CN107129946B - 一种高定植的微生物制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了了公开一种高定植的微生物制剂，其包括CGMCC编号11870的耐久肠球菌CR‑29(Enterococcus durans CR‑29)和CGMCC编号11869的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌SR‑19(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides SR‑19)。还公开了高定植的微生物制剂在制备调整肠道微生物菌群制剂、在制备预防和/或治疗肠道致病菌中的应用。

Description

一种高定植的微生物制剂及其应用

技术领域

本发明属于益生菌领域，具体涉及一种高定植的微生物制剂及其应用。

背景技术

肠道内细菌从来源上分，有原籍菌和过路菌两种。前者并非由口摄入，在肠道内保持稳定的群体；而后者则由口摄入并经胃肠道，原籍菌是使过路菌不能定殖的因素。胃肠道的原籍菌群能抑制其它外来微生物在肠道中定殖或增殖，这就是定殖抗力，也称竞争排斥。这种定殖抗力的产生是因为体内微生物与致病菌竞争肠道上皮的吸附位点而产生的。如果这些吸附位点被较多有益微生物所占据，病原微生物就会被排斥。

阻止病原菌的定殖和侵入，如阻止沙门氏菌对宿主的感染。这种豁附定植可能是因为益生菌菌表面有能与肠粘膜细胞牢固结合的特异性物质，推测可能是脂磷壁酸或肽聚糖，或细胞表面层蛋白，或者其中二者，或三者全部。这些特异性物质被称为粘附素，乳酸菌通过粘附素与肠粘膜紧密结合，在肠粘膜表面定殖占位，是形成生理屏障的主要组成部分。该屏障可以抵御外来细菌的入侵，维持肠道内微生态平衡。研究益生菌的定殖抗力与生态占位，对益生菌在人体能否发挥出应有作用至关重要。

近年来，益生菌的理论与应用得到迅猛发展。而利用生物之间天然互惠共生现象发展多种微生物的混合培养具有广阔的应用前景，也是当下研究相对不足领域之一。天然或人工混合共生体系是靠原始协同、互惠共生和偏利共生来维持稳定状态，微生物菌群中存在的拮抗与互助是群落的重要自稳机制。人体的肠道菌群即是一个巨大的微生物共生平衡体系，其中包括人体与肠道菌群的互惠共生，原核生物与真核生物的共生，细菌与细菌之间的共生等，而天然的益生菌共生体制剂在人体微生态环境中具有有更大的缓冲能力与环境适应能力，其中在医药与食品领域人工的复合微生态制剂以使用超过百年。目前，尚对具有协同关系菌株的筛选和组合缺乏有效的方法与理论指导，同时，益生菌剂组方及其比例关系以便提高其功能而缺乏理论依据。

发明内容

本发明的发明人经过不断实验，令人惊喜的发现了一种高定植的益生菌共生体，其在肠道定植方面产生了预料不到的效应，本发明即是基于以上发现而完成。

本发明的发明人在传统的民族乳制品中筛选出一对益生菌共生体肠膜明串株菌SR-19与耐久肠球菌CR-29，并对其互惠共生作用以及该益生菌共生体对其他人体肠道益生菌的促进生长能力进行研究。

本发明的第一个方面在于公开一种高定植的微生物制剂，其包括CGMCC编号11870的耐久肠球菌CR-29(Enterococcus durans CR-29)和CGMCC编号11869的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌SR-19(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides SR-19)。

优选的，所述一种高定植的微生物制剂中，耐久肠球菌CR-29与肠膜明串珠菌肠膜亚种菌SR-19的cfu/g比例为1:10-10:1。

本发明的第二个方面在于公开一种制备第一方面高定植的微生物制剂的培养方法，

采用液体培养基，肠膜明串珠菌肠膜亚种均SR-19与耐久肠球菌CR-29的接种量分别为5％与7％，初始pH6.8；

初始培养温度为44℃(1.0-1.5小时)；中段培养温度为42℃(2.0-2.5小时)，发酵中段为pH5.9；末段培养温度为38℃(1.5-2.0小时)；

振荡频率140r/min的条件下培养，培养4h后添加补充营养物质继续培养，至活菌数不小于1010cfu/mL收获；

培养出的活菌体可通过低温离心分离获得；

所述液体培养基，即工业培养基，的配方为：脱脂奶粉100g/L,酵母粉10g/L，蔗糖50g/L，柠檬酸钠2g/L,醋酸钠0.5g/L，pH 6.8-7.2；所述补充营养物质的配方为：牛肉膏与胡萝卜原汁2:1体积混合溶液。

本发明的第三个方面在于公开一种制备高定植的微生物制剂的菌粉，其特征在于，通过以下方法制成：

活菌数不小于1010cfu/mL益生菌共生体发酵液经过滤或离心，利用冻干保护剂进行真空冷冻干燥，冻干曲线为：起始温度-42℃，预冻4小时，-42℃至-5℃每小时升温5℃；-5℃至11℃每小时升温2℃，从10℃至40℃每小时升温5℃；从40℃至50℃每小时升温2℃，在30小时内完成冻干制备，制得共生体益生菌菌粉；以上操作均在无菌条件下进行。

本发明的第四个方面在于公开一种高定植的微生物制剂，含有所述微生物制剂和药学上可以接受的辅料。

本发明的第五个方面在于公开高定植的微生物制剂在制备调整肠道微生物菌群制剂中的应用。

本发明的第六个方面在于公开高定植的微生物制剂在制备耐胃酸、耐肠液、耐胆汁的调整肠道微生物菌群制剂中的应用。

本发明的第七个方面在于公开高定植的微生物制剂在制备预防和/或治疗肠道致病菌中的应用。

本发明的第八个方面在于公开高定植的微生物制剂在制备耐胃酸、耐肠液、耐胆汁的预防和/或治疗肠道致病菌中的应用。

在一些实施例中，该共生体益生菌的生产过程是通过：接种、复壮、发酵培养、分离、冻干等步骤。具体的，

共生体益生菌肠膜明串珠菌肠膜亚种SR-19与耐久肠球菌CR-29的接种量5％与7％，培养基为：牛奶(羊奶或马奶)、脱脂奶粉、乳清蛋白、维生素K、矿物元素为原料，初始培养温度为44℃(1.0-1.5小时)；中段培养温度为42℃(2.0-2.5 小时)；末段培养温度为38℃(1.5-2.0小时)。初始pH6.8，发酵中段为pH5.9，振荡频率140r/min的条件下培养，培养4h后以补料速度6.3m/h补充营养物质(牛肉膏与胡萝卜汁2:1混合溶液)继续培养至收获可使益生菌菌活菌数不小于 1010cfu/mL以上。培养出的活菌体可通过低温离心分离(6000r/min)获得，利用海藻酸钠、木糖醇、初乳蛋白(2:1:1)作为冻干保护剂进行真空冷冻干燥，冻干曲线为：起始温度-42℃，预冻4小时，-42℃至-5℃每小时升温5℃；-5℃至11℃每小时升温2℃，从10℃至40℃每小时升温5℃；从40℃至50℃每小时升温2℃，在30小时内完成冻干制备，制的共生体益生菌菌粉。

所述培养基与冻干保护剂配方：

益生菌共生体的培养基详细配方，包括各组分和含量；

实验室培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，加蒸馏水至1000mL，pH 6.4。

工业化培养基组成为:脱脂奶粉100g/L,酵母粉10g/L，蔗糖50g/L，柠檬酸钠2g/L,醋酸钠0.5g/L，pH 6.8-7.2。补充营养物质：牛肉膏Beef Extract与胡萝卜原汁2:1混合溶液按发酵总量的0.8％补充；

培养基121℃湿热灭菌，备用。

冻干保护剂：海藻酸钠50％、木糖醇25％、初乳蛋白25％(2:1:1)作为冻干保护剂按1:10比例与发酵液干物质混合。

本发明涉及的主要仪器及设备：

4℃冰箱SC-276，海尔集团；-86℃冰箱DW-FW3_51，中科美菱低温科技有限公司；电子天平JA2003，上海精密科学仪器有限公司；数显酸度计PHS-2_5，上海仪电科学仪器股份有限公司；无菌超净工作台SW-CJ一1F，苏净AIRTECH；高压灭菌锅LDZX-30KB，上海三申医疗器械有限公司；恒温培养箱JB202，上海锦屏仪器仪表有限公司；无菌过滤装置250mL，美国Nalgene公司；数显恒温水浴锅 HH-2，金坛市富华仪器有限公司；HITACHI U-2000型紫外可见分光光度计； Eppendorf TGL-168高速台式离心机；OLYMPUSBX50型光学显微镜；OLYMPUSBX50型摄像***；722型分光光度计；厌氧罐(BBL Gas park)；OLYMPUS PM-20型摄像***；250m1聚丙烯离心管、(Gilson)、涂菌平皿为国产；巴斯德吸管、吸管、微量加样器8道排枪，Eppendorf公司。

主要实验材料：耐久肠球菌CR-29，肠膜明串株菌SR-19，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号分别为CGMCC编号11870、和CGMCC编号11869。

保加利亚乳杆菌，嗜酸乳杆菌来自长春中俄科技园中俄生物工程与技术联合研发中心；青春双歧杆菌来自俄罗斯莫斯科大学；粪肠球菌F-3由俄罗斯圣彼得堡国立大学基础医学与医疗技术系提供。肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytonenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌(Escherichiacoli)由吉林大学公共卫生学院提供。

生物材料保藏信息：

耐久肠球菌CR-29，分类命名为耐久肠球菌Enterococcus durans，于2015年 12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.11870。

肠膜明串株菌SR-19，分类命名为肠膜明串珠菌肠膜亚种Leuconostocmesenteroides subsp.Mesenteroides，于2015年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.11869。

本发明中，共生体、益生菌共生体与微生物制剂含义相同。

附图说明

图1为放大1000的光镜照片，其中

1)CaCo-2细胞粘附的形态图；

2)益生菌与CaCo-2细胞粘附的形态图；

3)益生菌与CaCo-2细胞粘附的形态图；

4)益生菌共生体与CaCo-2细胞粘附的形态图；

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但足本领域技术人员将会理解，下列实施例仅于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1益生菌共生体的肠道细胞粘附能力测定

益生菌粘附到肠道上皮细胞能力的强弱仍然常被作为其肠道定殖能力大小及其能否发挥益生功能的重要指标。CaCo-2细胞是一种易于体外培养的人结肠腺癌细胞，其细胞形态、粘附能力等与人的肠道上皮细胞类似，常用来作为体外粘附试验的模型细胞。测定单一益生菌与益生菌共生体对CaCo-2细胞粘附能力。具体实验步骤如下:

1)细胞复苏:将存放于液氮罐中的CaCo-2细胞冻存管迅速置于37℃水浴锅中使其融化，将其接种在RPMI-1640完全培养基中于37℃二氧化碳培养箱中进行培养，隔天换一次培养液；

2)将细胞进行传代培养3-4代，待细胞长满培养皿，PBS清洗、胰酶消化后用血球计数板进行计数；

3)用RPMI-1640基础培养基调节细胞的浓度为5x10⁵个/mL，将此细胞悬液置于预先放置了盖玻片的6孔细胞培养板中，于二氧化碳培养箱中培养6h，使细胞贴壁；

4)将培养过夜的单一益生菌体与益生菌共生体浓度用RPMI-1640基础培养基调节为 10⁷cfu/mL；

5)倾去细胞培养基，将贴壁细胞与菌悬液共培养4h；

6)倾去菌悬液，用PBS缓冲液洗去未粘附的双歧杆菌；

7)甲醇固定5-10min，然后用瑞士-姬姆萨染液进行染色，染色步骤参照《快速姬姆萨复合染液说明书》进行操作；

8)用PBS缓冲液冲洗至染液无色，将细胞培养板放在37℃培养箱进行干燥或者自然干燥；

(9)在油镜下观察，计算50个随机的视野当中细胞上粘附的益生菌菌数。

表1单一益生菌与益生菌共生体与人体细胞粘附关系的结果

益生菌株	CaCo-2细胞粘附益生菌数目
		SR-19	645.3±2.0
CR-29	973.4±6.3
		SR-19与CR-29的共生体	2124.9±6.7

结果显示，SR-19与CR-29的共生体的细胞粘附能力大大超出了两者的直接叠加，具有显著的协同作用。

实施例2

本混合体微生物能够在胃酸中、碱环境和人体肠酶中保持生命活性；

单菌株与双联共生体菌株外耐受性检测方法与结果

益生菌必须是活体进入并定植于肠道才可发挥其益生功能，外界温度与去存放时间对益生菌的活性有直接的影响，并且其进入肠道则必须通过口腔，经过胃后到达肠道，其中胃中的胃酸及胃蛋白酶和小肠中胆盐及胰蛋白酶都具有抗菌作用，会影响活菌数目，从而影响益生菌发挥其效用。因此考量外界因素对菌活的影响与通过消化道且存活并定植于肠道是益生菌的筛选重要标准之一。

1.不同温度下共生体益生菌比人工混合益生菌的保藏特性比较

将已活化好的四种株益生菌以10％接种量分别接入5mL灭菌的MRS broth培养基中，分别将肠膜明串株菌SR-19与耐久肠球菌CR-29及混合接种液置于42℃水夹套恒温培养箱中培养至其对数生长末期，将保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌及其混合接种液置于38℃水夹套恒温培养箱中培养至其对数生长末期，分别放入冰箱4℃和恒温箱20℃保存，每组重复三个平行，分别在第0,2,4,7,10,14,21.28d 进行活菌平板计数。

由于不同的益生菌遗传因素不同，即使处于相同环境中的不同产品存放相同时间，活菌数也不同。4℃是常用的保藏食品的温度，20℃是一般的室内温度，三株菌在4℃下和20℃保藏期间活菌数是有一定程度的下降，这可能是由于保藏时培养基含有的代谢产物的抑制作用及在酸性环境下的“酸损伤”作用等所造成的。但4℃下总体上这四株菌在28天后单株或混合的情况下仍然有很高的存活率，其活菌数仍高达10⁸CFU/ml左右，其中肠膜明串株菌SR-19与耐久肠球菌CR-29的共生体混合液的活菌降低最少，28天后菌的存活仍在10⁹CFU/ml以上，并且20℃下存放 28天亦含有10⁷CFU/ml活菌量，显示了该益生菌共生体极强的稳定特性。

2.耐胃酸能力测定

对于调节肠道菌群的乳酸菌而言，必须进入人的肠道才能发挥其疗效功能，然而，在从口腔到肠道的过程中，乳酸菌必须经过人体的胃，因此研究乳酸菌在胃液中的耐受性就十分必要。在空腹时，胃液的pH值是1.5至1.8之间，在进食过程中，由于食物成分、进食量以及个体之间的差异，一般胃液的pH值在1.8至5.0 之间波动，通常在3.0左右，食用酸性食品可达1.5，食用碱性食品时可达4至5；此外，不同食物形态也影响其在胃中的消化时间，流体食物通常在胃中的平均消化时间是1.5-2h。

实验采用SR-19与CR-29的单一菌株与其组成的益生菌共生体在不同pH值的人工胃液中，在不同时间测定其活菌数。

(1)人造胃液的配制。取浓度为lmol/L的稀盐酸，加水稀释，将pH值分别调至 1.5,2.0,2.5,3.5，每100mL液体中加入1g胃蛋白酶(酶活力453U/mg),混匀，用0.20μm的无菌滤器过滤待用。

(2)实验方法:将活化好的三种益生菌液以1％接种量分别接入上述不同pH值的人造胃液中，37℃恒温水浴培养，在0,0.5,1,1.5,2,3h进行活菌平板计数。每组重复三个平行，求代数平均值。

单一益生菌与其组成的益生菌共生体在不同pH下人造胃液下的存活状况结果如下表所示:

表2不同pH值下单一菌体与共生体的人造胃液实验结果(lgCFU/mL)

结果表明:在pH＝1.5时，受测的单一菌株和两种菌株组成共生体均不能存活；在pH＝2.0时，三株乳杆菌均可以存活，但在较短时间内检测的存活菌数明显高于较长时间点的存活菌数；在pH值为2.5及以上时，人造胃液对单一菌株的有一定的影响，但对SR-19与CR-29菌株组成益生菌共生体的影响极小，这显示该共生体的良好耐酸稳定性。在pH值2.5以上时有的菌甚至出现了生长，这可能是因为： 1)人工胃液在该PH值下几乎对该菌没有影响，2)1％的接菌量带进了一定的营养物质；3)所取菌种是处于对数生长期的生长旺盛的菌。

以上结果表明，共生体的耐酸能力强于单一菌株，共生体菌株具有协同作用。

3.耐肠液能力测定

在小肠内生存着大量的微生物，不仅数量大，而且种类繁多，也是各种口服益生菌发挥作用的场所，无论怎样，保持一定数量的存活菌数是其发挥作用的先决条件。小肠液的作用、小肠的蠕动等是影响益生菌数量的因素。小肠液的pH值约为 7.6，食物通过小肠的平均时间约为1.5h。

实验采用三株菌在不同pH值的人工肠液中，37℃恒温水浴培养在不同时间测定其活菌数。

(1)人造肠液的配制:取磷酸二氢钾0.8g，加水500mL溶解，用质量分数为0.4％的氢氧化钠溶液调pH值至6.8，加水稀释至1000mL，每100mL液体中加入1g胰蛋白酶(酶活力11800U/mg)，混匀，用0.20μm的无菌滤器过滤待用。

(2)实验方法:将活化好的三种益生菌液以1％接种量分别接入上述不同pH值的人造肠液中，37℃恒温水浴培养，在0,0.5,1,1.5,2,3h进行活菌平板计数。每组重复三个平行，求代数平均值。

根据实验条件得到结果如下表所示:

表3单一菌体与其共生体在不同时间的人造肠液耐受性试验结果 (lg(CFU/mL))

结果表明：单一菌体在人工肠液中均有较高的存活数，并且对单一菌体组成的共生体来说，人造肠液在时间变化过程中几乎对活菌数没有影响。因此，在模拟人体肠液环境下，SR-19与CR-29菌株组成益生菌共生体具有优良的耐受性能。

以上结果表明，共生体的耐肠液能力强于单一菌株，共生体菌株具有协同作用。

4.耐胆盐能力测定

胆汁耐受力是乳杆菌重要的特征之一，乳杆菌要到达并定殖于人的肠道，必须对胆盐有一定的耐受性，其耐受力的高低意味着该菌株在肠道中的存活能力的高低。人体小肠中胆汁盐含量在0.03％—0.3％范围内波动。

在MRS broth培养基中加入猪胆酸盐，使其质量分数分别为0.15％,0.2％,0.25％,0.3％,0.35％,0.4％，分装于离心试管中，每支3mL，每个浓度5支，以质量分数为0.4％溴钾酚紫为指示剂。在121℃灭菌15min。将已活化好的三种益生菌液以1％接种量接入上述已处理好的培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h，每组重复三个平行，观察其颜色的变化。

表4单一菌体与共生菌体在不同浓度胆盐中的生长情况

注:“-”不生长；“+”生长；“++”生长良好；“+++”生长非常好

该实验结果显示了单一与共生菌体在不同浓度牛胆汁盐中的生长情况，可以看出，单一菌体具有优良的耐胆汁酸能力，而共生菌体耐受胆盐能力极强，在0.2％时可生长旺盛，在胆盐浓度0.4％时仍可以生长，SR-19和CR-29能生长的最高胆盐浓度为0.25％和0.3％。

以上结果表明，共生体的耐胆汁能力强于单一菌株，共生体菌株具有协同作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (4)

1.一种高定植的微生物制剂，其特征在于，其包括CGMCC编号11870的耐久肠球菌CR-29(Enterococcus durans CR-29)和CGMCC编号11869的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌SR-19(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides SR-19)；

所述一种高定植的微生物制剂中，耐久肠球菌CR-29与肠膜明串珠菌肠膜亚种菌SR-19的cfu/g比例为1:10-10:1。

2.一种制备如权利要求1所述一种高定植的微生物制剂的培养方法，其特征在于，

采用液体培养基，肠膜明串珠菌肠膜亚种均SR-19与耐久肠球菌CR-29的接种量分别为5％与7％，初始pH6.8；

初始培养温度为44℃，初始培养时间为1.0-1.5小时；中段培养温度为42℃，中段培养时间为2.0-2.5小时，发酵中段为pH5.9；末段培养温度为38℃，末段培养时间为1.5-2.0小时；

振荡频率140r/min的条件下培养，培养4h后添加补充营养物质继续培养，至活菌数不小于10¹⁰cfu/mL收获；

培养出的活菌体可通过低温离心分离获得；

所述液体培养基的配方为：脱脂奶粉100g/L,酵母粉10g/L，蔗糖50g/L，柠檬酸钠2g/L,醋酸钠0.5g/L，pH 6.8-7.2；所述补充营养物质的配方为：牛肉膏与胡萝卜原汁2:1体积混合溶液。

3.一种制备如权利要求1-2任一所述一种高定植的微生物制剂的菌粉，其特征在于，通过以下方法制成：

活菌数不小于10¹⁰cfu/mL益生菌共生体发酵液经过滤或离心，利用冻干保护剂进行真空冷冻干燥，冻干曲线为：起始温度-42℃，预冻4小时，-42℃至-5℃每小时升温5℃；-5℃至11℃每小时升温2℃，从10℃至40℃每小时升温5℃；从40℃至50℃每小时升温2℃，在30小时内完成冻干制备，制得共生体益生菌菌粉；以上操作均在无菌条件下进行。

4.一种高定植的微生物制剂，含有如权利要求1-2任一所述微生物制剂和药学上可以接受的辅料。

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