CN108179207B - 用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的pcr引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及瓜类细菌性果斑病的检验检疫，具体涉及用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物和方法。本发明提供的用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组，包括正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2，其核苷酸序列如下：BFB：5’‑ATGAAGCGTACTGTTCAG‑3’，BFB1：5’‑ACCATCGATATTAGCATC‑3’，BFB2：5’‑TTAAGGAGCAAACGTGC‑3’。

Description

用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物和方法
技术领域
本发明涉及瓜类细菌性果斑病的检验检疫，具体涉及用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物和方法。
背景技术
瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch of melons，BFB)是发生在西瓜、甜瓜等葫芦科作物上的一种种传细菌性病害，其病原菌西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)，为革兰氏阴性菌(Schaad,N.W.，Postnikova E,Sechler A,et al.Reclassification ofsubspecies of Acidovorax avenae as A.avenae(Manns 1905)emend.,A.cattleyae(Pavarino,1911)comb.nov.,A.citrulli (Schaad et al.,1978)comb.nov.,andproposal of A.oryzaesp.nov.Syst Appl Microbiol,2008,31:434～446)，主要侵染西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等葫芦科作物，严重威胁了各国西甜瓜产业的发展。自1965年首次在美国报道以来，该病已相继在世界上许多西瓜、甜瓜产区发生危害，并造成了巨大的经济损失(Walcott R R，Gitaitis R D.Detection of Acidovorax avenae subsp.citrulli inwatermelon seed using immunomagnetic separation and the polymerase chainreaction.Plant Disease,2000,84:470～474.)。我国在20世纪90年代首次报道该病害，随后在新疆、海南、内蒙古、北京、山东、吉林、福建和云南等地相继发生并呈上升趋势，造成大田西瓜、甜瓜减产甚至绝收，同时严重影响了我国的西瓜和甜瓜种业以及嫁接苗的安全生产，给我国的西瓜和甜瓜产业带来巨大的损失(赵廷昌，孙福在，王兵万.西瓜细菌性果斑病国内外研究进展.植物保护技术与推广，2001，3:37～38，36.)。
Somodi等(1991)首次提出西瓜噬酸菌存在多样性。之后，各国学者分别对世界各地的西瓜噬酸菌菌株的种内遗传多样性进行了分析，将所有供试菌株分成了两个亚组(R.R.Walcott,A.Fessehaie,A.C.Castro.Differences in Pathogenicity between twoGenetically Distinct Groups of Acidovorax avenae subsp.citrulli on CucurbitHosts.Journal of Phytopathology.2004,152(5):277–285；Shasha Yan,Yuwen Yang,Tielin Wang et al.Genetic diversity analysis of Acidovorax citrulli inChina.European Journal of Plant Pathology.2013,136(1)：171–181)。亚组I的菌株主要分离自甜瓜及南瓜等寄主，亚组II的菌株主要分离自西瓜。西瓜噬酸菌两个亚组的菌株在致病力和抗铜性等方面存在较大差异。亚组I的菌株对硫酸铜的敏感性明显低于亚组II的菌株(赵文龙，杨玉文，王铁霖等，瓜类细菌性果斑病菌对硫酸铜的敏感性检测与分析.植物保护，2013，39(6)：100～105)。因此，快速准确地区分I组和II组菌株在该病害的综合防治中有着非常重要的意义。
传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。因此，利用分子生物学手段快速、准确地鉴别瓜类细菌性果斑病菌具有重要的理论意义和实用价值。
目前，关于瓜类细菌性果斑病菌特异性分子检测的PCR引物主要有：Walcott等根据16S rDNA 序列设计的WFB1/WFB2，但是该引物不能将果斑病菌与同属的其他3个亚种区分开；Walcott等(Walcott R R，Gitaitis R D，Castro C.Role of blossoms in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp.citrulli.Phytopathology，2003，93(5):528～534.)根据16S-23S rRNA的ITS区(Internal Transcribed Spacer)序列设计的SEQID4m/SEQID5，该引物扩增时嗜酸菌属的其他3个亚种都为阴性；2007年，回文广等(回文广，赵廷昌，Schaad N W，等.哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立.中国农业科学，2007，40(11)：2495～2501.)利用ITS序列设计了特异性引物对果斑病菌进行检测，检测灵敏度为3×105cfu/mL；Bahar等人(Bahar O，Efrat M，Hadar E，et al.Newsubspecies-specific polymerase chain reaction based assay for the detectionof Acidovorax avenae subsp.citrulli.Plant Pathology，2008，57:754～763.)报道了一对引物BX-L1/BX-S-R2，可检测出5000粒种子中0.02％携带有果斑病菌的种子；2010年，田艳丽等(田艳丽，胥婧，赵玉强，等.利用PCR技术专化性检测瓜类细菌性果斑病菌.江苏农业学报，2010，26(3):512～516.)根据hrpB2基因序列设计特异性引物HB2F2/HB2R2，检测瓜类细菌性果斑病菌灵敏度为103cfu/mL。但这些报道仅仅局限于瓜类细菌性果斑病菌的快速检测，所采用的引物不能区分瓜类细菌性果斑病菌的I组和II组菌株。
因此，需要开发新的用于准确鉴定瓜类细菌性果斑病菌I组和II组菌株的基因片段及特异性引物。
pilA是IV型菌毛的主要结构亚基，通过细胞质膜蛋白pilC，将pilA亚基装配成菌毛，经由外膜分泌激素pilQ使菌毛呈现出来。IV型菌毛通常位于细菌的一极或两极，在革兰氏阴性和阳性菌中均有发现(Nudleman，2004；Pelicic，2008)。瓜类细菌性果斑病菌pilA基因的功能研究表明，II组菌株M6的pilA基因的缺失导致果斑病菌的致病力降低，蹭行运动丧失，生物膜形成能力下降；I组菌株(胡白石等)pilA基因缺失后，突变体的生长速度没有受到影响，而生物膜形成能力及游动能力明显下降，致病力减弱。
发明内容
鉴于目前检测方法无法准确鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的现状，本发明提供一组特异性PCR引物，用于鉴定瓜类细菌性果斑病菌的不同亚组，具有准确度高、灵敏度高、操作简便快速的优点。
本发明请求保护的技术方案如下：
用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组，其特征在于，包括正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2，其核苷酸序列如下：
BFB：5’-ATGAAGCGTACTGTTCAG-3’，
BFB1：5’-ACCATCGATATTAGCATC-3’，
BFB2：5’-TTAAGGAGCAAACGTGC-3’。
优选地，所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2在PCR反应体系中的浓度配比为BFB︰BFB1︰BFB2＝1～2︰1︰1。
用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR试剂盒，其特征在于，包含所述的用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组。
优选地，所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2为液态或固态粉末状，和/或所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2分别独立包装或混装。
优选地，还包括PCR反应所需的其它通用试剂以及试剂盒使用说明书。
所述的用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组或任一所述的用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR试剂盒在鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌中的应用。
用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得待测病菌的菌液或基因组DNA；
(2)以所述待测病菌的菌液或基因组DNA为模板，采用所述的用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组进行PCR反应，得到扩增产物；
(3)凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现348bp的条带，则所述待测病菌为瓜类细菌性果斑病菌I组菌株；若扩增产物中出现507bp的条带，则所述待测病菌为瓜类细菌性果斑病菌II组菌株。
优选地，所述PCR反应的体系为：KOD-Plus-Neo 10×PCR缓冲液2.5μl，25mMMgSO41.5μl，2mM dNTPs 2.5μl，10mM引物BFB/BFB1/BFB2各0.5μl，1.0U/μl KOD Plus Neo酶0.5μl，模板DNA或菌液0.5μl，灭菌双蒸水补足25μl。
优选地，所述PCR反应的条件为：94℃2min；94℃15sec，52℃30sec，68℃45sec，30个循环；68℃延伸2min。
优选地，所述获得待测病菌的菌液包括如下步骤：将单粒种子放入2ml的离心管中，加入1ml ddH2O，180r/min振荡培养30min，取培养上清液。
发明人首次发现瓜类细菌性果斑病菌的pilA基因能够用于区分瓜类细菌性果斑病菌I组和II组菌株，其中，I组菌株的pilA基因序列如SEQ ID NO.1所示，II组菌株的pilA基因序列如SEQ ID NO.2所示。基于瓜类细菌性果斑病菌不同亚组的pilA基因序列，获得了能够用于区分I组和II组菌株的特异性引物组合BFB/BFB1/BFB2，其核苷酸序列分别如SEQID NO.3～5所示。引物BFB/BFB1能够从I组菌株中扩增出348bp的DNA片段，引物BFB/BFB2能够从II组菌株中扩增出507bp的DNA片段，可作为瓜类细菌性果斑病菌的分组依据。
由于潜伏期的种子或者幼苗携带的菌量非常少，从种子或者幼苗获得的病菌的比例极低，对引物的特异性、灵敏度要求非常高。本发明的特异性引物BFB/BFB1/BFB2灵敏度高，特异性好，能通过一步PCR反应将不同亚组的瓜类细菌性果斑病菌鉴别出来。如图5(A－C)所示，采用引物BFB/BFB1/BFB2对瓜类细菌性果斑病菌进行检测，在同一个PCR体系中，无论是单独检测I组菌株，或单独检测II组菌株，或同时检测I组和II组菌株，其检测灵敏度均达到103CFU/ml，并且不存在交叉反应。将引物BFB/BFB1/BFB2用于种子带菌情况检测，可以检测到单粒种子带菌。
进一步地，本发明使用了111个已知的瓜类细菌性果斑病菌菌株对引物BFB/BFB1/BFB2的检测结果准确度进行验证。这111个菌株样本来源广泛，其中97个来自中国，14个来自其他国家，基本涵盖了目前瓜类细菌性果斑病盛行的地域。结果表明，本发明的鉴定结果与文献报道的鉴定结果的一致性高达99％以上。
本发明提供的PCR方法，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)准确性高：所采用的引物特异性强，不同的亚组得到不同的扩增产物，根据凝胶电泳结果即可确定待测菌株属于哪个亚组，能够有效避免假阴性结果。
(2)省时省力：采用双重PCR，只需一步PCR反应即可鉴定不同亚组的瓜类细菌性果斑病菌，操作简便易行。
(3)灵敏度高：对菌液进行检测，灵敏度均达到103CFU/ml。
综上，本发明提供的引物和一步PCR法能够快速、准确区分不同亚组的瓜类细菌性果斑病菌，可用于瓜类细菌性果斑病带菌种子、瓜类细菌性果斑病病株和病果的快速分子检测，有利于及时制定合适的瓜类细菌性果斑病防治方法，避免瓜类产业的经济损失，具有很高的实际应用价值。
附图说明
图1.瓜类细菌性果斑病菌I组菌株特异性引物扩增结果；
其中M为标准DNA分子标记(DNA marker M2000+)；泳道1-23为瓜类细菌性果斑病菌I组菌株(泳道1-23依次为Fc247，Fc520，AAC92-300，AAC200-23，Saticoy.B.H，pslb2，pslb15，pslb19，pslb36，pslb37，pslb39，pslb48，pslb55，pslb68，pslb74，pslb88，pslb93，pslb97，pslb98，pslb99，pslb101，pslb103，Aacw1)；泳道24为阴性对照。
图2.瓜类细菌性果斑病菌II组菌株特异性引物扩增结果；
其中M为标准DNA分子标记(DNA marker M2000+)；泳道1-23为瓜类细菌性果斑病菌II组菌株(泳道1-23依次为Aac5，Aac13，Aac14，Fc356，Fc376，Fc380，Fc491，AAC94-95，AAC94-39，AAC94-48，AAC208-27，ATCC29625，pslb27，pslbtw14，pslbtw23，pslbtw26，pslbtw31，pslbtw35，pslbtw39，pslbtw40，pslbtw41，pslbtw38，pslbtw43)；泳道24为阴性对照。
图3.一步法鉴定瓜类细菌性果斑病菌的不同亚组；
其中M为标准DNA分子标记(DNA marker M2000+)；泳道1-7，10为瓜类细菌性果斑病菌I组菌株(依次为Fc247，pslb2，pslb39，pslb93，pslb97，pslb98，Aacw1，Fc520)，泳道8，9，11-15为II组菌株(依次为Fc356，Fc491，AAC94-95，ATCC29625，pslbtw14，pslbtw38，pslbtw43)。
图4.一步法中引物浓度配比对PCR结果的影响；
图中包含三组实验结果，从左往右依次为摩尔浓度比为1︰1︰1、1.5︰1︰1和2︰1︰1的BFB/BFB1/BFB2引物扩增结果，每一组实验结果由“2”、“14”、“2+14”和CK的检测结果组成。其中，“2”代表以I组菌株pslb2的菌液为PCR模板的扩增结果，“14”代表以II组菌株pslbtw14的菌液为PCR模板的扩增结果，“2+14”代表以pslb2和pslbtw14的混合菌液(按照1:1的体积比混合两个菌株的菌液)为PCR模板的扩增结果，CK为阴性对照(采用ddH2O替代PCR反应体系中的菌液)；M为标准DNA分子标记(DNA marker M2000+)。图5.引物BFB/BFB1/BFB2的灵敏度检测结果；
其中，图5A为I组菌株pslb2不同菌液浓度的PCR扩增结果；图5B为II组菌株pslbtw14不同菌液浓度的PCR扩增结果；图5C为pslb2+pslbtw14的不同菌液浓度的PCR扩增结果；M为标准DNA分子标记(DNA marker M2000+)；DNA为阳性对照；108～101分别表示108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml、102CFU/ml、101CFU/ml的菌液浓度；CK为阴性对照。
图6.种子带菌情况的检测结果；
其中M为标准DNA分子标记(DNA marker M2000+)；泳道1为接种了I组菌株pslb2的西瓜种子的培养上清液；泳道2为接种了II组菌株pslbtw14的西瓜种子的培养上清液；泳道3为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
实验材料：
瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)：共111个已知菌株(如表1所示)，记载在已知文献Jie Zhong,Zhen-Ya Lin,Ya-Min Ma et al.Rapid Discriminationbetween Groups I and II of Acidovorax citrulli Using a Primer Pair Specificto a pilL Gene.Journal of Phytoathology,25 AUG 2015,doi:10.1111/jph.12435和Shasha Yan,Yuwen Yang,Tielin Wang et al.Genetic diversity analysis ofAcidovorax citrulli in China.European Journal of Plant Pathology.2013,136(1)：171–181中。其中，97个菌株来源于中国，14个菌株来源于国外，均由中国农业科学院植物保护研究所蔬菜病害组保存。
上述菌株本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起20年内向公众发放用于必要的验证试验。
表1本实验所使用的菌株材料
Figure BDA0001589578130000061
Figure BDA0001589578130000071
Figure BDA0001589578130000081
Figure BDA0001589578130000091
注：表1中的“-”表示寄主或分离部位不详。
主要试剂与仪器：
KOD Plus Neo酶、10×PCR缓冲液：购自TOYOBO生物科技有限公司。
细菌基因组DNA提取试剂盒：购自北京百泰克生物技术有限公司。
琼脂糖凝胶回收试剂盒：购自康宁生命科学(吴江)有限公司。
DNA marker M2000+：购自北京博迈德基因技术有限公司，DNA标准分子量从上到下依次为2000、1500、1000、750、500、250、100bp。
凝胶分析***：购自Bio-Rad公司，型号Gel Doc XR+。
下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级；未特别说明的试验方法均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或制造厂商说明书。
实施例1.筛选区分瓜类细菌性果斑病菌I组和II组菌株的特异性引物
1、瓜类细菌性果斑病菌DNA的提取
分别提取瓜类细菌性果斑病菌I组菌株和II组菌株的基因组DNA，所采用的菌株如下：
I组菌株：Fc247，Fc520，AAC92-300，AAC200-23，Saticoy.B.H，pslb2，pslb15，pslb19，pslb36，pslb37，pslb39，pslb48，pslb55，pslb68，pslb74，pslb88，pslb93，pslb97，pslb98，pslb99，pslb101，pslb103，Aacw1；
II组菌株：Aac5，Aac13，Aac14，Fc356，Fc376，Fc380，Fc491，AAC94-95，AAC94-39，AAC94-48，AAC208-27，ATCC29625，pslb27，pslbtw14，pslbtw23，pslbtw26，pslbtw31，pslbtw35，pslbtw39，pslbtw40，pslbtw41，pslbtw38，pslbtw43。
基因组DNA提取方法如下：
取甘油保存的果斑病菌菌液50μl，分别于KB固体培养基上画线，28℃培养48小时，然后挑取单菌落于含有100μg/ml Amp(氨苄西林)的KB液体培养基中，28℃，280r/min振荡培养24h。用BioTeKe的细菌基因组DNA提取试剂盒提取果斑病菌的全基因组DNA，操作步骤参见产品说明书。提取的基因组DNA置于-20℃条件下保存备用。
KB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)20g/L；丙三醇(Glycerol)15mL/L；K2HPO4 1.5g/L；MgSO4·7H2O 1.5g/L；调节KB培养基最终pH为7.2～7.4。固体KB培养基添加15g/L的琼脂粉(Agar)。121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后使用。
2、区分瓜类细菌性果斑病菌I组和II组菌株的特异引物的筛选
瓜类细菌性果斑病菌I组菌株的pilA基因全长522bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；II组菌株的pilA基因全长507bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据两组菌株pilA基因序列的差异，分别设计了I组果斑病菌的特异性引物BFB/BFB1和II组果斑病菌的特异性引物BFB/BFB2。引物由华大基因公司合成。
引物BFB的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)为：
BFB：5’-ATGAAGCGTACTGTTCAG-3’；
引物BFB1的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)为：
BFB1：5’-ACCATCGATATTAGCATC-3’；
引物BFB2的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)为：
BFB2：5’-TTAAGGAGCAAACGTGC-3’。
PCR反应体系：采用25μl的PCR反应体系，配比如下：KOD-Plus-Neo 10×PCR缓冲液2.5μl，MgSO4(25mM)1.5μl，dNTPs(2mM)2.5μl，10mM正向引物和反向引物(BFB/BFB1或BFB/BFB2)各0.5μl，KOD Plus Neo酶(1.0U/μl)0.5μl，菌液0.5μl(108CFU/ml)，灭菌双蒸水补足25μl。
阴性对照采用ddH2O替代PCR反应体系中的菌液。
PCR扩增条件为94℃2min；94℃15sec，52℃30sec，68℃45sec，30个循环；68℃延伸2min；4℃保存。
PCR扩增后，取4μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳45min，用EB染色，在紫外灯下观测并照相。
用引物BFB/BFB1、BFB/BFB2对多个果斑病菌菌株的DNA经过多次扩增，确定两对引物很稳定。从图1可以看出，采用引物BFB/BFB1扩增瓜类细菌性果斑病菌I组不同菌株，均获得了348bp的DNA片段；从图2可以看出，采用引物BFB/BFB2扩增瓜类细菌性果斑病菌II组不同菌株，均获得了507bp的DNA片段。分别对两种PCR产物进行测序，测序结果表明两个片段分别为瓜类细菌性果斑病菌I组和II组菌株pilA基因的目标序列。
实施例2.一步法鉴定瓜类细菌性果斑病菌不同亚组
1.一步PCR方法的构建
本发明构建了一步法扩增检测不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR方法，即将I组和II组的特异性引物同时放在一个PCR扩增体系中，通过一次扩增直接鉴定I组和II组菌株。
反应体系和扩增条件如下：
PCR反应体系：采用25μl的PCR反应体系，配比如下：KOD-Plus-Neo 10×PCR缓冲液2.5μl，MgSO4(25mM)1.5μl，dNTPs(2mM)2.5μl，引物BFB/BFB1/BFB2(10mM)各0.5μl，KODPlus Neo酶0.5μl(1.0U/μl)，菌液0.5μl(108CFU/ml)，灭菌双蒸水补足25μl。
PCR扩增条件为94℃2min；94℃15sec，52℃30sec，68℃45sec，30个循环；68℃延伸2min；4℃保存。
PCR扩增后，取4μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳45min，用EB染色，采用Bio-Rad公司的凝胶分析***进行照相分析。
结果如图3所示，用引物BFB/BFB1/BFB2可在所有瓜类细菌性果斑病菌中获得不同大小的PCR扩增片段，I组菌株可获得348bp的片段(泳道1～7，10：检测菌株依次为Fc247，pslb2，pslb39，pslb93，pslb97，pslb98，Aacw1，Fc520)，II组菌株可获得507bp的片段(泳道8为Fc356，泳道9为Fc491，泳道11-15为AAC94-95，ATCC29625，pslbtw14，pslbtw38，pslbtw43)。引物组在两组菌株中没有出现交叉反应，说明本发明所构建的引物BFB/BFB1/BFB2是不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的特异性引物，可用于一步法鉴定不同亚组的瓜类细菌性果斑病菌。
2.引物浓度配比对PCR结果的影响
采用摩尔浓度比为1︰1︰1、1.5︰1︰1和2︰1︰1的BFB/BFB1/BFB2引物分别进行PCR，反应体系、扩增条件及检测方法同步骤1。
结果如图4所示，图中包含三组实验结果，从左往右依次为摩尔浓度比为1︰1︰1、1.5︰1︰1和2︰1︰1的BFB/BFB1/BFB2引物扩增结果，每一组实验结果由“2”、“14”、“2+14”和CK的检测结果组成。其中，“2”代表以I组菌株pslb2的菌液为PCR模板的扩增结果，“14”代表以II组菌株pslbtw14的菌液为PCR模板的扩增结果，“2+14”代表以pslb2和pslbtw14的混合菌液(按照1:1的体积比混合两种菌液)为PCR模板的扩增结果，CK为阴性对照(采用ddH2O替代PCR反应体系中的菌液)。由此表明，三种浓度配比的引物组的扩增结果无显著差异；当I组和II组的菌株同时存在于同一反应体系中时，也能分别特异地扩增出348bp和507bp的目的片段。
实施例3.瓜类细菌性果斑病菌I组和II组菌株特异性引物的灵敏度检测
1、准备菌液
将果斑病菌I组菌株pslb2的菌液稀释成8个浓度梯度：108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml、102CFU/ml、101CFU/ml。
将果斑病菌II组菌株pslbtw14的菌液稀释成8个浓度梯度：108CFU/ml、107CFU/ml、106CFU/ml、105CFU/ml、104CFU/ml、103CFU/ml、102CFU/ml、101CFU/ml。
2、灵敏度检测
分别以pslb2菌液、pslbtw14菌液和pslb2+pslbtw14菌液(按照1:1的体积比混合pslb2和pslbtw14两种菌液)为模板，采用BFB/BFB1/BFB2引物组进行PCR，反应体系和扩增条件同实施例2步骤1。阳性对照采用实施例1中提取的相应菌株的基因组DNA为PCR模板。
所有的阴性对照采用无菌KB液体培养基替代菌液。按照实施例1中的方法对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
如图5(A-C)所示，BFB/BFB1/BFB2引物组用于扩增I组菌株pslb2菌液中的目的片段时，灵敏度为103CFU/ml(图5A)；用于扩增II组菌株pslbtw14菌液中的目的片段时，灵敏度为103CFU/ml(图5B)；用于扩增pslb2+pslbtw14菌液中的目的片段时，灵敏度为103CFU/ml(图5C)。
实施例4.本发明特异性引物的准确度检测
以表1所列出的111个菌株作为样品，按照如下方法对特异性引物的准确度进行检测。
(1)准备菌液
取甘油保存的果斑病菌菌液50μl，分别于KB固体培养基上画线，28℃培养48小时，然后挑取单菌落于无菌KB液体培养基中，28℃，280r/min振荡培养24h。
(2)扩增目的片段
PCR反应体系：采用25μl的PCR反应体系，配比如下：KOD-Plus-Neo 10×PCR缓冲液2.5μl，MgSO4(25mM)1.5μl，dNTPs(2mM)2.5μl，引物BFB/BFB1/BFB2(10mM)各0.5μl，KODPlus Neo酶0.5μl(1.0U/μl)，菌液0.5μl(108CFU/ml)，灭菌双蒸水补足25μl。
PCR扩增条件为94℃2min；94℃15sec，52℃30sec，68℃45sec，30个循环；68℃延伸2min；4℃保存。
(3)凝胶电泳检测
PCR扩增后，取4μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳45min，用EB染色，采用Bio-Rad公司的凝胶分析***进行照相分析。
(4)确定菌株所属亚组
根据每个菌株PCR产物的大小来判断该菌株所属亚组，如果PCR产物为348bp，则该菌株属于瓜类细菌性果斑病菌I组菌株；如果PCR产物为507bp，则该菌株属于瓜类细菌性果斑病菌II组菌株。
结果如表2所示，采用本发明的一步法鉴定111个已知菌株所属亚组的鉴定结果与文献报道的鉴定结果的一致性极高，达99％以上。除pslbtw20菌株的鉴定结果有争议以外，其余110个菌株的鉴定结果与文献报道完全一致。
表2.111个已知菌株所属亚组的鉴定结果
Figure BDA0001589578130000131
Figure BDA0001589578130000141
Figure BDA0001589578130000151
实施例5.种子带菌情况的检测
瓜类细菌性果斑病为种传病害，种子带菌是其远距离传播的重要方式，种子带菌与否对当年的产量有着至关重要的影响。本发明构建了检测种子带菌情况的PCR方法，以下为模拟实验。
样品制备：将10粒西瓜种子浸泡入108CFU/ml的不同亚组果斑病菌菌液中，28℃，180r/min振荡培养2h，将种子取出置于培养皿中，在灭菌的超净工作台中过夜晾干。
通过如下方法检测西甜瓜种子带菌情况：
(1)将晾干后的单粒种子放入2ml的离心管中，加入1ml ddH2O，180r/min振荡培养30min，取培养上清液备用。
(2)以培养上清液为模板进行PCR反应，反应体系和扩增条件及琼脂糖凝胶电泳检测同实施例4。阴性对照以ddH2O替代培养上清液。
结果如图6所示，使用BFB/BFB1/BFB2检测带有不同亚组果斑病菌的种子，可以准确地区分两个亚组的菌株，I组菌株可扩增出348bp的条带，II组菌株可扩增出507bp的条带。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 用于鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物和方法
<130> P170285/ZWB
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 瓜类细菌性果斑病菌I组菌株的pilA基因序列
<400> 1
atgaagcgta ctgttcagca aggtttcacc ttgatcgaac tgatgatcgt cgtggcgatc 60
attggtattt tggctgccgt ggcactgccg gcttatcagg attacacgaa aaaggcgaag 120
atgtcggaag tggtcttggc tgcgtcgcag tgtcgtacca ctattaccga gcaggttcaa 180
agcatggcat ccgacaaggt cggtgcggcc aatggttggg gctgtgaagc caacgttggt 240
ggaaatgttg catccggccc taccaagtat gttgcctcta tcgaaactac tgacaacggc 300
gtgatttctg caaaggctcg taacttcaac gatgctaata tcgatggtaa atatgttgtg 360
atgatcccta aaatctccgg cactgctatc gtggtcaatg ccgctagtaa agatcaaggc 420
aagcaaattt ctgaatggac ctgtggcggc ggagatgctg caggcaccca actggcttcc 480
tctagtatca acaaattcct tcctggctcc tgcaagtcgt ga 522
<210> 2
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 瓜类细菌性果斑病菌II组菌株的pilA基因序列
<400> 2
atgaagcgta ctgttcagca aggtttcacc ttgatcgaac tgatgatcgt ggtggcgatc 60
attggtattt tggctgccgt ggcactgccg gcttatcagg attacaccaa gaaagccaag 120
atgtctgaag tcatcttggc ggcttccagc tgccgtacca ccatcacgga aatctatcaa 180
agtgctactg cttcgagtcc tccggctgca ggtgcttggg gctgcgaaag tgcatcgtcc 240
accagtaagt atgtgaaatc catcaagacg actgccgatg gcaaggtgcg tgttgaggct 300
caaggcttta atgatggcaa cattgatgga aagtttgtgt acttggagcc caaaaccacc 360
gctggtgcag ccatgactgc tgctagcaat atggggcagc aagttggctc ttgggattgc 420
ggtgcaccgg ctggcgacac cattctcaaa ttccttcctg gatcgtgcaa ggcaaccgtg 480
acgaatgctg gcacgtttgc tccttaa 507
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正向引物BFB的核苷酸序列
<400> 3
atgaagcgta ctgttcag 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反向引物BFB1的核苷酸序列
<400> 4
accatcgata ttagcatc 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反向引物BFB2的核苷酸序列
<400> 5
ttaaggagca aacgtgc 17

Claims (9)

1.用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组，其特征在于，包括正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2，其核苷酸序列如下：
BFB：5’-ATGAAGCGTACTGTTCAG-3’，
BFB1：5’-ACCATCGATATTAGCATC-3’，
BFB2：5’-TTAAGGAGCAAACGTGC-3’；
所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2在PCR反应体系中的浓度配比为BFB︰BFB1︰BFB2＝1～2︰1︰1。
2.用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2为液态或固态粉末状，和/或所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2分别独立包装或混装。
4.根据权利要求2或3所述的PCR试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应所需的其它通用试剂以及试剂盒使用说明书。
5.权利要求1所述的用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组或权利要求2～4任一所述的用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR试剂盒在鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌中的应用。
6.用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得待测病菌的菌液或基因组DNA；
(2)以所述待测病菌的菌液或基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的用于一步鉴定不同亚组瓜类细菌性果斑病菌的PCR引物组进行PCR反应，得到扩增产物；
(3)凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现348bp的条带，则所述待测病菌为瓜类细菌性果斑病菌I组菌株；若扩增产物中出现507bp的条带，则所述待测病菌为瓜类细菌性果斑病菌II组菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的体系为：KOD-Plus-Neo10×PCR缓冲液2.5μl，25mM MgSO4 1.5μl，2mM dNTPs 2.5μl，10mM引物BFB/BFB1/BFB2各0.5μl，1.0U/μl KOD Plus Neo酶0.5μl，模板DNA或菌液0.5μl，灭菌双蒸水补足25μl。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：94℃2min；94℃15sec，52℃30sec，68℃45sec，30个循环；68℃延伸2min。
9.根据权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述获得待测病菌的菌液包括如下步骤：将单粒种子放入2ml的离心管中，加入1ml ddH2O，180r/min振荡培养30min，取培养上清液。
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