CN107124882A - 用于认知改善的新型化合物 - Google Patents

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CN107124882A CN201580046430.XA CN201580046430A CN107124882A CN 107124882 A CN107124882 A CN 107124882A CN 201580046430 A CN201580046430 A CN 201580046430A CN 107124882 A CN107124882 A CN 107124882A
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M·O·拉巴尔·格雷西亚
J·A·桑切斯·阿里亚斯
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Abstract

本发明涉及用于认知改善的新型化合物。本发明涉及某些具有多环结构和‑(C＝O)NRaRb单元的化合物，其中所述多环结构包括至少三个环系，其中一个环系是包含2至4个环的多环环系；至少一个环是芳环；并且其中所述结构包括至少3个氮原子和1个氧原子。本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物，以及其在医药中的用途，特别是在治疗和/或预防伴有认知缺陷或损伤的神经障碍或神经退行性疾病中的用途。

Description

用于认知改善的新型化合物
本发明涉及作为PDE和HDAC的双重抑制剂的化合物以及其制备方法。本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物，以及其在医药中的用途，特别是在治疗和/或预防伴有认知缺陷或损伤的神经障碍或神经退行性疾病中的用途。
背景技术
轻度认知损伤的特征在于不干扰个人日常生活的记忆、语言和/或其他基本认知功能的缺陷。该病况经常向痴呆演变，其特征在于认知能力的整体恶化到干扰日常生活的程度。阿尔茨海默氏病(AD)是老年人中最常见的痴呆形式，指的是不具有先兆原因(如中风、脑外伤或酒精)的痴呆；其特征在于在脑中存在细胞外淀粉样斑块和细胞内神经原纤维缠结，这引起神经元功能障碍和细胞死亡。与人口老龄化相关的AD患者数量的增加使得新的疾病管理/治疗策略的发展变得至关重要。
寻找有效的AD管理主要基于淀粉样蛋白(Aβ)假说，其主要集中在减少老年斑的数量，不过到目前为止鲜有成功。现今的重点放在疾病的其他标志，例如细胞骨架蛋白tau的过磷酸化，这是神经原纤维缠结的主要成分。
基因转录和蛋白质合成在新记忆的形成中起重要作用。使用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂增加组蛋白(H3和/或H4)乙酰化诱导染色质重构，其与基因转录激活相关。HDAC蛋白分为四类：I类(HDAC 1至3，HDAC8)，IIa类(HDAC 4、5、7和9)，IIb类(HDAC 6和10)和IV类(HDAC 11)。各HDAC在中枢神经***(CNS)中的表达模式及其在记忆功能中的作用在各亚型中不同。
4-丁酸苯酯(PBA)(HDAC抑制剂)是AD的Tg2576转基因小鼠模型中有效的认知增强剂，其过表达突变形式的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)。此外，PBA在这个动物模型中扭转疾病的病理标志并恢复树突棘损失。考虑到PBA抑制HDAC I类和IIb类，所有这些数据强烈地表明HDAC抑制剂在AD中的治疗益处的潜力。I类HDAC抑制剂通过增加组蛋白乙酰化水平而增强记忆功能，这有利于脑中的基因转录。
此外，衰老与磷酸二酯酶(PDE)表达和活性的增加相关。因此，磷酸二酯酶(PDE)一般是认知缺陷中的非淀粉样蛋白靶标的良好候选物，特别是在AD中。咯利普兰(其是一种特异性PDE4抑制剂)是第一例证明可用于恢复AD动物模型中认知缺陷的药物。
特异性磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(例如PDE5抑制剂：西地那非或他达拉非；和PDE9抑制剂：PF-4447943(6-[(3S,4S)-4-甲基-1-(嘧啶-2-基甲基)吡啶-3-基]-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4(5H)-酮))已显示出改善记忆性能或/和增强AD的不同动物模型中的突触可塑性和认知功能。PDE抑制剂通过升高cAMP和/或cGMP的水平来调节信号通路，其可以通过直接和/或间接激活cAMP反应元件结合(CREB)而最终促进基因转录。CREB依赖性基因表达构成长期记忆形成和持续长期增强(LTP)，这是突触可塑性和强度的指标。在海马体中，这可能通过形成新的突触连接而发生，其是恢复认知缺陷需要的。因此，通过激活CREB信号传导途径，PDE抑制剂可以改善AD症状。此外，其他CREB独立机制似乎有协同作用，以便通过增加cAMP和/或cGMP水平而恢复AD中的认知损伤。认知性能也可以通过PDE抑制剂介导的脑血流量和/或脑葡萄糖消耗的增加而间接地改善。
除了淀粉样蛋白积存，Tau磷酸化是AD进展的另一种组织病理学标记。重要的是，已经显示出PDE5抑制剂西地那非和他达拉非在AD的不同动物模型中减少Tau磷酸化(pTau水平)。
因此，仍然需要开发在伴有认知缺陷或损伤的神经障碍或神经退行性疾病的治疗和/或预防中显示出改善活性的化合物。
发明内容
发明人已经发现了具有多环结构和-(C＝O)NRaRb单元(moiety)的新化合物，其能够抑制一种或多种磷酸二酯酶(PDE)并同时抑制一种或多种组蛋白脱乙酰酶(HDAC)。因此，这些化合物是PDE和HDAC的双重抑制剂，并且可用于改善认知。本发明的化合物具有针对动物模型中已证明可用于预防神经退行性疾病的进展和/或增加与神经退行性疾病相关的认知缺陷的那些途径中的两种不同途径的优点。考虑到在临床阶段对AD的治疗的主要缺点在于当靶向单个病理生理事件时缺乏功效，本发明的对两种病理生理事件具有影响的化合物可以产生更有效的治疗。
因此，本发明的第一方面涉及式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，或者所述式(I)的化合物或任何其药学上可接受的盐的任何立体异构体或其混合物：
其中，
单元-NRaRb选自由式(M1)、式(M2)、式(M3)和式(M4)组成的组，其中虚线意味着Ra和Rb可选地形成已知环系：
B1是选自由式(A”)、式(B”)、式(C”)和式(D”)组成的组的基团：
Rc是氢；
Rd和Re独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基、以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和的或部分不饱和的已知3至8元碳环单环；
A是选自苯基和5至6元杂芳环的已知环系，其中取代基-NRc-和-NRdRe附接至相邻碳原子；
R'和R”独立地选自由H、Rf、可选地取代有一个或多个取代基Rf的苯基、可选地取代有一个或多个取代基Rf的5至6元杂芳环、以及可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基组成的组；
各Rf独立地选自卤素、-NO2、-CN、-ORg、-OC(O)Rg、-OC(O)ORg、-OC(O)NRgRg、-NRgRg、-NRgC(O)Rg、-NRgC(O)ORg、-NRgC(O)NRgRg、-NRgS(O)2Rg、-NRgSO2NRgRg、-SRg、-S(O)Rg、-SO2Rg、-SO2(ORg)、-SO2NRgRg、-C(O)Rg、-C(O)ORg、-C(O)NRgRg和-C(O)NRgORg；
各Rg独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基、以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和的或部分不饱和的已知3至7元碳环单环；
p、n和r独立地为0或1；
R1和R2独立地选自由以下基团组成的组：H；可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C7)烷基；和3至7元碳环或杂环单环，其是饱和或部分不饱和的或者芳香族的，并且其可选地取代有选自卤素和(C1-C3)烷基的一个或多个取代基；
Z1是选自由式(E)、式(F”)、式(G')、式(H')、式(J')和式(K)组成的组的二价基：
Z2选自由以下基团组成的组：-Z5-；-Z5-Cy4-；-Z5-Cy4-Z5-；和-Cy4-；
Z3和各Z5独立地为可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C6)烷基的二价基；
Z4是可选地取代有一个或多个取代基的饱和或不饱和的(C1-C6)烷基的二价基，所述取代基选自卤素、OH和可选地取代有一个或多个卤原子的-O(C1-C3)烷基；或者作为备选，Z4是–CR11R12-，其中R11和R12与它们附接的碳一起形成C═O或3至7元碳环或杂环单环，其是饱和或部分不饱和的，并且其可选地取代有以下基团：一个或多个卤原子或者可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C3)烷基；
q和m独立地为0或1；
Cy1是3至7元饱和或部分不饱和的杂环单环，其与3至7元饱和或部分不饱和的碳环或杂环单环稠合、桥接稠合或螺稠合，其中Cy1可选地取代有一个或多个R3基团；
Cy2是带有N的3至7元饱和或部分不饱和的杂环单环，其可选地与3至7元饱和或部分不饱和的碳环或杂环单环稠合、桥接稠合或螺稠合，其中Cy2可选地取代有一个或多个R3基团；
Cy3和Cy4独立地为苯基或3至7元碳环或杂环单环，其是饱和或部分不饱和的或芳香族的，并且其可选地取代有一个或多个R3基团；
R3选自：卤素；可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C7)烷基；可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的-O(C1-C7)烷基；以及3至7元碳环或杂环单环，其是饱和或部分不饱和的或芳香族的，并且其可选地取代有一个或多个取代基，所述取代基选自由卤素和可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C6)烷基组成的组；
R4和R10独立地为H或可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C6)烷基；并且
其中，在任一杂环中，一个或多个环成员选自NH、N、O和S；
其中，在所有饱和或部分不饱和的环中，所述环的一个或两个成员可选地为C(＝O)和/或C(＝NH)和/或C[＝N(C1-C4)烷基]，
其中，饱和烷基是指仅含有单键的直链或支化烃链；不饱和烷基是指含有一个或两个双键和/或一个或两个三键的直链或支化烃链；
其中，在任一烷基中，选自CH2或CH的一个或两个链成员可选地被独立地选自N、NR4、O、C(＝O)、C(＝O)NR4、NR4C(＝O)和S的链成员替代；并且
条件是：
式(A”)、式(B”)和式(C”)中的单元(L1)和式(D”)的单元(L2)
具有1至20个原子的链长度；并且
当所述式(I)的化合物中B1是式(C”)的基团并且所述单元-NRaRb具有式(M1)时，则式(C”)中的单元(L1)不是-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-，其中S原子附接至吡唑并嘧啶酮单元并且-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-的烃部分附接至-C(＝O)NRaRb单元；
当所述式(I)的化合物中B1是式(C”)的基团并且所述单元-NRaRb具有式(M4)时，则(M4)中的吡啶基团不是3-甲基吡啶-2-基氨基-、4-甲基吡啶-2-基氨基-、5-甲基吡啶-2-基氨基-、6-甲基吡啶-2-基氨基-、5-氯吡啶-2-基氨基-或5-溴吡啶-2-基氨基-；并且
当所述式(I)的化合物中B1是式(C”)的基团并且所述单元-NRaRb具有式(M4)时，则R1不是苯基或具有取代基的苯基。
式(I)的化合物的定义中所涵盖的以下列表的化合物(其中B1是式(C”)的基团且单元-NRaRb具有式(M1))被援引在Scifinder数据库中，但没有任何相关的书目参考文献：
2-[(4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-N-[(甲基氨基)羰基]-丙酰胺(CAS-RN：1031193-67-5)；N-(乙基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1324932-36-6)；2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]-N-(丙基氨基甲酰基)乙酰胺(CAS-RN：1327261-99-3)；2-[(4,5-二氢-4-氧代-1-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-N-[[(1-乙基乙基)氨基]乙酰胺(CAS-RN：923917-56-0)；2-[(4,5-二氢-4-氧代-1-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-N-[(甲基氨基)羰基]-丙酰胺(CAS-RN：924088-81-3)；2-[(4,5-二氢-4-氧代-1-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-N-[(乙基氨基)羰基]-丙酰胺(CAS-RN：924019-71-6)；2-[(4,5-二氢-4-氧代-1-苯基-1H吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-N-[(2-丙烯-1-基氨基)羰基]-乙酰胺(CAS-RN：924124-19-6)；2-[(4,5-二氢-4-氧代-1-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-N-[[(2-甲基丙基)氨基]羰基]-乙酰胺(CAS-RN：923913-11-5)；N-(丁基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1297095-41-0)；N-(叔丁基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1323968-79-1)；N-(异戊基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1323753-25-8)；2-[(4,5-二氢-4-氧代-1-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-N-[[(1,1-二甲基乙基)氨基]羰基]-丙酰胺(CAS-RN：1036673-46-7)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[(乙基氨基)羰基]-乙酰胺(CAS-RN：1015980-86-5)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[[(1-甲基乙基)氨基]羰基]-乙酰胺(CAS-RN：1015637-99-6)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[(甲基氨基)羰基]-丙酰胺(CAS-RN：1015638-71-7)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[(丙基氨基)羰基]-乙酰胺(CAS-RN：1015980-98-9)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[(乙基氨基)羰基]-丙酰胺(CAS-RN：1016059-67-8)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[[(2-甲基丙基)氨基]羰基]-乙酰胺(CAS-RN：1016059-70-3)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[[(1-甲基乙基)氨基]羰基]-丙酰胺(CAS-RN：1017177-19-3)；2-[[1-(3-氯苯基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫代]-N-[[(3-甲基丁基)氨基]羰基]-乙酰胺(CAS-RN：1015375-73-1)；N-(甲基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1327380-12-0)；N-(环己基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]丙酰胺(CAS-RN：1090694-76-0)；N-(环己基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1090673-85-0)；N-(环戊基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]丙酰胺(CAS-RN：1089529-44-1)；2-[[1-(3-氯苯基)-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫烷基]-N-(环己基氨基甲酰基)-乙酰胺(CAS-RN：1016059-46-3)；2-[[1-(3-氯苯基)-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫烷基]-N-(环戊基氨基甲酰基)乙酰胺(CAS-RN：1015638-39-7)；2-[[1-(3-氯苯基)-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]硫烷基]-N-(2-甲氧基乙基氨基甲酰基)乙酰胺(CAS-RN：1015376-05-2)；N-(2-甲氧基乙基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：930908-62-6)；N-(环戊基氨基甲酰基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：878940-69-3)。
式(I)的化合物的定义中所涵盖的以下列表的化合物(其中B1是式(C”)的基团且单元-NRaRb具有式(M4))被援引在Scifinder数据库中，但没有任何相关的书目参考文献：
3-[(4,5-二氢-1-甲基-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基]-N-(5-甲基-2-吡啶基)-丙酰胺(CAS-RN：1376242-38-4)；1-(1-甲基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-N-(6-甲基-2-吡啶基)哌啶-4-甲酰胺(CAS-RN：1301341-34-3)；N-(5-氯-2-吡啶基)-1-(4,5-二氢-1-甲基-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-4-哌啶甲酰胺(CAS-RN：1296538-47-0)；N-(5-溴-2-吡啶基)-1-(4,5-二氢-1-甲基-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-3-哌啶甲酰胺(CAS-RN：1293797-49-5)；N-(5-溴-2-吡啶基)-1-[1-(1,1-二甲基乙基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-哌啶甲酰胺(CAS-RN：1289341-51-0)；1-(1-甲基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-N-(3-甲基-2-吡啶基)哌啶-3-甲酰胺(CAS-RN：1288667-45-7)；1-[1-(1,1-二甲基乙基)-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]-N-(4-甲基-2-吡啶基)-4-哌啶甲酰胺(CAS-RN：1287617-32-6)；N-[3-氯-5-(三氟甲基)-2-吡啶基]-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1287091-89-7)；N-(3,5-二氯-4-甲基-2-吡啶基)-2-[(4-氧代-1-苯基-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫烷基]乙酰胺(CAS-RN：1276295-92-1)；N-(5-氯-2-吡啶基)-2-[(4,5-二氢-4-氧代-1-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)硫代]-丙酰胺(CAS-RN：1038095-75-8)；和4,5-二氢-N-(4-甲基-2-吡啶基)-4-氧代-1-苯基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-丙酰胺(CAS-RN：1016098-55-7)。
式(I)的化合物的定义中所涵盖的以下列表的化合物(其中B1是式(C”)的基团且单元-NRaRb具有式(M4))在WO2000/021926中援引作为细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，其可用于治疗癌症或其它增殖性疾病：
N-[4-[[4,5-二氢-3-(1-甲基环丙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100540-39-3)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(1-甲基环丙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100540-25-7)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(1-甲基环丙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100539-29-4)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(2-甲基丙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100535-70-3)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(2-甲基丙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100535-37-2)；N-[4-[[3-环丁基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100535-24-7)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(2-甲基丙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100534-67-5)；N-[4-[[3-环丁基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100534-24-4)；N-[4-[[3-环丁基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100533-35-4)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(1-甲基乙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100531-94-9)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-3-乙基-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100530-61-7)；N-[3-[[4,5-二氢-3-(1-甲基乙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100529-91-6)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-3-乙基-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100529-64-3)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-3-乙基-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100529-43-8)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(1-甲基乙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-3-甲基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100528-57-1)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-3-环丙基-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100526-20-2)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-3-环丙基-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100526-04-2)；N-[4-[[3-乙基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100525-23-2)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-3-环丙基-4,5-二氢-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100524-59-1)；N-[4-[[3-乙基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100523-76-9)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-4,5-二氢-3-(1-甲基乙基)-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100521-60-5)；N-[4-[[3-环丙基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100520-80-6)；N-[4-[[3-环丙基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100520-48-6)；N-[4-[[3-环丙基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100520-25-9)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-4,5-二氢-3-(1-甲基乙基)-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-甲氧基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100520-10-2)；N-[4-[[1-(2-氯-6-甲基苯基)-4,5-二氢-3-(1-甲基乙基)-4-氧代-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]-2-羟基苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：1100519-85-4)；N-[4-[[3-乙基-4,5-二氢-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：264140-35-4)；N-[4-[[4,5-二氢-3-(1-甲基乙基)-4-氧代-1-(2,4,6-三氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基]甲基]苯基]-N'-2-吡啶基脲(CAS-RN：264140-08-1)。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上定义的式(I)的化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
如前所述，本发明的化合物是PDE和HDAC的双重抑制剂，并且可用于改善认知。因此，本发明的另一方面涉及式(I)的化合物或包含如上定义的式(I)的化合物的药物组合物，其用作药物。
本发明的另一方面涉及式(I)的化合物或包含如上定义的式(I)的化合物的药物组合物，其用于治疗和/或预防由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病。因此，该方面涉及如上定义的式(I)的化合物在制备用于治疗和/或预防由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病的药物中的用途；并且还可以阐述为用于治疗和/或预防由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病的方法，该方法包括对有需要的受试对象(包括人)施用治疗有效量的先前定义的式(I)的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
具体实施方式
除非另有说明，否则本申请中使用的所有术语应以其在本领域内已知的普通含义来理解。对于本申请中使用的某些术语的其它更具体的定义如下所述，并且意图一致地适用于整个说明书和权利要求书，除非另有明确阐述的定义提供更宽的限定。
术语“碳环”环系是指其中所有的环成员都含有碳原子的已知环系。术语“杂环”环系是指其中一个或多个环成员(优选1、2、3或4个环成员)选自NH、N、O和S的化学上可能的已知环系。杂环的其余环成员独立地选自C、CH、CH2、O、N、NH和S。除非另有说明，否则“杂环”环系可以通过环系的C或N原子而附接至分子的其余部分。碳环和杂环都可以是饱和的或部分不饱和的，并且可以如本文所述不具有取代基或具有取代基，所述取代基位于任何可用位置上。
根据本发明，术语“多环”是指由两个、三个或四个环形成的环系，其可以是稠合的、桥接稠合的、螺稠合的或可以包含不同类型的稠合。出于本发明的目的，在“稠合”环中，稠合通过两个相邻环共有的一个键进行；在“桥接稠合”环中，稠合通过两个环共有的一系列原子(桥端)进行；而在“螺稠合”环中，稠合通过仅两个相邻环(包括桥环)共有的一个原子(螺原子)、优选为碳原子进行。
术语“杂芳”环是指其中一个或多个环成员(优选1、2、3或4个环成员)选自NH、N、O和S的化学上可能的已知芳族环系。杂芳环的其余环成员独立地选自C、CH、O、N、NH和S。杂芳环可以如本文所述不具有取代基或具有取代基，所述取代基位于任何可用位置上。
本文所用的术语“已知环系”是指化学上可行的且本领域已知的环系，因此意图排除化学上不可能的那些环系。
出于本发明的目的，在所有饱和或部分不饱和的环中，所述环的一个或两个成员可选地为C(＝O)和/或C(＝NH)和/或C[＝N(C1-C4)烷基]。
术语直链或支化、饱和或不饱和的(C1-Cn)烷基是指含有1至n个碳原子的直链或支化烃链。当(C1-Cn)烷基是饱和的时，其仅含有单键。当(C1-Cn)烷基是不饱和的时，其含有一个或两个双键和/或一个或两个三键。饱和或不饱和的(C1-Cn)烷基可以如本文所述具有取代基或不具有取代基。此外，在任何烷基中，选自CH2或CH的一个或两个链成员可选地被独立地选自N、NR、O、C(＝O)、C(＝O)NR、NRC和S的链成员替代；其中R如本文所述。当在本发明中没有指定术语(C1-Cn)烷基是饱和的还是不饱和的时，术语(C1-Cn)烷基必须理解为含有1至n个碳原子的饱和直链或支化烃链。上述定义也适用于O(C1-Cn)烷基。
卤素取代基是指氟、氯、溴或碘。
在本发明的涉及式(I)的化合物的实施方式(其中未指定某个基团是否经取代，例如指示该基团的某种取代或指示该基团是未取代的)中，应当理解，该基团可能取代是如式(I)的定义中的那种取代。
“保护基”(PG)是指当附接至分子中的反应性基团时掩蔽、减少或阻止该反应性的原子团。
表述“取代有一个或多个”是指基团可以取代有一个或多个(优选1、2、3或4个)取代基，条件是该基团具有足够易于被取代的位置。
出于本发明的目的，室温为20℃至25℃。
如上所述，本发明的第一方面涉及式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。对可以使用的盐的类型没有限制，条件是当这些盐用于治疗目的时它们是药学上可接受的。术语“药学上可接受的盐”包括通常用于形成碱金属盐和形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。
式(I)的化合物的药学上可接受的盐的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，它们可以通过常规化学方法由含有碱或酸单元的母体化合物制备。一般而言，这样的盐例如通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的合适的药学上可接受的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在它们的混合物中反应来制备。式(I)的化合物及其盐可以在一些物理性质方面可能不同，但它们是等同的。
本发明的化合物可以是游离溶剂化化合物或作为溶剂化物(例如水合物)的结晶形式，并且意图是这两种形式都在本发明的范围内。溶剂化的方法通常是本领域已知的。一般而言，具有例如水和乙醇等药学可接受溶剂的溶剂化形式对于本发明的目的而言等同于非溶剂化形式。
本发明通式的一些化合物可具有能产生各种立体异构体的手性中心。如本文所用，术语“立体异构体”是指个体化合物的所有异构体，其区别仅在于其原子在空间中的取向。术语立体异构体包括镜像异构体(对映体)；镜像异构体的混合物(外消旋体，外消旋混合物)；几何(顺/反(cis/trans)或顺式/反式(syn/anti)或E/Z)异构体；以及具有多于一个手性中心的化合物的异构体，其彼此不是镜像(非对映异构体)。本发明涉及这些立体异构体中的每一种及其混合物。
可通过诸如色谱法或分级结晶法等常规方法分离非对映异构体和对映异构体。光学异构体可以通过常规的光学离析技术拆分，从而得到光学纯异构体。这种拆分可对本发明的任何手性合成中间体或化合物进行。光学纯异构体也可以利用对映体特异性合成而单独获得。
B1单元(A”)、(B”)和(C”)中的双环可如下所示作为不同的互变异构体存在，其被认为对于本发明的目的而言是等同的：
在涉及式(I)的化合物的本发明的所有实施方式中，其药学上可接受的盐以及任何式(I)的化合物或其任何药学上可接受的盐的立体异构体都是预期的，即使它们没有被特别提及。
本发明的式(I)的化合物的特征在于它们具有选自由式(A’)、式(B’)、式(C’)和式(D')组成的组的多环环系和–(C＝O)NRaRb单元：
该多环环系包含2至4个环；至少一个环为芳环；并且包含至少3个氮原子和1个氧原子。上面定义的多环环系与–(C＝O)NRaRb单元之间的连接子，即式(L1)或(L2)的结构
具有包含1至20个原子的链长，并且包含烃链，其中一个或多个碳原子可选地被氮、硫和/或氧原子替代，其可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。
在具体实施方式中，多环环系与–(C＝O)NRaRb单元之间的连接子为式(L1')或(L2')的结构：
其具有包含3至20个原子的链长。出于本发明的目的，如果存在多于一种计算链长的可能性，则链长对应于最高的原子数。作为实例，在下面的化合物1-05中，连接子具有9个原子的链长：
在一个具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，单元-NRaRb具有式(M3)：
其中，Rc、Rd、Re、A、R'和R”如上定义。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，单元-NRaRb选自式(M3’)和式(M3”)，更具体而言，单元-NRaRb具有式(M3’)：
其中，Rc、Rd、Re、R'和R'如上定义。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，在式(M3)、式(M3’)或式(M3”)的单元中，Rc、Rd、Re和R'为H，而R”选自由H、卤素和5或6元杂芳环组成的组。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，在式(M3)、式(M3’)或式(M3”)的单元中，Rd和Re为H。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，单元-NRaRb具有式(M4)：
其中，Rc、R'和R”如上定义，条件是：当B1是式(C”)的基团时，则：(M4)中的吡啶基团不是3-甲基吡啶-2-基氨基-、4-甲基吡啶-2-基氨基-、5-甲基吡啶-2-基氨基-、6-甲基吡啶-2-基氨基-、5-氯吡啶-2-基氨基-或5-溴吡啶-2-基氨基-；并且R1不是苯基或具有取代基的苯基。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，在式(M4)的单元中，R'和R”为H；条件是：当B1是式(C”)的基团时，则：R1不是苯基或具有取代基的苯基。
在一个具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，单元-NRaRb具有式(M1)：
其中，Rc、Rd和Re如上定义，条件是：当式(I)的化合物中B1是式(C”)的基团时，则式(C”)中的单元(L1)不是-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-，其中S原子附接至吡唑并嘧啶酮单元并且-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-的烃部分附接至-C(＝O)NRaRb单元。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，在式(M1)的单元中，Rc为氢；并且Rd和Re独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基；更具体而言，Rc和Rd为氢；并且Re独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基；条件是当式(I)的化合物中B1是式(C”)的基团时，则式(C”)中的单元(L1)不是-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-，其中S原子附接至吡唑并嘧啶酮单元并且-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-的烃部分附接至-C(＝O)NRaRb单元。
在一个具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中单元-NRaRb具有式(M2)：
其中，Rc如上定义。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，B1是式(A”)的基团。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，B1是式(B”)的基团。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，B1是式(C”)的基团。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，R1选自下组：可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基；可选地取代有一个或多个选自卤素和(C1-C3)烷基的取代基的5至6元饱和碳环；以及可选地取代有一个或多个选自卤素和(C1-C3)烷基的取代基的5至6元饱和杂环。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，R2是H或可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，Z1是选自由式(E)、式(F”)和式(H')组成的组中的二价基：
其中，Cy2、R10、Z4、m、Cy3和q如上定义，更具体而言，其中q为1。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中r为0，或者作为备选，r为1且Z2为-Cy4-；更具体而言，其中r为0。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，B1是式(D”)的基团。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中，p为1；更具体而言，其中，Cy1是苯基或3至7元的饱和或部分不饱和的或芳香族的碳环或杂环单环，并且其中Cy1可选地取代有一个或多个R3基团。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其中p为1；更具体而言，其中Cy1选自下组：苯基、5至6元杂芳环和4至6元饱和杂环，其中Cy1可选地取代有一个或多个R3基团。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其是式(IA)的化合物：
其中，R3'是H或R3，并且R1、R2、R3、Z1、Z2、r、虚线和单元NRaRb如上定义。更具体而言，在式(IA)的化合物中，单元-NRaRb选自如上定义的式(M3’)和式(M3”)，更具体而言，其具有式(M3’)。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其是式(IB)的化合物：
其中，R3'是H或R3，并且R1、R2、R3、Z1、Z2、r、虚线和单元NRaRb如上定义。更具体而言，在式(IB)的化合物中，单元-NRaRb选自如上定义的式(M3’)和式(M3”)，更具体而言，其具有式(M3’)。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，特别是式(IA)的化合物或式(IB)的化合物，其中R3'选自H、卤素、可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基；以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的-O(C1-C4)烷基。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其是式(IC)的化合物：
其中，R3'是H或R3，并且R1、R2、R3、Z1、Z2、Z3、n、r、虚线和单元NRaRb如上定义。更具体而言，在式(IC)的化合物中，单元-NRaRb选自如上定义的式(M3’)和式(M3”)，更具体而言，其具有式(M3’)。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其是式(ICIII)的化合物或式(ICIV)的化合物：
其中，R5选自下组：H、卤素和可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C4)烷基；并且R1、R2、R3'、Z1、Z2、Z3、r、虚线和单元NRaRb如上定义。更具体而言，在式(ICIII)或式(ICIV)的化合物中，单元-NRaRb选自如上定义的式(M3’)和式(M3”)，更具体而言，其具有式(M3’)。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，特别是式(IC)的化合物、式(ICIII)的化合物或式(ICIV)的化合物，其中，R3'选自H和可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，其是式(ID)的化合物：
其中，R3'是H或R3，并且Z2、Z3、n、Cy1、虚线和单元NRaRb如上定义。更具体而言，在式(ID)的化合物中，单元-NRaRb选自如上定义的式(M3’)和式(M3”)，更具体而言，其具有式(M3’)。
在另一具体实施方式中，可选地与上面或下面描述的各实施方式的一个或多个特征结合，本发明涉及式(I)的化合物，特别是式(ID)的化合物，其中，R3'选自H、卤素和可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基。
发明人已经发现，也包含数个环系和–(C＝O)NRaRb单元的式(II)的化合物也是PDE和HDAC的双重抑制剂。因此，本发明还涉及式(II)的化合物，包括其任何立体异构体或混合物，或其药学上可接受的盐，
其中
单元-NRaRb选自由式(M1)、式(M2)、式(M3)和式(M4)组成的组，其中虚线意味着Ra和Rb可选地形成已知环系：
Rc是氢；
Rd和Re独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基、以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和的或部分不饱和的已知3至8元碳环单环；
A是选自苯基和5至6元杂芳环的已知环系，其中取代基-NRc-和-NRdRe附接至相邻碳原子；
R'和R”独立地选自由H、Rf、可选地取代有一个或多个取代基Rf的苯基、可选地取代有一个或多个取代基Rf的5至6元杂芳环、以及可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基组成的组；
各Rf独立地选自卤素、-NO2、-CN、-ORg、-OC(O)Rg、-OC(O)ORg、-OC(O)NRgRg、-NRgRg、-NRgC(O)Rg、-NRgC(O)ORg、-NRgC(O)NRgRg、-NRgS(O)2Rg、-NRgSO2NRgRg、-SRg、-S(O)Rg、-SO2Rg、-SO2(ORg)、-SO2NRgRg、-C(O)Rg、-C(O)ORg、-C(O)NRgRg和-C(O)NRgORg；
各Rg独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C4)烷基、以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和的或部分不饱和的已知3至7元碳环单环；
q和s独立地为0或1；
R6和R7独立地选自由以下基团组成的组：H；可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C6)烷基；以及含有1至3个选自NH、N、O和S的环成员的3至6元碳环或杂环单环，其是饱和或部分不饱和的或者芳香族的，并且其可选地取代有一个或多个R8基团；
Z6选自由以下基团组成的组：–Z8-；-Z8-Cy6-；-Z8-Cy6-Z8-；和-Cy7-；
Z7和Z8独立地为可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C6)烷基的二价基；
Cy5和Cy6独立地为苯基或4至6元碳环或杂环单环；其是饱和或部分不饱和的或者芳香族的；并且其可选地取代有一个或多个R8基团；
R8选自卤素、可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基；以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的-O(C1-C4)烷基；
其中，在任一杂环中，一个或多个环成员选自NH、N、O和S；
其中，在所有饱和或部分不饱和的环中，所述环的一个或两个成员可选地为C(＝O)和/或C(＝NH)和/或C[＝N(C1-C4)烷基]；并且
其中，在任一烷基中，选自CH2或CH的一个或两个链成员可选地被独立地选自N、NR9、O、C(＝O)、C(＝O)NR9、NR9C(＝O)和S的链成员替代；并且R9是H或可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C6)烷基；
其中，饱和烷基是指仅含单键的直链或支化烃链；并且不饱和烷基是指含有一个或两个双键和/或一个或两个三键的直链或支化烃链；
条件是式(II)的单元(L3)
具有包含1至20个原子的链长度。
在具体实施方式中，在式(II)的化合物中，单元-NRaRb选自如上定义的式(M3’)和式(M3”)，更具体而言，其具有式(M3’)。
在具体实施方式中，在式(II)的化合物中，q是0，s是1，并且Cy5是3至6元碳环或3至6元杂环，其中Cy5可选地取代有一个或多个R8基团。在另一实施方式中，在式(II)的化合物中，q是0，s是0。
在本发明的另一实施方式中，式(I)的化合物选自选自下组：
*关于这些化合物，示出了顺式和反式异构体的随机的绝对构型。在实例中，通过明确地区分顺式和反式异构体的物理和/或光谱性质，而清楚地指出相对地涉及了哪种异构体。
在本发明的另一个实施方式中，式(I)的化合物选自选自下组：
*关于这些化合物，示出了顺式和反式异构体的随机的绝对构型。在实例中，通过明确地区分顺式和反式异构体的物理和/或光谱性质，而清楚地指出相对地涉及了哪种异构体。
在本发明的另一个实施方式中，式(I)的化合物选自选自下组：
在本发明的另一个实施方式中，式(I)的化合物选自选自下组：
一般而言，如上定义的式(I)的化合物，其中，单元-NRaRb选自由具有下式的(M1)、(M2)、(M3)和(M4)组成的组：
即，分别为式(IM1)、(IM2)、(IM3)和(IM4)的化合物，
可通过使式B1-COOR'(IV)的化合物分别与式(XXII)、(XXIII)、(XXIV)和(XXV)的适当试剂反应而获得，其中B1如上定义，且R’为H，
其中，Rc、Rd、Re、A、R'和R”如上定义。可在诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和羟基苯并***(HOBt)或五氟苯酚(PFP)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)等活化剂的存在下，在二甲基氨基吡啶(DMAP)或(苯并***-1-基氧基)三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)的存在下，优选在诸如N-甲基吗啉(NMM)或N,N'-二异丙基乙胺(DIEA)等碱的存在下，在诸如二氯甲烷、氯仿或二甲基甲酰胺等适当溶剂中于室温至溶剂沸点温度的温度下进行这些转化。
作为备选，式(IM1)、(IM2)、(IM3)和(IM4)的化合物可通过以下方式获得：使式B1-COOR'(IV)的化合物与(COCl)2在诸如二氯甲烷和二甲基甲酰胺等适当溶剂的存在下反应，其中B1如上定义并且R’为H；随后使酰氯中间体分别与式(XXII)、(XXIII)、(XXIV)或(XXV)的适当试剂在诸如三乙胺等碱的存在下于诸如二氯甲烷等适当溶剂内反应。
必要时，可通过合适的保护基适当地保护不同于反应性氨基的式(XXII)、(XXIII)、(XXIV)或(XXV)的化合物中存在的氨基，并且在与式B1-COOR'(IV)的化合物反应之后，可以将其脱保护，从而获得游离氨基。
式(IV)的化合物，其具有式(IVa)或式(IVb)：
其中，B1'、Z2～Z4、m、n、r、Cy1～Cy3如式(I)的化合物中定义且R'为羧基保护基，所述式(IV)的化合物可通过将式(VI)的化合物分别与式(VII)的化合物或式(VIII)的化合物偶联而制备，如方案1中所示：
这种转化可在诸如三乙胺等碱的存在下，在诸如乙醇等适当溶剂中，并于适当的温度下(优选加热)进行。
式(IV)的化合物，其具有式(IVc)或式(IVd)：
其中，Q选自由-SO2NH-(Z4)m-、-O-(Z4)m-和-(Z4)m-组成的组；B1'、Z2～Z4、m、n、r、Cy1～Cy3如式(I)的化合物中定义；并且R'为羧基保护基，所述式(IV)的化合物可通过将式(IX)或式(X)的化合物分别与式(XI)的化合物偶联而制备，其中X为离去基团，例如卤素或甲磺酸酯，如方案2中所示：
这种转化可在诸如碳酸钾等碱的存在下，在诸如乙腈等适当溶剂中，并于适当的温度下(优选加热)进行。
式(IV)的化合物，其具有式(IVe)：
其中，B1'、Z1～Z2、n、Cy1～Cy3如式(I)的化合物中定义且R'为羧基保护基，所述式(IV)的化合物可通过将式(XII)的化合物与式(XIII)的化合物偶联而制备，其中X为离去基团，例如卤素或甲磺酸酯，如方案3中所示：
式(IV)的化合物，其具有式(IVf)：
其中，B1'、Z1～Z2、n、Cy1～Cy3如式(I)的化合物中定义且R'如上定义，所述式(IV)的化合物可通过将式(XIV)的化合物与式(XV)的化合物偶联而制备，如方案4中所示：
这种转化可在诸如Ph3P和偶氮二羧酸二异丙酯(DIAD)的存在下，在诸如甲苯等适当溶剂中，并于适当的温度下(优选加热)进行。
式(IV)的化合物，其具有式(IVg)：
其中，B1'、Z1～Z2、n、Cy1～Cy3如式(I)的化合物中定义且R'如上定义，所述式(IV)的化合物可通过将式(XVI)的化合物与式(XVII)的化合物偶联而制备，其中X为离去基团，例如卤素或甲磺酸酯，并且R5为H或可选地具有取代基的(C1-C4)烷基，如方案5中所示：
可利用与对制备式(IVc)或(IVd)的化合物而描述的那些反应条件类似的反应条件如上限定地制备化合物(IVe)和(IVg)。
式(IV)的化合物，其具有式(IVh)：
其中，Z2～Z3、n和Cy1如式(I)的化合物中定义且R'如上定义，并且B1”是式(D')的基团：
所述式(IV)的化合物可通过将式(XVIII)的化合物与式(XIX)的化合物偶联而制备，其中X为离去基团，例如卤素或甲磺酸酯，如方案6中所示：
这种转化可在诸如CuI、K3PO4和(±)-1,2-反式二氨基环己烷的存在下，在诸如二噁烷等适当溶剂中，并于适当的温度(优选室温)下进行。
作为备选，式(IVh)的化合物可通过将式(XX)的化合物与式(XXI)的化合物偶联而制备，如方案7中所示：
这种转化可在诸如甲醇等适当溶剂中于适当的温度下(优选加热)进行。
式(II)的化合物可以通过与上述式(I)的化合物类似的方式制备。式(V)至(XXI)的化合物可商购或可通过如下文实施例中所示的常规合成方法获得。
本发明还涉及药物组合物，其包含治疗有效量的如上所定义的式(I)的化合物或式(II)的化合物以及药学上可接受的赋形剂或载体。
本文所用的表述“治疗有效量”是指当施用时足以预防所治疗疾病的一种或多种症状的发展或在一定程度上缓解所述疾病的一种或多种症状的化合物的量。获得治疗益处的本发明化合物的具体剂量可根据个体患者的具体情况而变化，包括患者的体型、体重、年龄和性别，疾病的性质和阶段，疾病的侵袭性和施用途径等。例如，可以使用约0.01mg/kg至约300mg/kg的剂量。
表述“药学上可接受的赋形剂或载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载物。各组分在与药物组合物的其它成分相容的意义上必须是药学上可接受的。它还必须适合用于与人和动物的组织或器官接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或与合理的利益/风险比相称的其它问题或并发症。
药物制剂的选择将取决于活性化合物的性质及其施用途径。可以使用任何施用途径，例如口服、肠胃外和局部施用。
例如，药物组合物可以配制用于口服施用，并且可以含有一种或多种生理上相容的固体或液体形式的载体或赋形剂。这些制剂可以含有常规成分，例如粘合剂、填料、润滑剂和可接受的润湿剂。
药物组合物可以与常规可注射液体载体(例如水或合适的醇)组合而配制用于胃肠外施用。这种组合物中可包括常规的注射用药物赋形剂，例如稳定剂、增溶剂和缓冲剂。这些药物组合物可以肌内、腹膜内或静脉内注射。
药物组合物可以配制用于局部施用。制剂包括乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液和贴剂，其中化合物分散或溶解于合适的赋形剂中。
药物组合物可以是任何形式，包括片剂、丸剂、胶囊剂、水性或油性溶液、悬浮液、乳液或适于在使用前用水或其它合适的液体介质重构的干粉形式等，以便即时或延迟释放。
合适的赋形剂和/或载体及其量可由本领域技术人员根据所制备的制剂类型而容易地确定。
如实施例中所示，本发明的化合物是PDE和HDAC的双重抑制剂，因此可用于治疗和/或预防由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病。
在一个具体实施方式中，本发明涉及如上所述的式(I)的化合物，其中，B1是式(A”)、(B”)或(D”)的基团，所述化合物是PDE5和至少一种HDAC的双重抑制剂，所述HDAC选自由HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6组成的组。
在另一具体实施方式中，本发明涉及如上所述的式(I)的化合物，其中，B1是式(C”)的基团，所述化合物是PDE9和至少一种HDAC的双重抑制剂，所述HDAC选自由HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6组成的组。
因此，本发明涉及如上定义的式(I)的化合物或式(II)的化合物或包含式(I)或式(II)的化合物的药物组合物，其用作药物。
此外，本发明涉及如上定义的式(I)的化合物或式(II)的化合物或包含式(I)或式(II)的化合物的药物组合物，其用于治疗和/或预防由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病。因此，该方面涉及如上定义的式(I)的化合物或式(II)的化合物在制备用于治疗和/或预防由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病的药物中的用途；并且还可以阐述为治疗和/或预防由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病的方法，该方法包括对有需要的受试对象(包括人)施用治疗有效量的先前定义的式(I)的化合物或式(II)的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
由PDE和HDAC的双重抑制介导的疾病的实例包括伴有认知缺陷或损伤的神经障碍和神经退行性疾病。因此，本发明的化合物可用于治疗和/或预防伴有认知缺陷或损伤的神经障碍或神经退行性疾病。
因此，本发明涉及式(I)的化合物或式(II)的化合物或包含如上定义的式(I)或式(II)的化合物的药物组合物，其用于治疗和/或预防伴有认知缺陷或损伤的神经障碍或神经退行性疾病。因此，该方面涉及如上定义的式(I)的化合物或式(II)的化合物在制备用于治疗和/或预防伴有认知缺陷或损伤的神经障碍或神经退行性疾病的药物中的用途；并且还可以阐述为治疗和/或预防伴有认知缺陷或损伤的神经障碍或神经退行性疾病的方法，该方法包括对有需要的受试对象(包括人)施用治疗有效量的先前定义的式(I)的化合物或式(2)的化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
在具体实施方式中，神经退行性疾病是伴有认知缺陷或损伤的神经退行性疾病。更具体而言，伴有认知缺陷或损伤的神经退行性疾病或神经障碍选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、血管性痴呆(不复杂，伴有精神错乱、妄想或情绪抑郁)、轻度认知损伤和年龄相关的认知损伤。更优选地，所述疾病是阿尔茨海默氏病。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词的变型并非意在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包括”涵盖“由...组成”的情况。本发明的其它目的、优点和特征对于阅读本说明书后的本领域技术人员而言将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来了解。通过示例提供以下实施例，并且它们并不意在限制本发明。
实施例
制备型HPLC纯化方法的一般工序：
利用来自233泵(二元)的Gilson 281、自动进样器和UV检测器进行HPLC测量。通过LC-MS检测级分。MS检测器配置有电喷雾电离源。源温度保持在300℃至350℃。
HPLC方法(纯化方法)：
方法1：在luna(100×30mm；5μm)上进行反相HPLC。溶剂A：含0.075％TFA的水；溶剂B：乙腈。梯度：于25℃，在10.5分钟内从28％的B达到58％的B；然后保持4分钟58％的B，PDA。
方法2：在luna C8(100×30mm；5μm)上进行反相HPLC。溶剂A：NH4HCO3的10mM水溶液；溶剂B：乙腈。梯度：于25℃，在12分钟内从45％的B达到65％的B，保持2分钟65％的B；然后在0.2分钟内从65％的B达到95％的B，保持2分钟95％的B；然后在0.2分钟内达到45％的B，保持1.4分钟45％的B。流速：20mL/分钟。监测波长：220nm和254nm。
方法3：在luna C18(150×20mm；5μm)上进行反相HPLC。溶剂A：含0.040％氨水合物的水；溶剂B：含0.040％氨水合物的乙腈；梯度：于室温，在6分钟内以20mL/分钟从20％的B达到40％的B；然后保持2分钟的25mL/分钟的40％的B，UV检测器。
方法4：在luna(100×30mm；5μm)上进行反相HPLC。溶剂A：含0.075％TFA的水；溶剂B：含0.075％TFA的乙腈。梯度：于25℃，在6分钟内从26％的B达到46％的B；然后保持4分钟40％的B，PDA。
方法5：在Luna C18(100×30mm；4μm)上进行反相HPLC。溶剂A：含0.075％三氟乙酸的水；溶剂B：含0.075％三氟乙酸的乙腈。梯度：于室温，在6分钟内以25mL/分钟从20％的B达到40％的B；然后保持2分钟的25mL/分钟的40％的B，UV检测器。
方法6：在Luna C18(100×30mm；4μm)上进行反相HPLC。溶剂A：含0.075％三氟乙酸的水；溶剂B：含0.075％三氟乙酸的乙腈。梯度：于室温，在6分钟内以25mL/分钟从20％的B达到45％的B；然后保持3分钟的25mL/分钟的40％的B，UV检测器。
方法7：在Waters Xbridge(150*25 5u)上进行反相HPLC。溶剂A：NH4HCO3的6.7mM水溶液；溶剂B：乙腈。梯度：于25℃，在8分钟内从35％的B达到60％的B，保持2分钟60％的B；然后在0.2分钟内从60％的B达到100％的B，保持1.5分钟100％的B；然后在0.2分钟内达到35％的B，保持2分钟35％的B。流速：25mL/分钟。监测波长：220nm和254nm。
方法8：在Waters Xbridge(150*25 5u)上进行反相HPLC。溶剂A：NH4HCO3的6.7mM水溶液；溶剂B：乙腈。梯度：于25℃，在8分钟内从25％的B达到55％的B，保持2分钟55％的B；然后在0.2分钟内从55％的B达到100％的B，保持1.5分钟100％的B；然后在0.2分钟内达到25％的B，保持2分钟25％的B。流速：25mL/分钟。监测波长：220nm和254nm。
超临界流体色谱(SFC)分离方法：
使用Thar SFC Pre-80和UV检测器(220nm)进行SFC分离。
方法1：
-柱：Chiralcel AD-H 5μm，3.0cm id×25cm L
-流动相：A为SFC CO2，B为EtOH
-梯度：B：40
-流速：70g/分钟
-背压：100巴
-柱温：38℃
在实施例中使用以下缩写：
AcOH：乙酸；Boc：叔丁氧羰基；calc.：计算值；conc.：浓缩；DMAP：4-二甲基氨基吡啶；DCM：二氯甲烷；DIAD：偶氮二羧酸二异丙酯；DIC：N,N'-二异丙基碳二亚胺；DMAP：4-(二甲基氨基)吡啶；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；EA/EtOAc：乙酸乙酯；EDC.HCl：1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；eq：当量；ESI-MS：电喷雾离子化质谱；Et3N：三乙胺；HOBt：羟基苯并***；HPLC：高性能液相色谱；LDA：二异丙基氨基锂；MW：微波；NMM：N-甲基吗啉；PE：石油醚；PFP：五氟苯酚；PG：保护基；r.t.：室温；TEA：三乙胺；TFA：三氟乙酸；THF：四氢呋喃；THP：四氢吡喃；TLC：薄层色谱；TMSCl：三甲基甲硅烷基氯。
试剂的制备
制备试剂KR-1：1-叔丁氧基羰基-4-(5-溴嘧啶-2-基)哌嗪
对市售5-溴-2-氯嘧啶(9.75g，50mmol)的CH3CN(100mL)溶液添加1-Boc-哌嗪(9.25g，50mmol)和K2CO3(13.8g，100mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌过夜。然后，将反应混合物在真空下浓缩，用EA萃取并用水洗涤，通过Na2SO4干燥并在真空下浓缩，从而得到KR-1(15g，87.7％产率)。ESI-MS(M+1)：343,345；C13H19BrN4O2的calc.：342.1。
制备试剂KR-2：2-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-羧酸乙酯
对KR-1(6.00g，17.49mmol)的乙醇(100mL)溶液添加Et3N(1.77g，2.43ml)和Pd(dppf)2Cl2(5g)，随后将反应混合物在100℃、1.5MPa于CO气氛下搅拌过夜。将反应混合物过滤，并将滤液在真空下浓缩，从而得到KR-2(5g，85.2％产率)。ESI-MS(M+1)：337；C16H24N4O4的calc.：336.2。
制备试剂KR-3：5-溴-2-[4-(N-叔丁氧基羰基-氨基)哌啶-1-基]嘧啶
KR-3以与KR-1类似的方式从5-溴-2-氯嘧啶开始获得，但是使用哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯代替1-Boc-哌嗪。84.3％产率。ESI-MS(M+1)：357,359；C14H21BrN4O2的calc.：356.1。
制备试剂KR-4：2-[4-(N-叔丁氧基羰基-氨基)哌啶-1-基]嘧啶-5-羧酸乙酯
KR-4以与KR-2类似的方式从KR-3开始获得。61.22％产率。ESI-MS(M+1)：350.2；C17H26N4O4的calc.：350.2。
制备试剂KR-5：5-甲基噻吩-2-羧酸乙酯
对市售5-甲基噻吩-2-羧酸(9.2g，0.065mol)的DMF(80mL)溶液添加K2CO3(17.9g，0.13mol)，然后缓慢添加化合物CH3CH2I(15.2g，0.98mol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在TLC(PE/EtOAc＝2:1)显示起始材料完全消耗后，将混合物用水淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并浓缩，从而得到浅黄色油状的粗制试剂KR-5(9.5g，86.3％)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。ESI-MS(M+1)：171.0；C8H10O2S的calc.：170.0。
制备试剂KR-6：3-[(4-乙氧羰基苯基)甲基]-氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯
用0.5M的9-BBN的THF(10mL)溶液处理市售3-亚甲基氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(500mg，3mmol)，并将混合物在回流下加热4小时。将所得混合物转移至4-碘苯甲酸乙酯(1.7g，6mmol)、Pd2(dba)3(270mg，0.3mmol)、X-Phos(450mg，0.9mmol)和Na2CO3(1g，9mmol)在1,4-二噁烷(40mL)和H2O(4mL)中搅拌混合物中。将所得混合物在回流下搅拌过夜。然后过滤，将混合物用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并浓缩，从而得到粗化合物，其通过柱色谱法(利用PE/EtOAc＝50:1至5:1洗脱)纯化，从而得到浅黄色油状的纯试剂KR-6(200mg，20％产率)。ESI-MS(M+1)：320；C18H25NO4的calc.：319.1。
制备试剂R-09a：2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-羧酸乙酯
对KR-2(2.50g，7.44mmol)的溶液添加4mol/L DCM/HCl(30mL)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩，从而得到R-09a(320mg，96.7％产率)。ESI-MS(M+1)：237；C11H16N4O24的calc.：236.1。
制备试剂R-09b：2-(4-氨基哌啶-1-基)嘧啶-5-羧酸乙酯
R-09b以与R-09a类似的方式从KR-4开始获得。93.5％产率。ESI-MS(M+1)：251；C12H18N4O2的calc.：250.1。
制备试剂R-09e：4-(氮杂环丁烷-3-基甲基)苯甲酸乙酯
将试剂KR-6(200mg，0.63mmol)的HCl/EtOAc(10mL)溶液在室温下搅拌1小时，然后浓缩，从而得到白色固体状的粗制试剂R-09e(150mg，定量)。ESI-MS(M+1)：220；C13H17NO2的calc.：219.1。
制备试剂R-11a：3-亚甲基环丁烷羧酸乙酯
对市售3-亚甲基环丁腈(10.7g，115mmol)的EtOH(70mL)溶液添加KOH(25.2g，450mmol)，然后将混合物在回流下搅拌过夜。将所得混合物在回流下搅拌过夜直至TLC显示起始材料完全消耗，蒸发溶剂并加入水。加入1N HCl以使pH为约3，并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物(12.3g，约95％)。将粗产物(12.3g，110mmol)溶于DMF(120mL)中。然后对该溶液添加EtI(21.5g，138mmol)和K2CO3(31.7g，230mmol)。将混合物在室温搅拌8小时。加入水并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过柱纯化以得到浅黄色油状的试剂R-11a(13.6g，88％产率)。GC-MS(M)：140；C8H12O2：140.08。
制备试剂R-12b：5-(溴甲基)噻吩-2-羧酸乙酯
对试剂KR-5(1.9g，0.011mol)的CCl4(30mL)溶液添加过氧化苯甲酰(BPO)(212mg，0.001mmol)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(2.85g，0.016mmol)，然后将反应混合物在回流下搅拌2小时直至TLC(PE/EtOAc＝5:1)显示起始材料完全消耗，将混合物用DCM萃取，将有机层用NaHCO3水溶液、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过硅胶色谱法(PE/EtOAc＝5:1)纯化，从而得到黄色油状的纯试剂R-12b(1.3g，48.1％)。ESI-MS(M+1)：249.1；C8H9BrO2S的calc.：247.9。
制备试剂R-13a：4-(三氟甲基磺酰氧基)-环己-3-烯-1-羧酸乙酯
在-78℃下对市售4-氧代环己烷羧酸乙酯(3.0g，17.65mmol)的无水THF(30mL)溶液添加二(三甲基甲硅烷基)氨基锂(LHMDS)(18.53mL，1.0M的THF溶液，18.53mmol)，然后将混合物在相同温度下搅拌1小时，在N2保护下添加化合物PhN(SO2CF3)2(6.62g，18.53mmol)的THF(20mL)溶液。在添加之后，将混合物在室温下搅拌过夜直至TLC显示起始材料完全消耗，将混合物用KHSO4水溶液淬灭，用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取，将有机层用1.0M NaOH水溶液、无水NH4Cl、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到黄色油状的粗制试剂R-13a(5.0g，93％)。ESI-MS(M+1)：303；C10H13F3O5S的calc.：302.0。
制备试剂R-14a：1-苄基-4-甲基吡咯烷-3-羧酸乙酯(反式外消旋体)
对市售(E)-丁-2-烯酸甲酯(32g，0.28mol)的溶液添加甲苯(500mL)、N-(甲氧基甲基)(苯基)-N-((三甲基甲硅烷基)甲基)甲胺(74g，0.31mol)和CF3COOH(30g，0.28mol)。将反应混合物在50℃加热18小时。将反应混合物浓缩，用饱和碳酸氢钠淬灭，用DCM萃取，在无水Na2SO4上干燥，过滤并浓缩，从而得到浅黄色油状的粗制R-14a(40g，57.97％产率)。ESI-MS(M+1)：248；C15H21NO2的calc.：247.1。
制备试剂R-19a：溴代-(2-乙氧基-2-氧代-乙基)锌
在N2保护下将Zn粉末(5.2g，80mmol)放入250mL三颈烧瓶中，然后将溶解在干燥THF(20mL)中的TMSCl(0.5mL)注入烧瓶内。将悬浮液混合物在室温下搅拌20分钟，然后在室温下将市售的溶解在干燥THF(50mL)中的2-溴乙酸乙酯(6.5mL)滴加到烧瓶中约30分钟。在添加完成之后，将反应混合物在40℃下再搅拌30分钟，其直接用于下一步骤。
合成途径1a
条件：a)Na(1eq)的乙醇溶液处于室温下1小时；然后，R-01(2eq)在室温下过夜；b)R-02(2eq)的2-甲氧基乙醇/CH3COOH溶液于100℃过夜；c)Cs2CO3(2eq)，R-03(1.25eq)的DMF溶液，室温；d)HCl(6M)在100℃过夜；e)H2SO4(浓)/HNO3(1:2)添加至H2SO4(浓)溶液；然后在50℃过夜；f)在SOCl2中回流过夜；然后在THF中，于0℃下添加至NH3.H2O中，2小时；g)在H2气氛下，在50Psi下，Pd/C在甲醇中于30℃过夜；h)R-04(1eq)、Et3N(2eq)的DCM溶液在室温下12小时；i)NaOH(2eq)的乙醇/H2O/H2O2(3:1:0.1)溶液于100℃过夜；j)ClSO3H在室温下2小时；k)R-06(2eq)的乙醇溶液在MW下处于100℃下1小时；l)Br2(1.2eq)的AcOH溶液于室温下过夜；m)AcOK(2eq)、R-08(1.2eq)和(dppf)2Cl2Pd(0.1eq)的二噁烷溶液于90℃过夜；n)NaOH/H2O(4M)和H2O2(1.3eq)的水溶液于室温下过夜。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基；X是离去基团，例如卤素；A是可选地具有取代基的3至7元杂环单环。
制备中间体I-01a：2,4-二氧代庚酸乙酯
对甲基丙基酮(1,43.06g，0.5mol)的乙醇(200mL)溶液添加Na(41.5g，0.5mol)，在室温下搅拌1小时，然后将草酸二乙酯(R-01a，73.03g，68mL)添加到反应混合物中并在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过NH4Cl溶液淬灭并在真空下浓缩以便得到粗产物，随后用EA萃取，用水洗涤，在真空下浓缩，从而得到I-01a(60g，64.5％产率)。ESI-MS(M+1)：187；C9H14O4的calc.：186.1。
制备中间体I-02a：3-丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯
对I-01a(42g，0.225mol)的2-甲氧基乙醇:CH3COOH(335mL:335mL)溶液添加NH2NH2.H2O(22.52g，0.45mmol)。将反应混合物加热至100℃过夜。将反应混合物在真空下浓缩并用EA萃取，用水洗涤，并将有机层在真空下浓缩，从而得到I-02a(35g，85％产率)。ESI-MS(M+1)：183；C9H14N2O2的calc.：182.1。
制备中间体I-03a：1-甲基-3-丙基-1H-吡唑-5-羧酸乙酯
对I-02a(40g，0.22mol)的DMF(500mL)溶液添加Cs2CO3(0.44mol,2eq)，然后加入化合物CH3I(0.28mol,1.25eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空下浓缩并用DCM萃取，用水洗涤。将有机层在真空下浓缩，从而得到I-03a(30g，70％产率)。ESI-MS(M+1)：197；C10H16N2O2的calc.：196.1。
制备中间体I-04a：1-甲基-3-丙基-1H-吡唑-5-羧酸
将I-03a(11g，56.12mmol)的HCl(121mL,6M)溶液加热至100℃过夜。将反应混合物在真空下浓缩并用EA萃取，用水洗涤，并将有机层在真空下浓缩，从而得到I-04a(9.4g，98％产率)。ESI-MS(M+1)：169；C8H12N2O2的calc.：168.1
制备中间体I-05a：1-甲基-4-硝基-3-丙基-1H-吡唑-5-羧酸
将I-04a(9.5g，56.54mmol)的溶液溶解在浓H2SO4(40mL)中。然后将浓H2SO4:HNO3(3.6mL:8mL)缓慢添加到反应混合物中，并在50℃下搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水中并过滤，收集滤饼，并且在真空下浓缩，从而得到I-05a(8g，71.11％产率)。ESI-MS(M+1)：214；C8H11N3O4的calc.：213.1。
制备中间体I-06a：1-甲基-4-硝基-3-丙基-1H-吡唑-5-甲酰胺
将I-05a(8g，40.20mmol)的溶液溶解在SOCl2(20mL)中，然后回流过夜。将反应混合物在真空下浓缩，从而得到1-甲基-4-硝基-3-丙基-1H-吡唑-5-碳酰氯。因此，该化合物溶解在THF(100mL)中，随后在冰水浴中添加至NH3H2O(100mL)。在又2小时之后，将反应混合物在真空下浓缩，从而得到I-06a(8g).ESI-MS(M+1)：213；C8H12N4O3的calc.：212.1。
制备中间体I-07a：4-氨基-1-甲基-3-丙基-1H-吡唑-5-甲酰胺
将I-06a(10g，47.17mmol)的溶液溶解在甲醇(100mL)中，然后将Pd/C(5g)加入反应混合物中，并在H2气氛下，在50Psi(345kPa)下于30℃搅拌过夜。将反应混合物过滤，并将滤液在真空下浓缩，从而得到I-07a(8.5g，98.83％产率)。ESI-MS(M+1)：183；C8H14N4O的calc.：182.1。
制备中间体I-08a：5-(2-乙氧基苯基羰基氨基羰基)-1-甲基-3-丙基-1H-吡唑-4- 胺
对I-07a(6g，32.97mmol)的DCM(100mL)溶液添加Et3N(6.6g，65.34mmol)、2-乙氧基苯甲酰氯(R-04a，6.1g，32.97mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过加入水使反应混合物洗涤淬灭，并用DCM萃取。收集有机相，在Na2SO4上干燥，并在真空下浓缩，从而得到I-08a(10.85g，98％产率)。ESI-MS(M+1)：331；C17H22N4O3的calc.：330.2。
制备中间体I-09a：6,7-二氢-5-(2-乙氧基苯基)-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡 唑并[4,3-d]嘧啶
将I-08a(8g，24.24mmol)的溶液溶解在乙醇(273mL)、水(78mL)、NaOH(2.11g，52.75mmol)和H2O2(8.75mL)中。将反应混合物在100℃下搅拌过夜。然后，将反应混合物在真空下浓缩，用水洗涤并用DCM萃取。收集有机相，在Na2SO4上干燥并浓缩，从而得到I-09a(4g，53.3％产率)。ESI-MS(M+1)：313；C17H20N4O2的calc.：312.2。
制备中间体I-10a：4-乙氧基-3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)苯-1-磺酰氯
在冰水中将I-09a(2.5g，8.0mmol)加入ClSO3H(R-05，10mL)并在室温下搅拌2小时。通过添加水使反应混合物淬灭，然后过滤。收集滤饼并在真空下干燥，从而得到I-10a(2.0g)。ESI-MS(M+1)：411；C17H19ClN4O4S的calc.：410.1。
制备中间体I-11a：N-([3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)-4-乙氧基]苯-1-磺酰基)哌嗪
对I-10a(0.41g，1mmol)的乙醇(273mL)溶液添加哌嗪(R-06a，0.256g，2mmol)，并将混合物在微波(MW)下于100℃搅拌1小时。将反应混合物在真空下浓缩，从而得到I-11a(0.4g，86.8％产率)。ESI-MS(M+1)：461；C21H28N6O4S的calc.：460.2。
制备中间体I-12a：5-(5-溴-2-乙氧基苯基)-1-甲基-3-丙基-1H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-7(6H)-酮
对中间体I-09a(2g，6.41mmol)的AcOH(30mL)溶液缓慢添加Br2(1.25g，7.69mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后将Na2SO3(0.0189g，3mmol)和水加入反应混合物中，在室温下搅拌2小时。然后将反应混合物在真空下浓缩，用EA萃取，用水洗涤，并通过Na2SO4干燥，然后在真空下浓缩，从而得到I-12a(2g，79.7％)。ESI-MS(M+1)：391；C17H19BrN4O2的calc.：390.2。
制备中间体I-13a：5-(2-乙氧基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷- 2-基)苯基)-1-甲基-3-丙基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7(6H)-酮
对化合物I-12a(3.9g，10.0mmol)的1,4-二噁烷(200mL)溶液添加乙酸钾(AcOK)(1.96g，20mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-二(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(3.05g，12mmol)和(dppf)2Cl2Pd(816mg，1mmol)。将反应混合物在90℃下搅拌过夜，然后过滤并将滤液浓缩，从而得到I-13a(320mg，96.7％)。ESI-MS(M+1)：439；C23H31BN4O4的calc.：438.3。
制备中间体I-14a：[3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧 啶-5-基)]-4-乙氧基苯酚
对化合物I-13a(4.39g，10mmol)的水(50mL)溶液添加NaOH/H2O(4M，13mmol)和过氧化氢(494mg，13mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入Na2SO3溶液并搅拌2小时。然后用EA提取并通过Na2SO4干燥，并且将有机相浓缩，从而得到中间体I-14a(2.0mg，61％)。ESI-MS(M+1)：329；C17H20N4O3的calc.：328.4。
合成途径1b
条件：a)Et3N和R-09的乙醇溶液在MW下处于100℃下2小时；b)LiOH.H2O(5eq)的THF/甲醇/H2O溶液于室温下过夜；c)EDC.HCl(1.2eq)、HOBt(1.2eq)、NMM(5eq)和R-10(1eq)的DMF溶液于室温下过夜；d)SOCl2(3.3eq)在80℃下2小时；然后TEA(2eq)和R-21(1eq)的CH2Cl2溶液在室温下；e)HCl/EtOAc(4N)，在室温下16小时。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，Q是NH或其中Cy2是杂环，并且A是烃链，其可选地含有氮、硫和/或氧原子，并且可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。
制备中间体I-15a：2-(4-[3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4,3- d]嘧啶-5-基)-4-乙氧基苯基磺酰基]哌嗪-1-基)嘧啶-5-羧酸乙酯
对I-10a(0.41g，1mmol)的乙醇(273mL)溶液添加2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-羧酸乙酯(R-09a，0.236g，2mmol)，Et3N(303mg，3mmol)。将混合物在MW下于100℃搅拌2小时。将反应混合物在真空下浓缩，从而得到I-15a(0.4g，65.5％产率)。ESI-MS(M+1)：611；C28H34N8O6S的calc.：610.2。
制备中间体I-16a：2-(4-[3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4,3- d]嘧啶-5-基)-4-乙氧基苯基磺酰基]哌嗪-1-基)嘧啶-5-羧酸
对I-15a(500mg，0.82mmol)的THF/甲醇/H2O(10/1/5mL)溶液添加LiOH.H2O(168mg，4.1mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。在TLC显示大部分起始材料完全消耗后，将混合物用水稀释并将pH调节至2～3。将混合物用EA萃取并用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并浓缩，从而得到粗I-16a(300mg，63.8％产率)。ESI-MS(M+1)：583；C26H30N8O6S的calc.：582.2。
制备化合物1-01：N-(2-氨基苯基)-2-[4-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基- 6H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-5-基)苯基]磺酰基哌嗪-1-基]嘧啶-5-甲酰胺
对I-16a(0.583g，1mmol)的DMF(20mL)溶液添加EDC.HCl(230mg，1.2mmol)、HOBt(160mg，1.2mmol)、苯-1,2-二胺(市售R-10a，108mg，1mmol)、NMM(505mg，5mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc稀释并用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并浓缩，从而得到粗产物，其通过柱色谱法纯化，从而得到化合物1-01(400mg，45％)。ESI-MS(M+1)：673；C32H36N10O5S的calc.：672.76；Rt为2.53(HPLC方法：1)。
除非下表中另有指明，按照与化合物1-01相同的合成途径并使用相同的试剂获得以下化合物：
合成途径1c
条件：a)NIS(1.2eq)，TFA，在室温下过夜；b)R-11,9-BBN的THF溶液(0.5M溶液)回流4小时；c)I-18、Pd2(dba)3(0.05eq)、X-Phos(0.12eq)、Na2CO3(2.5eq)、1,4-二噁烷和H2O回流过夜；d)LiOH.H2O(5eq)的THF/甲醇/H2O溶液在室温下过夜；PFP(1eq)，DIC(1.6eq)的CH2Cl2溶液在室温下过夜；f)R-10、R-22或R-23(1.1eq)、(DMAP(1.1eq))和DIEA(2.1eq)的DMF溶液在60℃～80℃下过夜；g)SOCl2(10eq)处在80℃下2小时；随后TEA(2eq)和R-21(1eq)的CH2Cl2溶液处在室温下；h)HCl/EtOAc(4N)在室温下16小时；i)K2CO3(3eq)的水溶液、Pd(PPh3)4(0.1eq)和R-12(1.1eq)的1,4-二噁烷溶液在80℃下过夜；j)SOCl2在80℃下3小时，然后甲基脲(4.0eq)、DIEA(2.0eq)、CH3CN在80℃下过夜。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，X是卤素，并且A是烃链，其可选地含有氮、硫和/或氧原子，并且可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。
制备中间体I-18a：5-(2-乙氧基-5-碘-苯基)-1-甲基-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-7-酮
在0℃对中间体I-09a(10g，32mmol)的TFA(50mL)溶液添加N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)(8.6g，38.4mmol)。将混合物溶液在室温下搅拌过夜。将混合物用水溶液淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并浓缩，从而得到粗产物，其通过柱纯化，从而得到白色固体状的中间体I-18a(11g，79％)。ESI-MS(M+1)：439.1；C17H19IN4O2的calc.：438.0。
制备中间体I-19a：3-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]甲基]环丁烷羧酸乙酯
将试剂R-11a(700mg，5mmol)用0.5M的9-BBN的THF(12mL)溶液处理，并将混合物在回流下加热3小时。将所得混合物转移至中间体I-18a(1.66g，3.8mmol)、Pd2(dba)3(138mg，0.15mmol)、X-Phos(143mg，0.3mmol)和Na2CO3(850mg，8mmol)的1,4-二噁烷(35mL)溶液以及H2O(6mL)的搅拌混合物中。将所得混合物在回流下搅拌过夜直至TLC显示起始材料完全消耗，然后过滤，将混合物用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并浓缩，从而得到粗化合物，其通过柱色谱法(利用PE/EtOAc＝50:1至5:1洗脱)纯化，从而得到为浅黄色固体状的纯化合物中间体I-19a(1.38g，80.3％产率)。ESI-MS(M+1)：453.2；C25H32N4O4的calc.：452.2。
制备中间体I-20a：3-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]甲基]环丁烷羧酸
对中间体I-19a(1.38g，3.05mmol)的THF/MeOH/H2O(3/3/2，32mL)溶液添加LiOH.H2O(1.34g，10eq)。在TLC显示起始材料完全消耗后，将所得混合物在在室温下搅拌8小时，随后将混合物用水稀释并利用1N HCl将pH调节至3～4，并将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩并通过制备型TLC纯化，从而提供所需中间体I-20a(1.30g，约100％)。ESI-MS(M+1)：425.2；C23H28N4O4的calc.：424.2。
制备中间体I-21a：(2,3,4,5,6-五氟苯基)-3-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3- 丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]环丁烷羧酸酯
在N2下于0℃对中间体I-20a(850mg，2.0mmol)和DIC(404mg，3.2mmol)的CH2Cl2(40mL)溶液添加市售五氟苯酚(386mg，2.1mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。在TLC显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过柱纯化，从而得到黄色固体状的纯中间体I-21a(720mg，61％)。ESI-MS(M+1)：591.2；C29H27F5N4O4的calc.
制备化合物1-04：(外消旋体)N-(2-氨基苯基)-3-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧 代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]环丁烷甲酰胺
对中间体I-21a(720mg，1.22mmol)的DMF(40mL)溶液添加DIEA(348mg，2.7mmol)和苯-1,2-二胺(市售R-10a，158mg，1.46mmol)。将混合物在80℃下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗，然后用水淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法2)纯化，从而获得作为外消旋混合物的纯化合物1-04(330mg，52.7％产率)。ESI-MS(M+1)：515.3；C29H34N6O3的calc.：514.2；Rt为3.01。
制备化合物1-09和1-10：顺式和反式N-(2-氨基苯基)-3-[[4-乙氧基-3-(1-甲基- 7-氧基-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]环丁烷甲酰胺
通过SFC(SFC方法1)从外消旋混合物1-04(720mg)中分离顺式和反式对应的异构体，从而获得顺式异构体1-09(23mg，3.2％)，ESI-MS(M+1)：515.2，C29H34N6O3的calc.：514.2(Rt为3.36)；和反式异构体1-10(25.1mg，3.5％)，ESI-MS(M+1)：515.2，C29H34N6O3的calc.：514.2(Rt为4.83)。
除非下表中另有指明，按照与化合物1-04相同的合成途径并使用相同的试剂获得以下化合物：
制备中间体I-19b：4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]甲基]苯甲酸甲酯
对中间体I-13a(300mg，0.685mmol)的1,4-二噁烷(20mL)溶液添加R-12a——4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(市售试剂，142mg，0.623mmol)、K2CO3(284mg，2.06mmol，在1mL水中)、Pd(PPh3)4(722mg，0.0623mmol)，然后在N2保护下将混合物于在80℃下搅拌过夜。在LC-MS显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过制备型TLC(PE/EtOAc＝1:1)纯化，从而得到黄色固体状的纯中间体I-19b(148mg，51.93％产率)。ESI-MS(M+1)：461；C26H28N4O4的calc.：460.2。
制备中间体I-20b：4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]甲基]苯甲酸
对中间体I-19b(148mg，0.32mmol)的MeOH/THF/H2O(3/9/3,15mL)溶液添加LiOH.H2O(135mg，3.2mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗。然后浓缩，将混合物用H2O稀释并用1N HCl将pH调节至1～2，然后浓缩，从而得到黄色固体状的粗中间体I-20b(140mg，97.22％)。ESI-MS(M+1)：447；C25H26N4O4的calc.：446.1。
制备1-18：4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5- 基)苯基]甲基]-N-(甲基氨基甲酰基)苯甲酰胺
将中间体I-20b(100mg，0.22mmol)的SOCl2(10mL)溶液在80℃下搅拌3小时。然后，将混合物在真空下浓缩，从而得到中间体4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]苯甲酰氯。对该中间体的CH3CN(10mL)溶液添加甲基脲(71.7mg，0.97mmol)和DIEA(75mg，0.58mmol)。并将混合物在80℃下搅拌过夜。然后，将反应用水淬灭并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥并浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法2)纯化，从而获得黄色固体状的纯化合物1-18(11.5mg，12.1％产率)。ESI-MS(M+1)：503.3；C27H30N6O4的calc.；Rt为2.93。
制备中间体I-21b：(2,3,4,5,6-五氟苯基)-4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3- 丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]苯甲酸酯
在N2下于0℃对中间体I-20b(220mg，0.38mmol)和五氟苯酚(77mg，0.42mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液添加DIC(76mg，0.61mmol)。将混合物在室温下搅拌6小时。在TLC显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗中间体I-21b(200mg，75％)，其通过制备型TLC纯化为黄色固体。ESI-MS(M+1)：613.2；C31H25F5N4O4的calc.：612.2。
制备化合物1-11：N-(2-氨基苯基)-4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基- 6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]苯甲酰胺
在室温下对中间体I-21b(200mg，0.32mmol)的DMF(5mL)溶液添加苯-1,2-二胺(市售R-10a，69.3mg，0.64mmol)、DIEA(52mg，0.40mmol)和DMAP(44mg，0.36mmol)，然后将混合物在60℃下搅拌过夜。将混合物用水稀释并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型TLC纯化，从而得到浅黄色固体状的化合物1-11(36.7mg，22％)。ESI-MS(M+1)：537.3；C31H32N6O3的calc.：536.2。Rt为3.20。
制备中间体I-22a：N-[2-[[4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并 [4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]苯甲酰基]氨基]-4-(2-噻吩基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
将I-20b(150.00mg，335.95umol，1.00eq)在SOCl2(399.68mg，3.36mmol，10.00Eq)中的混合物在80℃下搅拌2小时。LCMS(TLC)显示反应完成。将混合物于45℃在减压下浓缩。将残留物溶于DCM(5mL)中并在25℃下滴加至(2-氨基-4-(噻吩-2-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(R21a，97.55mg，335.95umol，1.00eq)和TEA(67.99mg，671.90μmol，2.00Eq)的DCM(5mL)溶液。LCMS(TLC)显示反应完成。将混合物浓缩并通过TLC纯化，从而提供中间体I-22a(200.00mg，粗)。
制备化合物1-13：N-[2-氨基-5-(2-噻吩基)苯基]-4-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7- 氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]苯甲酰胺
将I-22a(200.00mg，278.22μmol，1.00Eq)在HCl/EtOAc(4N，5mL)中的混合物在25℃下搅拌16小时。LCMS显示反应完成。将混合物于40℃在减压下浓缩并通过制备型HPLC(方法2)纯化，从而获得白色固体状的纯化合物1-13(12.00mg，19.39μmol，6.97％产率)。ESI-MS(M+1)：619.3；C35H34N6O3S的calc.：618.2。Rt为2.82。
除非下表中另有指明，按照与化合物1-11或1-13相同的合成途径并使用相同的试剂获得以下化合物：
合成途径1d
条件：a)R-13(1eq)、Pd(PPh3)4(0.1eq)、K2CO3(3eq)的水溶液在1,4-二噁烷中于80℃下过夜；b)Pd/C的MeOH溶液在H2气氛下处在室温1小时；c)LiOH.H2O(5eq)的THF/甲醇/H2O溶液在室温下过夜；d)PFP(1eq)、DIC(1.6eq)的CH2Cl2溶液在室温下过夜；e)R-10(1.1eq)和DIEA(2.1eq)的DMF溶液在60℃～80℃下过夜；f)SOCl2(3.3eq)处在80℃下2小时；然后TEA(2eq)和R-21(1eq)的CH2Cl2溶液处在室温下；g)HCl/EtOAc(4N)处在室温下16小时。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，且n是0或1。
制备中间体I-23a：4-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]环己-3-烯-1-羧酸乙酯
对中间体I-13a(300mg，0.685mmol)的1,4-二噁烷(20mL)溶液添加R-13a——4-(三氟甲基磺酰氧基)环己-3-烯-1-羧酸乙酯(207mg，0.685mmol)、K2CO3(284mg，2.06mmol，在1mL水中)、Pd(PPh3)4(80mg，0.0685mmol)，然后在N2保护下将混合物于在80℃下搅拌过夜。在LC-MS显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过制备型TLC(PE/EtOAc＝1:1)纯化，从而得到白色固体状的中间体I-23a(300mg，94％产率)。ESI-MS(M+1)：465；C26H32N4O4的calc.：464.2。
制备中间体I-24a：4-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]环己烷羧酸乙酯
在H2气氛下对中间体I-23a(170mg，0.366mmol)的MeOH(20mL)溶液添加Pd/C(50mg)，然后将混合物在室温下搅拌1小时直至LC-MS显示起始材料完全消耗，随后过滤，将滤液浓缩，从而得到白色固体状的粗中间体I-24a(154mg，90％)，其直接用于下一步骤。ESI-MS(M+1)：467；C26H34N4O4的calc.：466.2。
制备中间体I-25a：4-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]环己烷羧酸
对粗中间体I-24a(154mg，0.330mmol)的MeOH/THF/H2O(3/9/3,15mL)溶液添加LiOH.H2O(139mg，3.30mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗。然后浓缩，将混合物用H2O稀释并用1N HCl将pH调节至1～2，用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到黄色固体状的粗中间体I-25a(110mg，75％)。ESI-MS(M+1)：439；C24H30N4O4的calc.：438.2。
制备中间体I-26a：(2,3,4,5,6-五氟苯基)-4-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3- 丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]环己烷羧酸酯
在N2下于0℃对中间体I-25a(520mg，1.19mmol)和DIC(227mg，1.80mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液添加五氟苯酚(263mg，1.43mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。在TLC显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过柱纯化，从而得到纯中间体I-26a(540mg，75％)。ESI-MS(M+1)：605.2；C30H29F5N4O4的calc.：604.2。
制备化合物1-05、1-06和1-07：外消旋体、顺式和反式N-(2-氨基苯基)-4-[4-乙氧 基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]环己烷甲酰胺
对中间体I-26a(540mg，0.89mmol)的DMF(40mL)溶液添加DIEA(310mg，2.4mmol)和苯-1,2-二胺(市售R10a，113mg，1.05mmol)。将混合物在80℃下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗，然后用水淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法2)纯化，从而获得纯外消旋化合物1-05(21.2mg)，其中ESI-MS(M+1)：529.2，C30H36N6O3的calc.：528.3(Rt为3.30)；顺式异构体1-06(12.3mg)，其中ESI-MS(M+1)：529.3，C30H36N6O3的calc.：528.3(Rt为3.15)；和反式异构体1-07(16.8mg)，其中ESI-MS(M+1)：529.3，C30H36N6O3的calc.：528.3(Rt为3.21)。
合成途径1e
条件：a)Zn(CN)2(2eq)、Pd(PPh3)4(0.1eq)的DMF溶液于80℃下过夜；b)DIBAL-H(1.1eq)的DCM溶液在室温下过夜；c)R-14(2.0eq)、AcOH(催化剂)和Na(AcO)3BH(3.0eq)的DCM溶液在室温下过夜；d)LiOH.H2O(10eq)的THF/甲醇/H2O溶液在室温下过夜；e)PFP(1.2eq)、DIC(1.6eq)的CH2Cl2溶液在室温下过夜；f)R-10(2.0eq)、DMAP(1.2eq)和DIEA(1.2eq)的DMF溶液在60℃下过夜；g)SOCl2(3.3eq)处在80℃下2小时；然后TEA(2eq)和R-21(1eq)的CH2Cl2溶液处在室温下；h)HCl/EtOAc(4N)处在室温下16小时。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，且Q是NH或其中Cy2是杂环。
制备中间体I-28a：4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧 啶-5-基)苄腈
对中间体I-18a(4.0g，9.13mmol)的DMF(30mL)溶液添加Zn(CN)2(2.21g，18.26mmol)、Pd(PPh3)4(1.06g，0.913mmol)，然后在N2保护下将混合物于在80℃下搅拌过夜。在LC-MS显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过柱色谱法纯化，从而得到白色固体状的中间体I-28a(2.50g，81％产率)。ESI-MS(M+1)：338；C18H19N5O2的calc.：337.1。
制备中间体I-29a：4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧 啶-5-基)苯甲醛
在0℃下对中间体I-28a(2.50g，7.42mmol)的无水DCM(30mL)溶液缓慢添加二异丁基氢化铝(DIBAL-H)(8.2mL，1.0M甲苯溶液，8.16mmol)，然后在N2保护下将混合物在室温下搅拌直至HPLC显示起始材料完全消耗，将混合物倒入2N HCl中，用DCM萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过柱色谱法纯化，从而得到白色固体状的纯中间体I-29a(1.69g，67％产率)。ESI-MS(M+1)：341；C18H20N4O3的calc.：340.1。
制备中间体I-30a：1-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-羧酸乙酯
对中间体I-29a(1g，2.9mmol)的无水DCM(50mL)溶液添加氮杂环丁烷-3-羧酸乙酯(市售R14a，755mg，5.9mmol)、AcOH(催化剂)和三乙酰氧基硼氢化钠(Na(AcO)3BH)(1g，8.6mmol)，然后将混合物在室温下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗，将混合物用DCM萃取三次，将有机层用NaHCO3水溶液、盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过制备型TLC(PE/EtOAc＝1:1)纯化，从而得到白色固体状的纯中间体I-30a(0.8g，67％)。ESI-MS(M+1)：454；C23H29N5O4的calc.：453.2。
制备中间体I-31a：1-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-羧酸
对化合物I-30a(800mg，1.8mmol)的MeOH/THF/H2O(3/9/3,15mL)溶液添加LiOH.H2O(763mg，18mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗。然后浓缩，将混合物用H2O稀释并用1N HCl将pH调节至1～2，用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到白色固体状的粗中间体I-31a(785mg，99％)。ESI-MS(M+1)：426；C22H27N5O4的calc.：425.2。
制备中间体I-32a：(2,3,4,5,6-五氟苯基)-1-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3- 丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-羧酸酯
在N2下于0℃对中间体I-31a(350mg，0.82mmol)和2,3,4,5,6-五氟苯酚(128mg，0.99mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液添加DIC(180mg，1.31mmol)。将混合物在室温下搅拌6小时。在TLC显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗中间体I-32a(180mg，38％)，其通过制备型TLC纯化为黄色固体。ESI-MS(M+1)：592；C28H26F5N5O4的calc.：591.2。
制备化合物1-12：N-(2-氨基苯基)-1-[[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基- 6H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基]甲基]氮杂环丁烷-3-甲酰胺
在室温下对化合物I-32a(180mg，0.30mmol)的DMF(5mL)溶液添加苯-1,2-二胺(市售R-10a，65mg，0.60mmol)、DMAP(44mg，0.36mmol)and DIEA(52mg，0.40mmol)，然后将混合物在60℃下搅拌过夜。将混合物用水溶液淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型TLC纯化，从而得到浅黄色固体状的化合物1-12(31mg，30％)。ESI-MS(M+1)：516.2；C28H33N7O3的calc.：515。Rt为2.26。
合成途径1f
条件：a)R-19(过量)、Pd2(dba)3(0.1eq)和Xphos(0.2eq)的THF溶液在80℃下过夜；b)LiOH.H2O(10eq)的THF/甲醇/H2O溶液在室温下过夜；c)R-20(1.1eq)、BOP(1.5eq)和DIEA(3eq)的DMF溶液在80℃下过夜。
在上述方案中，n为1、2、3或4。
制备中间体I-67a：2-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]乙酸乙酯
在N2保护下对中间体I-12a(500mg，1.282mmol)、Pd2(dba)3(118mg，0.128mmol)、X-Phos(147mg，0.256mmol)的无水THF(30mL)溶液添加R-19a(20mL，过量)，然后将混合物在N2保护下于80℃搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗，然后将混合物用EtOAc萃取并用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(PE/EtOAc＝1:1)纯化，从而得到白色固体状的纯中间体I-67a(270mg，52.94％)。ESI-MS(M+1)：399.3；C21H26N4O4的calc.：398.2。
制备中间体I-68a：2-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d] 嘧啶-5-基)苯基]乙酸
对中间体I-67a(270mg，0.678mmol)的MeOH/THF/H2O(3/9/3，15mL)溶液添加LiOH.H2O(285mg，6.78mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗。然后浓缩，将混合物用H2O稀释并用1N HCl将pH调节至1～2，用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到白色固体状的粗中间体I-68a(230mg，91.63％)。ESI-MS(M+1)：371.2；C19H22N4O4的calc.：370.2。
制备化合物1-15：2-[4-乙氧基-3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6H-吡唑并[4,3-d]嘧 啶-5-基)苯基]-N-(2-吡啶基)乙酰胺
对中间体I-68a(115mg，0.311mmol)的DMF(10mL)溶液添加市售吡啶-2-胺(R-20a，32mg，0.342mmol)、BOP(206mg，0.467mmol)、DIEA(120mg，0.933mmol)。将混合物在80℃下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗，然后用水淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法5)纯化，从而得到红色固体状的纯化合物1-15(10.5mg，7.55％)。ESI-MS(M+1)：447.2；C24H26N6O3的calc.：446.2。Rt为2.43。
合成途径2a
条件：a)原位获得R-15(NH4Cl和Al(CH3)3(2M)的甲苯溶液处于0℃，然后在室温下1小时)；然后添加2并回流6小时；b)N2H4.H2O的乙醇溶液在室温下；c)在0℃下对3的NaOH 4N(3eq)溶液添加R-16(1.1eq)，然后在室温下过夜；d)DMAP(催化剂)和吡啶的THF溶液处于55℃；然后添加R-17并回流4小时；e)在乙醇中回流3小时；f)POCl3和1,2-二氯乙烷处于110℃下2小时；g)ClSO3H处在室温下2小时；h)R-06(2eq)的乙醇溶液在MW下处于80℃下1小时；i)Br2(1.2eq)的AcOH溶液在室温下过夜；j)AcOK(2eq)、R-08(1.2eq)和(dppf)2Cl2Pd(0.1eq)的二噁烷溶液在90℃下过夜；k)NaOH/H2O(4M)和H2O2(1.3eq)的水溶液在室温下过夜。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，X是卤素，A可选地具有取代基的3至7元杂环单环。
制备中间体I-34a：2-乙氧基苄脒
对2-乙氧基苄腈(2，10g，68mmol)的甲苯(150mL)溶液添加AlCH3ClNH2(1eq)。原位新制备甲基氯代氨基铝；在0℃下将NH4Cl(0.535g，10mmol)溶解在干燥甲苯(10mL)中，添加三甲基铝(2M的甲苯溶液，5.0mL，10mmol)并使反应升温至室温，搅拌1小时，从而得到直接使用的AlCH3ClNH2。将混合物在80℃下搅拌6小时。将反应混合物在真空下浓缩，从而得到粗I-34a(8.42g，75.4％产率)。ESI-MS(M+1)：165；C9H12N2O的calc.：164.2。
制备中间体I-36a：2-乙酰氨基戊酸
在约5℃～10℃下将丁酰氯(R-16a，9.6g，90mmol)滴加到D,L-丙氨酸(3，6.68g，75mmol)的氢氧化钠(7.2g，180mmol)水溶液中。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用DCM萃取，将其回收，从而获得油残留物状的粗I-36a(7.65g，64％产率)。ESI-MS(M+1)：160；C7H13NO3的calc.：159.2。
制备中间体I-37a：3-乙酰氨基-2-氧代己酸乙酯
在搅拌下将乙基草酰氯(R-17，8.6g，63.0mmol，2eq)滴加到I-36a(5g，31.4mmol)、吡啶(5.15g，66mmol，2.1eq)和DMAP(0.125g，1mmol)的THF(200mL)溶液中。将反应混合物回流4小时，冷却，用水(100mL)稀释并用EA萃取。回收乙酸乙酯，从而获得油状材料。将该粗产物溶于乙醇(100mL)并添加碳酸氢钠(1.58g，18.8mmol)。将内容物回流4小时，冷却并通过过滤移除碳酸氢钠。将混合物浓缩，从而得到粗产物，其通过利用己烷:EA(3:1)的柱色谱法纯化，从而获得I-37a(2.1g，31％产率)。ESI-MS(M+1)：216；C10H17NO4的calc.：215.2。
制备中间体I-38a：N-(1-(3-(2-乙氧基苯基)-4,5-二氢-5-氧代-1,2,4-三嗪-6- 基)乙基)丁酰胺
在约10分钟～15分钟内对I-34a(1.11g，6.8mmol)的乙醇(15mL)溶液添加水合肼(0.345g，6.8mmol)的乙醇(5mL)溶液。将反应混合物在在室温下搅拌10分钟。添加MgSO4(1g)，并将反应混合物(其中生成中间体I-35并在未分离下反应)加热至回流。然后，在约15分钟内添加I-37a(1.48g，6.8mmol)的乙醇(10mL)溶液。将反应混合物回流3小时。将混合物浓缩，从而得到粗产物，其通过柱色谱法纯化，从而得到化合物I-38a(638mg，28.4％产率)。ESI-MS(M+1)：331；C17H22N4O3的calc.：330.4。
制备中间体I-39a：2-(2-乙氧基苯基)-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2, 4]三嗪-4-酮
对I-38a(456mg，1.38mmol)的1,2-二氯乙烷(10mL)溶液添加POCl3(1.67g，11mmol，8eq)。使反应回流2小时。将反应混合物在室温下冷却，在DCM(20mL)中稀释，并通过添加氢氧化钠水溶液而中和。提取反应混合物并在真空下浓缩，从而得到粗产物化合物I-39a(169mg，39.2％产率)。ESI-MS(M+1)：313；C17H20N4O2的calc.：312.4。
制备中间体I-40a：4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1, 2,4]三嗪-2-基)苯磺酰氯
I-40a以与I-10a类似的方式从I-39a开始获得。80％产率。ESI-MS(M+1)：411；C17H19ClN4O4S的calc.：410.08。
制备中间体I-41a：2-(2-乙氧基-5-哌嗪-1-基磺酰基苯基)-5-甲基-7-丙基-3H- 咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮
I-41a以与I-11a类似的方式从I-40a开始获得。82.6％产率。ESI-MS(M+1)：461；C21H28N6O4S的calc.：460.2。
合成途径2b
条件：a)Et3N和R-09的乙醇溶液在MW下处于100℃下2小时；b)LiOH.H2O(5eq)的THF/甲醇/H2O溶液在室温下过夜；c)EDC.HCl(1.2eq)、HOBt(1.2eq)、NMM(5eq)和R-10(1eq)的DMF溶液在室温下过夜；d)SOCl2(3.3eq)处于80℃下2小时；然后，TEA(2eq)和R21(1eq)的CH2Cl2处于室温下；e)HCl/EtOAc(4N)处在室温下16小时。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，Q是NH或其中Cy2是杂环，并且A是烃链，其可选地含有氮、硫和/或氧原子，并且可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。
制备中间体I-45a：2-[4-[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1- f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]磺酰基哌嗪-1-基]嘧啶-5-羧酸乙酯
I-45a也使用2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-羧酸乙酯(R-09a)以与I-15a类似的方式从I-40a开始获得。66.6％产率。ESI-MS(M+1)：611；C28H34N8O6S的calc.：610.3。
制备中间体I-46a：2-[4-[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1- f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]磺酰基哌嗪-1-基]嘧啶-5-羧酸
I-46a以与I-16a类似的方式从I-45a开始获得。78.7％产率。ESI-MS(M+1)：583；C26H30N8O6S的calc.：582.20。
制备化合物2-02：N-(2-氨基苯基)-2-[4-[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基- 3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]磺酰基哌嗪-1-基]嘧啶-5-甲酰胺
化合物2-02以与化合物1-01类似的方式从I-46a开始获得。63％产率。ESI-MS(M+1)：ESI-MS(M+1)：673；C32H36N10O5S的calc.：672.36；并且Rt为2.24。
除非下表中另有指明，按照与化合物2-02相同的合成途径并使用相同的试剂获得以下化合物：
合成途径2c
条件：a)NIS(1.2eq)，TFA，在室温下过夜；b)R-11，9-BBN的THF溶液(0.5M溶液)，回流4小时；c)I-18、Pd2(dba)3(0.1eq)、X-Phos(0.1eq)、Na2CO3(3.0eq)、1,4-二噁烷和H2O回流过夜；d)LiOH.H2O(10eq)的THF/甲醇/H2O溶液在室温下过夜；e)PFP(1.2eq)，DIC(1.6eq)的CH2Cl2溶液在室温下过夜；f)R-10或R-22(1.1eq)、(DMAP(1.1eq))和DIEA(2.1eq)的DMF溶液在60℃～80℃下过夜；g)SOCl2(3.3eq)处在80℃下2小时；随后TEA(2eq)和R-21(1eq)的CH2Cl2溶液处在室温下；h)HCl/EtOAc(4N)在室温下16小时；i)Na2CO3(2eq)的水溶液、Pd(PPh3)4(0.1eq)和R-12(1.1eq)的1,4-二噁烷溶液在80℃下过夜。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，并且A是烃链，其可选地含有氮、硫和/或氧原子，并且可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。
制备中间体I-48a：2-(2-乙氧基-5-碘-苯基)-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f] [1,2,4]三嗪-4-酮
在0℃下对中间体I-39a(5g，16mmol)的TFA(50mL)溶液添加NIS(4.3g，19.2mmol)。将混合物溶液在室温下搅拌过夜。将混合物用水淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过柱纯化，从而得到白色固体状的中间体I-48a(5g，79％)。ESI-MS(M+1)：439.1；C17H19IN4O2的calc.：438.0。
制备中间体I-49a：3-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f] [1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]环丁烷羧酸乙酯
用0.5M的9-BBN的THF(10mL)溶液处理试剂3-亚甲基环丁烷羧酸乙酯R-11a(200mg，1.43mmol)，并将混合物在回流下加热4小时。将所得混合物转移至中间体I-48a(0.6g，1.37mmol)、Pd2(dba)3(120mg，0.14mmol)、X-Phos(66mg，0.14mmol)和Na2CO3(454mg，4.2mmol)的1,4-二噁烷(20mL)溶液以及H2O(4mL)的搅拌混合物中。将所得混合物在回流下搅拌过夜。然后过滤，将混合物用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过柱色谱法(利用PE/EtOAc＝50:1至5:1洗脱)纯化，从而得到浅黄色油状的纯中间体I-49a(200mg，33％产率)。ESI-MS(M+1)：453.2；C25H32N4O4的calc.：452.2。
制备中间体I-50a：3-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f] [1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]环丁烷羧酸
对中间体I-49a(200mg，0.44mmol)的THF/MeOH/H2O(3/3/2，16mL)溶液添加LiOH.H2O(168mg，10eq)。在TLC显示起始材料完全消耗后，将所得混合物在室温下搅拌8小时，随后将混合物用水稀释并利用1N HCl将pH调节至6～7，并将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而提供所需中间体I-50a(160mg，82％)。ESI-MS(M+1)：425.2；C23H28N4O4的calc.
制备中间体I-51a：(2,3,4,5,6-五氟苯基)-3-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7- 丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]环丁烷羧酸酯
在N2下于0℃对中间体I-50a(1.40g，3.3mmol)和DIC(630mg，5.0mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(500mg，3.9mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。在TLC显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过柱纯化，从而得到黄色固体状的纯中间体I-51a(1.22g，64％)。ESI-MS(M+1)：591.3；C29H27F5N4O4的calc：590.2。
制备化合物2-04：(外消旋体)N-(2-氨基苯基)-3-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧 代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]环丁烷甲酰胺
对中间体I-51a(1.22g，2.1mmol)的DMF(40mL)溶液添加DIEA(440mg，3.4mmol)和苯-1,2-二胺(市售R-10a，282mg，2.6mmol)。将混合物在80℃下搅拌过夜直至LC-MS显示起始材料完全消耗，然后用水淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(方法2)纯化，从而获得作为外消旋混合物的黄色固体的纯化合物2-04(450mg，42％产率)。ESI-MS(M+1)：515.3；C29H34N6O3的calc.：514.2；Rt为2.42。
制备化合物s2-05和2-06：顺式和反式N-(2-氨基苯基)-3-[[4-乙氧基-3-(5-甲 基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]环丁烷甲酰胺
通过SFC(SFC方法1)从外消旋混合物2-04(450mg)中分离顺式和反式对应的异构体，从而获得顺式异构体2-05(19.7mg，4.4％)，ESI-MS(M+1)：515.3，C29H34N6O3的calc.：514.2(Rt为2.25)；和反式异构体2-06(12.4mg，2.8％)，ESI-MS(M+1)：515.3，C29H34N6O3的calc.：514.2(Rt为2.28)。
制备中间体I-49b：4-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f] [1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]苯甲酸甲酯
对中间体I-43a(500mg，1.14mmol)的1,4-二噁烷/H2O(10:1，33mL)溶液添加R-12a——4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(市售试剂，287mg，1.25mmol)、Na2CO3(242mg，2.28mmol)和Pd(PPh3)4(132mg，0.114mmol)，并将混合物于在85℃下通过MW搅拌1小时。在LC-MS显示起始材料完全消耗后，将混合物用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗化合物，其通过制备型TLC(PE/EtOAc＝1:1)纯化，从而得到黄色固体状的纯中间体I-49b(300mg，57.14％产率)。ESI-MS(M+1)：461.2；C26H28N4O4的calc.：460.2。
制备中间体I-50b：4-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f] [1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]苯甲酸
对中间体I-49b(300mg，0.65mmol)的MeOH/THF/H2O(3:3:2，20mL)溶液添加LiOH.H2O(274mg，6.5mmol)，并将所得混合物在25℃下搅拌12小时。然后将混合物用水稀释并用1N HCl将pH调节至6～7。将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到所需中间体I-50b(180mg，产率60.2％)。ESI-MS(M+1)：447.2；C25H26N4O4的calc.：446.1。
制备中间体I-51b：(2,3,4,5,6-五氟苯基)-4-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7- 丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]苯甲酸酯
在N2下于0℃对中间体I-50b(180mg，0.4mmol)和DIC(153mg，1.21mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液添加五氟苯酚(111mg，0.6mmol)。将混合物在25℃下搅拌12小时。在TLC(PE:EtOAc＝1:1)显示起始材料完全消耗后，将混合物浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型TLC(PE:EtOAc＝2:1)纯化，从而获得浅黄色固体状的纯中间体I-51b(180.00mg，73％产率)。ESI-MS(M+1)：613.2；C31H25F5N4O4的calc.：612.2。
制备化合物2-07：N-(4-氨基-3-噻吩基)-4-[[4-乙氧基-3-(5-甲基-4-氧代-7-丙 基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-2-基)苯基]甲基]苯甲酰胺
在25℃下对中间体I-51b(180mg，0.29mmol)的DMF(10mL)添加噻吩-3,4-二胺(R-22，61mg，0.44mmol)、DMAP(1.5mg，0.029mmol)和DIEA(75mg，0.58mmol)，然后将混合物在60℃下搅拌12小时。然后，将混合物浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法2)纯化，从而获得黄色固体状的纯化合物2-07(6mg，3.8％产率)。ESI-MS(M+1)：543.3；C29H30N6O3S的calc.；Rt为2.307。
合成途径3a
条件：a)R-33(1.6eq)、Et3N(2eq)的乙醇溶液处在50℃下2小时；b)30％H2O2溶液、NH4OH(饱和)的乙醇溶液处在室温下2小时；c)R-34，NaH，120℃，MW，1小时；d)Pd/C的甲醇溶液在H2气氛中于40Psi下处在室温下5小时；e)R-35(对映异构纯，S；3eq)的甲醇溶液和EtONa(2.7M)于80℃下过夜；f)Et3N(1.5eq)和CH3SO2Cl(1.1eq)的DCM溶液处在0℃下1小时。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基。考虑任何外消旋混合物和纯对映异构体。
制备中间体I-53a：5-氨基-1-环戊基-吡唑-4-甲腈
在N2下于室温对市售环戊基肼盐酸盐(R-33a)(1.82g，18.18mmol)和市售化合物4——(乙氧基亚甲基)丙二腈(1.34g，10.97mmol)在EtOH(20mL)中的混合物一次性添加Et3N(3.03g，29.93mmol)。将混合物在室温下搅拌10分钟。然后加热至50℃并搅拌2小时。将混合物冷却至室温并在减压下浓缩。将残留物倒入水中，并用EA(50mL)萃取水相。将合并的有机相用饱和盐水(20mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。残留物通过硅胶色谱法纯化以提供黄色固体状的中间体I-53a(1.22g，69％产率)。ESI-MS(M+1)：177.1；C9H12N4的calc.：176.1。
制备中间体I-54a：5-氨基-1-环戊基-吡唑-4-甲酰胺
在N2下于室温对中间体I-53a(2.20g，12.48mmol)在CH3CH2OH(20mL)中的混合物一次性添加H2O2(4.24g，124.80mmol)。然后滴加NH3.H2O(4.37g，124.80mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时。HPLC(TLC)显示反应完成。将残留物加入Na2SO3水溶液(150mL)并搅拌2小时。用EA(50mL)萃取水相。将合并的有机相用饱和盐水(20mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。残留物通过硅胶色谱法纯化以提供黄色固体状的中间体I-54a(1.54g，63％产率)。ESI-MS(M+1)：195.1；C9H14N4O的calc.：194.1。
制备中间体I-55a：6-(1-苄基-4-甲基-吡咯烷-3-基)-1-环戊基-5H-吡唑并[3,4- d]嘧啶-4-酮(反式外消旋体)
对中间体I-54a(1.3g，5.26mmol)的EtOH(10mL)溶液添加1-苄基-4-甲基吡咯烷-3-羧酸乙酯、反式外消旋体R-34a(510mg，2.63mmol)和NaH(631mg，26.3mmol)，然后通过MW将反应混合物在120℃下搅拌1小时。将混合物用水淬灭并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到粗产物，其通过柱色谱法纯化，从而得到黄色固体状的纯中间体I-55a(685mg，69.0％产率)。ESI-MS(M+1)：378.2；C22H27N5O的calc.：377.2。
制备中间体I-56a：1-环戊基-6-(4-甲基吡咯烷-3-基)-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶- 4-酮(反式外消旋体)
对中间体I-55a(2g，5.3mmol)的MeOH(10mL)溶液添加Pd/C(1g)，然后将反应混合物在H2(40psi)气氛中于室温下搅拌5小时。将混合物过滤并在真空下浓缩，并用EtOAc萃取，将有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥。浓缩混合物从而得到黄色固体状的中间体I-56a(687mg，45.11％产率)。ESI-MS(M+1)：288.2；C15H21N5O的calc.：287.2。
制备中间体I-57a：1-环戊基-6-(1-羟乙基)-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮
对中间体I-54a(3.0g，15.6mmol)的无水EtOH(100mL)溶液添加市售(S)-2-羟基丙酸甲酯(R-35，5.36g，51.48mmol)和EtONa(21.3mL，2.7M，新制)，将反应混合物在80℃下搅拌12小时。然后将反应混合物在真空下浓缩并通过柱(PE：EtOAc＝10:1to 1:1)纯化，从而得到中间体I-57a(3.5g，产率：68.47％，SFC中示出30:70对映异构体)。ESI-MS(M+1)：249.2；C12H16N4O2的calc.：248.2。
制备中间体I-58a：1-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)乙基甲磺 酸酯
在0℃下对中间体I-57a(3.5g，14.1mmol)的DCM(50mL)溶液缓慢添加Et3N(2.14g，21.15mmol)和甲磺酰氯(1.78g，15.51mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。然后将反应混合物通过DCM萃取并用水洗涤，通过Na2SO4干燥，在真空下浓缩，并通过柱(PE：EtOAc＝10:1～1:1)纯化，从而得到中间体I-58a(2g，43.46％)。ESI-MS(M+1)：327.2；C13H18N4O4S的calc.：326.1。
合成途径3b
条件：a)酮R-36(1eq)或醛R-37(1.2eq)，AcOH(催化剂)，Na(AcO)3BH(2eq)，DCM，在室温下过夜；b)R-18(1.5eq)、CH3COOH(2eq)的DCM溶液处在0℃下3小时，Na(AcO)3BH(2eq)在室温下15小时；c)K2CO3(3eq)和R-11(1.5eq)的CH3CN溶液处在80℃下2～48小时；d)LiOH.H2O(10eq)的THF/甲醇/H2O溶液在室温下过夜；e)I-60的SOCl2溶液在室温下1小时；f)R-10(1.1eq)、TEA(2.0eq)的DCM溶液在室温下过夜；g)TEA(2eq)和R21(1.1eq)的CH2Cl2溶液在室温下12小时；；h)HCl/EtOAc(4N)在室温下1小时。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，X是离去基团(如卤素)，并且A是烃链，其可选地含有氮、硫和/或氧原子，并且可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。考虑任何外消旋混合物和纯对映异构体。
制备中间体I-59a：4-[[3-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-4- 甲基吡咯烷-1-基]甲基]苯甲酸甲酯(反式外消旋体)
对中间体I-56a(300mg，1.04mmol)的DCM(10mL)溶液添加市售4-甲酰基苯甲酸甲酯(R-37a，205.7mg，1.25mmol)，并对混合物添加CH3COOH(0.1mL)。然后将混合物在室温下搅拌1小时。然后对混合物添加NaBH(OAc)3(442.6mg，2.09mmol)并在室温下搅拌过夜。在TLC(DCM/MeOH 10:1)显示起始材料消耗之后，将混合物过滤并浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型TLC纯化，从而获得黄色固体状的纯中间体I-59a(255mg，56.21％产率)。ESI-MS(M+1)：436.2；C24H29N5O3的calc.：435.2。
制备中间体I-60a：4-[[3-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-4- 甲基-吡咯烷-1-基]甲基]苯甲酸(反式外消旋体)
对中间体I-59a(255mg，0.59mmol)的THF/MeOH/H2O(3/3/2，10mL)溶液添加LiOH.H2O(25mg，59mmol)。将所得混合物在室温下搅拌4小时，在TLC(DCM/MeOH10:1)显示起始材料完全消耗之后，将混合物用水稀释并用1N HCl将pH调节至2～3，并将混合物用EtOAc萃取，用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，浓缩，从而得到浅黄色固体状的粗中间体I-60a(231mg，93.6％产率)，其不经纯化而用于下一步骤。ESI-MS(M+1)：422.2；C23H27N5O3的calc.：421.2。
制备中间体I-61a：4-[[3-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-4- 甲基-吡咯烷-1-基]甲基]苯甲酰氯(反式外消旋体)
在N2下于-5℃对中间体I-60a(100mg，0.24mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液添加(COCl)2(150mg，1.2mmol)和DMF(0.1mL)。将混合物在室温下搅拌1小时。将混合物在真空下浓缩，从而得到粗中间体I-61a(100mg，粗)，其直接用于下一步骤。ESI-MS(M+1)：440.3；C23H26ClN5O2的calc.：439.2。
制备化合物3-01：N-(2-氨基苯基)-4-[[(3S,4S)-3-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑 并[3,4-d]嘧啶-6-基)-4-甲基-吡咯烷-1-基]甲基]苯甲酰胺(反式外消旋体)
在N2下于0℃对溶于CH2Cl2(10mL)的化合物Et3N(46mg，0.44mmol)和苯-1,2-二胺(市售R-10a，30mg，0.28mmol)的溶液添加粗中间体I-61a(100mg，0.22mmol)的CH2Cl2(2mL)溶液。将所得混合物在室温下搅拌过夜直至TLC显示起始材料完全消耗，将混合物浓缩，从而得到粗化合物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法2)纯化，从而获得黄色固体状的纯化合物3-01(6mg，5.3％产率)。ESI-MS(M+1)：512.3；C29H33N7O2的calc.：511.3；Rt为2.70。
除非下表中另有指明，按照与化合物3-01相同的合成途径并使用相同的试剂或中间体获得以下化合物：
制备中间体I-62a：N-[2-[[4-[[3-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6- 基)-4-甲基-吡咯烷-1-基]甲基]苯甲酰基]氨基]-4-(2-噻吩基)苯基]氨基甲酸叔丁酯(反 式外消旋体)
在N2下于0℃对溶于CH2Cl2(10mL)的化合物Et3N(24mg，0.24mmol)和(2-氨基-4-(噻吩-2-基)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(R21a，41mg，0.14mmol)添加粗中间体I-61a(50mg，0.12mmol)的CH2Cl2(2mL)溶液。将所得混合物在在25℃下搅拌12小时，直至TLC(PE:EtOAc＝1:1)显示起始材料完全消耗，将混合物浓缩，从而得到粗化合物，其通过制备型TLC(DCM:MeOH＝10:1)纯化，从而获得黄色固体状的纯中间体I-62a(55mg，72％产率)。ESI-MS(M+1)：694.3；C38H43N7O4S的calc.：693.3。
制备化合物3-02：N-[2-氨基-5-(2-噻吩基)苯基]-4-[[3-(1-环戊基-4-氧代-5H- 吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)-4-甲基-吡咯烷-1-基]甲基]苯甲酰胺(反式外消旋体)
将中间体I-62a(20mg，0.03mmol)的HCl/EtOAc(4M,10mL)溶液在25℃下搅拌1小时，然后浓缩，从而得到粗化合物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法2)纯化，从而获得黄色固体状的纯化合物3-02(5.5mg，30.9％产率)。ESI-MS(M+1):594.3；C33H35N7O2S的calc.：593.2；Rt为3.30。
除非下表中另有指明，按照与化合物3-02相同的合成途径并使用相同的试剂或中间体获得以下化合物：
合成途径3c
条件：a)Et3N和R-09的CH3CN/甲苯溶液处在110℃下2小时；b)LiOH.H2O(10eq)的THF/甲醇/H2O在室温下4小时；c)PFP(1eq)、DIC(1.6eq)的CH2Cl2溶液在室温下过夜；d)R-10(1.1eq)、TEA(2.0eq)的DCM溶液在室温下过夜；e)TEA(2eq)和R21(1eq)的CH2Cl2溶液处在室温下；f)HCl/EtOAc(4N)在室温下16小时。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，Q是氧、NH或其中Cy2是杂环，并且A是烃链，其可选地含有氮、硫和/或氧原子，并且可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。考虑任何外消旋混合物和纯对映异构体。
制备中间体I-63a：4-[[1-[1-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基) 乙基]氮杂环丁烷-3-基]甲基]苯甲酸乙酯
对R-09e(160mg，0.73mmol)的CH3CN(5mL)和甲苯(5mL)溶液添加Et3N(147mg，1.46mmol)和中间体I-58a(239mg，0.73mmol)。将反应混合物通过微波在110℃下搅拌2小时。在TLC(DCM/MeOH＝10:1)显示起始材料消耗后，将混合物浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型TLC(DCM/MeOH＝10:1)纯化，从而获得浅黄色固体状的中间体I-63a(110mg，33.5％产率)。ESI-MS(M+1)：450.2；C25H31N5O3的calc.：449.2。
制备中间体I-64a：4-[[1-[1-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基) 乙基]氮杂环丁烷-3-基]甲基]苯甲酸
对中间体I-63a(110mg，0.24mmol)的THF/MeOH/H2O(3/3/2，20mL)溶液添加LiOH.H2O(103mg，2.5mmol)。将所得混合物在在25℃下搅拌4小时，在TLC(DCM/MeOH＝10:1)显示起始材料完全消耗后，将混合物用水稀释并用1N HCl将pH调节至2～3，并将混合物浓缩，从而得到浅黄色固体状的粗中间体I-64a(90mg，87.26％产率)，其不经纯化而用于下一步骤。ESI-MS(M+1)：422.2；C23H27N5O3的calc.：421.2。
制备中间体I-65a：(2,3,4,5,6-五氟苯基)-4-[[1-[1-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡 唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)乙基]氮杂环丁烷-3-基]甲基]苯甲酸酯
在N2下于0℃对中间体I-64a(80mg，0.19mmol)和DIC(34mg，0.28mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液添加市售五氟苯酚(42mg，0.23mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。在TLC(DCM/MeOH＝10:1)显示起始材料完全消耗后，将混合物浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型TLC(DCM/MeOH＝10:1)纯化，从而获得浅黄色固体状的纯中间体I-65a(75.00mg，60.53％产率)。ESI-MS(M+1)：588.2；C29H26F5N5O3的calc.：587.2。
制备化合物3-04：N-(2-氨基苯基)-4-[[1-[1-(1-环戊基-4-氧代-5H-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-6-基)乙基]氮杂环丁烷-3-基]甲基]苯甲酰胺
在室温下对中间体I-65a(75mg，0.13mmol)的DMF(10mL)溶液添加苯-1,2-二胺(市售R-10a，28mg，0.26mmol)、DMAP(1.56mg，0.012mmol)和DIEA(33mg，0.26mmol)，然后将混合物在60℃下搅拌过夜。将混合物浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法2)纯化，从而获得黄色固体状的纯化合物3-04(10mg，15.1％产率)。ESI-MS(M+1)：512.2；C29H33N7O2的calc.；Rt为1.78。
合成途径4a
条件：a)MnO2(10eq)的DCM溶液在室温下过夜；b)R-24的iPrOH溶液回流过夜；c)在0℃对Et3N(2eq)的THF溶液添加R-25(1eq)；然后，处在室温下3小时；d)NH3/甲醇(30％)处在40℃下3天。
考虑任何外消旋混合物和纯对映异构体。
制备中间体I-69a：苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲醛
在室温下将市售胡椒醇(5，100g，0.66mmol)和活性MnO2(572g，6.6mmol)的DCM(1000ml)溶液搅拌过夜。将反应混合物过滤并将滤液用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并浓缩，从而得到白色固体状的粗I-69a(80g，80％产率)。ESI-MS(M+1)：151；C8H6O3的calc.：150.1。
制备中间体I-70a：1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡 啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯
将I-69a(30g，0.2mol)和试剂(R)-2-氨基-(1H-吲哚-3-基)丙酸甲酯(R-24，43.6g，0.2mol)的丙-2-醇(500mL)溶液回流过夜。将反应混合物浓缩并将固体溶解在NaHCO3水溶液和DCM中。将有机相分离并在Na2SO4上干燥，浓缩，将残留物溶解在50mL DCM中，并伴随搅拌添加己烷(600mL)。滤出固体并将滤液浓缩，从而得到作为外消旋混合物的粗化合物I-70a(90％顺式异构体)(50g，70％产率)。ESI-MS(M+1)：351；C20H18N2O4的calc.：350。
制备中间体I-71a：1-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(2-氯乙酰基)-2,3, 4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧酸甲酯
在0℃对I-70a(50g，0.14mol)和Et3N(29g，0.28mol)的无水THF(500mL)溶液添加氯乙酰氯(R-25，17.7mg，0.15mol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。用300mL的DCM稀释，并通过NaHCO3水溶液洗涤，干燥并浓缩，从而得到黄色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的I-71a(20g，2.57mmol，27％产率)。ESI-MS(M+1)：427；C22H19ClN2O5的calc.：426.1。
制备中间体I-72a：6-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2,3,6,7,12,12a--六氢吡 嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮
将化合物I-71a(5g，9.5mmol)的NH3/甲醇(30mL，30％)溶液在40℃下搅拌3天。浓缩并溶解在50mL的DCM中。用水(50mL×3)洗涤并干燥。将有机相浓缩，从而得到白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的产物I-72a(3g，84.2％产率)。ESI-MS(M+1)：376；C21H17N3O4的calc.：375.1。
合成途径4b
条件：a)R-26(2eq)的甲醇溶液在80℃～100℃下过夜；b)HCl/EtOAc(1N)处在室温下3小时；c)K2CO3(2.4eq)、R-12(1.2eq)的DMF溶液在80℃下过夜；d)R-27(1.2eq)、CH3COOH、NaBH3CN(2eq)的DCM溶液在室温下过夜；e)LiOH.H2O(2.5eq)的THF/MeOH/H2O溶液在室温下过夜；f)PFP(1eq)、DIC(1.6eq)的CH2Cl2溶液在室温下过夜；g)R-10(1.5eq)、(DMAP)和DIEA的DMF溶液在60℃下过夜。
在上述方案中，R是(C1-C6)烷基，X是离去基团(如卤素)，并且A是烃链，其可选地含有氮、硫和/或氧原子，并且可选地含有一个或多个芳环、杂芳环、碳环和/或杂环。
制备中间体I-73a：4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1,4-二氧代-3,4, 6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)-基)甲基)哌啶-1-羧酸叔 丁酯
在N2下于25℃对中间体I-61a(4.3g，10.07mmol)在MeOH(200.00mL)中的混合物一次性添加4-(氨基甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(R-26a，4.32g，20.15mmol)。将混合物加热至80℃～100℃并搅拌过夜。TLC(DCM：MeOH＝20:1)显示反应完成。将混合物冷却至25℃，过滤并将滤液浓缩至干燥。将残留物通过硅胶柱色谱法(DCM:MeOH＝20:1)纯化，从而提供黄色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的纯中间体I-73a(4.0g，6.99mmol，60.99％产率)。ESI-MS(M+1)：573；C32H36N4O6的calc.：572.2。
制备中间体I-74a：6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-(哌啶-4-基甲基)- 2,3,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮
在N2下于0℃对中间体I-73a(4.00g，5.24mmol)添加HCl/EtOAc(200.00mL，1N)。将混合物在25℃下搅拌3小时。LC-MS显示反应完成。将混合物浓缩至干燥，从而提供白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的粗产物中间体I-74a(3.1g，4.91mmol，93.73％产率)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。ESI-MS(M+1)：473；C27H28N4O4的calc.：472.2。
制备中间体I-75a：2-(4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1,4-二氧代- 3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)-基)甲基)哌啶-1- 基)嘧啶-5-羧酸乙酯
对中间体I-74a(900.00mg，1.91mmol)和2-氯嘧啶-5-羧酸乙酯(R-12c，409.77mg，2.20mmol)在DMF(50.00mL)中的混合物添加K2CO3(631.31mg，4.57mmol)。将混合物在80℃下搅拌过夜。TLC(PE:EtOAc＝1:1)显示反应完成。将混合物冷却至25℃，用水(20mL)稀释并用EtOAc萃取(3×50mL)。将合并的有机相用饱和盐水(2×50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，并通过硅胶柱色谱法(PE:EtOAc＝1:1)纯化，从而提供白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的中间体I-75a(680.00mg，1.09mmol，59.68％产率)。ESI-MS(M+1)：623；C34H34N6O6的calc.：622.2。
制备中间体I-76a：2-(4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1,4-二氧代- 3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)-基)甲基)哌啶-1- 基)嘧啶-5-羧酸
在N2下于25℃对中间体I-75a(680.00mg，1.09mmol)在THF/MeOH/H2O(10:3:2,150mL)中的混合物添加LiOH·H2O(114.34mg，2.73mmol)。将混合物在25℃下搅拌过夜。LC-MS显示反应完成。然后将混合物用水稀释并利用2N HCl将pH调节至4～5。将所得混合物浓缩，从而得到白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的粗中间体I-76a(450.00mg，756.79μmol，69.43％产率)，其不经进一步纯化而用于下一步骤。ESI-MS(M+1)：595；C32H30N6O6的calc.：594.2。
制备I-77a：2,3,5,6-四氟-4-甲基苯基-2-(4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯- 5-基)-1,4-二氧代-3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)- 基)甲基)哌啶-1-基)嘧啶-5-羧酸酯
在N2下于0℃对中间体I-76a(450.00mg，756.79μmol)和DIC(617.08mg，4.89mmol)在DCM(50.00mL)中的混合物添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(167.15mg，708.15μmol)。将混合物在25℃下搅拌过夜。LC-MS显示反应完成。然后将混合物浓缩并通过制备型HPLC(一般工序，方法6)纯化，从而得到白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的纯中间体I-77a(300.00mg，394.39μmol，52.11％产率)。ESI-MS(M+1)：761；C38H29N6O6F5的calc.：760.2。
制备化合物4-01：N-(2-氨基苯基)-2-(4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5- 基)-1,4-二氧代-3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)- 基)甲基)哌啶-1-基)嘧啶-5-甲酰胺
在N2下于25℃对中间体I-77a(100mg，131.46umol)的DMF(20.00mL)溶液添加苯-1,2-二胺(R-10a，21.32mg，197.19μmol)、DIEA(3.40mg，26.29μmol)和DMAP(1.61mg，13.15μmol)。将混合物在60℃下搅拌过夜。LC-MS显示反应完成。将混合物冷却至25℃并倒入水(10mL)中。将水相用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。将合并的有机相用饱和盐水(2×20mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，并通过制备型HPLC(一般工序，方法7)纯化，从而得到白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的纯化合物4-01(12.00mg，15.77μmol，12.00％产率，90％纯度)。ESI-MS(M+1)：685.4；C38H36N8O5的calc.；Rt＝3.027分钟。
制备中间体I-75b：4-((4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1,4-二氧代- 3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)-基)甲基)哌啶-1- 基)甲基)苯甲酸甲酯
在25℃下对中间体I-74a(750.00mg，1.59mmol)的DCM(100mL)溶液添加4-甲酰基苯甲酸甲酯(R-27a)(313.22mg，1.91mmol)和CH3COOH(1.00mL)。在搅拌1小时后，在25℃下添加NaBH3CN(199.83mg，3.18mmol)。反应混合物在25℃下搅拌过夜。TLC(PE：EtOAc＝1:3)显示反应完成。将混合物倒入水(50mL)中并用DCM(2×100mL)萃取。将组合的有机相用饱和盐水(2×100mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，并通过制备型TLC(PE:EtOAc＝1:3)纯化，从而得到白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的中间体I-75b(360.00mg，580umol，36.48％产率)。ESI-MS(M+1)：621；C36H36N4O6的calc.：620.2。
制备中间体I-76b：4-((4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1,4-二氧代- 3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)-基)甲基)哌啶-1- 基)甲基)苯甲酸
在25℃下对中间体I-75b(360mg，563.89μmol)在THF/MeOH/H2O(2:1:1,60mL)中的混合物添加LiOH·H2O(59.15mg，1.41mmol)。将混合物在25℃下搅拌过夜。TLC(PE：EtOAc＝1:1)显示反应完成。将混合物倒入水(50mL)中并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机相用饱和盐水(2×50mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩至干燥，从而提供白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的中间体I-76b(150mg，247.25μmol，43.85％产率)。ESI-MS(M+1)：607；C35H34N4O6的calc.：606.2。
制备中间体I-77b：4-((4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-1,4-二氧代- 3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)-基)甲基)哌啶-1- 基)甲基)苯甲酸全氟苯酯
在N2下于0℃对中间体I-76b(150mg，247.25μmol)和DIC(46.80mg，370.88μmol)在DCM(20.00mL)中的混合物添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(54.61mg，296.70μmol)。将混合物在25℃下搅拌过夜。LC-MS显示反应完成。将混合物浓缩，并通过制备型HPLC(一般工序，方法6)纯化，从而提供白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的中间体I-77b(30mg，38.87μmol，15.72％产率)。ESI-MS(M+1)：773；C41H33F5N4O6的calc.：772.2。
制备化合物4-02：N-(2-氨基苯基)-4-((4-((6-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5- 基)-1,4-二氧代-3,4,6,7,12,12a-六氢吡嗪并[1',2':1,6]吡啶并[3,4-b]吲哚-2(1H)- 基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯甲酰胺
在25℃下用10分钟对中间体I-77b(30mg，38.87μmol)的DMF(5.00mL)溶液添加苯-1,2-二胺(R-10a，6.30mg，58.24μmol)、DMAP(474.32μg，3.88μmol)和DIEA(10.04mg，77.65μmol)，然后将混合物在60℃下搅拌过夜。LC-MS显示反应完成。将混合物在真空下浓缩，从而得到粗产物，其通过制备型HPLC(一般工序，方法8)纯化，从而得到白色固体状的外消旋混合物(主要为顺式异构体)的纯化合物4-02(4.6mg，17.00％产率)。ESI-MS(M+1)：697.5；C41H40N6O5的calc.：696.2；Rt＝2.97。
生物测试
体外活性
PDE酶活性检验
用于测量PDE5A、PDE9A同种型b、PDE4D7和PDE4A1酶活性的生物化学检验依赖于来自CisBio(CisBio,Cat.#62GM2PEB)的HTRF cGMP试验试剂盒，其测定反应中存在的cGMP的量。酶获自BPS Biosciences(PDE5A的GenBank登录号：NM_001083，Cat.#60050；PDE9A：NM_001001567，Cat.#60090；PDE4D7：NM_001165899，Cat.#60047；和PDE4A1：U97584，Cat.#60040)并且它们是全长的，具有N端GST标签。它们在杆状病毒感染的Sf9细胞表达***中进行表达。
对于各种酶，如下以20μL的最终体积在384孔板中进行酶活性检验：
·在检验缓冲液中制备4倍浓缩的2.5μL载体或研究的化合物，该缓冲液含有50mMTris-HCl，6mM MgCl2，pH 7.4(PDE5A，PDE4D7，PDE4A1)和另外0.03％Tween-20(PDE9A)。DMSO的最终百分比为0.5％。
·将2.5μL PDE5A(7μg/mL)或2.5μL PDE9A(0.2μg/mL)或2.5μL PDE4D7(1.25μg/mL)或2.5μL PDE4A1(1.5μg/mL)在检验缓冲液中稀释。最终浓度为1.75μg/mL(PDE5A)或0.05μg/mL(PDE9A)或0.31μg/mL(PDE4D7)或0.375μg/mL(PDE4A1)。
·5μL的基底cGMP 4倍浓缩以达到100nM(PDE5A和PDE9A)或250nM(PDE4D7和PDE4A1)的环核苷酸的最终浓度。
·在板密封后，将混合物在37℃下温育30分钟。
·如CisBio的检验试剂盒推荐的，通过添加5μL标记有染料D2的标记的cGMP(cGMP-D2)和5μL标记有穴状化合物的Mab抗cGMP(cGMP-穴状化合物)来停止反应。
·将板密封并在室温下温育1小时。
使用读板器EnVision(Perkin-Elmer)在665nm激发和620nm发射下测定每个孔的荧光。结果——表1(下文)由665nm/620nm比率计算。在化合物的载体存在下获得阳性对照。在不存在cGMP和标记的cGMP-D2环核苷酸的情况下获得阴性对照。
使用SHSY-5Y细胞系的HDAC活性
HDAC抑制导致相应的功能反应，AcH3水平增加。因此，通过使用针对Lys9(AcH3K9)处的乙酰化组蛋白3的特异性抗体的蛋白质印迹分析来评估用于总结HDAC活性的细胞检验。在24小时内用本发明的化合物或已知的PDE抑制剂以100nM、500nM、1μM和/或5μM处理细胞培养物，表1(下文)描述了功能活性：组蛋白3乙酰化水平(AcH3)vs基准(未处理)。
使用人成神经细胞瘤细胞系(SHSY-5Y)。细胞系获自ATCC(CRL-2266)，并在35mm板(Becton Dickinson,NJ)中培养。细胞在5％CO2气氛下和补充有Glutamax(Gibco,Invitrogen,CA)、100单位/ml青霉素/链霉素、1×MEM非必需氨基酸和10％胎牛血清(Gibco,Invitrogen,CA)的Dulbecco改良Eagle培养基中生长至90％融合。
收集细胞，并在含有冷裂解缓冲液以及蛋白酶抑制剂(0.2M NaCl，0.1M HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、10％甘油、200mM NaF、2mM Na4P2O7、5mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1mM EGTA(乙二醇四乙酸)、2mM DTT(二硫苏糖醇)、0.5mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、1mMNa3VO4和完全蛋白酶抑制剂混合物，Roche Diagnostics)的缓冲液中超声处理，以14,000×g在4℃离心20分钟，将上清液等分并在-80℃下储存。使用BioRad Bradford蛋白质试验(BioRad Laboratories)测定总蛋白质浓度。
将蛋白质样品与Laemmli样品缓冲液混合，溶解到十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上并转移到硝酸纤维素膜上。用5％乳剂、0.05％Tween-20的PBS(磷酸盐缓冲盐水)或TBS(Tris-缓冲盐水)溶液封阻膜，然后通过以下原发性抗体在相应的缓冲液中温育过夜：兔多克隆抗乙酰化组蛋白3(乙酰基K9)(Cell Signaling Technology)，兔多克隆抗总组蛋白3(Millipore)。除了以1:50,000使用的鼠单克隆抗β-肌动蛋白之外，所有抗体在1:1000稀释下使用。在TBS/Tween20中洗涤两次并单独在TBS中洗涤一次后，按照增强的化学发光***(ECL,GE Healthcare Bioscience,Buckinghamshire,UK)的说明，使用HRP共轭的抗兔或抗鼠抗体(Santa Cruz Biotechnology；稀释1:5,000)并且对HyperfilmtECL(GEHealthcare Bioscience)进行放射自显影曝光，从而检测免疫标记的蛋白条带。使用Quantity OneTM软件v.4.6.3(Bio-Rad)来进行量化。
表1显示重组酶(IC50)PDE5A1和PDE9A的抑制值；其中，IC50≥10μM(+)(无活性)，1μM≤IC50<10μM(++)，10nM≤IC50<1μM(+++)且IC50<10nM(++++)。此外，表1还显示组蛋白3乙酰化水平(AcH3)相对于基准(未处理)的增量；因此，基准x1表示无增量(+)，基准x1.4≤(++)<基准x2，基准x2≤(+++)<基准x3且基准x3≤(++++)。N.E.表示无效果。
还包括已知的PDE抑制剂(西地那非和他达拉非)以及HDAC抑制剂(伏立诺他)作为参照。
表1
a化合物浓度为1μM
b化合物浓度为500nM
c化合物浓度为100nM
d化合物浓度为5μM
从上表中可以看出，本发明的测试化合物显示出双重活性，抑制PDE和组蛋白3乙酰化，其可能对AD治疗起关键作用，并且不能通过参照化合物实现(例如西地那非、他达拉非或伏立诺他)。
Tg2576神经元中的AD相关标记(APP处理和pTau)
在来自Tg2576小鼠胚胎的海马体和皮质的神经元的体外(DIV)21天后，在原代培养物中分析化合物对淀粉样病理的影响。Tg2576小鼠表达含有瑞典双突变的人APP(hAPP)的695-aa同种型，其有利于Aβ产生。将神经元处理两天，并在第三天，最后一次处理后的24小时收集。首先，通过测量作为Aβ42前体的羧基末端片段AβPP(C99)，分析化合物对淀粉样病变途径的hAPP处理的影响。在这种情况下，报告的EC50——表2(下文)表示相对于基准(载体，无治疗)的C99水平降低50％。
接下来使用识别Ser202/Thr205上的超磷酸化表位的磷酸特异性抗体(AT8)分析化合物对相同样品中磷酸化tau(p-Tau)的水平(AD的另一种标志物)的影响。在这种情况下，报告的EC50——表2(以下)表示相对于基准(载体，无治疗)的pTau水平降低50％。
为了在原代神经元培养物中分析APP衍生片段和p-Tau水平，将细胞收集在含有SDS(2％)、Tris-HCl(10mM，pH 7.4)、蛋白酶抑制剂(1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和完全蛋白酶抑制剂混合物：Roche Diagnostics)和磷酸酶抑制剂(0.1mM Na3VO4和1mM NaF)的缓冲液中。将匀浆超声处理2分钟，并以100,000×g离心1小时。将上清液的等分试样在80℃下冷冻，并且利用Bio-Rad蛋白质检验(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)通过Bradford方法测定其蛋白质浓度。
将蛋白质提取物的等分试样与XT样品缓冲液和XT还原剂(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)混合并煮沸5分钟。在Criterion预制Bis-Tris 4％～12％梯度预制凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中分离蛋白质并将其转移至脱除率为0.2mm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Hybond LFP,Amersham Biosciences,Little Chalfont,UK)。用5％乳剂、0.05％Tween-20的PBS或TBS溶液封阻膜，并在相应缓冲液中用以下原生性抗体温育过夜：鼠单克隆抗磷酸蛋白AT8(Pierce Biotechnology Inc.,Rockford)、6E10鼠单克隆抗体(Aβ肽的氨基酸1-17；Millipore)、鼠单克隆抗β-肌动蛋白。所有抗体在1:1,000的稀释下使用，鼠单克隆抗β-肌动蛋白(1:50,000)除外。在TBS/Tween20中洗涤两次并单独在TBS中洗涤一次后，使用HRP共轭的抗兔或抗鼠抗体(稀释1:5000，Santa Cruz Biotechnology)检测免疫标记的蛋白条带。使用定量用Quantity OneTM软件v.4.6.3(Bio-Rad)，通过增强的化学发光(ECL,GEHealthcare Bioscience,Buckinghamshire,UK)和针对Hyperfilm ECL(GE HealthcareBioscience)的放射自显影曝光来显示结合。
表2显示了对原代培养物Tg2576神经元的功能反应。包括已知的PDE5抑制剂(他达拉非)以及HDAC抑制剂(伏立诺他)作为参照，并将它们的功能反应报告为EC50；其中，N.E.表示无效果，EC50≥10μM(+)，1μM≤EC50<10μM(++)，10nM≤EC50<1μM(+++)且EC50<10nM(++++)。本发明的化合物以固定浓度(50nM)检验，并且还报告了C99和pTau水平相对基准(盐水，未处理)的降低；其中，基准x1表示无降低(+)，基准x0.2≤(++)<基准x0.4(降低20％～40％)，基准x0.4≤(+++)<基准x0.6(降低40％～60％)且基准x0.6≤++++)(降低等于或大于60％)。N.E.表示无效果。
表2
实施例 pTau C99
他达拉非 +++
伏立诺他 +++
1-11a ++ ++
a化合物浓度为(50nM)
体内活性
野生型小鼠中pCREB和AcH3的抑制
为了测定本发明的化合物抑制脑中HDAC和PDE的能力，将化合物经腹膜内以40mg/kg(n＝3)的单剂量施用至野生型小鼠。另一组动物接受载体(1/1/8,v:v:v,DMSO/Tween20/盐水)。一小时后，通过颈脱位处死小鼠，并从脑中快速切下其海马体。通过将海马体在具有蛋白酶抑制剂(0.2M NaCl、0.1M HEPES、10％甘油、200mM NaF、2mM Na4P2O7、5mM EDTA、1mM EGTA、2mM DTT、0.5mM PMSF、1mM Na3VO4和完全蛋白酶抑制剂混合物，RocheDiagnostics)的冷裂解缓冲液中均化而获得总组织匀浆。然后将匀浆在4℃下以14,000×g离心20分钟，将上清液等分并在-80℃储存。利用BioRad Bradford蛋白质试验(BioRadLaboratories)测定总蛋白质浓度。如“体外”部分中所述的分析蛋白质样品。结果示于表3中。
Tg2576小鼠中的AD相关标记(APP处理(C99)和pTau)
使用在含有SDS(2％)的缓冲液中获得的海马体匀浆，并按照与野生型小鼠研究中所述相同的方案，在慢性治疗(3～5周)后，也在Tg2576小鼠中分析化合物的作用，并根据体外Tg2576神经元中描述的方案完成分析。
表3显示生物反应相对于基准(无处理)的增量；因此，基准x1表示无增量(+)，基准x1≤(++)<基准x2，基准x2≤(+++)<基准x3，基准x3≤(++++)<基准x4且基准x4≤(+++++)。N.E.表示无效果。还包括已知的PDE5抑制剂(他达拉非)以及HDAC抑制剂(伏立诺他)作为参照。a数据获自野生型小鼠，b数据获自Tg2576小鼠。
表3
实施例 pCREBa AcH3a pTaub C99b
他达拉非c +++ N.E. +++
伏立诺他d N.E. +++
1-11 +++ ++
c单剂量为1mg/Kg；腹膜内
d单剂量为12.5mg/Kg；腹膜内
在上表中可见，本发明的测试化合物显示出体内功能性双重活性，其可能对AD治疗起关键作用，并且参照化合物(他达拉非和伏立诺他)不能实现。
药代动力学
在每个点的四只野生型小鼠的预定时间收集用于测量化合物浓度的血浆和脑样品。测量三个时间点：0.25小时、0.5小时和1.0小时。使用具有电喷雾电离(ESI)源和Acquity UPLC(Waters,Manchester,UK)的Xevo-TQ MS三重四极杆质谱仪测量化合物的浓度。
剂型制备和剂型施用：
化合物溶液通过将样品溶解在DMSO中而制备，并且通过加入Tween 20和0.9％的NaCl(1/1/8,v:v:v,DMSO/Tween 20/盐水)的混合物而使该溶液达到最终体积。化合物作为单次腹膜内注射。通过断头术杀死动物。
样品收集：
血浆。将血液收集到含有EDTA的管中，并通过离心分离(4℃，13200rpm，5分钟)收集血浆并在-80℃下储存直至进行分析。
脑。小鼠死亡后立即收集大脑。切除大脑，称重并在-80℃冷冻，直到进一步处理以用于分析。
色谱法：
通过利用Acquity UPLC BEH C18柱(100×2.1mm，1.7μm粒径；Waters)以0.4mL/分钟的梯度洗脱进行色谱分离。流动相由A和B构成，A为含0.1％甲酸的水，B为含0.1％甲酸的甲醇。在95％A的初始条件1.5分钟后，溶剂B在2分钟内从5％增加至100％，在100％保持1.5分钟，然后在0.1分钟内施加线性梯度至初始条件并保持3.4分钟以使柱重新平衡，得出8.5分钟的循环时间。自动进样器温度设定为10℃，柱温为45℃。
质谱法：
使用装配有电喷雾电离界面的三重四极杆质谱仪监测化合物。为了检测和定量化，使用3.5kV的毛细管电压和38V的锥电压。源温度和去溶剂化温度分别为150℃和650℃。对锥气(75L h-1)和去溶剂化气(1000L h-1)使用超高纯氮。电喷雾离子化以正模式操作，并且使用的碰撞气体为流速0.15mL min-1的超纯氩。
定量化和样品制备：
通过使用基质匹配标准的外部校准实现定量。使用加权最小二乘线性回归(W＝1/x)计算浓度。通过将适当体积的化合物的稀释溶液(在甲醇和水的混合物中制备，50:50，v:v)加入50μL空白血浆或75mg均化空白脑的等分试样中来制备校准用标准。加入2％甲酸的乙腈溶液以使蛋白质沉淀。然后将混合物搅动10分钟，并在4℃下以13200rpm离心分离5分钟。将所得上清液转移至设计用于除去磷脂的Ostro板(Waters,Manchester,UK)。将所得洗脱液在氮气流下于37℃蒸发。将残留物溶于75μL甲醇和水的混合物(50:50,v:v)中。将所得溶液的10uL等分试样注射到LC-MS/MS***上以用于分析。将冷冻血浆样品在室温下解冻，彻底涡旋并进行上述提取工序。将脑样品在室温下解冻，并使用Branson 250超声波降解器(Branson,Danbury,Connecticut,USA)均化。当均化时，称量75mg并如前所述进行提取。
结果
由LC-MS/MS分析得到的浓度值描述于表4中。表4显示化合物在施用后1小时的血浆和脑浓度以及脑/血浆比；剂量为40mg/Kg(腹膜内)。
表4
化合物 C(血浆；nM) C(脑；nmol/Kg) 脑/血浆比(％) 穿过BBB？
1-11 12132.5(1762.9)a 1903.4(565.8)a 15.7 是
a标准偏差值
在上表中可见，如上表3(功能反应)中所证实的，本发明的测试化合物穿过血脑屏障并以有效浓度到达脑。
老年Tg2576小鼠的记忆功能
通过使用两种不同的行为任务——条件化恐惧(FC)和Morris水迷宫(MWM)试验，如表5(下文)所示，在3～5周的慢性治疗后，在Tg2576小鼠(16～18个月)中研究了本发明化合物对记忆功能的影响。
FC任务的行为过程涉及三个阶段：习惯性、训练和测试。在习惯性阶段期间，使小鼠习惯于调节箱(环境)5分钟，没有呈现刺激。24小时后(训练阶段)，将小鼠置于培养室中并允许其探索2分钟，之后，施加足底电击(0.3mA)无条件刺激(2s)，并在30秒之后使小鼠返回其家笼。
使小鼠在训练后24小时返回到调节室，并允许其探索环境2分钟，在此期间记录僵立行为(freezing behavior)(环境长期记忆)。僵立评分表达为百分比。调节过程在StartFear***(Panlab S.L.,Barcelona,Spain)中进行，其允许通过高灵敏度重量传感器***记录和分析由动物运动产生的信号。模拟信号被传送到通过称重传感器单元调制的FREEZING和STARTLE软件，以用于记录目的和在活动/不动性方面的后验分析。
使用MWM测试来评估空间记忆。在处理后，动物组在MWM中进行空间参照学***台(可见平台)。在该阶段期间没有出现远端可见的线索。相同的平台位置用于所有可见的平台阶段，并且针对连续8天(4次试验/天)进行的不可见平台训练(在表面下方浸没1cm)进行改变，在该阶段存在所有可见的远端线索。在可见的和隐藏的平台版本中，小鼠都面向池壁被伪随机地置于在选定的位置，以消除迷宫外空间线索的潜在混乱影响。每个试验在小鼠到达平台或60秒后终止，以先到者为准。为了测试保持度，在测试的第4天、第7天和试验的最后一天(第9天)开始进行三次探索试验。在探索试验中，从池中取出平台，记录在平台先前设置的象限中花费的时间的百分比。通过连接到SMART-LD程序(Panlab S.L.,Barcelona,Spain)的池中心上方的相机监测所有试验，以用于之后分析逃避潜伏期、游泳速度、路径长度和探索试验期间在池的每个象限中花费的时间的百分比。所有实验程序采用不分组的方式进行。
表5
at检验，本发明的化合物vs载体
bMWM试验的保持度，第4天
c标准偏差值
d20mg/Kg，腹膜内
在上表中可见，在老年Tg2576小鼠受到严重损伤的行为任务(FC和MWM)中，本发明的测试化合物改善了这些动物的记忆保留缺陷。

Claims (15)

1.式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，或者所述式(I)的化合物或任何其药学上可接受的盐的任何立体异构体或其混合物：
其中，
单元-NRaRb选自由式(M1)、式(M2)、式(M3)和式(M4)组成的组，所述单元-NRaRb中的虚线意味着Ra和Rb可选地形成已知环系：
B1是选自由式(A”)、式(B”)、式(C”)和式(D”)组成的组的基团：
Rc是氢；
Rd和Re独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基、以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和的或部分不饱和的已知3至8元碳环单环；
A是选自苯基和5至6元杂芳环的已知环系，其中取代基-NRc-和-NRdRe附接至相邻碳原子；
R'和R”独立地选自由H、Rf、可选地取代有一个或多个取代基Rf的苯基、可选地取代有一个或多个取代基Rf的5至6元杂芳环、以及可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基组成的组；
各Rf独立地选自卤素、-NO2、-CN、-ORg、-OC(O)Rg、-OC(O)ORg、-OC(O)NRgRg、-NRgRg、-NRgC(O)Rg、-NRgC(O)ORg、-NRgC(O)NRgRg、-NRgS(O)2Rg、-NRgSO2NRgRg、-SRg、-S(O)Rg、-SO2Rg、-SO2(ORg)、-SO2NRgRg、-C(O)Rg、-C(O)ORg、-C(O)NRgRg和-C(O)NRgORg；
各Rg独立地选自H、可选地取代有一个或多个卤原子的-(C1-C7)烷基、以及可选地取代有一个或多个卤原子的饱和的或部分不饱和的已知3至7元碳环单环；
p、n和r独立地为0或1；
R1和R2独立地选自由下列基团组成的组：H；可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C7)烷基；和3至7元碳环或杂环单环，所述碳环或杂环单环是饱和或部分不饱和的或者芳香族的，并且可选地取代有选自卤素和(C1-C3)烷基的一个或多个取代基；
Z1是选自由式(E)、式(F”)、式(G')、式(H')、式(J')和式(K)组成的组的二价基：
Z2选自由下列基团组成的组：-Z5-；-Z5-Cy4-；-Z5-Cy4-Z5-；和-Cy4-；
Z3和各Z5独立地为可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C6)烷基的二价基；
Z4是可选地取代有一个或多个取代基的饱和或不饱和的(C1-C6)烷基的二价基，所述取代基选自卤素、OH和可选地取代有一个或多个卤原子的-O(C1-C3)烷基；或者作为备选，Z4是–CR11R12-，其中R11和R12与它们附接的碳一起形成C═O或3至7元碳环或杂环单环，所述碳环或杂环单环是饱和或部分不饱和的，并且其可选地取代有以下基团：一个或多个卤原子或者可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C3)烷基；
q和m独立地为0或1；
Cy1是3至7元饱和或部分不饱和的杂环单环，所述杂环单环与3至7元饱和或部分不饱和的碳环或杂环单环稠合、桥接稠合或螺稠合，其中Cy1可选地取代有一个或多个R3基团；
Cy2是带有N的3至7元饱和或部分不饱和的杂环单环，所述杂环单环可选地与3至7元饱和或部分不饱和的碳环或杂环单环稠合、桥接稠合或螺稠合，其中Cy2可选地取代有一个或多个R3基团；
Cy3和Cy4独立地为苯基或3至7元碳环或杂环单环，所述碳环或杂环单环是饱和或部分不饱和的或芳香族的，并且可选地取代有一个或多个R3基团；
R3选自：卤素；可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C7)烷基；可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的-O(C1-C7)烷基；以及3至7元碳环或杂环单环，所述碳环或杂环单环是饱和或部分不饱和的或芳香族的，并且可选地取代有一个或多个取代基，所述取代基选自由卤素和可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C6)烷基组成的组；
R4和R10独立地为H或可选地取代有一个或多个卤原子的(C1-C6)烷基；并且
其中，在任一杂环中，一个或多个环成员选自NH、N、O和S；
其中，在所有饱和或部分不饱和的环中，所述环的一个或两个成员可选地为C(＝O)和/或C(＝NH)和/或C[＝N(C1-C4)烷基]，
其中，饱和烷基是指仅含有单键的直链或支化烃链；不饱和烷基是指含有一个或两个双键和/或一个或两个三键的直链或支化烃链；
其中，在任一烷基中，选自CH2或CH的一个或两个链成员可选地被独立地选自N、NR4、O、C(＝O)、C(＝O)NR4、NR4C(＝O)和S的链成员替代；并且
条件是：
式(A”)、式(B”)和式(C”)中的单元(L1)和式(D”)的单元(L2)
具有1至20个原子的链长度；并且
当所述式(I)的化合物中B1是式(C”)基团并且所述单元-NRaRb具有式(M1)时，则式(C”)中的单元(L1)不是-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-，其中S原子附接至吡唑并嘧啶酮单元并且-S-CH2-、-S-(CH2)2-或–S-CH(CH3)-的烃部分附接至-C(＝O)NRaRb单元；
当所述式(I)的化合物中B1是式(C”)基团并且所述单元-NRaRb具有式(M4)时，则(M4)中的吡啶基团不是3-甲基吡啶-2-基氨基-、4-甲基吡啶-2-基氨基-、5-甲基吡啶-2-基氨基-、6-甲基吡啶-2-基氨基-、5-氯吡啶-2-基氨基-或5-溴吡啶-2-基氨基-；并且
当所述式(I)的化合物中B1是式(C”)基团并且所述单元-NRaRb具有式(M4)时，则R1不是苯基或具有取代基的苯基。
2.如权利要求1所述的式(I)的化合物，其中，所述单元-NRaRb具有式(M3)或式(M4)。
3.如权利要求2所述的式(I)的化合物，其中，所述式(M3)的所述单元-NRaRb具有式(M3’)：
4.如权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物，其中，B1是式(A”)基团。
5.如权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物，其中，B1是式(B”)基团。
6.如权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物，其中，B1是式(C”)基团。
7.如权利要求4至6中任一项所述的式(I)的化合物，其中，R1选自由下列基团组成的组：可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基；可选地取代有一个或多个取代基的5至6元饱和碳环，所述取代基选自卤素和(C1-C3)烷基；以及可选地取代有一个或多个取代基的5至6元饱和杂环，所述取代基选自卤素和(C1-C3)烷基。
8.如权利要求4至7中任一项所述的式(I)的化合物，其中，R2是H或可选地取代有一个或多个卤原子的饱和或不饱和的(C1-C4)烷基。
9.如权利要求4至8中任一项所述的式(I)的化合物，其中，Z1是选自由式(E)、式(F”)和式(H')组成的组中的二价基。
10.如权利要求4至9中任一项所述的式(I)的化合物，其中，r为0，或者作为备选，r为1且Z2为-Cy4-。
11.如权利要求1至3中任一项所述的式(I)的化合物，其中，B1是式(D”)基团。
12.如权利要求4至11中任一项所述的式(I)的化合物，其中，p为1，并且Cy1选自由下列基团组成的组：苯基、5至6元杂芳环和4至6元饱和杂环，其中，Cy1可选地取代有一个或多个R3基团。
13.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1至12中任一项所述的式(I)的化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。
14.如权利要求1至12中任一项所述的式(I)的化合物或如权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防伴有认知缺陷或损伤的神经障碍，或神经退行性疾病。
15.如权利要求14所述的应用的式(I)的化合物或药物组合物，其中，所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
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