CN114350829A - 一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物组、试剂盒及应用，涉及病原菌检测技术领域。同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物组、试剂盒包括用于检测产肠毒素大肠杆菌ST基因、LT基因和用于检测沙门氏菌invA基因的引物和探针。利用本发明可同时实现产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌毒力基因的检测，检测灵敏度高、特异性强、重复性好，适于推广应用。

Description

一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组 合、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是造成牛腹泻的主要病原之一，其致病因子有很多，首要致病因素是肠毒素，ETEC的肠毒素包括2类：耐热肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)。ST免疫原性极低且不被LT或霍乱抗毒素中和，ST与GM1受体结合后可刺激肠上皮细胞中的腺苷酸环化酶(AC)的分泌，使细胞质中的环磷酸腺苷(cAMP)含量增高。LT是一种分子量较大的蛋白质，其免疫原性强，是目前在人和动物实验中鉴定出的最有效的黏膜免疫原之一。LT与GM1受体结合后刺激肠上皮细胞中的鸟腺苷酸环化酶的分泌，使细胞浆中的环磷酸鸟苷酸分泌上升。其致病机制是首先入侵机体的小肠，依靠定植因子定植、增殖后产生肠毒素侵害机体细胞，最终导致机体细胞的死亡。沙门氏菌(Salmonella)属肠道菌科，其血清型有2600多种，肠炎沙门氏菌是最具致病性的血清型。沙门氏菌是引起牛腹泻的主要病原菌，主要感染7～28日龄之间的犊牛，主要表现症状为体温升高、水样粪便，偶尔也可见粪便中出现黏膜出血随即迅速脱水。invA作为起重要的毒力基因，可作为PCR反应中的特异基因来设计特异性引物进行扩增。
目前，研究人员已根据LT和ST研究出利用PCR对大肠杆菌的鉴定方法，然而，针对引起牛腹泻的细菌性腹泻的最主要的两种病原(ETEC和沙门氏菌)需要分别进行PCR检测，并且检测灵敏度低、特异性差。
因此，如何提供一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌，且检测灵敏度高、特异性强的检测产品是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合、试剂盒及应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测产肠毒素大肠杆菌ST基因和/或LT基因，和沙门氏菌invA基因的引物和探针；
所述检测产肠毒素大肠杆菌ST基因的引物和探针包括：
ST-F：5’-GTCAACTGAATCACTTGACTCTTC-3’，SEQ ID NO:1；
ST-R：5’-GCACAGGCAGGATTACAACAA-3’，SEQ ID NO:2；
ST-P：5’-CAACTGAATCACTTGACTCTT-3’，SEQ ID NO:3；
所述检测产肠毒素大肠杆菌LT基因的引物和探针包括：
LT-F：5’-ATGGCTCCTCAGTCTATTACAGA-3’，SEQ ID NO:4；
LT-R：5’-GTCTCGGTCAGATATGTGATTCTT-3’，SEQ ID NO:5；
LT-P：5’-CCGGGACTTCGACCTGAAATGTTGC-3’，SEQ ID NO:6；
所述检测沙门氏菌invA基因的引物和探针包括：
invA-F：5’-CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA-3’，SEQ ID NO:7；
invA-R：5’-TAGACAGGGCGGAGGACAAATC-3’，SEQ ID NO:8；
invA-P：5’-CCTACCATACGGGCCATTTGTC-3’，SEQ ID NO:9。
作为本发明优选的技术方案，所述ST-P探针5'端的荧光报告基团为CY5，3'端的荧光淬灭基团为BHQ1；所述LT-P 5'端的荧光报告基团为ROX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ2；所述invA-P5'端的荧光报告基团为HEX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ3。
本发明的另一目的是提供一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品，包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括如上所述的引物探针组合。
作为本发明优选的技术方案，所述检测用品为试剂盒。
更优选的，使用时检测体系为25μL，且所述ST-F和ST-R的终浓度均为160nmol/L，ST-P终浓度为240nmol/L；所述LT-F和LT-R的终浓度均为200nmol/L，LT-P终浓度为280nmol/L；所述invA-F和invA-R终浓度均为280nmol/L，invA-P终浓度为320nmol/L。
更更优选的，使用时检测体系为25μL，还包括：Premix Ex Taq 12.5μL，DNA模板2μL和余量RNase-free水。
更优选的，使用时的检测程序为：
预变性95℃20s；
变性95℃5s，退火延伸54.5℃30s，42个循环。
本发明的又一目的是，提供上述引物探针组合或上述检测用品在制备检测产肠毒素大肠杆菌和/或沙门氏菌的产品中的应用。
本发明的再一目的是，提供上述引物探针组合或上述检测用品在检测产肠毒素大肠杆菌和/或沙门氏菌中的应用。
与现有技术相比，本发明可同时实现产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌毒力基因的检测，且检测灵敏度高、特异性强、重复性好，适于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
附图1所示为ETEC ST基因普通PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-3：ST肠毒素核酸DNA；4：阴性对照；
附图2所示为ETEC LT基因普通PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-3：LT肠毒素核酸DNA；4：阴性对照；
附图3所示为沙门氏菌invA基因普通PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-3：沙门氏菌核酸DNA；4：阴性对照；
附图4所示为ETEC ST基因阳性菌液PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-5：ST基因克隆菌阳性菌液；6：阴性对照；
附图5所示为ETEC LT基因阳性菌液PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-5：LT基因克隆菌阳性菌液；6：阴性对照；
附图6所示为沙门氏菌invA基因阳性菌液PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-5：invA基因克隆菌阳性菌液；6：阴性对照；
附图7所示为ETEC ST基因重组质粒PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-3：重组质粒；4：阴性对照；
附图8所示为ETEC LT基因重组质粒PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-3：重组质粒；4：阴性对照；
附图9所示为沙门氏菌invA基因重组质粒PCR扩增结果；
其中，M：marker；1-4：重组质粒；5：阴性对照；
附图10所示为ETEC ST基因重组质粒测序结果；
附图11所示为ETEC LT基因重组质粒测序结果；
附图12所示为沙门氏菌invA基因重组质粒测序结果；
附图13所示为ETEC ST、LT和沙门氏菌invA引物探针组合筛选结果；
其中，M：marker；1：ST基因；2：LT基因；3：invA基因；4：阴性对照；
附图14所示为ETEC ST引物浓度优化结果；加粗曲线为最优；
1：160nmol/L；2：240nmol/L；3：280nmol/L；4：360nmol/L；5：200nmol/L；6：320nmol/L；7：阴性对照；
附图15所示为ETEC LT引物浓度优化结果；加粗曲线为最优；
1：200nmol/L；2：240nmol/L；3：280nmol/L；4：360nmol/L；5：320nmol/L；6：160nmol/L；7：阴性对照；
附图16所示为沙门氏菌invA引物浓度优化结果；加粗曲线为最优；
1：280nmol/L；2：200nmol/L；3：240nmol/L；4：160nmol/L；5：320nmol/L；6：360nmol/L；7：阴性对照；
附图17所示为ETEC ST探针浓度优化结果；加粗曲线为最优；
1：240nmol/L；2：320nmol/L；3：360nmol/L；4：280nmol/L；5：200nmol/L；6：160nmol/L；7：阴性对照；
附图18所示为ETEC LT探针浓度优化结果；加粗曲线为最优；
1：280nmol/L；2：360nmol/L；3：320nmol/L；4：200nmol/L；5：240nmol/L；6：160nmol/L；7：阴性对照；
附图19所示为沙门氏菌invA探针浓度优化结果；加粗曲线为最优；
1：320nmol/L；2：360nmol/L；3：280nmol/L；4：240nmol/L；5：200nmol/L；6：160nmol/L；7：阴性对照；
附图20所示为ETEC ST荧光定量PCR扩增曲线；
1-8：1×108copies/μL～1×101copies/μL；9：阴性对照；
附图21所示为ETEC ST荧光定量PCR标准曲线；
附图22所示为ETEC LT荧光定量PCR扩增曲线；
1-8：1×108copies/μL～1×101copies/μL；8：阴性对照；
附图23所示为ETEC LT荧光定量PCR标准曲线；
附图24所示为沙门氏菌invA荧光定量PCR扩增曲线；
1-8：1×108copies/μL～1×101copies/μL；8：阴性对照；
附图25所示为沙门氏菌invA荧光定量PCR标准曲线；
附图26所示为ETEC ST荧光定量PCR敏感性实验结果；
1-9：1×109～1×101copies/μL；10：阴性对照；
附图27所示为ETEC LT荧光定量PCR敏感性实验结果；
1-8：1×108～1×101copies/μL；9：阴性对照；
附图28所示为沙门氏菌invA荧光定量PCR敏感性实验结果；
1-9：1×109～1×101copies/μL；10：阴性对照；
附图29所示为ETEC ST荧光定量PCR特异性实验结果；
1：CVCC209；2：阳性质粒；3：阴性对照、ATCC25922、CVCC216株、CVCC2184株、Mh、PmA、PmB、CpA、CpB、CpD、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；
附图30所示为ETEC LT荧光定量PCR特异性实验结果；
1：CVCC216株；2：阳性质粒；3：阴性对照、ATCC25922、CVCC209株、CVCC2184株、Mh、PmA、PmB、CpA、CpB、CpD、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；
附图31所示为沙门氏菌invA荧光定量PCR特异性实验结果；
1：CVCC2184株；2：阳性质粒；3：阴性对照、ATCC25922、CVCC216株、CVCC209株、Mh、PmA、PmB、CpA、CpB、CpD、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；
附图32所示为ETEC ST荧光定量PCR重复性实验结果；
1-3：1×106～1×104copies/μL；4：阴性对照；
附图33所示为ETEC LT荧光定量PCR重复性实验结果；
1-3：1×106～1×104copies/μL；4：阴性对照；
附图34所示为沙门氏菌invA荧光定量PCR重复性实验结果；
1-3：1×106～1×104copies/μL；4：阴性对照；
附图35所示为ETEC ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR引物浓度优化结果；加粗曲线为最优；
附图36所示为ETEC ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR探针浓度优化结果；加粗曲线为最优；
附图37三重荧光定量PCR扩增曲线；
1-8：1×108copies/μL～1×101copies/μL；9：阴性对照；
附图38所示为三重荧光定量PCR标准曲线；
附图39三重荧光定量PCR敏感曲线；
1-7：1×107copies/μL～1×101copies/μL；8：阴性；
附图40所示为三重荧光定量PCR特异性结果；
1：CVCC209株；2：CVCC216株；3：CVCC2184株；4：阴性对照、ATCC25922、Mh、PmA、PmB、CpA、CpB、CpD、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；
附图41所示为三重荧光定量PCR重复性检测结果；
1：1×106copies/μL；2：1×105copies/μL；3：1×104copies/μL；4：阴性；
附图42所示为三重荧光定量PCR检测临床样品结果；
1：阳性质粒2：临床样品3：阴性。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1引物和探针的设计与合成
根据GenBank上公布发表产肠毒素大肠杆菌的EcoPV-173分离株(KY581592.1)、2173分离株(AJ555214.1)、CV839-15分离株(CP024975.1)、Sta分离株(MK315206.1)、EC2173分离株(CP000913.1)的ST基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取ST基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针(见表1)。上下游引物和探针分别命名为ST-F、ST-R和ST-P，探针5'端的荧光报告基团为CY5，3'端的荧光淬灭基团为BHQ1。
根据GenBank上公布发表产肠毒素大肠杆菌的CF-9分离株(MW769793.1)、ETEC分离株(MF438046.1)、NIOECM31分离株(JX867103.1)、NIOECG54分离株(JX867100.1)、NIOECM15分离株(JX867098.1)的LT基因序列；利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取5`UTR基因片段上的LT基因保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针(见表1)。上下游引物和探针分别命名为LT-F、LT-R和LT-P，探针5'端的荧光报告基团为ROX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ2。
根据GenBank上发表的沙门氏菌分离株(M90846.1)、FSL-R8-7977分离株(MK017939.1)、FSL-R8-0153分离株(MK017941.1)、ATCC 43974分离株(MK017942.1)、S49分离株(HQ260705.1)的invA基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取invA基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针(见表1)。上下游引物和探针分别命名为invA-F、invA-R和invA-P，探针5'端的荧光报告基团为HEX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ3。
设计的引物和探针，由华大基因合成。
表1
Figure BDA0003526853080000061
Figure BDA0003526853080000071
实施例2产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量标准品的制备
1.细菌DNA的提取
用接种环沾取冻干的大肠杆菌参考菌株CVCC209(产生ST肠毒素)、CVCC216(产生LT肠毒素)和CVCC2184(肠炎沙门氏菌)放于5mL营养肉汤中37℃过夜培养，参考试剂盒说明书，对上述过夜培养的菌液进行DNA提取。
2.普通PCR检测
(1)普通PCR反应体系的参数
取步骤1提取的DNA作为模板，用实施例1中设计好的引物分别进行扩增。
普通PCR扩增反应体系(25μL)为：Premix TaqTM 12.5μL、引物(10μmol/L)各1.0μL、模板DNA 2.0μL、ddH2O 8.5μL。
普通PCR扩增反应参数为：94℃3min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，30个循环；72℃7min。
(2)琼脂糖凝胶电泳
将琼脂糖和10×TAE电泳缓冲液按比例配制成凝胶，将DL500 Marker和PCR扩增产物分别加入点样孔中进行凝胶电泳，电泳条件为110V 45min。电泳结束后观察结果，电泳条带与目的基因片段大小一致(参见附图1-附图3)。
3.标准品的构建
(1)胶回收
采用胶回收试剂盒将凝胶电泳后的琼脂糖进行回收：
电泳结束后，在紫外灯下切下含目的片段的凝胶，称取凝胶重量。加入等倍体积Buffer GDP，55℃水浴8min。准备置备管，把溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30s，弃滤液。加入300μL Buffer GDP至吸附柱中，静置1min，12,000×g离心30s，弃滤液。加入700μL Buffer GW至吸附柱中，12,000×g离心30s，重复一次，12,000×g离心2min。将吸附柱放置在干净的离心管中，加入30μL ddH2O，12,000×g离心30～60s，获得回收的产肠毒素大肠杆菌ST、LT基因和沙门氏菌invA基因回收产物。
(2)目的基因与载体pMD-19T的连接
取产肠毒素大肠杆菌ST、LT基因回收产物和沙门氏菌invA基因回收产物，分别与大小为2692bp的pMDTM 19-T Vector进行连接。体系(10μL)为pMD19-T Vector 1μL、胶回收产物4.0μL、Solution I 5.0μL；16℃孵育30min，得到连接产物。
(3)克隆质粒的转化
取-80℃环境保存的Takara DH5α感受态细胞，随后将连接产物加到100μL感受态细胞中，放入冰中30min后立即转移至入42℃水浴锅中进行45s的热激转化，再次冰内孵化1min。加入890μLLB液体培养基，总量1000μL，37℃摇床中培养1h。取出混合液离心3min，吸出700μL上清液弃去，用剩下的300μL上清液反复吹打重悬沉淀，取适量涂布于含Amp的LB固体培养基上，随后放入37℃恒温培养箱中静置培养10～12h左右(等到长出适宜大小的单个菌落)。
(4)阳性克隆菌的筛选
从培养的平皿中挑取3～5个单个菌落，接种于LB液体培养基中，37℃、200×g的恒温摇床中培养12～16h。
(5)重组阳性质粒的提取
将培养后的菌液作为模板，进行常规PCR扩增，选取与目的基因片段大小所对应的菌液为阳性菌液，参照试剂盒进行质粒提取，步骤如下：
离心管中加入5mL过夜培养的菌液，10,000×g离心1min，留沉淀。加入250μLBufferP1，振荡混匀。加入250μLBufferP2，温和的上下颠倒混匀，使菌体裂解后继续加入350μLBuffer P3，13000×g离心10min。准备置备管，取上清13,000×g离心30s，弃滤液。加入600μLBuffer PW2至吸附柱中，13,000×g离心30s，弃滤液，重复一次。13,000×g离心1min干燥吸附柱。准备干净的离心管，加入30μL Elution Buffer，室温静置2min，13,000×g离心1min洗脱DNA。
(6)重组阳性质粒的鉴定
1)菌液PCR鉴定：
为了验证目的基因是否连接在载体上，以步骤(5)选出的阳性菌液为模板，分别用上下游引物组进行PCR扩增，观察结果，同时设立阴性对照(参见附图4-附图6)。
反应体系：12.5μL Premix TaqTM、8.5μL无菌水、上下游引物各1.0μL。
反应程序：95℃3min；95℃20s，56℃20s，72℃20s，30个循环；72℃7min。
由附图4-附图6可知，分别扩增出与目的基因大小相同的片段，表明目的基因已克隆到pMD19-T载体。
2)质粒PCR鉴定：
为了鉴定提取的质粒是否与目的基因大小一致，用合成的引物对将步骤(5)提出的质粒作为模板进行PCR扩增，观察结果，同时设立阴性对照(参见附图7-附图9)。反应体系、反应程序同上。
3)测序鉴定：对PCR扩增后与目的片段大小相符的阳性质粒进行测序验证(参见附图10-附图12)，测序结果与GenBank上与公布的基因序列进行比对分析，确认与模板基因同源性均为100％。重组质粒置-20℃保存备用。
(7)重组质粒DNA拷贝数的计算及稀释
提取质粒后各取1μL，测得ST、LT和invA标准阳性质粒的浓度分别为175.1ng/μL、180.8ng/μL和100ng/μL，通过计算公式：质粒拷贝数(copies/μL)＝6.02×(重组质粒浓度ng/μL×10-9)×1023/(660×重组质粒碱基数)计算质粒拷贝数，ST、LT和invA质粒拷贝数分别为3.22×1010copies/μL、3.2×1010copies/μL和3.19×1010copies/μL。制备阳性标准品时使用无酶水进行10倍倍比稀释。
4.产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA单重荧光定量PCR检测
(1)引物探针组合筛选
利用实施例1引物探针组进行单重荧光定量PCR检测：
单重荧光定量PCR反应程序为预变性95℃30s；变性95℃5s、退火延伸56℃30s，44个循环。
单重荧光定量PCR初始反应体系(25μL)为Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL、PCR Forward Primer(10μM)0.5μL、PCR Reverse Primer(10μM)0.5μL、Probe 0.7μL、DNA模板2.0μL、灭菌水8.8μL。
结果如附图13所示，所扩增的条带清晰，明亮，大小一致，可以进行后续实验。
(2)反应参数的优化
为了探索不同反应条件对ST、LT和invA单重荧光定量PCR扩增的影响，需对PCR条件进行摸索优化，来获取最佳的反应条件，并为三重荧光定量PCR各条件的优化提供适当的优化范围。
1)引物浓度优化
阳性质粒DNA作为模板，分别吸取0.4μL-1.4μL，终浓度分别为160nmol/L、200nmol/L、240nmol/L、280nmol/L、320nmol/L、360nmol/L 6个梯度的上下游引物，探针添加量暂固定为0.7μL。选择荧光值高，Ct值最小的为最佳浓度，如果两个条件无法同时满足，则优先考虑Ct值。
结果如附图14-附图16所示，ST引物浓度0.4μL(160nmol/L)Ct值最小，扩增曲线良好；LT引物浓度0.6μL(200nmol/L)Ct值最小，扩增曲线良好；invA引物浓度1μL(280nmol/L)Ct值最小，扩增曲线良好；因此本试验ST的最佳引物浓度选0.4μL(160nmol/L)；LT的最佳引物浓度选0.6μL(200nmol/L)；invA的最佳引物浓度选1μL(280nmol/L)。
2)探针浓度优化
阳性质粒DNA作为模板，分别吸取0.4μL-1.4μL，终浓度分别为160nmol/L、200nmol/L、240nmol/L、280nmol/L、320nmol/L、360nmol/L 6个梯度的探针(上下游引物的添加量参考步骤1)的优化结果)。
结果如附图17-附图19所示，ST探针浓度0.8μL(240nmol/L)Ct值最小，扩增曲线良好；LT探针浓度1μL(280nmol/L)Ct值最小，扩增曲线良好；invA探针浓度1.2μL(320nmol/L)Ct值最小，扩增曲线良好；因此本试验ST的最佳探针浓度选0.8μL(240nmol/L)；LT的最佳探针浓度选1μL(280nmol/L)；invA的最佳探针浓度选1.2μL(320nmol/L)。
(3)产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA单重荧光定量PCR标准曲线的建立
模板选用1×108copies/μL～1×101copies/μL共8个浓度的阳性质粒，每个模板作3个重复，设立阴性对照。引物和探针量按照优化结果进行反应，根据软件分析得到相关系数和扩增效率后绘制产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA单重定量PCR标准曲线方程。结果如附图20-附图25所示。
(4)产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA单重荧光定量PCR的敏感性试验
模板为1×109copies/μL～1×101copies/μL共9个标准阳性质粒，作3个重复，设立阴性对照。同时按照步骤2中普通PCR和优化后的荧光定量PCR方法检测，得出定量PCR检测方法的最低检出浓度。
结果如附图26-附图28所示，ST、LT和invA荧光定量PCR检测最低拷贝数均为1×101copies/μL。
(5)产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA单重荧光定量PCR的特异性试验
反应体系、程序不变，分别以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、牛曼氏杆菌(Mh)、多杀性巴氏杆菌A型(PmA)、多杀性巴氏杆菌B型(PmB)、牛羊产气荚膜梭菌A型(CpA)、牛羊产气荚膜梭菌B型(CpB)、牛羊产气荚膜梭菌D型(CpD)、大肠杆菌参考菌株CVCC209、大肠杆菌参考菌株CVCC216、沙门氏菌参考菌株CVCC2184、大肠杆菌质控菌株ATCC25922的核酸(均为市售菌提取DNA)为模板，以1×107copies/μL ST、LT、invA标准阳性质粒分别作为阳性对照，并设立阴性对照，进行特异性验证，结果如附图29-附图31所示。
(6)产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA单重荧光定量PCR的重复性试验
模板1×106copies/μL～1×104copies/μL阳性质粒，作三次及以上重复，设立阴性对照，对实验数据分析，验证荧光定量PCR方法的稳定性，结果如附图32-附图34所示。
实施例3产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR方法的建立
1.产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR反应体系的优化
按照单重荧光定量PCR方法中已优化好的各项反应条件进行扩增(反应体系：25μL)，按照表2进行引物浓度优化。
表2引物方阵优化表
Figure BDA0003526853080000111
结果如附图35所示，当ST引物浓度0.4μL、LT引物浓度0.6μL、invA引物浓度1μL时Ct值最小，扩增曲线良好。因此确定ST、LT和invA的最佳引物浓度分别是0.4μL、0.6μL和1μL。
2.探针浓度优化
按照单重荧光定量PCR方法中已优化好的各项反应条件进行扩增(反应体系：25μL)按照表3进行探针浓度优化。
表3探针方阵优化表
Figure BDA0003526853080000112
Figure BDA0003526853080000121
结果如附图36所示，当ST探针浓度0.8μL、LT探针浓度1μL、invA时探针浓度1.2μLCt值最小，扩增曲线良好。因此确定ST、LT、invA的最佳探针浓度分别是0.8μL、1μL、1.2μL。
3.产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR标准曲线的建立
用于检测ST基因的引物探针包括：
ST-F：5’-GTCAACTGAATCACTTGACTCTTC-3’，SEQ ID NO:1；
ST-R：5’-GCACAGGCAGGATTACAACAA-3’，SEQ ID NO:2；
ST-P：5’-CAACTGAATCACTTGACTCTT-3’，SEQ ID NO:3；
探针5'端的荧光报告基团为CY5，3'端的荧光淬灭基团为BHQ1。
用于检测LT基因的引物探针包括：
LT-F：5’-ATGGCTCCTCAGTCTATTACAGA-3’，SEQ ID NO:4；
LT-R：5’-GTCTCGGTCAGATATGTGATTCTT-3’，SEQ ID NO:5；
LT-P：5’-CCGGGACTTCGACCTGAAATGTTGC-3’，SEQ ID NO:6；
探针5'端的荧光报告基团为ROX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ2。
用于检测沙门氏菌invA基因的引物探针包括：
invA-F：5’-CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA-3’，SEQ ID NO:7；
invA-R：5’-TAGACAGGGCGGAGGACAAATC-3’，SEQ ID NO:8；
invA-P：5’-CCTACCATACGGGCCATTTGTC-3’，SEQ ID NO:9。
探针5'端的荧光报告基团为HEX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ3。
检测体系为25μL：
Premix Ex Taq 12.5μL，
ST-F 0.4μL，
ST-R 0.4μL，
ST-P 0.8μL，
LT-F 0.6μL，
LT-R 0.6μL，
LT-P 1μL，
invA-F 1μL，
invA-R 1μL，
invA-P 1.2μL，
DNA模板2μL，
加RNase-free水至25μL。
检测程序为：
预变性95℃20s；
变性95℃5s，退火延伸54.5℃30s，42个循环。
模板选用1×108copies/μL～1×101copies/μL阳性质粒，每个模板作3个重复，设立阴性对照，结果如附图37和附图38所示。
ST的标准曲线回归方程为y＝-3.524x+40.237，相关系数R2达0.975，扩增效率E＝92.2％；LT的标准曲线回归方程为y＝-4.153x+41.710，相关系数R2达0.968，扩增效率E＝74.1％；invA的标准曲线回归方程为y＝-3.365x+41.347，相关系数R2达0.915，扩增效率E＝98.2％。
4.产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR的敏感性试验
扩增体系、程序同三重荧光定量PCR标准曲线建立，模板为1×107copies/μL～1×101copies/μL标准阳性质粒。结果如附图39，产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR最低检出浓度为1×101copies/μL。
5.产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR的特异性试验
扩增体系、程序同三重荧光定量PCR标准曲线建立，模板同单重荧光定量PCR的特异性试验，结果如附图40。只有ST、LT、invA的阳性质粒出现扩增曲线。
6.产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR的重复性试验
扩增体系、程序同三重荧光定量PCR标准曲线建立，1×106copies/μL-1×104copies/μL阳性质粒作为模板，结果如图41所示，ST、LT、invA同一模板Ct值基本一致，扩增曲线也大致相同；组内重复变异系数均低于2％，表明试验重复性高，稳定性良好。
实施例4引物探针组合应用
用表1的引物探针组合，以实施例3建立的产肠毒素大肠杆菌ST、LT和沙门氏菌invA三重荧光定量PCR检测方法，对85份粪便样品中提出的DNA样品进行检测。结果如附图42所示，85份粪便样品中检出产肠毒素大肠杆菌(ETEC)15份，沙门氏菌阳性10份，双阳性2份，与测序结果一致。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合、试剂盒及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcaactgaa tcacttgact cttc 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcacaggcag gattacaaca a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caactgaatc acttgactct t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctcctc agtctattac aga 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtctcggtca gatatgtgat tctt 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgggacttc gacctgaaat gttgc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacgctcttt cgtctggcat ta 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagacagggc ggaggacaaa tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctaccatac gggccatttg tc 22

Claims (9)

1.一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测产肠毒素大肠杆菌ST基因和/或LT基因，和沙门氏菌invA基因的引物和探针；
所述检测产肠毒素大肠杆菌ST基因的引物和探针包括：
ST-F：5’-GTCAACTGAATCACTTGACTCTTC-3’，SEQ ID NO:1；
ST-R：5’-GCACAGGCAGGATTACAACAA-3’，SEQ ID NO:2；
ST-P：5’-CAACTGAATCACTTGACTCTT-3’，SEQ ID NO:3；
所述检测产肠毒素大肠杆菌LT基因的引物和探针包括：
LT-F：5’-ATGGCTCCTCAGTCTATTACAGA-3’，SEQ ID NO:4；
LT-R：5’-GTCTCGGTCAGATATGTGATTCTT-3’，SEQ ID NO:5；
LT-P：5’-CCGGGACTTCGACCTGAAATGTTGC-3’，SEQ ID NO:6；
所述检测沙门氏菌invA基因的引物和探针包括：
invA-F：5’-CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA-3’，SEQ ID NO:7；
invA-R：5’-TAGACAGGGCGGAGGACAAATC-3’，SEQ ID NO:8；
invA-P：5’-CCTACCATACGGGCCATTTGTC-3’，SEQ ID NO:9。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的引物探针组合，其特征在于，所述ST-P探针5'端的荧光报告基团为CY5，3'端的荧光淬灭基团为BHQ1；所述LT-P 5'端的荧光报告基团为ROX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ2；所述invA-P5'端的荧光报告基团为HEX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ3。
3.一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品，其特征在于，包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括权利要求1或权利要求2所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品，其特征在于，所述检测用品为试剂盒。
5.根据权利要求3或4所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品，其特征在于，使用时检测体系为25μL，且所述ST-F和ST-R的终浓度均为160nmol/L，ST-P终浓度为240nmol/L；所述LT-F和LT-R的终浓度均为200nmol/L，LT-P终浓度为280nmol/L；所述invA-F和invA-R终浓度均为280nmol/L，invA-P终浓度为320nmol/L。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品，其特征在于，使用时检测体系为25μL，还包括：Premix Ex Taq 12.5μL，DNA模板2μL和余量RNase-free水。
7.根据权利要求3或4所述的一种同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的检测用品，其特征在于，使用时的检测程序为：
预变性95℃20s；
变性95℃5s，退火延伸54.5℃30s，42个循环。
8.权利要求1或2所述引物探针组合或权利要求3-6任一所述检测用品在制备检测产肠毒素大肠杆菌和/或沙门氏菌的产品中的应用。
9.权利要求1或2所述引物探针组合或权利要求3-6任一所述检测用品在检测产肠毒素大肠杆菌和/或沙门氏菌中的应用。
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