CN107177537A

CN107177537A - 细菌菌株，微生物菌剂及其应用

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Publication number: CN107177537A
Application number: CN201710564349.1A
Authority: CN
Inventors: 任萍; 顾金刚; 卢昌艾
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2017-09-19
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN107177537B

Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种细菌菌株，微生物菌剂及其应用。所述菌株为苏云金芽孢杆菌A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.14089；保藏时间为：2017年5月4日。含有该菌株的菌剂尤其适合北方玉米秸秆的快速降解，在作物秸秆田间原位还田中具有重要作用，同时具有能够增加土壤腐殖质、提高土壤肥力的作用。

Description

细菌菌株，微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种细菌菌株，微生物菌剂及其应用。

背景技术

我国作物秸秆资源丰富，数量巨大，种类多样，每年的作物秸秆产出量7～8亿吨。由于秸秆在短期内不易腐解，利用效率低，绝大部分秸秆废弃或被焚烧，在种植业为主的地区，作物秸秆已经成为生产中的障碍。所以，焚烧秸秆遍及广大乡村，由此引起环境污染与有机资源的严重浪费。据统计，全国用作还田和有机肥料的作物秸秆仅占总量的20％左右，焚烧占17％，尚有50％未被利用。

我国北方地区的诸多省份都是农业大省，对秸秆处理的需求更为迫切。北方地区秋冬季节气候冷凉，不利于玉米秸秆木质素、纤维素的降解。所以突破北方地区不良气候的条件下，秸秆大规模、快速腐熟还田技术瓶颈是实现我国北方地区秸秆利用亟待解决的问题。选育和利用作物秸秆高效耐低温的降解微生物菌株，研发高效降解菌剂，建立作物秸秆田间原位生物转化还田技术，是解决我国北方秸秆降解问题的重要发展趋势之一。

利用秸秆降解微生物进行玉米、小麦、水稻秸秆的降解与原位还田具有巨大的应用潜力。复合菌系的筛选研究也有一些报道，有关秸秆发酵菌剂的产品非常少，尚未形成体系，更没有稳定高效秸秆快速降解菌群的生产使用。秸秆快速腐解技术尚未得到有效地解决，限制了秸秆资源的高效利用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一方面目的在于提供具有纤维素降解功能的细菌菌株，该菌株耐低温能力强，且具有非常好的纤维素降解功能。

本发明的另一目的在于提供包含如上所述细菌菌株的微生物菌剂，该混合菌剂分解纤维素的能力明显强于其中任何一个单一菌株，可很好地应用于秸秆降解之中。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

根据本发明的一方面，涉及一种细菌菌株，所述菌株为苏云金芽孢杆菌A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.14089；保藏时间为：2017年5月4日。

该菌种的拉丁学名为Bacillus thuringensis，中文学名为苏云金芽孢杆菌，菌株名为A2。

该菌株具有高效的秸秆降解功能，且对低温耐受性较强。

上述的经过分离纯化的弯曲芽孢杆菌，其菌落为蜡滴状，淡黄色不透明，边缘不规则并伴有略微凸起，层呈齿状。

含有所述苏云金芽孢杆菌A2的微生物菌剂也属于本申请要求保护的范围。对于该菌株而言，考虑到应用时的秸秆降解效率及其可能需要运输等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。

优选的，上述微生物菌剂还包括以下菌株中的一种、两种或全部：

菌株为弯曲芽孢杆菌A1，保藏编号为CGMCC NO.14088；

香草芽孢杆菌B2，保藏编号为CGMCC NO.14090；以及

弯曲芽孢杆菌D3，保藏编号为CGMCC NO.14091；

上述噬菌体均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2017年5月4日。

在一些实施方式中，所述微生物菌剂中含有所述苏云金芽孢杆菌A2及所述弯曲芽孢杆菌A1；

在一些实施方式中，所述微生物菌剂中含有所述苏云金芽孢杆菌A2及所述香草芽孢杆菌B2；

在一些实施方式中，所述微生物菌剂中含有所述苏云金芽孢杆菌A2及所述弯曲芽孢杆菌D3；

在一些实施方式中，所述微生物菌剂中含有所述苏云金芽孢杆菌A2、所述弯曲芽孢杆菌A1及所述香草芽孢杆菌B2；

在一些实施方式中，所述微生物菌剂中含有所述苏云金芽孢杆菌A2、所述弯曲芽孢杆菌A1及所述弯曲芽孢杆菌D3；

在一些实施方式中，所述微生物菌剂中含有所述苏云金芽孢杆菌A2、所述香草芽孢杆菌B2及所述弯曲芽孢杆菌D3。

优选的，如上所述的微生物菌剂，以活菌数计，所述菌剂中弯曲芽孢杆菌A1、苏云金芽孢杆菌A2、香草芽孢杆菌B2以及弯曲芽孢杆菌D3的混合比例为(1～5):(1～5):(1～5)：(1～5)。

更优选的，所述菌剂中弯曲芽孢杆菌A1、苏云金芽孢杆菌A2、香草芽孢杆菌B2以及弯曲芽孢杆菌D3等比混合。

上述的微生物菌菌剂，优选为液体菌剂，该液体菌剂中，培养液可优选为液体培养基，例如LB液体培养基，或者进一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和烟酸等营养物。优选的，为了实现良好的纤维素降解效果，在该液体菌剂中，每种菌株的活菌的数量≥1×10⁷CFU/ml，优选的，每种菌株的活菌的数量是1×10^7-16CFU/ml；更优选为1×10^8-15CFU/ml，也可以选择1×10⁹CFU/ml，1×10¹⁰CFU/ml，1×10¹¹CFU/ml，1×10¹²CFU/ml，1×10¹³CFU/ml，1×10¹⁴CFU/ml等。

优选的，如上所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

本发明基于上述的液体微生物菌剂提供了一种制备方法，包括如下步骤：

将如上所述的菌株接种于液体培养基中进行培养，得到液体菌剂；

可选的，将所述液体菌剂过滤和/或浓缩。

整个微生物菌剂的制备方法简单，可以短时间保存和方便运输，使用的时候直接以一定的比例添加到土壤中即可，使用非常方便。

上述的微生物菌菌剂，优选为固体菌剂，所述固体菌剂由如上所述的菌株附加固态载体和/或助剂制备而成。

优选的，如上所述的微生物菌剂，所述固态载体包括草炭、糠粉、麦麸、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、白炭黑、滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种。

优选的，如上所述的微生物菌剂，所述助剂选自蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、豆粕、十二烷基苯磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物中的一种或两种以上的混合物。

本发明基于上述的固体微生物菌剂提供了一种制备方法，包括如下步骤：

将经过纯化后得到的所述菌株混于固态载体和/或助剂中既得。

如上所述的菌株、或如上所述的菌剂在秸秆消纳中的应用。

该菌剂可用于玉米、小麦、水稻秸秆的降解与原位还田。

与现有技术相比，本发明提供一种高效降解秸秆的微生物菌株，以及包含该菌株的微生物菌剂，该菌剂的主要成分四种微生物菌株构成，尤其适合北方玉米秸秆的快速降解，在作物秸秆田间原位还田中具有重要作用。同时，具有能够增加土壤腐殖质、提高土壤肥力的作用。

本发明提供的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，菌株名为A1，保藏编号CGMCCNO.14088；

本发明提供的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，菌株名为A2，保藏编号CGMCC NO.14089；

本发明提供的香草芽孢杆菌(Bacillus vanillea)，菌株名为B2，保藏编号CGMCCNO.14090；

本发明提供的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，菌株名为D3，保藏编号CGMCCNO.14091；

上述菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间均为：2017年5月4日。经保藏中心于2017年5月4日检测为存活菌株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了个微生物菌株的筛选方法及菌剂的组合方法。

1、实验材料

1.1菌株与土壤

供试菌株：菌种库保藏纤维素降解细菌。

东北黑土：吉林公主岭田间0～20cm表土。

1.2培养基

1.2.1细菌培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂16～18g，去离子水1L。

1.2.2细菌发酵培养基(YPD全营养培养基)：溶解酵母膏/酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L于1L去离子水中，pH 7.0。

1.2.3纤维素降解菌培养基：KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄ 0.25g、蛋白胨2g、羧甲基纤维素钠(CMC)1.88g、刚果红0.2g、琼脂16～18g，去离子水1L，pH 7.0。

1.2.4基础营养液(赫奇逊氏培养基)：磷酸二氢钾1.0g，NaCl 0.1g，NaNO₃ 2.5g，去离子水1L，pH自然。

单菌株低温活性筛选方法

2.1菌株活化与复壮

接种环挑取保藏斜面管内的菌落接种于不加琼脂的细菌液体培养基(1.2.1)内，在28℃温度下培养72h，制备单菌株供试菌液。

2.2菌株低温活性筛选

250ml三角摇瓶内加入40克土壤，喷水润湿润至含水量为30～50％田间持水率，透气膜封口湿热灭菌3～5次，用细菌培养基(1.2.1)平板检验土壤无活菌后，接种2ml供试菌液，28℃培育3天，然后以-20℃保温24h；20℃保温24h为一个循环。冻融循环9次后，在摇瓶内加入100ml无菌水，往复震荡(转速170r/min)30分钟制备土壤悬液，逐级稀释，平板计数法进行活菌计数测定。当冻融循环后土壤中菌体数量>10¹¹cfu/g土时，所接种的菌株判定为低温高活性。

表1

接种菌株	冻融循环9次后计数(cfu/g.土)
		A1	1.38×10¹²
A2	2.72×10¹¹
		B1	9.50×10¹²
B2	1.16×10¹²
		D1	6.50×10¹²
D2	5.60×10¹⁶
		D3	1.26×10¹²

2.3摇瓶法筛选高效秸秆降解菌株

于100mL三角瓶中，加入50ml基础营养液(1.2.4)和5g烘干玉米碎秸秆，湿热法灭菌后，接种表1高活性低温菌株，在30℃、170r/min振荡培养10天、15天和20天，每个处理重复三次，同时做基础营养液+秸秆对照CK，测定培养10天、15天和20天秸秆失重率，接种菌株处理秸秆的减重率比不接种菌空白对照秸秆减重率相对提高10％以上分别为降解功能强的菌株。

表2

表3

根据表2和表3，接种10天降解效果好的菌株有A1、A2、B1和B2，接种15天秸秆降解功能强的菌株有B1、B2、D1、D2和D3，接种20天的高效秸秆降解菌株包括A1、A2、B2和D3。

2.4复合菌系筛选

设置A1A2-B-D型4株菌组合即除去2株菌之后任意B1或B2菌与D1、D2或D3的组合。将各菌株组合的菌悬液按照体积比1∶1混合，分别接种6mL于混合有5克烘干秸秆的灭菌蛭石内，保持蛭石饱和吸水状态，在人工气候室培养20天(25℃日、20℃夜)；测定20d时秸秆失重率，每个重复3次，同时做基础营养液+秸秆对照CK。接种菌剂秸秆失重率与相对空白提高百分率为促腐率，促腐率大于10％者为所筛选的复合菌系。实验结果得到A1A2B3D3、A1A2B2D3、A1A2B2D1、A1A2B2D5、A1A2B2D4等5组复合菌系。

其中，A1即对应本发明保藏的弯曲芽孢杆菌A1；A2对应本发明保藏的苏云金芽孢杆菌A2；B2对应本发明保藏的香草芽孢杆菌B2；D3对应本发明保藏的弯曲芽孢杆菌D3；

表4

实施例2

本实施例提供了一种液体菌剂及其制备方法，具体包括以下步骤：

在细菌发酵培养基中(1.2.2)制备单株菌液，糠麸粉按固液比1：2比例吸附单菌液，制备单菌剂A1、A2、B2、D3；4种单菌剂等比例混合、风干装袋，完成复合菌剂的制备。

测得所得液体菌剂中为各菌株的含量均为1×10^10-11CFU/ml。

实施例3

在本实施例中，制备操作同实施例1，与实施例1不同的是，在本实施例中，制备单菌剂A1、B2、D3；3种单菌剂按照活菌数1:3:5的比例混合、风干装袋，完成复合菌剂的制备。

实施例4

本实施例提供了一种固体菌剂及其制备方法，具体包括以下步骤：

将上述实施例2制成的液体菌剂按照每1千克液体菌剂配30克滑石粉(作为固体载体)的比例加入至滑石粉中充分搅拌混匀，过滤、干燥、粉碎，即得固体菌剂。

实施例5

本实施例中，制备操作同实施例4，与实施例4不同的是，在本实施例中，所用的固体载体为滑石粉、细沙以及粘土等比例的混合物。

实验例田间效果验证

玉米10月收获后粉碎，在秸秆表面均匀施撒5公斤实施例2制备得到的复合菌剂，深翻30公分把秸秆埋入土中，同时埋入秸秆样袋，第二年春天开始测定秸秆样品腐解率(以减重率计算)。

表5

表6

表7

由表6和表7结果看出，在公主岭和双城春季玉米苗期和大喇叭口期(5月～7月)生长阶段，本发明提供的复合菌剂在田间对翻埋秸秆有很好的促腐效果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.细菌菌株，其特征在于，所述菌株为苏云金芽孢杆菌A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.14089；保藏时间为：2017年5月4日。

2.含有权利要求1所述菌株的微生物菌剂。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括以下菌株中的一种、两种或全部：

弯曲芽孢杆菌A1，保藏编号为CGMCC NO.14088；

香草芽孢杆菌B2，保藏编号为CGMCC NO.14090；以及

弯曲芽孢杆菌D3，保藏编号为CGMCC NO.14091；

4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，以活菌数计，所述菌剂中弯曲芽孢杆菌A1、苏云金芽孢杆菌A2、香草芽孢杆菌B2以及弯曲芽孢杆菌D3的混合比例为(1～5):(1～5):(1～5)：(1～5)。

5.根据权利要求2～4任一项所述的微生物菌剂，其特征在于，在所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，每种菌株的活菌的数量≥1×10⁷CFU/ml。

6.根据权利要求2～4任一项所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固体菌剂，所述固体菌剂由所述的菌株附加固态载体和/或助剂制备而成。

7.如权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述固态载体包括草炭、糠粉、麦麸、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、白炭黑、滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种；

优选的，所述助剂选自蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、豆粕、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物中的一种或多种的混合物。

8.权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述菌株接种于液体培养基中进行培养，得到液体菌剂；

可选的，将所述液体菌剂过滤和/或浓缩。

9.权利要求6或7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.权利要求1所述的菌株、或权利要求2～7任一项所述的微生物菌剂在秸秆消纳中的应用。