TW201313658A - 耐高溫多功能溶磷鉀微生物及其生物肥料製作 - Google Patents
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Abstract
由不同禽畜糞堆肥和生物肥料製備過程中分離得多功能耐高溫溶磷鉀細菌Bacillus licheniformis A3 BCRC 910522和Bacillus subtilis H8 BCRC 910523，可以在25和50℃下生長並溶解磷酸鈣、磷酸鋁、氫氧基磷灰石(hydroxyapatite)、磷礦石、長石、依利石及高嶺石活性外，同時具有澱粉質、纖維素、幾丁質、果膠質、蛋白質、脂質、聚木糖和角蛋白質分解酵素活性。當其接種至農業廢棄物及禽畜糞廢棄物等原料基質時，可加速腐熟、提升生物肥料品質與增加中溫和耐高溫溶磷和溶鉀微生物族群及其於中溫和耐高溫菌族群之比例。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522之生物肥料有較高可溶性磷含量和溶磷效率與中溫和耐高溫溶磷微生物族群及其於中溫和耐高溫總菌族群之比例。接種B. subtilis H8 BCRC 910523則有較短腐熟時間、較高可溶性鉀含量和溶鉀效率與中溫和耐高溫溶鉀微生物族群及其於中溫和耐高溫總菌族群之比例。因此接種不同多功能溶磷和溶鉀活性菌株製備生物肥料可提升磷和鉀移動及溶磷和溶鉀菌族群，提升生物肥料品質為永續農業上可行方式深具發展潛力。
Description
本發明係關於耐高溫溶磷鉀微生物Bacillus lichenifromis A3 BCRC 910522和Bacillus subtilis H8 BCRC 910523可以在25和50℃下生長，並具有溶解磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、氫氧基磷灰石(hydroxyapatide)及礦物磷4種無機磷活性外，亦可溶解長石、依利石及高嶺石3種無機鉀活性，同時具有澱粉質、纖維素、幾丁質、果膠質、蛋白質、脂質、聚木糖及角蛋白質分解酵素活性。當其接種至農業廢棄物及禽畜糞廢棄物等原料基質，製備多功能性生物肥料時，可以加速有機物分解、促進腐熟、增加可溶性磷和可溶性鉀含量及提高品質，增進中溫和耐高溫溶磷和溶鉀微生物生長。提高中溫和耐高溫溶磷和溶鉀微生物族群及其於中溫和耐高溫菌族群之比例。此種製備多功能性生物肥料，深具有機農業、資源回收和環境保護等永續經營應用。
磷和鉀是植物生長主要營養元素之一，可提供植物生長時生化代謝能量來源與組合細胞內遺傳物質、各種胞器、巨分子及化學物質之成分以及儲存細胞內能量、反應外來環境的刺激和進行訊息的傳遞。磷和鉀對於植物生長及繁衍，具有重要功能。但是在自然界中，雖然土壤富含磷和鉀源，但可供給植物利用的可溶性型態的磷和鉀非常少。例如土壤中磷的平均含量為0.05%(w/w)，其中只有0.1%可為植物利用型態，其餘的磷源則被土壤固定，形成植物不易吸收利用之固定態磷。在土壤中，總鉀含量介於<0.01-4%之間(Wild，1988)。大多數的土壤之總鉀含量約為1%，但可供植物吸收利用之可溶性鉀只佔非常小部份，且土壤中鉀移動方向和土壤性質有密切關係(Blake等，1999)。農民為了增加收獲，使用大量化學磷肥和鉀肥，以提升土壤中可利用性磷和鉀含量，提供農作物吸收利用。但是使用大量的磷肥和鉀肥會造成土壤的酸化、地下水源污染和河川優養化等環境污染問題，而且化學磷肥和鉀肥一旦施用於農地時，在短時間內即會和土壤中之元素形成不可利用型態之複合物而降低其有效性，並造成環境污染和提高農業生產成本。因此如何利用土壤中所富含之不可溶性磷源和鉀源，將其溶出以提升土壤中可溶性磷和可溶性鉀含量，不但可減少化學肥料使用，更具永續經營概念，為現在農業重要課題。
微生物在土壤磷和鉀循環中扮演重要角色，如：溶磷菌和溶鉀菌。溶磷菌有溶解磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、氫氧基磷灰石(hydroxyapatite)及礦物磷等無機磷源活性(Chang和Yang，2009;Ogbo，2010)，而溶鉀菌則可溶解長石、高嶺石、依利石、雲母及蒙特石等無機鉀源活性(Hutchens，2009;Koele等，2009;Uroz等，2009、2011)。因此直接接種溶磷或溶鉀微生物於作物種子、植物根圈和鄰近根圈土壤及利用其製備含高可溶性磷和可溶性鉀生物肥料為目前農業上常用之方法，以提升土壤中可溶性磷和鉀含量、增加農業生產及永續農業經營(Badr等，2006;Nishanth和Biswas，2008;Kumar等，2009;Aria等，2010;Behbahani，2010;Singh和Reddy，2011)。
目前有機農業的概念一直在推廣中，生物肥料的使用即為其中之一。在生物肥料中接種固氮、溶磷、溶鉀、有機質分解、抗菌及菌根微生物等，以期增進生物肥料腐熟速度、氮磷鉀濃度、改良土壤物性及保護作物抵抗病害能力。當生物肥料施用於田間後，其所含之溶磷或溶鉀微生物可維持肥料中可溶性磷和可溶性鉀濃度，並溶解土壤中不可溶性磷和鉀源，以供農作物和土壤微生物生長代謝，增加農地產量(Nishanth和Biswas，2008;Chang和Yang，2009;Singh和Reddy，2011)。另外也減少化學磷肥和鉀肥使用，降低農業生產成本及減少因大量使用化學肥料所造成之環境生態污染。因此接種適合且有效之溶磷鉀微生物於各式有機廢棄物以製備富含可溶性磷和可溶性鉀之生物肥料，不但可降低化學磷肥和鉀肥使用，且可利用有機廢棄物，促進資源再利用、保護環境及提高產量，值得推廣(Nishanth和Biswas，2008;Chang和Yang，2009;Martinez等，2009;Ogbo，2010)。
由於在生物肥料製作過程中，會產生45-80℃以上高溫。目前所使用之溶磷或溶鉀微生物大部分是中溫菌，只能於中溫下生長，因此不適合生物肥料製作初期接種。因為生物肥料製作過程中，初期會產生45-80℃高溫而抑制中溫溶磷鉀微生物的生長。因此本發明擬生產含高肥力和高濃度可溶性磷和可溶性鉀之生物肥料，接種於中溫和高溫均能生長、同時具有溶解多種磷礦石活性及溶解多種鉀礦石活性之耐高溫溶磷鉀微生物。因其耐高溫特性可應用於生物肥料製作初期接種，參與生物肥料腐熟，表現耐高溫溶磷和溶鉀活性，縮短生物肥料腐熟時間，且其於中溫下亦可生長可應用於田間施用，表現中溫溶磷和溶鉀活性幫助植物生長。因此本發明從堆肥製作和生物肥料中分離數株耐高溫溶磷鉀微生物，並測試其於25和50℃培養時之溶解磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、氫氧基磷灰石(hydroxyapatite)、礦物磷、長石、依利石及高嶺石活性。進一步挑選適當分離株接種於農業廢棄物和禽畜糞廢棄物進行生物肥料製備，研究其於堆積過程中對生物肥料腐熟度、品質、磷和鉀移動及微生物相變化的影響，以供農業增產、資源回收、環境保護及永續農業應用。
本發明以堆肥製作及生物肥料為耐高溫多功能溶磷鉀微生物之分離源，因其具有複雜有機廢棄物組成和高溫特性，參與堆肥化過程之微生物應具多功能酵素活性和耐高溫生理特徵。一共進行22次堆肥場堆肥樣品和4次生物肥料樣品採集，於台灣不同地區、基質和調整資材(如：稻桿、稻殼、木屑，廢棄太空包、咖啡渣、酒糟、中藥殘渣，廚餘及食品加工後殘渣)、堆積方式之禽畜糞(如：豬、雞及牛糞)堆肥場採集不同堆積時間堆肥樣品。其中豬糞堆肥場採樣10次，主要以軌道式堆積法製備，堆積時間8-10週，溫度介於19-78℃。雞糞堆肥場採樣10次，主要以軌道式堆積法製備，堆積時間6-9週，溫度介於19-68℃。牛糞堆肥場採樣2次，以條積式堆積法製備，堆積時間5-13週，溫度介於31-70℃。為增加所分離微生物之多樣性，本發明也收集生技產業界所提供之生物肥料原料、半成品、成品與生物肥料接種***4種，溫度介於26-62℃。
微生物族群以連續稀釋傾倒培養基法進行偵測和篩選。中溫微生物為生長於25℃之菌落，而耐高溫菌則培養於50℃。溶磷微生物菌數以三種不同營養成份之磷酸鈣為唯一磷源培養基偵測和篩選。分別為NBRIP(National Botanical Research Institute’s phosphate)培養基，每升含glucose 10 g、Ca3(PO4)2 5 g、MgCl2‧6H2O 5 g、MgSO4‧7H2O 0.25 g、KCl 0.2 g、(NH4)2SO4 0.1 g及agar 15 g，pH 6.5±0.1。SCP(Sucrose calcium phosphate)培養基，每升含sucrose 10 g、Ca3(PO4)2 5 g、NH4NO3 0.27 g、MgSO4‧7H2O 0.1 g、KCl 0.2 g、yeast extract 0.1 g、MnSO4‧H2O 0.001 g、FeSO4‧7H2O 0.001 g及agar 15 g，pH 6.5±0.1。及PVK(Pikovskaya’s)培養基，每升含glucose 10 g、Ca3(PO4)2 5 g、(NH4)2SO4 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO4‧7H2O 0.1 g、KCl 0.2 g、yeast extract 0.5 g、MnSO4‧H2O 0.002 g、FeSO4‧7H2O 0.002 g及agar，15g，pH 6.5±0.1。
由上述豬、雞及牛糞堆肥與生物肥料中，共分離出977株溶磷微生物，其中694株為耐高溫微生物，283株為中溫微生物。包含621株耐高溫溶磷細菌、202株中溫溶磷細菌、50株耐高溫溶磷放線菌、40株中溫溶磷放線菌、23株耐高溫溶磷真菌及41株中溫溶磷真菌。分離株利用NBRIP、SCP及PVK平板檢測法分別於25和50℃培養5天，測量其菌落(CS)和溶磷圈(CZ)直徑，並計算CZ/CS比值為其溶磷酸鈣活性參數(TCPSAI)進行篩選。
694株耐高溫溶磷微生物於25和50℃均可生長，進一步分別在此兩種溫度下篩選菌落較大(代表生長快速)、溶磷圈較大(代表具有高溶磷活性)及溶磷酸鈣活性參數較高(代表有較高溶磷效率)之分離株。共挑選出耐高溫溶磷細菌47株、耐高溫溶磷放線菌7株和耐高溫溶磷真菌5株等共59株，於25和50℃在NBRIP、SCP及PVK進行溶磷酸鈣活性參數測試。
在微生物淋洗礦物研究中，發現微生物溶磷和溶鉀機制相似，均為酸化作用(acidification)、酵素分解作用(enzymolysis)、有機酸分泌(organic acid production)、夾膜吸附作用(capsule absorption)及聚合物質形成作用(polymer substance formation)，溶磷微生物也可能具有溶鉀機制。因而本發明利用以鉀礦石為唯一鉀源之改良式Bromfield培養基平板檢測法於25和50℃培養5天後偵測耐高溫溶磷微生物生長情形和溶鉀活性。以鉀礦石為唯一鉀源之改良式Bromfield培養基每升含glucose 5 g、NaH2PO4 0.5 g、MgSO4‧7H2O 0.5 g、(NH4)2SO4 1.0 g、NaCl 0.2 g、供試鉀礦石50 g及agar 20 g，pH 6.5±0.1。供試鉀礦石粉末分別為長石(總氮、總磷及總鉀含量分別為0.0025±0.0008、0.034±0.004及42.2±5.8 g kg-1 feldspar)、依利石(總氮、總磷及總鉀含量分別為0.0012±0.0003、0.024±0.006及3.2±0.8 g kg-1 illite)及高嶺石(總氮、總磷及總鉀含量分別為0.0028±0.0009、0.023±0.006及4.1±0.3 g kg-1 kaolinite)。以長石、依利石及高嶺石為唯一鉀源之改良式Bromfield培養基在本發明中分別簡稱為長石、依利石及高嶺石培養基。
耐高溫溶磷細菌分離株以長石培養基在25和50℃培養時菌落直徑分別介於2.0±0.2-13.0±2.3 mm和2.5±0.0-23.2±1.3 mm。以依利石培養基在25和50℃培養時菌落直徑分別介於1.9±0.2-12.4±1.2 mm和2.1±0.2-21.6±2.9 mm。以高嶺石培養基在25和50℃培養時菌落直徑分別介於1.5±0.2-10.6±0.1 mm和1.6±0.0-14.7±2.6 mm。分離株Bacillus lichenifromis A3 BCRC 910522及B. subtilis H8 BCRC 910523於50℃培養時均形成較大菌落，因此挑選此兩種分離株作進一步研究。
耐高溫溶磷微生物在25和50℃生長時均具有溶鉀活性，可稱為耐高溫溶磷鉀微生物。本發明篩選出耐高溫溶磷鉀細菌B. lichenifromis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523分別在長石、依利石及高嶺石培養基於50℃培養時均有較大菌落，可知其在高溫和含鉀礦石環境下，皆可快速生長和表現溶鉀活性，適合接種於堆肥製備，提升堆肥可溶性鉀濃度和改善品質。在三種鉀礦石培養基於25℃培養下也可形成菌落，可知當堆肥施放於田間後，在中溫土壤也可生長並溶解鉀，以供作物所需，提升產量。這2株微生物同時具有中溫和耐高溫溶磷和溶鉀活性，可運用於堆肥製作和農業生產，提升堆肥和土壤可溶性磷和可溶性鉀含量，值得資源回收和永續農業所應用。
由於禽畜糞堆肥製作時，在發酵初期會產生60-80℃高溫，因此在此高溫下依然可生長之耐高溫溶磷鉀微生物為製備生物肥料之較佳選擇。如這些微生物在此高溫下具有多樣性酵素活性，更可加速堆肥腐熟，縮短製備時間和降低成本，如在中溫培養時也同時表現這些活性，則其應用價值更高，可稱為多功能耐高溫溶磷鉀微生物。耐高溫溶磷鉀細菌分離株B. lichenifromis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523其生長溫度範圍皆介於10-75℃。它們均具有溶解多種無機磷礦石和無機鉀礦石活性。因而本發明挑選為專利菌株，其可加速轉換禽畜糞堆肥為生物肥料及提升肥料中可溶性磷和可溶性鉀含量。這些微生物之溶磷和溶鉀活性、酵素活性及生物肥料製作實例如下所示，以進一步了解本發明，但是對於所附帶請求專利部分並無侷限用意。
耐高溫多功能溶磷鉀細菌分離株A3和分離株H8之型態如圖1和圖2所示。兩個分離株皆為桿菌，有內生孢子。其生化特性如表1所示。兩個分離株皆可以水解澱粉和酪蛋白(casein)，皆可以在10-75℃下生長。分離株A3和分離株H8以16S核糖體DNA分子鑑定結果如表2所示。分離株A3與Bacillus licheniformis ATCC 14580相似度達99.9%，故命名為Bacillus licheniformis A3。分離株H8與Bacillus subtilis strain BJ-1相似度達100%，故命名為Bacillus subtilis H8。並將Bacillus licheniformis A3和Bacillus subtilis H8寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，編號分別為Bacillus licheniformis A3 BCRC 910522及Bacillus subtilis H8 BCRC 910523。
耐高溫溶磷鉀細菌B. lichenifromis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523之溶無機磷活性如表3及圖3-7所示。其溶磷酸鈣活性以NBRIP、PVK及SCP測定。溶磷酸鋁(AlPO4)、磷酸鐵(FePO4)、氫氧基磷灰石(hydroxyapatite)及磷礦石(以色列磷礦石，每公斤含P 285克、N<0.2克、K 0.9克、Na 40克、Ca 13克、Mg 38克及C 341克)活性則分別以等量磷酸鋁、磷酸鐵、氫氧基磷灰石及磷礦石取代磷酸鈣為唯一磷源之PVK培養基進行測定(簡稱為磷酸鋁、磷酸鐵、氫氧基磷灰石及磷礦石培養基)。
如表3所示，此二菌株均可於25和50℃在NBRIP、PVK及SCP上生長和表現溶磷酸鈣活性。B. subtilis H8 BCRC 910523於25和50℃培養下有溶磷酸鋁活性。B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523於25和50℃下亦有溶氫氧基磷灰石及礦物磷活性。此二菌株之酸化培養基和溶無機磷活性再分別以NBRIP、PVK、SCP、磷酸鋁、磷酸鐵、氫氧基磷灰石及磷礦石培養基液態檢測法於25和50℃連續培養10天，測定培養液pH和可溶性磷含量。
此2株供試菌株在NBRIP、PVK及SCP液態培養基於25和50℃培養10天之酸化培養基和溶磷酸鈣活性變化如圖3所示。分離株溶磷酸鈣和酸化培養基活性有正相關性。以NBRIP液態培養基於25℃培養時，未接種微生物對照組pH和可溶性磷含量維持恆定。B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523酸化培養基和溶磷酸鈣活性均隨培養時間而上升，培養第10天有最低pH和最高可溶性磷含量(圖3a和3b)。
在NBRIP於50℃培養時，未接種微生物對照組之pH和可溶性磷含量均無顯著變化。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522之酸化培養基和溶磷酸鈣活性隨培養時間上升，培養第10天其培養基pH最低值和最高可溶性磷含量。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之pH和可溶性磷含量均無顯著變化(圖3c和3d)。
以PVK液態培養基於25℃培養時，未接種微生物對照組培養基pH和可溶性磷含量均無顯著變化。接種B. subtilis H8 BCRC 910523於培養第2天有最高酸化培養基活性和溶磷酸鈣活性，之後均隨培養時間逐漸下降。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522於培養第2天表現最高酸化培養基活性和溶磷酸鈣活性，之後酸化培養基活性持續下降，溶磷酸鈣活性於培養第6天出現最低值，之後稍為上升(圖3e和3f)。
以PVK於50℃培養時，未接種微生物對照組培養基pH和可溶性磷含量保持穩定無顯著變化。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523於培養第2天表現最高酸化培養基活性，其溶磷酸鈣活性亦於第2天急速上升，之後略微下降，再上升至第10天最高(圖3g和3h)。
供試菌株以SCP液態培養基於25℃培養所得之酸化培養基和溶磷酸鈣活性如圖3i和3j所示。未接種對照組培養基pH和可溶性磷含量均維持衡定。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522培養第2天pH最低，之後逐漸上升。其溶磷酸鈣活性也於培養第2天最高，之後略微降低，培養第10天最低值，且小於未接種對照組，其溶磷酸鈣活性低於轉換為生質量活性。接種B. subtilis H8 BCRC 910523酸化培養基活性於培養第4天到達最高，之後隨培養時間pH值逐漸上升，培養第10天pH值最高。其可溶性磷含量於培養過程中均低於未接種對照組，溶磷酸鈣活性低於轉換為生質量活性。
未接種微生物之SCP液態培養基於50℃培養10天之pH和可溶性磷含量均無顯著變化。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522於培養第2天有最高酸化培養基和溶磷酸鈣活性，之後培養基pH持續上升至第10天。溶磷酸鈣活性均低於微生物吸收可溶性磷轉換為生質量。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之酸化培養基活性從第0天持續上升至第6天，之後再緩慢下降至第10天。溶磷酸鈣活性由第0天緩慢上升至第6天，之後逐漸下降至第10天(圖3k和3l)。
B. licheniformis A3 BCRC 910522以PVK液態培養基於25℃培養2天有最高酸化培養基活性，培養4天次之，而以SCP液態培養基於50℃培養10天最低。以PVK液態培養基於50℃培養10天有最高溶磷酸鈣活性，而於25℃培養2天次之，以SCP液態培養基於50℃培養10天最低值。B. subtilis H8 BCRC 910523以PVK液態培養基於50℃培養10天有最高酸化培養基活性，以25℃培養2天次之，而以SCP液態培養基於25℃培養10天最低值。但其以PVK液態培養基於25℃培養2天後有最高溶磷酸鈣活性，以50℃培養10天次之，而以NBRIP液態培養基於50℃培養10天最低。
因此耐高溫溶磷鉀細菌以PVK培養基培養時有最高酸化培養基和溶磷酸鈣活性，以NBRIP培養次之，而以SCP最低。PVK為耐高溫溶磷鉀細菌表現酸化培養基和溶磷酸鈣活性較佳培養基，而SCP較差。當以NBRIP培養時，B. subtilis H8 BCRC 910523以25℃培養時有最高溶磷酸鈣活性。
供試菌株以液態磷酸鋁培養基培養時，酸化培養基和溶磷酸鋁活性如圖4所示。於25℃培養時，未接種微生物對照組pH和可溶性磷含量維持恆定。當接種B. licheniformis A3 BCRC 910522時，培養基pH維持穩定無顯著變化，與未接種微生物對照組無顯著差異。但其可溶性磷含量於培養過程中均低於未接種微生物對照組，逐漸下降至第4天最低值，之後再緩慢上升至第10天。培養前4天，所接種微生物利用培養基所含可溶性磷進行生長代謝，使可溶性磷含量降低。之後因微生物缺乏可溶性磷而生長受阻，部分死亡破碎的細胞釋放可溶性磷，導致可溶性磷含量緩慢上升。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之酸化培養基和溶磷酸鋁活性於培養第2天最高，之後逐漸降低，培養10天有最低值並與未接菌對照組無顯著差異(圖4a和4b)。
於50℃培養時，未接種微生物對照組pH和可溶性磷含量維持穩定。當接種B. subtilis H8 BCRC 910523之酸化培養基和溶磷酸鋁活性隨培養時間逐漸上升，培養第10天出現最大活性，培養基有最低pH和最高可溶性磷含量。當接種B. licheniformis A3 BCRC 910522並未表現酸化培養基和溶磷酸鋁活性，其培養基pH保持穩定且與對照組無顯著差異，可溶性磷含量均低於未接種微生物之對照組，第2天並出現最低值，之後緩慢上升至第10天(圖4c和4d)。可見B. licheniformis A3 BCRC 910522於培養前2天利用培養基可溶性磷進行生長，但2天後，因可溶性磷含量低而逐漸死亡，細胞破裂釋放可溶性磷，導致培養基可溶性磷稍為上升。
供試菌株於液態磷酸鐵培養基所表現之酸化培養基和溶磷酸鐵活性如圖5所示。未接種微生物對照組培養基pH和可溶性磷含量於25和50℃培養10天均無顯著差異。接種供試菌株可溶性磷含量均低於未接種微生物對照組，培養第2-4天出現最低值，之後緩慢上升。供試菌株於50℃培養時較25℃提前達最低可溶性磷含量，因供試菌株為耐高溫細菌，於50℃生長時較25℃為快，導致在50℃培養時可溶性磷含量吸收較25℃高。
圖6為供試菌株於液態氫氧基磷灰石培養基在25和50℃培養10天之pH和溶氫氧基磷灰石活性變化。未接種微生物對照組於25和50℃培養時pH和可溶性磷含量均維持恆定。接種B. subtilis H8 BCRC 910523於25℃培養時，酸化培養基和溶氫氧基磷灰石活性於培養第2天最高，之後緩慢下降至第10天最低。於50℃培養時，接種B. subtilis H8 BCRC 910523酸化培養基活性隨時間逐漸上升，第10天有最高溶氫氧基磷灰石活性。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522於25℃培養時在第2天表現最高酸化培養基活性，之後pH值緩慢上升至第10天。但於50℃培養時，培養基pH由第0天快速下降至第2天，之後無顯著差異維持恆定至第10天。溶氫氧基磷灰石活性亦於第2天最高，之後略微下降。
此2株供試菌株以液態磷礦石培養基培養之酸化培養基和溶磷礦石活性如圖7所示。未接種對照組培養基於25和50℃培養時，其pH和可溶性磷含量維持恆定。於25℃培養10天，B. licheniformis A3 BCRC 910522及B. subtilis H8 BCRC 910523於第2天表現最高酸化培養基和溶磷礦石活性，培養基有最低pH和最高可溶性磷含量，之後逐漸下降，第10天培養基有最高pH值和最低可溶性磷含量。於50℃培養時，B. licheniformis A3 BCRC 910522之酸化培養基和溶磷礦石活性均隨培養時間逐漸上升，於第10天出現最大值，培養基有最低pH和最高可溶性磷含量。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之酸化培養基和溶磷礦石活性由第0天快速上升，再緩慢上升至第4天後保持穩定pH值和可溶性磷含量。
因此耐高溫溶磷鉀細菌溶解磷酸鋁、氫氧基磷灰石及磷礦石活性與其酸化培養基活性有正相關性。B. subtilis H8 BCRC 910523於25℃培養第2天有最高溶磷酸鋁活性。B. licheniformis A3 BCRC 910522於25℃培養2天後表現最高溶氫氧基磷灰石活性，但於50℃時，經培養10天方出現最高溶氫氧基磷灰石活性。
以液態PVK、磷酸鋁、磷酸鐵、氫氧基磷灰石及磷礦石培養基於25℃培養，B. licheniformis A3 BCRC 910522表現3種溶無機磷活性，以溶磷酸鈣活性最高，溶氫氧基磷灰石活性次之，而溶磷礦石活性最低。B. subtilis H8 BCRC 910523表現4種溶無機磷活性(磷酸鈣、磷酸鋁、氫氧基磷灰石及磷礦石)，以溶磷酸鈣活性最高，溶磷礦石活性次之，而溶磷酸鋁活性最低。於50℃培養時，B. licheniformis A3 BCRC 910522有3種溶無機磷活性，以溶磷酸鈣活性最高，溶氫氧基磷灰石活性次之，而溶磷礦石活性最低。B subtilis H8 BCRC 910523於50℃培養時表現4種溶無機磷活性(磷酸鈣、磷酸鋁、氫氧基磷灰石及磷礦石)，以溶磷酸鈣活性最高，溶磷礦石活性次之，而溶磷酸鋁活性最低。因而此2株細菌均以磷酸鈣為最佳磷源，可供製作生物肥料並改良其可溶性磷含量之菌株。
由於長石、依利石及高嶺石為自然界含量較豐富之鉀礦石，因此B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523之溶鉀活性以偵測其溶長石、依利石及高嶺石之可溶性鉀離子活性為代表，同時測定其酸化培養基活性(Han和Lee，2005;Badr等，2006;Uroz等，2009)。此2株微生物分別以液態長石、依利石及高嶺石培養基於25和50℃培養20天，以自動化pH測定儀測量培養基pH值和atomic absorption spectrometry及ICP測定可溶性鉀，結果如圖8所示。2株供試菌株均可在長石、依利石及高嶺石培養基中生長與表現酸化培養基與溶長石、依利石及高嶺石活性，且於50℃培養時較25℃表現較高溶鉀活性，並以長石為最適鉀源，依利石次之，高嶺石較差。由微生物淋洗礦物研究中，微生物溶鉀機制有酸化作用、酵素分解作用、有機酸分泌、夾膜吸附作用及聚合物質形成作用。因此本發明之2株供試菌株可能利用兩種以上機制進行鉀礦石溶解釋放可溶性鉀。
未接種微生物對照組培養基於25和50℃培養時，其pH和可溶性鉀含量維持一定且無顯著變化(圖8)。未接種微生物之長石培養基於25和50℃連續培養20天之pH和可溶性鉀含量介於6.42±0.10-6.52±0.07和0.13±0.02-0.14±0.02 μg ml-1之間。未接種微生物之依利石培養基介於6.48±0.02-6.51±0.01和0.09±0.00-0.10±0.01 μg ml-1之間。未接種微生物之高嶺石培養基介於6.49±0.00-6.51±0.01和0.11±0.01-0.12±0.01 μg ml-1之間。此2株供試菌株以液態長石、依利石及高嶺石培養基檢測法於25和50℃培養時之酸化培養基活性均於培養第4天有最大值，之後隨培養時間下降，因微生物利用碳源後進而代謝蛋白質等含氮物質。酸化培養基活性在培養前10天，以50℃培養較25℃為高，因供試菌株於50℃培養生長代謝較25℃為快。但培養10天後，酸化培養基活性25℃培養較50℃為高，可溶性鉀含量以累積方式持續上升至第20天出現最大值。
B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523以液態長石、依利石及高嶺石培養基檢測法於25和50℃培養20天過程中均有最高酸化培養基和溶鉀活性，因此進一步進行生物肥料製作和提升其可溶性鉀含量之接種菌株。
由於製作生物肥料之有機質廢棄物種類繁多且成份複雜，包括農業、畜牧業、禽畜糞、屠宰場、蔬果市場、食品加工業、養殖漁業及都市廚餘等廢棄物，因此應用於生物肥料製作之接種菌株需具有多樣性酵素活性，方可於製作過程中生長代謝有機質、提升堆肥化活性、降低生產成本及改善堆肥品質。堆肥中之澱粉質、幾丁質、纖維素、半纖維素、角蛋白質、脂質、蛋白質、果膠質及聚木糖分解酵素等活性與堆肥腐熟、品質及微生物族群有關。因此本發明之B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523供試菌株分別以平板和液態檢測法於25和50℃培養進行偵測澱粉質、幾丁質、纖維素、脂質、果膠質、聚木糖、角蛋白質和蛋白質分解酵素活性，結果如圖9和圖10所示。澱粉質、幾丁質、纖維素、脂質、果膠質、聚木糖及蛋白質分解酵素活性分別以可溶性澱粉質-酵母抽取物培養基(每升含yeast extract 10 g、soluble starch 10 g及agar 15 g，pH為7.0±0.1)、幾丁質分解酵素分析培養基(每升含colloidal chitin 10 g、urea 0.3 g、(NH4)2SO4 1.4 g、KH2PO4 2 g、CaCl2‧6H2O 0.4 g、MgSO4‧7H2O 0.3 g、FeSO4‧7H2O 0.005 g、ZnSO4‧7H2O 0.014 g、MnSO4‧4H2O 0.016 g、CoCl2‧6H2O 0.002 g及agar 15 g，pH為7.0±0.1)、Mandels-Reese培養基(每升含carboxymethylcellulose(CMC) 10 g、peptone 1 g、urea 0.3 g、(NH4)2SO4 1.4 g、KH2PO4 2 g、CaCl2‧6H2O 0.4 g、MgSO4‧7H2O 0.3 g、FeSO4‧7H2O 0.005 g、ZnSO4‧7H2O 0.014 g、MnSO4‧4H2O 0.016 g、CoCl2‧6H2O 0.002 g及agar 15 g，pH為7.0±0.1)、丁酸甘油脂培養基(每升含peptone from meat 2.5 g、peptone from casein 2.5 g、yeast extract 3 g、tributyrin 10 ml及agar 15 g，pH為7.0±0.1)、果膠質分解酵素分析培養基(每升含pectin 10 g、urea 0.3 g、(NH4)2SO4 1.4 g、KH2PO4 2 g、CaCl2‧6H2O 0.4 g、MgSO4‧7H2O 0.3 g、FeSO4‧7H2O 0.005 g、ZnSO4‧7H2O 0.014 g、MnSO4‧4H2O 0.016 g、CoCl2‧6H2O 0.002 g及agar 15 g，pH為7.0±0.1)、聚木糖分解酵素分析培養基(每升含oat xylan 10 g、urea 0.3 g、(NH4)2SO4 1.4 g、KH2PO4 2 g、CaCl2‧6H2O 0.4 g、MgSO4‧7H2O 0.3 g、FeSO4‧7H2O 0.005 g、ZnSO4‧7H2O 0.014 g、MnSO4‧4H2O 0.016 g、CoCl2‧6H2O 0.002 g及agar 15 g，pH為7.0±0.1)及脫脂奶粉培養基(每升含skim milk 5 g、glucose 0.005 g、nutrientbroth 1 g、KH2PO4 0.5及agar 15 g，pH為7.0±0.1)；角蛋白質分解酵素活性分別以羽毛分解能力培養基(每升含chicken feather waste 10 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.3 g、KH2PO4 0.4 g及agar 20 g，pH為7.0±0.1)和角蛋白分解酵素生產培養基(每升含chicken feather waste 10 g、starch 3 g、NH4Cl 5 g、K2HPO4 4 g、Na2SO4 1 g及agar 20 g，pH為7.5±0.1)測定。
供試菌株以液態檢測法於25和50℃培養所表現之酵素活性與平板檢測法之酵素活性參數有正相關。B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523於25和50℃培養時均可表現8種酵素活性，包括澱粉質、幾丁質、纖維素、角蛋白質、脂質、蛋白質、果膠質及聚木糖分解酵素活性。未接種微生物對照組均未偵測到酵素活性，而微生物之酵素活性均呈現金字塔型變化，於培養過程中出現最大值。供試菌株於50℃連續培養7天所表現之最大酵素活性均高於25℃，因其於50℃培養之生長代謝速度較25℃為高。澱粉質、脂質、果膠質、聚木糖、蛋白質及角蛋白質分解酵素活性均於25和50℃培養3天後出現最大值。幾丁質分解酵素於25℃培養第5天為最高，但於50℃培養時則為第4天。纖維素分解酵素活性於25℃培養第4天為最高，但於50℃培養時則為第3天。
B. licheniformis A3 BCRC 910522於25和50℃培養時表現澱粉質、纖維素、脂質及蛋白質分解等4種最高酵素活性。B. subtilis H8 BCRC 910523以25和50℃培養時表現幾丁質、果膠質、聚木糖及角蛋白質分解等4種最高酵素活性(圖9和10)。因而此2株供試菌株可作為加速堆肥化之接種菌株。
B. licheniformis A3 BCRC 910522與B. subtilis H8 BCRC 910523接種於小型發酵桶(30-31 kg)製作生物肥料，評估其對生物肥料腐熟度、品質、可溶性磷和鉀含量及微生物族群之影響。以生物肥料之氣味、顏色、溫度、pH、水份含量、有機質含量、總碳含量、總氮含量、C/N比及發芽率為腐熟指標，並評估接種微生物對堆肥化速度和品質之影響(圖11和12)。
生物肥料之原料為雞糞10%、木屑和廢米糠30%及食品加工業污泥60%。原料呈灰棕色、有黏性、顆粒直徑介於1-30 mm及混雜食品發酵酸味惡臭[判定為2級(2-)惡臭]、溫度34.3±0.9℃、pH 6.4±0.3、水份含量45.3±1.8%、有機質含量71.4±3.3%、總有機碳含量61.1±0.7%、總氮含量1.35±0.05%及苜蓿發芽率73.3±3.1%。當每克乾重原料接種供試菌株1×105 CFU，而以未接種微生物之堆肥為對照組。利用鏟子均勻混合，使原料顆粒直徑小於40 mm，調整水份含量約為65%和碳氮比介於20-25之間。再將混合完全之原料平均置放於3座35公升塑膠發酵桶(上部內圈直徑37 cm、下部內圈直徑28 cm及高度45 cm)，堆肥高度約40 cm，每座發酵桶之原料重量介於31-32 kg。堆積過程中每3-4天翻堆1次，將上、中及下層生物肥料以鏟子攪動混合，同時以小鐵鏟將大顆粒粉碎，堆積56天，觀察其顏色和氣味。每7天偵測生物肥料中心離表面約100-120 cm高度之溫度為大氣溫度，並採集離生物肥料表面約10-20公分深度之樣品，進行各項生物肥料腐熟指標和微生物族群分析。生物肥料溫度堆積後迅速上升，於第7天達到最高，第14天時稍為降低2.19-3.75℃，此後便快速下降，於第56天時與大氣溫度已無顯著差異(圖11a)。三種不同微生物處理生物肥料於堆積初期前14天有較高微生物活性，之後堆肥化趨緩溫度迅速下降，於堆積56天後已達到穩定和腐熟狀態。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料於堆積第7天為最高溫度(53.6±0.5℃)，其次為接種B. licheniformis A3 BCRC 910522，而未接種任何微生物對照組顯著最低(46.5±1.6℃)。
pH、總氮含量及發芽率於堆積0-14天期間均快速上升，之後隨堆積時間緩慢上升，因有機物分解及有機酸或對植物有毒物質降解。接種B. subtilis H8 BCRC 910523於堆積過程中有較高pH、總氮含量及發芽率，接種B. licheniformis A3 BCRC 910522次之，而未接種微生物對照組較低。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料於56天堆積過程中均有較低水份含量、有機質含量和總有機碳含量及C/N比，接種B. licheniformis A3 BCRC 910522次之，但未接種微生物對照組均較高。
兩組生物肥料與未接種微生物之對照組堆肥於堆積過程之顏色和氣味變化如表4所示。堆積開始時，生物肥料和未接種微生物堆肥原料均為灰棕色，有混合氨氣、雞糞尿惡臭及食物腐敗酸味，判為2級惡臭(2-)。堆積第21天後，顏色開始轉變為深灰棕色。堆積第42天，接種微生物之生物肥料均轉變為灰色，且於堆積第49天轉換為深灰色。但未接種微生物對照組堆肥於堆積第49天方由深灰棕色轉變為灰色，且於堆積第56天出現深灰色。三種處理生物肥料經7天堆積後，氣味為微生物發酵和食物腐敗混合臭味，判為3級惡臭，之後惡臭氣味逐漸消失。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料於堆積第42天氣味即為芳香土壤味，讓人聞之歡愉，判為4級香氣(4+)。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522之生物肥料於堆積第49天出現4級香氣。未接種微生物對照組堆肥於堆積第56天方出現4級香氣。因此接種微生物於堆肥原料可在堆積過程中降低惡臭和促進腐熟，加深顏色及減少臭味產生。
在生物肥料製備過程中，堆積初期前14天有較高微生物活性，且接種耐高溫溶磷鉀微生物的確可提升pH、縮短製備時間、加深顏色及降低惡臭。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料有最高微生物活性，而接種B. licheniformis A3 BCRC 910522次之。
生物肥料製作過程中之總磷、總鉀、可溶性磷和可溶性鉀含量、溶磷效率及溶鉀效率如圖12所示。總磷、總鉀及可溶性鉀含量均隨堆積時間緩慢逐漸上升，最高值出現於堆積第56天。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料於堆積期間均有較高總磷、總鉀及可溶性鉀含量，接種B. licheniformis A3 BCRC 910522次之，而未接種微生物對照組堆肥均較低。
溶鉀效率為可溶性鉀含量相對總鉀含量之比值，代表生物肥料堆積過程中鉀元素移動受微生物溶鉀活性及生物肥料物化作用之影響。此三種不同處理生物肥料之溶鉀效率均隨堆積時間降低。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料於第56天堆積有顯著最高溶鉀效率(12.1±0.1%)，接種B. licheniformis A3 BCRC 910522次之，未接種微生物顯著最低。因而B. subtilis H8 BCRC 910523為製作生物肥料提升可溶性鉀含量之較佳菌株，B. licheniformis A3 BCRC 910522次之。
可溶性磷含量和溶磷效率的變化相似，堆積第7天後，所有處理之生物肥料均持續下降，至堆積第56天為最低值(圖12c和12e)。由於pH值逐漸上升、溶磷微生物溶磷活性降低。堆積第7天，接種B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料可溶性磷含量上升至最大值。可知B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523於生物肥料製作初期接種可有效發揮其溶磷活性，提供可溶性磷供微生物代謝。溶磷效率為可溶性磷含量與總磷含量之比值，代表在堆肥環境中，因微生物溶磷活性及堆肥化之物理和化學作用所產生不可溶性磷釋放效率。只有接種B. licheniformis A3 BCRC 910522生物肥料於堆積第7天上升至最大值，而接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料及未接種微生物之對照組堆肥上升趨勢較不明顯。可知接種B. licheniformis A3 BCRC 910522於轉換農業和食品加工廢棄物為生物肥料製備初期，可表現較佳溶磷活性，而B. subtilis H8 BCRC 910523次之。
接種B. licheniformis A3 BCRC 910522之生物肥料於堆積過程中均有顯著較高可溶性磷含量和溶磷效率，接種B. subtilis H8 BCRC 910523次之，但未接種微生物對照組堆肥較低。堆積56天，接種B. licheniformis A3 BCRC 910522之生物肥料有顯著最高可溶性磷含量和溶磷效率(分別為1.6±0.0 g kg-1和4.7±0.1 %)，接種B. subtilis H8 BCRC 910523次之，但未接種微生物對照組堆肥均顯著最低。可知接種B. licheniformis A3 BCRC 910522為提升生物肥料可溶性磷含量較佳接種菌株，而B. subtilis H8 BCRC 910523次之。
三種不同處理之生物肥料中微生物族群變化如圖13所示，生物肥料中微生物族群於堆積後7-14天最高，而後隨堆積時間而降低。溶磷菌族群顯著高於溶鉀菌數，因此添加適合耐高溫溶鉀菌以提升溶鉀菌族群和可溶性鉀含量為可行方法。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料於堆積過程中均有顯著較高耐高溫微生物族群總菌數、耐高溫溶磷菌數及耐高溫溶鉀菌數。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522次之，而未接種微生物對照組堆肥均顯著較低。另外接種B. subtilis H8 BCRC 910523生物肥料經56天堆積後，亦有較高中溫溶磷菌數和中溫溶鉀菌數。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522次之，而未接種微生物對照組均顯著最低。因此接種耐高溫溶磷鉀細菌可提升生物肥料之中溫和耐高溫總菌數、中溫和耐高溫溶磷菌數及中溫和耐高溫溶鉀菌數。B. subtilis H8 BCRC 910523和B. licheniformis A3 BCRC 910522被選為較佳接種菌株。
中溫溶磷菌和中溫溶鉀菌於中溫總菌數比例及耐高溫溶磷菌和耐高溫溶鉀菌於耐高溫總菌數比例如圖14所示。三種不同處理生物肥料之中溫溶磷菌和中溫溶鉀菌於中溫總菌數比例和耐高溫溶磷菌和耐高溫溶鉀菌於耐高溫總菌數比例於堆積初期前14天均持續下降，並於堆積第14天出現最低值，因為堆積初期非溶磷鉀微生物大量繁殖和第14天有最高微生物族群所致。之後其比例緩慢上升至第56天。因可溶性磷為微生物生長要素之一，因此溶磷菌比非溶磷微生物有較高抵抗飢餓環境能力。
接種B. licheniformis A3 BCRC 910522生物肥料在堆積過程中均有最高中溫溶磷菌於中溫總菌數比例和耐高溫溶磷菌於耐高溫總菌數比例，接種B. subtilis H8 BCRC 910523次之，而未接種微生物對照組均顯著最低。堆積第56天，接種B. licheniformis A3 BCRC 910522之生物肥料有顯著最高中溫溶磷菌和中溫溶磷菌於中溫總菌數比例和耐高溫溶磷菌和耐高溫溶磷菌於耐高溫總菌數比例，接種B. subtilis H8 BCRC 910523次之，未接種微生物對照組均顯著最低。接種B. subtilis H8 BCRC 910523生物肥料在堆積過程中均有最高中溫溶鉀菌於中溫總菌數比例和耐高溫溶鉀菌於耐高溫總菌數比例，接種B. subtilis A3 BCRC 910522次之，而未接種微生物對照組均顯著最低。因此接種耐高溫溶磷鉀細菌可提升生物肥料之中溫溶磷菌和中溫溶鉀菌族群於總中溫菌族群比例和耐高溫溶磷菌和耐高溫溶鉀菌族群於總耐高溫菌族群比例。
接種B. licheniformis A3 BCRC 910522之生物肥料於製備過程中均有最高可溶性磷含量、溶磷效率、中溫溶磷菌於中溫總菌數比例及耐高溫溶磷菌於耐高溫總菌數比例。接種B. subtilis H8 BCRC 910523之生物肥料於製備過程中均有最高可溶性鉀含量、溶鉀效率、中溫溶鉀菌於中溫總菌數比例及耐高溫溶鉀菌於耐高溫總菌數比例。而未接種微生物對照組顯著最低。
本發明於禽畜糞堆肥中成功分離2株耐高溫溶磷鉀細菌分離株，具有溶解磷酸鈣、磷酸鋁、氫氧基磷灰石及礦物磷活性與溶解長石、依利石及高嶺石之溶鉀活性。這些分離株於25和50℃培養下，B. licheniformis A3 BCRC 910522有最高溶氫氧基磷灰石活性及次高溶高長石、依利石及高嶺石活性與B. subtilis H8 BCRC 910523表現4種溶磷活性及最高溶長石、依利石及高嶺石活性，因此被選為生物肥料製備之接種菌株。接種此二菌株於農業和食品加工業廢棄物生物肥料中可加速其腐熟、增加可溶性磷和鉀含量以提高品質，增進中溫和耐高溫溶磷菌及溶鉀菌族群生長。
生物肥料腐熟速度與總菌數、溶磷菌及溶鉀菌族群有正相關，但可溶性磷和可溶性鉀含量則分別與溶磷菌數於總菌數比例和溶鉀菌數於總菌數比例有正相關。接種B. licheniformis A3 BCRC 910522於生物肥料中有最高可溶性磷含量、溶磷效率及溶磷菌數於總菌數比例。接種B. subtilis H8 BCRC 910523則表現最高堆肥化速度、可溶性鉀含量、溶鉀效率、溶鉀菌數及溶鉀菌數於總菌數比例。混合接種B. licheniformis A3 BCRC 910522和B. subtilis H8 BCRC 910523等耐高溫溶磷鉀微生物於農業、廚餘、蔬果市場、食品加工及禽畜糞廢棄物，可製備多功能生物肥料，不但可提升其可溶性磷和可溶性鉀含量，同時可加速生物肥料腐熟、提升生物肥料品質與增加中溫和耐高溫溶磷和溶鉀微生物族群及其於中溫和耐高溫菌族群之比例。深具生物肥料製作、資源回收、農業生產及永續農業經營應用價值。
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圖1、分離株B. licheniformis A3 BCRC 910522菌株顯微鏡下型態。
圖2、分離株B. subtilis H8 BCRC 910523菌株顯微鏡下型態。
圖3、供試菌株溶磷酸鈣活性。(●)未接種對照組，(▼) B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖4、供試菌株溶磷酸鋁活性。(●)未接種對照組，(▼) B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖5、供試菌株溶磷酸鐵活性。(●)未接種對照組，(▼) B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖6、供試菌株溶氫氧基磷灰石活性。(●)未接種對照組，(▼) B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖7、供試菌株溶磷礦石活性。(●)未接種對照組，(▼) B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖8、供試菌株溶鉀礦石活性。(●)未接種對照組，(▼) B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖9、供試菌株分解碳源酵素活性。(●)未接種對照組，(▼) B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖10、供試菌株分解氮源酵素活性。(●)未接種對照組，(▼)B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖11、小量堆積之生物肥料製作性質變化。(●)未接種對照組，(▼)接種B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ) 接種B. subtilis H8 BCRC 910523，(█)大氣溫度。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖12、小量堆積之生物肥料磷鉀移動。(●)未接種對照組，(▼)接種B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ)接種B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖13、小量堆積之生物肥料微生物族群變化。(●)未接種對照組，(▼)接種B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ)接種B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
圖14、小量堆積之生物肥料溶磷和鉀微生物族群於總微生物族群比例。(●)未接種對照組，(▼)接種B. licheniformis A3 BCRC 910522，(Δ)接種B. subtilis H8 BCRC 910523。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。
Claims (6)
- 一種製作多功能性生物肥料的方法，接種耐高溫溶磷鉀菌，可將農業廢棄物及禽畜糞廢棄物等原料基質轉變成生物肥料為特徵。
- 如請求專利範圍第1項所述之方法，使用之耐高溫溶磷鉀菌為Bacillus lichenifromis A3 BCRC 910522。
- 如請求專利範圍第1項所述之方法，使用之耐高溫溶磷鉀菌為Bacillus subtilis H8 BCRC 910523。
- 如請求專利範圍第1項所述之方法，耐高溫溶磷鉀菌具有溶解磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、氫氧基磷灰石(hydroxyapatide)、礦物磷、長石、依利石及高嶺石的能力，且可在15-75℃生長，其最適溫度為50-55℃。
- 如請求專利範圍第1項所述之方法，耐高溫溶磷鉀菌具有澱粉質分解酵素活性、纖維素分解酵素活性、幾丁質分解酵素活性、果膠質分解酵素活性、蛋白質分解酵素活性、脂質分解酵素活性與角蛋白質分解酵素活性。且可在15-75℃生長，其最適溫度為50-55℃。
- 如請求專利範圍第1項所述，接種耐高溫溶磷鉀菌，可以縮短生物肥料腐熟時間、提高所生產生物肥料之總氮含量、灰分含量、可溶性磷含量、可溶性鉀含量和種子發芽率，降低總有機碳含量、碳氮比和粗脂肪含量，提高生物肥料品質。
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