     差
  对照2     80     5     10     3     2     好     差     差
  对照3     70     3     25     1     1     好     差     差
  对照4     30     5     60     2     3     差     好     nt
  对照5     20     5     70     2     3     差     好     nt
  对照6     10     5     80     2     3     差     好     nt
nt：未检测
                                                 表IX(单位：w/w％)
  递送介质(D.M.) 麦饼 脱乙酰壳多糖   木屑  几丁质 Pharma media    WYE20或WYE324的起始细胞数(cfu/g)       3个月后WYE20或WYE324的细胞数(cfu/g) 细胞生长
  在4℃   在25℃
  D.M.1   65     1     30     2     2   1.2×107   1.0×106   2.3×105   好
  D.M.2   65     2     30     1     2   1.9×107   1.5×106   2.9×105   好
  D.M.3   65     2     30     2     1   1.3×107   1.4×106   2.5×105   好
  D.M.4   65     1     30     1     3   2.1×107   1.7×106   3.6×105   好
  D.M.5   65     1     30     3     1   2.0×107   1.2×106   3.1×105   好
  D.M.6   63     5     30     1     1   2.7×107   1.1×106   2.7×105   好
  D.M.7   60     5     30     2     3   1.5×107   1.3×106   3.3×105   好
  D.M.8   50     1     45     2     2   1.6×108   2.1×107   2.1×106   好
  D.M.9   45     5     45     2     3   2.6×108   1.1×107   2.5×106   好
                                                     表IX(续)(单位：w/w％)
  递送介质(D.M.) 麦饼 脱乙酰壳多糖   木屑 几丁质 Pharma media   WYE20或WYE324的起始细胞数(cfu/g)         3个月后WYE20或WYE324的细胞数(cfu/g) 细胞生长
  在4℃   在25℃
  D.M.10   45     3     50     1     1   2.1×108   1.0×107   3.1×106   好
  D.M.11   40     3     55     1     1   1.9×108   1.6×107   3.5×106   好
  D.M.12   40     1     55     3     1   1.8×108   1.9×107   2.4×106   好
  D.M.13   40     1     55     1     3   2.2×108   1.3×107   1.9×106   好
如表VIII和IX所示，D.M.1-13的团丸形成、空气渗透性和细胞生长情况为好和中等，而各组分的含量不同的对照1-6在团丸形成、空气渗透性或细胞生长情况方面差。
另外，用YGM孢子形成培养基包被D.M.1-13团丸，并且测定其对细胞生长和存活的作用。结果显示于表X。
                                                      表X(单位：w/w％)
  递送介质(D.M.) 麦饼 脱乙酰壳多糖 木屑 几丁质 Pharmamedia    YGM*      WYE20或WYE324的起始细胞数(cfu/g)       3个月后WYE20或WYE324的细胞数(cfu/g) 细胞生长
    在4℃     在25℃
  D.M.14     65     1     30     2     2     0.2     1.1×107   1.2×106   2.4×105   好
  D.M.15     65     2     30     1     2     0.5     1.4×107   1.4×106   2.9×105   好
  D.M.16     65     2     30     2     1     1.0     1.6×107   1.6×106   2.6×105   好
  D.M.17     65     1     30     1     3     1.5     2.0×107   1.9×106   4.2×105   好
  D.M.18     65     1     30     3     1     1.8     2.2×107   1.3×106   3.2×105   好
  D.M.19     63     5     30     1     1     2.0     1.7×107   2.1×106   3.7×105   好
  D.M.20     60     5     30     2     3     3.5     1.1×107   2.3×106   3.4×105   好
  D.M.21     50     1     45     2     2     3.5     1.2×108   2.3×107   2.3×106   好
  D.M.22     45     5     45     2     3     2.5     1.6×108   2.1×107   2.5×106   好
  D.M.23     45     3     50     1     1     2.0     2.2×108   1.3×107   3.2×106   好
                                                  表X(续)(单位：w/w％)
  递送介质(D.M.) 麦饼 脱乙酰壳多糖   木屑  几丁质 Pharmamedia    YGM*     WYE20或WYE324的起始细胞数(cfu/g)        3个月后WYE20或WYE324的细胞数(cfu/g) 细胞生长
    在4℃     在25℃
  D.M.24     40     3     55     1     1     1.5     2.9×108   2.1×107   3.6×106   好
  D.M.25     40     1     55     3     1     0.5     1.4×108   1.9×107   2.6×106   好
  D.M.26     40     1     55     1     3     0.2     1.2×108   1.3×107   2.9×106   好
YGM*：总重w/w％
如表IX和X所示，在D.M.1-26中WYE20和WYE324的细胞长时间稳定(＞3个月)。D.M.1-26的WYE20和WYE324的细胞显示＞105cfu/克，这是储存3个月后生物控制活性所需的细菌浓度。特别是，当使用包被了YGM培养基的D.M.14-26时，WYE20和WYE324细胞的稳定性得到改善。实施例VI悬浮液形式的生物控制剂的制备
将在1.0升蒸馏水的总体积中包含20克果胶和2克胶体几丁质的递送介质在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。通过将在“材料和方法”部分描述的链霉菌WYE20或WYE324掺入到所获得的经高压蒸汽灭菌递送介质中而制备悬浮液形式的生物控制剂(1.2×107cfu/毫升)。
将获得的产物保存在4℃。该生物控制剂的形式适用于处理植物种子并且通过犁田或在用水稀释之后喷洒而适用于苗床的处理。实施例VII抗真菌活性测试
进行体内生物控制测试以测定实施例V和实施例VI制备的生物控制剂的效力。通过处理植物、植物种子、植物根部、苗床、苗钵、盆栽混合物或土壤，对生物控制剂的降低真菌病害和加强植物生长的能力进行测试。
(1)对黄瓜丝核菌枯萎病的生物控制活性
进行生物控制测试以检测WYE20作为抑制丝核菌枯萎黄瓜的生物控制剂的效力。
通过将种子浸于20毫升的实施例VI制备的WYE20(1.2×107cfu/毫升)中3小时并且然后播种于苗钵中，以此对黄瓜种子进行处理。将种子分别在无菌蒸馏水和递送介质中浸3小时，将所得的各个种子作为对照。
用Hortus(英国)作为盆栽混合物。将盆栽混合物在121℃高压蒸汽灭菌60分钟，并且在25℃放置12小时，然后再次在121℃高压蒸汽灭菌60分钟。将该高压蒸汽灭菌循环重复3次。
将茄属丝核菌培养于PDB(马铃薯葡萄糖肉汤；Difco)在25℃培养14天，收获，并且与经高压蒸汽灭菌的盆栽混合物混合以获得约60％致病机会。将黄瓜种子用生物控制剂处理，将各个对照种子播种于含有盆栽混合物的苗钵中，该盆栽混合物中已经人工接种了茄属丝核菌。
将废弃的纸杯(直径9厘米)用作为播种苗钵。在每个测试制备每个杯含有3个种子的6个纸杯。将纸杯置于随机设计的温室的试验区中。湿度保持在40％和60％并且如果必要使用更多的水。温度保持在25℃和30℃的日光。
有周期地记录枯萎出现和发病率的结果。最后的结果显示于表XI。
                                       表XI
    处理   种植的黄瓜种子数 发芽的黄瓜种子数(％) 健康植株(％) 鲜重(克)/地上部分
    7天   14天   18天
  没有病源体+对照     18     18b*(100) 18b*(100)   2.61b*
  茄属丝核菌+对照     18     7a(39)   7a(39)   1.73a
  茄属丝核菌+液体D.M.处理     18     8a(44)   8a(44)   1.75a
  茄属丝核菌+WYE20处理     18     18b(100)   18b(100)   2.51b
*跟随相同字母的栏中的平均值在P＝0.05水平的差异不十分显著。D.M.：递送介质。
如表XI所示，用作为生物控制剂的递送介质中的WYE20处理的黄瓜种子没有显示黄瓜的丝核菌枯萎病。另外，由对照种子生长的黄瓜植物显示由茄属丝核菌导致的严重的生长延迟，而由经处理的种子长出的植物没有这种现象。该结果显示WYE20可有效地控制茄属丝核菌和加强植物生长。
(2)对黄瓜霉粉病的生物控制活性
进行生物控制测试以检测实施例VI制备的WYE324(1.2×107cfu/毫升)作为抑制苗钵中的黄瓜植株的霉粉病的生物控制剂的效力。
将废弃的纸杯(直径9厘米)用作为播种苗钵。在含有盆栽混合物的每个杯中播种1个黄瓜种子。所述盆栽混合物由农田土壤和Hortus(英国)(4∶1；v/v比例)组成。将纸杯置于温室。如果必要使用更多的水。温度保持在25℃和30℃的日光。
在测试开始时将20毫升的含有WYE324的生物控制剂喷洒到一株黄瓜植株(14天龄)上并且在1星期之后再喷洒1次。将用相同量的水喷洒的植物作为对照。在该测试中处理组和对照组各有3个黄瓜植株(每杯一个黄瓜植株)。
为了天然诱导由苍耳单丝壳菌引起的霜霉病，使用每组3个纸杯和三个发病的黄瓜植物(每纸杯一个植物)并且随机排布置于温室中。将湿度保持在70％到90％之间。如果必要使用更多的水。温室温度保持在25℃和30℃之间。调查黄瓜霜霉病发生的机会。试验持续2星期并且重复该测试。结果显示于表XII。
                 表XII
    处理     黄瓜霜霉病发病机会
    试验1     试验2
    对照      +      +
  WYE324处理的      -      -
如表XII所示，在用含有WYE324的生物控制剂喷洒的黄瓜植物中没有检测到霜霉病，而在对照植物中观察到疾病。结果显示WYE324可有效地控制黄瓜的霜霉病。
(3)链霉菌WYE20或WYE324对高尔夫球场绿色爬行牧草的丝核菌棕色斑的生物控制活性
进行生物控制测试以检测链霉菌WYE20和WYE324对高尔夫球场绿色爬行牧草的丝核菌棕色斑的抑制效力。
将上述“材料和方法”部分描述的液体培养基产生的链霉菌WYE20和WYE324用于该测试。将链霉菌WYE20或WYE324的细胞数调整到2.0×105cfu/毫升。在用WYE20或WYE324或对照处理的各个试验块进行该测试。在一个高尔夫球场制备各含四个试验块(1.5厘米×1.5厘米)的处理组和对照组。以随机设计的试验块进行该测试。从1996年6月25日到1996年8月23日在试验块上每隔7-10天喷洒WYE20或WYE324菌株。每次喷洒每个试验块使用2.5升的WYE20或WYE324；而给对照试验块提供相同量的水。在试验期间没有使用化学杀真菌剂。定期地记录丝核菌棕色斑的出现并且显示于表XIII(位置1)和XIV(位置2)。
如表XIII(位置1)和XIV(位置2)所示，在用WYE20或WYE324菌株处理的试验块中丝核菌棕色斑急剧降低。结果显示WYE20和WYE324可有效地抑制高尔夫球场绿色爬行牧草的丝核菌棕色斑。
                        表XIII(位置1)
    处理              丝核菌棕色斑出现(％)
    7/25/96     8/6/96     8/23/96
    对照WYE20处理的WYE324处理的     10.18a*3.38b0.00c     14.6a*9.2b5.2c     59a*24b24b
*跟随相同字母的栏中的平均值在P＝0.05水平时没有显著差异。
                        表XIV(位置2)
    处理            丝核菌棕色斑出现(％)
    7/25/96     8/6/96     8/23/96
    对照WYE20处理的WYE324处理的     5.6a*0.0b0.0b     9.3a*0.8b0.0b     28.3a*5.3b0.7c
*跟随相同字母的栏中的平均值在P＝0.05水平时没有显著差异。
(4)对走道草坪(Zoysia japonica)的丝核菌大斑块的生物控制活性。
进行生物控制测试以检测在实施例VI制备的包括链霉菌WYE20或菌株IBT678的生物控制剂对走道草坪(Zoysia japonica)的丝核菌大斑的抑制效力。将生物控制剂中的链霉菌WYE20或菌株IBT678的细胞数调整到2.0×106cfu/毫升。
将茄属丝核菌AG2-2感染的土壤接种到走道草坪(Zoysia japonica)上并然后移植到苗钵(直径25厘米)中。分别在1996年和1997年每隔1星期用200毫升的生物控制剂处理一次，共处理2星期到3星期。用相同量的水处理的苗钵作为对照。每组使用三个苗钵并且置于温室中，按随机块排布。为了天然诱导疾病，从1996年的9月初到10月初以及从1997年3月初到6月末分别将苗钵置于高尔夫球场的走道附近。调查丝核菌大斑的出现，在用含有WYE20的生物控制剂处理的苗钵没有检测到大斑；而在对照和IBT678处理的苗钵中观察到疾病，如表XV所示。
                        表XV
    处理     Zoysia japonca大斑出现
    1996秋季     1997春季
    病源体+对照病源体+WYE20处理的病源体+WYE324处理的       +-没有测试       +-+
如表XV所示，结果显示WYE20有效地控制走道草坪(Zoysiajaponica)的丝核菌大斑。
(5)对胡椒植物疫霉枯萎病的生物控制
进行生物控制测试以检测实施例VI的含有链霉菌WYE20或WYE324的生物控制剂对苗钵中胡椒幼苗的幼苗枯萎病的抑制效力。
将胡椒种子浸于无菌水中2天并且通过用实施例VI制备的生物控制剂WYE20或WYE324将胡椒种子浸泡18小时(处理组)而对其进行处理。将链霉菌WYE20或WYE324细胞数分别调整到1.2×107cfu/毫升和1.7×107cfu/毫升。将胡椒种子浸于无菌水中2天并且然后浸泡18小时。将它们作为对照组。另一方面，将浸于无菌水中2天的胡椒种子再置于实施例VI的递送介质中18小时。将它们用作为其它的对照组。
如在上述用黄瓜进行的测试所述，将辣椒幼苗培养于PDB(马铃薯葡萄糖肉汤)在25℃培养14-21天，收获，并且接种到无菌的盆栽混合物(Horus，英国)中以获得感染的盆栽混合物，其对于对照组胡椒幼苗疫霉枯萎病有约80％疾病机会。所获得的用辣椒疫霉感染的盆栽混合物用于测定递送介质中链霉菌WYE20或WYE324对该测试中胡椒疫霉的幼苗枯萎病的抑制效力
将废弃的纸杯(直径9厘米)用作为幼苗苗钵。在每个测试中制备每个杯含有3个种子的14个纸杯。在温室中以25℃和32℃之间的日光温度进行试验。在该温室中，苗钵置于温室中，按随机排布。湿度保持在80％并且如果必要使用更多的水喷洒苗钵的顶部。
记录胡椒疫霉枯萎病的发生和发病率，结果显示于表XVI。
                                表XVI
    处理 种植的胡椒种子数 发芽的胡椒种子数(发芽％) 显示疫霉枯萎病的胡椒幼苗(发病％)
    14天   14天     18天
  没有病源体+对照     42     37(88a*)   0(0c*)     0(0c*)
  辣椒疫霉+对照     42     34(81a)   28(82a)     33(97a)
  辣椒疫霉+液体D.M.处理的     42     35(83a)   29(83a)     34(97a)
  辣椒疫霉+WYE20处理的     42     34(81a)   12(35b)     26(76b)
  辣椒疫霉+WYE324处理的     42     36(86a)   22(61c)     28(78b)
*跟随相同字母的栏中的平均值在P＝0.05水平时没有显著差异。
如表XVI所示，经WYE20或WYE324菌株处理的种子长出的胡椒植物的疫霉枯萎病显著降低。结果显示本发明的WYE20和WYE324有效地抑制胡椒植物的疫霉枯萎病。
(6)利用胡椒幼苗测定加强植物生长的测试
进行幼苗控制测试以测定本发明的含有链霉菌WYE20和WYE324的生物控制剂对加强胡椒幼苗的生长的效力。
将胡椒种子浸于无菌水中2天并且用实施例V(D.M.22)制备的生物控制剂中的WYE20或WYE324处理(每4克生物控制剂处理1000个种子)。在种子处理之前分别将链霉菌WYE20和WYE324细胞数分别调整到1.2×107cfu/毫升和1.7×107cfu/毫升。将胡椒种子浸于无菌水中并且用作为对照组(对照1)。同时，将胡椒种子用不含有WYE20或WYE324的递送介质处理(每4克D.M.22处理1000个种子)并且将它们用作为其它的对照组(对照2)。
如在上述用黄瓜进行的测试所述相同的方法将辣椒种子种植。
将废弃的纸杯(直径9厘米)用作为幼苗苗钵。在每个测试制备每个杯含有1个种子的121个纸杯。在温室中以25℃和32℃之间的日光温度进行试验。在该温室中，按随机块安排将苗钵置于温室。湿度保持在40％到60％的范围内，并且如果必要使用的水喷洒苗钵的顶部。将15毫升的在“材料和方法”部分获得的链霉菌WYE20或WYE324细胞培养物肉汤接种到在栽培4星期之后用生物控制剂处理的幼苗苗钵中。给对照组相同量的水。试验持续9星期并且结果显示于表XVII。
                      表XVII
    处理   胡椒幼苗   植物高度(厘米)(平均)
    对照1     121     23.7a*
    对照2     121     24.5a
  WYE20处理的     121     27.4b
  WYE324处理的     121     28.6b，c
*跟随相同字母的栏中的平均值在P＝0.05水平时没有显著差异。
如表XVII所示，与从对照种子繁殖的那些植物相比，用WYE20或WYE324处理的胡椒种子生长的植株其生长显著加强。这表明本发明的WYE20或WYE324可高度有效地加强胡椒植物的生长。
(7)利用胡椒幼苗在农田进行生物控制测试
进行生物控制测试以测定本发明的生物控制剂对农田控制疫霉枯萎病和加强植物生长的效力。
将在无菌水中浸泡2天的胡椒种子浸泡于由实施例VI制备的生物控制剂中3小时。将种子用实施例V制备的生物控制剂(D.M.22)处理(每4克1000和种子)。在处理种子之前分别将链霉菌WYE20和WYE324细胞数分别调整到1.2×107cfu/毫升和1.7×107cfu/毫升。
再将胡椒种子浸于无菌水中2天和3小时。由此将胡椒种子用不含有WYE20或WYE324的相同递送介质处理并且将它们用作为对照组。将各个种子种植于苗床。按需喷洒水并且将温度保持在20℃和35℃之间。当幼苗生长到1.5-2.0厘米高度时，将胡椒幼苗移植到由25幼苗穴(5厘米×5厘米，6厘米深)组成的幼苗盘中，所述幼苗穴含有精细沙子的盆栽土壤和递送介质中的WYE20或WYE324的混合物(每个幼苗穴0.1克)。将对照胡椒幼苗移植到含有相同量的精细沙子的盆栽土壤和相同量的仅为递送介质的幼苗穴。将这些幼苗苗钵置于温度为18℃-35℃的温室，如果必要供应更多的水。在该温室中，将苗钵按随机试验块安排。在温室生长11星期之后，将各个植株移植到农田。在移植之前1星期，向每个处理组的幼苗穴加入10毫升的WYE20或WYE324的培养物肉汤(1.2-1.7×105cfu/毫升)。给对照幼苗苗钵提供相同量的水。
定期地观察移植的胡椒的发病率和生长情况，记录平均值显示于表XVIII(农田1)和XIX(农田2)。
                         表XVIII(农田1)
    处理 移植的胡椒植物的数量 在移植62天之后植株高度(厘米)   疫霉枯萎病的发病率(％)
 移植之后62天 移植之后101天
    对照WYE20处理WYE324处理     1.3401.3401.340     78.5a*86.0b90.5c   28.4a*23.5b8.7c   98.6a*89.2b76.1c
*跟随相同字母的栏中的平均值在P＝0.05水平时没有显著差异。
                   表XIX(农田2)
    处理   移植的胡椒植株的数量     疫霉枯萎病的发病率(％)
  移植之后82天     移植之后101天
    对照WYE20处理的WYE324处理     860860860     26a*0b0c     42.4a*7.6b2.0c
*跟随相同字母的栏中的平均值在P＝0.05水平时没有显著差异。
如表XVIII和XIX所示，与从对照种子繁殖的那些植物相比，用WYE20或WYE324处理的胡椒种子生长的植株的生长显著加强和疫霉枯萎病降低。这表明本发明的WYE20或WYE324可高度有效地控制农田疫霉枯萎病和加强胡椒植物的生长。
已经提供了本发明的实施方案的实施例和优选的实施方案，对本领域内技术人员来说可以进行不背离本发明精神和不超越其更宽的方面的修饰和改变是不言而喻的。因此，许多变化，修饰和实施方案被认为在本发明的真实的精神和范围内。
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Claims (22)

1.微生物链霉菌WYE20和链霉菌WYE324的生物学纯的培养物，分别具有KCTC0341BP和KCTC0342BP的鉴定特性。
2.包括链霉菌WYE20和链霉菌WYE324的生物学纯的培养物的微生物的抗真菌生物控制剂。
3.根据权利要求1和2所述的微生物，其中的微生物能够保护敏感性植物使其免受真菌感染。
4.根据权利要求3所述的微生物，其中保护是指抗引起幼苗疾病的真菌病源体，所述疾病包括枯萎病和根部腐烂以及叶的病害，包括黄瓜霜霉病、胡椒的疫霉枯萎病或草坪的丝核菌棕色/大斑。
5.根据权利要求2所述的抗真菌生物控制剂，其中生物控制剂包括链霉菌WYE20或链霉菌WYE324的生物学纯的培养物和递送介质。
6.根据权利要求5所述的抗真菌生物控制剂，其中递送介质由占递送介质总重量40-65w/w％的麦饼、1-5w/w％的脱乙酰壳多糖、30-55w/w％的木屑、1-3w/w％的几丁质和1-3w/w％的Pharmamedia组成。
7.根据权利要求6所述的抗真菌生物控制剂，其中递送介质还含有0.2-3.5w/w％的孢子形成培养基。
8.根据权利要求6和7所述的抗真菌生物控制剂，其中链霉菌WYE20或链霉菌WYE324的生物学纯的培养物包含105-1010个菌落形成单位/克递送介质。
9.根据权利要求5所述的抗真菌生物控制剂，其中递送介质由在水中的1.0-3.0w/w％的果胶和0.1-0.6w/w％的胶体几丁质组成。
10.根据权利要求9所述的抗真菌生物控制剂，其中链霉菌WYE20或链霉菌WYE324的生物学纯的培养物包含105-1010个菌落形成单位/克递送介质。
11.制备抗真菌生物控制剂的方法，包括生产链霉菌WYE20或链霉菌WYE324的生物学纯的培养物的培养过程；和下游过程。
12.根据权利要求11所述的培养过程，其中该过程包括在25℃-33℃以130-300rpm培养3-7天。
13.根据权利要求11所述的下游过程，其中该过程包括将收获的链霉菌WYE20或链霉菌WYE324的纯培养物冻干。
14.根据权利要求11所述的下游过程，其中该过程包括将收获的纯培养物掺入到合适的递送介质中。
15.制备抗真菌生物控制剂的方法，其中该方法包括下面的步骤：
制备含有占递送介质总重量40-65w/w％的麦饼、1-5w/w％的脱乙酰壳多糖、30-55w/w％的木屑、1-3w/w％的几丁质和1-3w/w％的Pharmamedia的递送介质；
将获得的递送介质高温蒸汽灭菌；
将链霉菌WYE20(KCTC 0341BP)或链霉菌WYE324(KCTC0342BP)掺入到所得递送介质中；
在25℃-33℃将被掺入的链霉菌WYE20(KCTC 0341BP)或链霉菌WYE324(KCTC 0342BP)培养5-14天；和
无菌干燥所获得的产物。
16.根据权利要求15所述的制备抗真菌生物控制剂的方法，其中该方法包括无菌混合所获得的干燥产物。
17.根据权利要求15所述的递送介质的制备，其中该制备包括使递送介质形成团丸，并且用0.2-3.5w/w％的孢子形成培养基包被所得的团丸。
18.根据权利要求15所述的掺入，其中链霉菌WYE20或WYE324包含105-1010菌落形成单位/克递送介质。
19.根据权利要求15所述的高压蒸汽灭菌，其中该高压蒸汽灭菌包括在121℃灭菌30-40分钟。
20.制备抗真菌生物控制剂的方法，其中该方法包括如下步骤：
制备由1.0-3.0w/w％的果胶、0.1-0.6w/w％的胶体几丁质和余量的水组成的递送介质；
将获得的递送介质高温蒸汽灭菌；
将链霉菌WYE20(KCTC 0341BP)或链霉菌WYE324(KCTC0342BP)掺入到所得的递送介质中。
21.根据权利要求20所述的掺入，其中链霉菌WYE20或WYE324包含105-1010菌落形成单位/克递送介质。
22.权利要求2-10所述的抗真菌生物控制剂的应用方法，其中所述的应用包括包被、混合、喷洒，或在犁田时应用到植物种子、盆栽混合物、生长的植物或其土壤上。
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