CN106554925A - 一株具有高产胞外多糖的乳明串珠菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离出的具有高产胞外多糖的乳明串珠菌，保藏号为CGMCC No.11248，具有高产胞外多糖的能力，具有一定的疏水能力和耐消化道环境的能力，且具有较强的抑菌能力。本发明菌株在小鼠体内具有免疫诱导和调节作用，能够应用于发酵乳制品的制备以及保健食品和药品的制备。

Description

一株具有高产胞外多糖的乳明串珠菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及极端环境功能性乳酸菌开发与应用领域，以及具有高产胞外多糖(EPS)的乳明串珠菌的分离、筛选、鉴定及益生功能评价，和在食品和药品生产中的应用。

背景技术

微生物胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易于菌体分离的荚膜多糖或粘液多糖，属于次级代谢产物。发酵奶产品以及乳酸菌益生效应的产生不仅仅来自于乳酸菌本身和细胞壁成分，还有一部分来自于乳酸菌的代谢产物如肽和发酵过程中产生的胞外多糖(EPS)。乳酸菌作为食品级的微生物被公认为安全的微生物(GRAS)，其产生的EPS有助于改善自然发酵奶产品的质地和粘度，并且防止发酵乳制品收缩脱水。另外，大量的研究证实EPS具有免疫调节和抗肿瘤的生理活性，对人类的健康有着重要的意义。对于细菌本身而言，EPS有助于防止干燥、有毒化合物和噬菌体侵蚀、渗透胁迫和促进其黏附到固体表面以及生物膜的形成等(Vuyst et al.,1999)。另外，还有研究指出EPS具有抑制致病菌的能力(Wu et al.,2010)。EPS对发酵乳制品品质的改善作用，以及本身对人体的益生作用，已经有很多研究报道。而随着EPS益生功能研究的深入，益生元产品的开发也成为目前新型的健康的并且极其受欢迎的益生产品。但是由于EPS研究的时间较短，高产EPS微生物的发掘欠缺，造成发酵乳制品中添加工业凝胶来改善产品品质的丑闻，并且屡禁不止，以及含EPS的益生菌产品供不应求。这也说明市场对高产EPS乳酸菌的需求是如此的迫切。

从生态的角度来看，无论古生菌还是细菌都有一个相似点，就是利用自身产生生物聚合物来保护菌体细胞，从而免受极端环境的损害(Khan et al.,2011)。因此，长期生活在低温、高海拔、强紫外、稀氧的极端环境下可能使乳酸菌形成了一种特殊的遗传机制，具有产生更多的EPS来达到抵御外界环境胁迫保护自身的可能，且从青藏高原牦牛酸奶表观观察没有添加任何添加剂的情况下具有很高的粘度。

由此，在极端环境下筛选的具有高产胞外多糖的益生乳酸菌基于其益生功能的特殊性，具有较大的开发和应用价值，对维持人体健康具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高产胞外多糖且维持基本益生特性，能在体内发挥特殊益生功能的益生菌，以期进一步开发利用。

为了实现上述目的，本发明方法步骤如下：

(1)青藏高原传统发酵牦牛酸奶中的微生物通过MRS、M17、KFS和SL四种不同的培养基培养，挑选特征菌株并纯化，得到纯分离的菌株。

(2)结合过氧化氢阴性、革兰氏染色阳性、菌体形态以及镜检分离挑选似乳酸菌菌株，进行16S rDNA测序，NCBI中进行Blast比对，鉴定并保存403株乳酸菌菌株。

(3)测定(2)中已鉴定的乳酸菌菌体的产胞外多糖能力进行筛选，筛选出本发明菌株H52具有高产胞外多糖的能力，在(2)中被鉴定为乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)。

(4)对本发明菌株H52的体外益生功能进行评价，包括酶活、抑菌能力、模拟胃肠道、耐胆盐、疏水能力测定。

(5)通过动物模型试验，对本发明菌株进行体内免疫特性研究。

本发明所述具有高产胞外多糖的乳明串珠菌已于2015年8月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11248。

本发明具有综合性能的菌株，该菌株高产胞外多糖菌株，具有较强的肽酶和糖苷酶水解活性，在胆盐耐受能力、抑菌能力、疏水能力以及模拟胃肠道的体外试验中都表现较好的益生特性，尤其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、鼠伤寒志贺氏菌具有较强的抑制能力。

经动物试验证明，本发明菌株对脏器无毒副作用，能诱导血清中免疫因子IL-10、IL-12和IFN-γ的增加，具有免疫调节作用。

附图说明

图1为本发明实施例4发明菌株对小鼠血清细胞因子和分泌型免疫球蛋白A的影响

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图， 对本发明进一步详细说明。

相关培养基配方

乳酸细菌培养基(MRS)(张刚，2007)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 6.2～6.4，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。

M17培养基(张刚，2007)：精确称取植质蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，量取1.0mol/L MgSO₄·7H₂O 1.0mL，蒸馏水1000mL，琼脂15g。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 7.0，加入琼脂，121℃灭菌15min，趁热倒平板。

SL培养基(张刚，2007)：称取酪蛋白水解物10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠25g，七水硫酸镁0.58g，琼脂15g，葡萄糖20g，吐温801.0mL，磷酸氢二钾6g，七水硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.15g，蒸馏水1000mL。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 5.4，加入已加热溶解的琼脂，混合均匀，边搅拌边煮沸5min，冷却到50℃，倒平板。

KFS链球菌选择性培养基：月示蛋白胨10g，酵母粉10g，甘油磷酸钠10g，氯化钠5g，麦芽糖20g，乳糖1g，叠氮钠0.4g，琼脂13g，溴甲酚紫0.015g，调节pH 7.2。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调pH 7.2，加入琼脂，121℃灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入无菌1％TTC溶液10mL，混匀，趁热倒平板。

营养培养基(NB)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。制法：将上述成分混合，溶解后调pH，121℃灭菌15min，冷却备用。制备营养培养基平板时，加入0.8％的琼脂。

脑心浸液肉汤(BHI)：蛋白胨10g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5g，氯化钠5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠2.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。制法：将上述成分混合，溶解后调pH，121℃灭菌15min，冷却备用。制备培养基平板时，加入0.8％的琼脂。

试验中采用的参考菌株

标准致病菌：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，CICC10420)，单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，CICC21583)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CICC10384)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli，CICC20234)。单增李斯特氏菌用脑心浸液培养基培养，其余致病菌用营养培养基培养。

实施例1：从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离并鉴定乳酸菌

一、样品来源

来源于我国甘肃省天祝藏族自治县传统发酵牦牛乳制品。

二、从传统牦牛乳制品中分离得到乳酸菌

取1mL发酵牦牛乳制品按1:10比例，用灭菌生理盐水稀释，此为10^-1稀释度。然后吸取1mL上述稀释液，再10倍稀释，为10^-2稀释度，以此类推。选取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度，分别吸取100μL稀释液分别均匀地涂布于MRS、M17、KFS和SL(调pH5.4)平板培养基上，分别在37℃、42℃、42℃和37℃厌氧恒温培养48小时，挑取特征菌落，并进一步纯化，得到纯分离的乳酸菌菌株。

三、对菌株进行鉴定

(1)革兰氏染色、过氧化氢酶实验

革兰氏染色：挑取平板上的纯菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、番红复染、干燥、油镜镜检。蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。

过氧化氢酶实验：将待测菌在空气中暴露30min，用滴管吸取少量3％(体积分数)过氧化氢滴于平板表面所生长的菌落，2-3分钟后观察有气泡产生的为阳性，无为阴性。

该菌株革兰氏染色为阳性，过氧化氢实验为阴性，可初步视为乳酸菌。

(2)16SrRNA鉴定

纯化后的乳酸菌在MRS培养基中培养8h后，10000rpm/min离心3-5min收集菌体，按照试剂盒使用方法提取DNA。然后进行PCR扩增，在细菌的通用引物27F和1492R(Monis et al,2005)的扩增下，进行16SrRNA的扩增。扩增条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min 30s；72℃5min，30次循环。PCR产物送上海美吉生测序公司进行序列分析。将测得乳酸菌菌株16S rRNA基因序列用BLAST(http：//wwwncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜索，与待测菌株同源性值大于98％，则可认为他们属于同一个种。可鉴定的乳酸菌共403株，全部用于高产胞外多糖乳酸菌的筛选。

实施例2：高产胞外多糖乳酸菌的筛选

(1)胞外多糖的分离

将分离得到的乳酸菌接种到经灭菌的MRS培养基中，37℃培养活化2-3次。将活化后的菌液调整菌数到2×10⁸，再按2％的接种量分别接种杆菌和球菌到2mL MRS和M17(含5％的乳糖)的培养基中。37℃发酵培养24h，10000g(4℃)离心10min，取上清。加入3倍 体积95％冷乙醇于上清液中，4℃过夜沉淀，于12000g(4℃)，离心6min，收集沉淀。再加入2mL热的超纯水溶解，并装入8000-14000透析袋中放置4℃冰箱中透析24h，每天换3次水(每8h一次)，定容测定糖含量(郭兴华,2008；Nuria et al.,2009)。

(2)糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定糖含量。准确称取标准葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水定容。各种试剂按照表1所示的量加入试管中后，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm波长下检测吸光度。2mL蒸馏水按同样处理后作为空白对照。以OD值和多糖含量做标准曲线(郭兴华,2008)。

表1 葡萄糖标准曲线制作

将以上从乳酸菌发酵液中分离得到的糖溶液按照标准曲线的测定程序，检测490nm处的吸光值。根据标准曲线计算EPS的量，并筛选出高产EPS的乳酸菌菌株。

表2为试验中筛选出的本发明菌株EPS产量，在没有优化条件下，EPS产量为304.86mg/L。

表2 本发明乳酸菌EPS产量

实施例3：体外益生特性研究

一、发明菌株酶活测定(API-ZYM)

采用法国梅里埃公司API-zym试剂进行检测，该技术为一个半定量的微量方法***，专为研究酶活所设计的。菌液采用无菌MRS培养液传代培养3次，离心收集菌体，用无菌生理盐水准备1×10⁷CFU/mL的菌悬液进行试验。

表3表明，乳酸菌H52具有较强的肽酶活性，能有效水解氨基酸为挥发性分子，对发酵产品的风味产生承担着非常重要的作用。而H52强的糖苷酶活性可有效利用糖源，决定着乳酸菌发酵能量的提供，半乳糖苷酶活性越高，可有效缓解人体肠道乳糖不耐症。

表3 发明乳酸菌H52的酶活

注：“1”相当于释放5微毫克分子浓度(5nM)；“2”相当于10nM；“3”为20nM；“4”为30nM；“5”为40nM或更高。

二、发明菌株抑菌试验

采用琼脂扩散法(Papamaloni et al.,2003)进行抑菌试验。

乳酸菌发酵上清液准备：将乳酸菌过夜活化两次，调整菌数到1×10⁸CFU/mL，2％接种到3个不同的10mL MRS液体培养基中，分别编号1、2、3，37℃，培养24h。将乳酸菌发酵液9500g离心10min，取上清。(Aslim et al.,2005)。

将20mL营养培养基或脑心浸液培养基(含0.75％琼脂)灭菌后冷却到45℃，分别接入已过夜培养的不同致病菌，使其终浓度为1×10⁶CFU/mL，混匀，倾倒到无菌培养皿中。冷却凝固后，用无菌打孔器在平板上打8mm的孔，孔内分别加入100μL不同乳酸菌1、2、3号发酵液，4℃扩散5h后放置37℃培养24h。最后量取抑菌圈直径，扣除8mm孔径的大小。

表4表明该发明菌株H52的24h发酵液对金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、大肠杆菌和鼠伤寒志贺氏菌都表现较强的抑制能力，具有较为广泛的抑菌能力。

表4 发明菌株H52的抑菌能力

注:“–”,≤0mm；“±”,0–4mm；“+”,4–8mm；“++”,8–12mm；“+++”,>12mm.

三、发明菌株消化道模拟试验及疏水能力测定

(1)疏水能力

根据Collado等(2008)的方法进行试验，菌体在实验前按1％(v/v)的接种量接种于无菌MRS培养基37℃传代培养3次。离心收集菌体，PBS洗两次，重悬于PBS缓冲液中，调整菌数1×10⁸CFU/mL。将菌悬液放置于室温下，在不同时间(0,2,4,6,8,10,20h)检测600nm下的吸光度。

疏水能力(％)＝(A₀-A_t)/A₀×100

A₀代表0h下的吸光度，A_t代表不同时间(0,2,4,6,8,10,20h)下的吸光度。

(2)模拟胃肠道存活率

采用Carteris等(1998)的方法。具体步骤如下：

模拟胃液的配制：0.35g胃蛋白酶溶于100mL 0.2％的无菌生理盐水，用浓盐酸调节pH到3.0，过0.45μm滤膜除菌。

模拟肠液的配制：0.1g胰蛋白酶，1.8g胆盐溶于无菌溶剂含1.1g NaHCO₃、0.2g NaCl及100mL蒸馏水，用0.5M的NaOH调整pH到8.0。溶液过0.45μm滤膜除菌。

将已活化3次的菌液按10％的接种量接种到模拟胃液(pH3)中，混匀，37℃厌氧培养，分别在0,3h取样平板计数。在模拟胃液中培养3h后，吸取1mL培养液接种到9mL模拟肠液(pH 8)中，37℃厌氧培养，分别在0,3,6,11,24h取样计数。

计数用MRS培养平板，生理盐水梯度稀释，取样涂布，37℃厌氧培养48h，计数30～300菌数的平皿。

存活率(％)＝(log CFU N₁/log CFU N₀)×100％

N₁代表经过模拟胃肠道培养后的乳酸菌数量；N₀代表模拟胃肠道培养前的乳酸菌数量。

(3)耐胆盐能力

无菌MRS-THIO培养基(含0.2％巯基乙酸钠)中添加0.3％(W/V)的牛胆汁，然后接种1％的乳酸菌(已活化三次)，对照组为不含牛胆汁的MRS-THIO培养液。水浴37℃培养，每两小时取样620nm下测定吸光度，用不含乳酸菌的相对应的空白培养基调零。记录OD_620nm 变化0.3个单位的时间。推迟时间(LT)的计算为乳酸菌生长到OD_620nm变化0.3个单位时所推迟的时间。LT越小耐胆盐能力越强(Walker和Gilliland，1993)。

表5表明本发明菌株具有消化道耐受能力以及疏水能力，能够在消化道环境中保持较高的存活率，且疏水性增加了黏附到肠道壁的机会，满足作为益生菌的基本条件。

表5 发明菌株H52模拟消化道耐受能力及疏水能力

¹乳酸菌在pH3人工胃液中存活3h后，再在模拟肠液中消化24h后的存活率。

²在吸光度OD_620nm时，MRS-THIO与MRS-THIO(含0.3％胆盐)两种培养基中菌株生长增加0.3个单位所需要的时间差。

实施例4：动物试验

(1)小鼠喂养

18只雄性BALB小鼠，体重25g左右，自由采食和饮水，经7天的预试期后，空腹12h，不限制饮水，称重。根据体重随机分为2组，每组9只，每个处理组饲喂基础日粮。小鼠分组处理及剂量见表6，每日灌胃一次，试验期2周。小鼠自然光照，自由采食和饮水。

表6 实验动物分组及处理

最后一天灌胃后，停止进食8h，不限制饮水。称重，摘眼球取血，室温放置，离心(4000g，10min)分离血清，-80℃保存备用。采血后劲椎脱臼处死，放置于冰上，分离肝、心、肾、脾、胸腺。用预冷的生理盐水冲洗表面血迹，医用纱布拭干，分别称重。按下式计算脏器比重：

(2)细胞因子IL-12，IL-10和IFN-γ的测定

血清样品室温融化，按照IL-12，IL-10和IFN-γELISA试剂盒的操作手册进行(购自上海研吉生物科技有限公司)。

(3)分泌型免疫球蛋白sIgA的测定

血清样品室温融化，按照sIgA放射免疫试剂盒的操作手册进行。

见表7试验结果表明，发明菌株对脏器无毒副作用。且图1表明，发明菌株能诱导血清中免疫因子IL-10、IL-12和IFN-γ的增加，具有体内免疫诱导和调节作用。

表7 发明菌株对小鼠脏器的影响

本发明提供的菌株乳明串珠菌H52试验证明其具有较高的产胞外多糖能力。该菌株满足作为益生菌的基本条件，具有较强的抑制常见致病菌生长的能力，对维持肠道正常微生物菌群平衡具有一定的作用，能保持较高存活率通过消化道环境。该菌株较好的疏水能力增加了其黏附到肠道壁并发挥益生作用的机会。该产品无毒副作用，可作为保健食品或药品提高机体免疫力、调节肠道菌群等作用。该发明菌株用于乳制品发酵中可提高发酵产品的品质。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种具有高产胞外多糖的乳明串珠菌，保藏编号为CGMCC No.11248。

2.一种权利要求1所述的乳明串珠菌的筛选鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离乳酸菌菌株，并纯化，得到纯分离的菌株。

(2)通过过氧化氢酶实验、革兰氏染色、菌体形态和16SrRNA序列分析，鉴定步骤(1)筛选出的乳酸菌菌株，包括本发明菌株H52乳明串珠菌。

(3)通过苯酚-硫酸法测定本发明菌株24h发酵液中糖含量，筛选出具有高产胞外多糖能力的本发明菌株。

3.一种权利要求1所述的乳明串珠菌的益生特性评定方法，其特征在于，包括以下内容：

(1)通过抑菌试验验证本发明菌株具有较强的抑菌能力。

(2)通过体内、体外试验验证本发明菌株具有基本益生菌特性及免疫调节作用。

4.权利要求1所述的具有高产胞外多糖的乳明串珠菌在制备发酵乳制品中的应用。

5.权利要求1所述的具有高产胞外多糖的乳明串珠菌在制备保健食品和药品中的应用。