CN107080835A - 长效生长激素及其生产方法 - Google Patents

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乌迪·埃亚尔·菲玛
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Opko Biology Science Co Ltd
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Abstract

本发明涉及长效生长激素及其生产方法。具体地，本发明公开了生长激素蛋白以及编码该生长激素蛋白的多核苷酸在人类受试者中诱导体重减轻或身体脂肪减少的方法中、在提高***(IGF‑1)水平的方法中以及在降低生长激素的给药频率的方法中的应用，该生长激素蛋白包含连接至所述生长激素的绒毛膜***的氨基末端羧基末端肽(CTP)和两个羧基末端绒毛膜***CTP。还公开了包含本发明的生长激素和编码该生长激素的多核苷酸的药物组合物以及使用该药物组合物的方法。

Description

长效生长激素及其生产方法
本申请是申请日为2012年08月02日的题为“长效生长激素及其生产方法”的中国专利申请号201280048492.0的分案申请。
相关申请的引用
本申请要求于2011年8月2日提交的美国申请序列号US 13/195,931的优先权，其为于2009年7月24日提交的美国专利申请序列号US 12/509,188的延续部分，该US 12/509,188是于2009年6月2日提交的美国专利申请序列号US 12/476,916的延续部分，该US 12/476,916是于2009年3月11日提交的美国专利申请序列号US 12/401,746的延续部分，该US12/401,746是于2007年2月1日提交的美国专利申请序列号US 11/700,911的延续，该US11/700,911要求于2006年2月3日提交的美国临时申请序列号US 60/764,761的权益。所有这些申请特此通过引用将其整体并入本文。
技术领域
本发明公开了生长激素蛋白以及编码该生长激素蛋白的多核苷酸在人类受试者中诱导体重减轻或身体脂肪减少的方法中、提高***(IGF-1)水平的方法中以及降低生长激素的给药频率的方法中的应用，该生长激素蛋白包含连接至所述生长激素的绒毛膜***的氨基末端羧基末端肽(CTP)和两个羧基末端绒毛膜***CTP。还公开了包含生长激素和编码本发明的生长激素的多核苷酸的药物组合物以及使用该药物组合物的方法。
背景技术
多肽在血液、肝脏或肾脏中容易变性或酶促降解。因此，多肽通常具有几个小时的短的循环半衰期。因为它们的低稳定性，所以肽类药物通常以持续的频率进行递送以保持活性肽的有效血浆浓度。此外，由于肽类药物通常通过输液给予，频繁注射肽类药物给受试者带来相当的不适。因此，存在对可以延长治疗性多肽的半衰期并且同时保持其高药理效力的技术的需要。此类所需的肽类药物还应当满足增强的血清稳定性、高活性和当注射至受试者体内时诱导不期望的免疫反应的概率低的要求。
不利的药代动力学，如短的血清半衰期能够阻碍许多反之有前途的候选药物的药物开发。血清半衰期是分子的经验特征，并且必须为每个新的潜在药物进行实验来确定。例如，具有较低分子量的多肽药物，因为所需的给药方案的成本或频率，生理清除机制，如肾过滤可能使得维持治疗水平的药物变得不可行。相反地，在药物或其代谢产物具有毒性副作用的情况下，长的血清半衰期是不希望的。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中诱导体重减轻或减少身体脂肪的方法，包括向受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接到该生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接到该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在所述受试者中诱导体重减轻或减少身体脂肪。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中提高***(IGF-1)水平的方法，包括向受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接到该生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接到该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而提高所述受试者中的IGF-1水平。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在受试者中将***(IGF-1)水平维持在正常治疗范围内的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接到该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在该受试者中将IGF-1维持在正常治疗水平范围内。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中降低生长激素的给药频率(dosing frequency)的方法，包括将一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)连接到所述生长激素的氨基末端并且将两个绒毛膜***CTP连接到所述生长激素的羧基末端的步骤，从而降低生长激素的给药频率。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中诱导生长或体重增加的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接到该生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接到该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，其中所述受试者是儿童或青少年，从而在所述受试者中诱导生长或体重增加。
附图说明
图1是蛋白质印迹(Western blot)，其说明hGH(SEQ ID NO:5)、hGH-CTP(SEQ IDNO:9)、hGH-CTP-CTP(SEQ ID NO:10)、CTP-hGH-CTP-CTP(SEQ ID NO:11)和tCTP-hGH-CTP-CTP(SEQ ID NO:12)的分子量及同一性。使用单克隆抗-hGH抗体对PAGE SDS凝胶进行印迹和染色。该照片显示，与商业化的hGH和野生型hGH一样，抗-hGH抗体识别CTP修饰的hGH变异体。
图2是说明切除垂体的(hypophysectomized)大鼠在给予本发明的GH-CTP多肽(不同的MOD)后体重增加的柱状图。
图3包括两个图象(1)CTP-hGH-CTP-CTP pCI-dhfr质粒的谱图和(2)CTP-hGH-CTP-CTP的结构蛋白式。
图4A和图4B是显示在大鼠中静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)给予单剂量的CTP-hGH-CTP-CTP或GH(n＝3-6每剂量/途径)之后的平均血浆CTP-hGH-CTP-CTP或GH浓度(pg/ml)的曲线图。
图5是显示与每天GH注射(0.1mg/Kg/天)相比，在切除垂体的大鼠中皮下给予单剂量的CTP-hGH-CTP-CTP(0.4mg/Kg、0.8mg/Kg和4mg/Kg)(n＝10每剂量)之后的平均增量增重的曲线图。
图6为显示在单独注射CTP-hGH-CTP-CTP后与大鼠体重增加相关联的曲线下的面积的曲线图。
图7为显示与每天GH注射(0.1mg/Kg/天)相比，在切除垂体的大鼠中每隔4天皮下给予各剂量的CTP-HGH-CTP-CTP(0.4mg/Kg、0.8mg/Kg和4mg/Kg)(n＝10每剂量)之后的增量增重曲线。
图8为显示在皮下注射CTP-HGH-CTP-CTP和商业化的hGH后，切除垂体的大鼠中的hGH血清浓度的曲线。将单剂量的CTP-hGH-CTP-CTP0.6mg/Kg或1.8mg/Kg和Biotropin0.35mg/Kg或1.05mg/Kg皮下注射到切除垂体的大鼠中，以确定PK/PD曲线。使用特异性ELISA试剂盒测量注射后的血清hGH。
图9为显示在皮下注射CTP-HGH-CTP-CTP和商业化的hGH后，切除垂体的大鼠中IGF-1血清水平的曲线图。将单剂量的CTP-hGH-CTP-CTP0.6mg/Kg或1.8mg/Kg和Biotropin0.35mg/Kg或1.05mg/Kg皮下注射到切除垂体的大鼠中，以确定PK/PD曲线。使用特异性ELISA试剂盒(Roche Diagnostics)测量注射后的血清IGF-1。
具体实施方式
在一个实施方式中，本发明提供一种长效生长激素以及生产和使用该长效生长激素的方法。在另一个实施方式中，长效生长激素包含羧基末端肽(CTP，也称为CTP单元)。在另一个实施方式中，长效多肽包含人绒毛膜***(hCG)的羧基末端肽(CTP)。在另一个实施方式中，CTP作为一种防止目的生长激素或多肽的降解的防护剂。在另一个实施方式中，CTP扩展目的生长激素或多肽的Cmax。在另一个实施方式中，CTP扩展目的生长激素或多肽的Tmax。在另一个实施方式中，CTP扩展目的生长激素或多肽的循环半衰期。在一些实施方式中，CTP增强目的生长激素或多肽的效力。
在其他实施方式中，本发明的工程化的目的生长激素或多肽包含连接到氨基末端的单个CTP和串联连接到羧基末端的两个CTP肽，其在生物学活性方面至少与非CTP修饰的目的生长激素或多肽等效。在其他实施方式中，本发明的工程化的目的生长激素或多肽包含连接到氨基末端的单个CTP和串联连接到羧基末端的两个CTP肽，其在药理学量度(如药代动力学和药效学)方面至少与非CTP修饰的目的生长激素或多肽等效。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种多肽，其包含生长激素以及连接到该生长激素的氨基末端的至少一个CTP肽和连接到该生长激素的羧基末端的至少两个绒毛膜***羧基末端肽。在另一个实施方式中，本发明提供了一种多肽，其包含连接到生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽和连接到该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***羧基末端肽。
在另一个实施方式中，在本文中术语“CTP肽”、“羧基末端肽”和“CTP序列”可互换地使用。在另一个实施方式中，羧基末端肽是全长CTP。在另一个实施方式中，羧基末端肽是截短的CTP。每种可能性都代表了本发明的单独的实施方式。
在另一个实施方式中，在本文中“信号序列”和“信号肽”可互换地使用。在另一个实施方式中，当“序列”涉及多核苷酸时，其可以指代编码部分(coding portion)。每种可能性都代表了本发明的单独的实施方式。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种多肽，其由生长激素、连接到该生长激素的氨基末端的单个绒毛膜***羧基末端肽和连接到该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***羧基末端肽构成。在另一个实施方式中，本发明提供了一种多肽，其由生长激素、连接到该生长激素的氨基末端的单个绒毛膜***羧基末端肽、连接到该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***羧基末端肽和连接到一个绒毛膜***羧基末端肽的氨基末端的信号肽构成。
在另一个实施方式中，与不具有CTP的相同生长激素相比，包含本文所描述的CTP的生长激素具有增强的体内生物学活性。在另一个实施方式中，与不具有CTP的相同生长激素相比，包含至少一个连接到其氨基末端的CTP和至少两个连接到其羧基末端的CTP的生长激素具有增强的体内生物学活性。在另一个实施方式中，与不具有CTP的相同生长激素相比，包含一个连接到其氨基末端的CTP和两个连接到其羧基末端的CTP的生长激素具有增强的体内生物学活性。
在另一个实施方式中，受试者是人类受试者。在另一个实施方式中，受试者是宠物。在另一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方式中，受试者是农畜。在另一个实施方式中，受试者是猴子。在另一个实施方式中，受试者是马。在另一个实施方式中，受试者是牛。在另一个实施方式中，受试者是小鼠。在另一个实施方式中，受试者是大鼠。在一个实施方式中，受试者是男性。在另一个实施方式中，受试者是女性。
在另一个实施方式中，本文所描述的CTP-生长激素-CTP-CTP的构型包含通过肽键连接到至少一个CTP单元的生长激素或其活性片段。在另一个实施方式中，本文所描述的CTP-生长激素-CTP-CTP包含通过肽键连接到至少一个CTP单元的生长激素或其活性片段，该至少一个CTP单元通过肽键连接到一个另外的CTP单元。在另一个实施方式中，本文所描述的多肽包含其生长激素片段和CTP单元和/或通过肽键相互连接的其片段。在另一个实施方式中，一种核酸分子编码本文所描述的包含生长激素和/或其片段以及CTP单元和/或其片段的多肽。
在另一个实施方式中，羧基末端肽(CTP)通过接头(linker)连接到生长激素。在另一个实施方式中，将CTP序列连接至生长激素的接头是共价键。在另一个实施方式中，将CTP序列连接到生长激素的接头是肽键。在另一个实施方式中，将CTP序列连接到生长激素的接头是被取代的肽键。在另一个实施方式中，羧基末端肽(CTP)序列包含选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，SEQ ID NO:1包含下列氨基酸(AA)序列：DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILQ(SEQ ID NO:1)。在另一个方式中，SEQ ID NO:2包含下列氨基酸(AA)序列：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:2)。
在另一个实施方式中，羧基末端肽(CTP)序列是截短的。在另一个实施方式中，截短的CTP包含下列氨基酸序列：SSSSKAPPPSLP(SEQ ID NO:4)。
在另一个实施方式中，本发明的羧基末端肽(CTP)的肽包含来自天然人类绒毛膜***肽的第112位～第145位氨基酸的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的CTP序列包含人类绒毛膜***肽的第118位～第145位氨基酸的氨基酸序列。在另一个实施方式中，CTP序列还从人类绒毛膜***肽的第112位～第118位中的任一位置开始并且在第145位终止。在一些实施方式中，CTP序列肽为28、29、30、31、32、33或34个氨基酸长并且从基因库保藏的CTP氨基酸序列的第112、113、114、115、116、117或118位开始。
在另一个实施方式中，CTP肽是在美国专利号中所描述的CTP肽，通过引用以其整体内容并入本文。在另一个实施方式中，CTP肽是绒毛膜***CTP的变异体，其如美国专利号US 5,712,122(通过引用以其整体内容并入本文)中描述的通过1～5个保守氨基酸替换而与天然CTP不同。在另一个实施方式中，CTP肽是绒毛膜***CTP的变异体，其通过1个保守氨基酸替换而与天然CTP不同。在另一个实施方式中，CTP肽是绒毛膜***CTP的变异体，其通过2个保守氨基酸替换而与天然CTP不同。在另一个实施方式中，CTP肽是绒毛膜***CTP的变异体，其通过3个保守氨基酸替换而与天然CTP不同。在另一个实施方式中，CTP肽是绒毛膜***CTP的变异体，其通过4个保守氨基酸替换而与天然CTP不同。在另一个实施方式中，CTP肽是绒毛膜***CTP的变异体，其通过5个保守氨基酸替换而与天然CTP不同。在另一个实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少70％同源。在另一个实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少80％同源。在另一个实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少90％同源。在另一个实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽至少95％同源。
在另一个实施方式中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人类CTP DNA序列或其肽至少70％同源。在另一个实施方式中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人类CTP DNA序列或其肽至少80％同源。在另一个实施方式中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人类CTP DNA序列或其肽至少90％同源。在另一个实施方式中，本发明的CTP肽DNA序列与天然人类CTP DNA序列或其肽至少95％同源。
在一个实施方式中，截短的CTP包含SEQ ID NO:4的最前的11个氨基酸。在一个实施方式中，截短的CTP包含SEQ ID NO:4的最前的8个氨基酸。在一个实施方式中，截短的CTP包含SEQ ID NO:4的最前的13个氨基酸。在一个实施方式中，截短的CTP包含SEQ ID NO:4的最前的6个氨基酸。在一个实施方式中，截短的CTP包含SEQ ID NO:4的最前的5个氨基酸。
在一个实施方式中，绒毛膜***CTP氨基酸序列中的至少一个是糖基化的。在另一个实施方式中，绒毛膜***CTP氨基酸序列两者都是糖基化的。在另一个实施方式中，绒毛膜***CTP氨基酸序列中的2个是糖基化的。在另一个实施方式中，绒毛膜***CTP氨基酸序列中的2个以上是糖基化的。在另一个实施方式中，所有绒毛膜***CTP氨基酸序列都是糖基化的。在一个实施方式中，本发明的CTP序列包含至少一个糖基化位点。在一个实施方式中，本发明的CTP序列包含2个糖基化位点。在一个实施方式中，本发明的CTP序列包含3个糖基化位点。在一个实施方式中，本发明的CTP序列包含4个糖基化位点。
在另一个实施方式中，至少一个羧基末端肽(CTP)序列包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所描述的序列的氨基酸序列。在另一个实施方式中，至少一个羧基末端肽(CTP)是截短的。
在一个实施方式中，当术语“端(termini)”、“末端(terminal)”涉及蛋白质或肽或其片段的羧基或氨基末端时，在本文中可以互换使用。在另一个实施方式中，术语“C-末端(C-terminal)”、“羧基末端(carboxy terminal)”或“羧基末端(carboxyl terminal)”在本文中可互换使用。在另一个实施方式中，“N-末端(N-terminal)”和“氨基末端(aminoterminal)”在本文中可互换使用。每种可能性都代表了本发明的一个独立的实施方式中。
在另一个实施方式中，在生长激素的氨基末端的CTP序列和在生长激素的羧基末端的CTP序列两者都提供了防止生长激素降解的增强防护。在另一个实施方式中，至少一个在生长激素的氨基末端的CTP序列和在生长激素的羧基末端中的两个CTP单元提供了防止清除的增强防护。在另一个实施方式中，至少一个在生长激素的氨基末端的CTP序列和在生长激素的羧基末端中的两个CTP单元提供了延长的清除时间。在另一个实施方式中，至少一个在生长激素的氨基末端的CTP序列和在生长激素的羧基末端中的两个CTP单元增强了生长激素的Cmax。在另一个实施方式中，至少一个在生长激素的氨基末端的CTP序列和在生长激素的羧基末端中的两个CTP单元增强了生长激素的Tmax。在另一个实施方式中，至少一个在生长激素的氨基末端的CTP序列和在生长激素的羧基末端中的两个CTP单元增强了生长激素的Tl/2(半衰期)。
在另一个实施方式中，在生长激素的氨基末端和在生长激素的羧基末端两者上的CTP序列都延长了该经修饰的生长激素的半衰期。在另一个实施方式中，至少在生长激素的氨基末端的单个CTP序列和至少两个在生长激素的羧基末端的CTP序列为该经修饰的生长激素提供了延长的半衰期。在另一个实施方式中，在生长激素的氨基末端的单个CTP序列和在生长激素的羧基末端的两个CTP序列为该经连接的(attached)生长激素提供了延长的半衰期。在另一个实施方式中，在生长激素的氨基末端的单个CTP序列和在生长激素的羧基末端的串联的两个CTP序列为该经修饰的生长激素提供了延长的半衰期。
在另一个实施方式中，在多肽的氨基末端的CTP序列、在生长激素的羧基末端的CTP序列、和串联地连接至在羧基末端的CTP序列的至少一个另外的CTP序列为生长激素提供了防降解的增强防护。在一些实施方式中，在生长激素氨基末端的CTP序列、在生长激素的羧基末端的CTP序列、和串联地连接至在羧基末端的CTP序列的至少一个另外的CTP序列延长了生长激素的半衰期。在一些实施方式中，在生长激素氨基末端的CTP序列、在生长激素的羧基末端的CTP序列、和串联地连接至在羧基末端的CTP序列的至少一个另外的CTP序列增强了生长激素的生物学活性。
在另一个实施方式中，生长激素进一步包含信号肽。在一些实施方式中，信号序列包括但不限于内源信号序列。在一些实施方式中，信号序列包括但不限于任何已知的生长激素或多种生长激素的内源信号序列。在另一个实施方式中，本发明的多肽和方法提供了另外具有信号肽的生长激素，该信号肽包含以下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(SEQ ID NO:3)。
在另一个实施方式中，以与未修饰的生长激素相同的方式使用本发明的结合的生长激素。在另一个实施方式中，本发明的结合的生长激素在活体内具有增加的循环半衰期和血浆停留时间、降低的清除率和提高的临床活性。在另一个实施方式中，由于本文中的结合的生长激素的改良的性质，较之未修饰的生长激素，较低频率给予这些结合物。在另一个实施方式中，本文所描述的结合生长激素给予每周一次至每两周一次。在另一个实施方式中，每两周一次至每三周一次给予本文所描述的结合的生长激素。在另一个实施方式中，每天一次至每周三次给予本文所描述的结合的生长激素。在另一个实施方式中，降低频率的给予将带来改善的患者依从性，从而提高治疗效果并提高患者的生活质量。在另一个实施方式中，已经发现，与连接至聚(乙二醇)的生长激素的常规结合物相比，具有本发明的结合物的分子量和接头结构的生长激素CTP结合物具有提高的效力、改善的稳定性、提高的AUC水平、提高的循环半衰期。在另一个实施方式中，已经发现，与连接至聚(乙二醇)的生长激素的常规结合物相比，具有本发明的结合物的分子量和接头结构的生长激素CTP结合物具有提高的效力、改善的稳定性、提高的AUC水平、提高的循环半衰期。在另一个实施方式中，结合的生长激素的治疗有效量是体内可测量的预期生物学活性所需的结合物的量。在另一个实施方式中，根据本发明的教导而利用的生长激素表现出提高的效力。在另一个实施方式中，将CTP序列连接至生长激素的氨基末端和羧基末端两者获得了延长的体内活性。
在另一个实施方式中，根据所接受治疗的病症的确切类型、所治疗的患者的病情以及组合物中的其他成分等因素来确定结合的生长激素的治疗有效量。在另一个实施方式中，结合的生长激素的治疗有效量为0.01～10μg/kg体重，每周给予一次。在另一个实施方式中，结合的生长激素的治疗有效量为0.1～1μg/kg体重，每周给予一次。在另一个实施方式中，以强有效于通过各种途径向人类患者给予的方式来配制包含结合的生长激素药物组合物。
在另一个实施方式中，生长激素是本领域技术人员已知的任何生长激素。在另一个实施方式中，生长激素是人类生长激素。在另一个实施方式中，可以在基因库数据库中获得生长激素的核苷酸序列和/或氨基酸序列。在另一个实施方式中，生长激素是同源物。在另一个实施方式中，同源物也指其缺失、***或替换(包括氨基酸替换)的变异体以及其具有生物学活性的多肽片段。
在另一个实施方式中，生长激素是缺少外显子2、3、4、或它们的任何组合的hGH的变异体。在另一个实施方式中，生长激素包含信号肽。在另一个实施方式中，生长激素包含信号切割位点。在另一个实施方式中，包含本发明的由CTP修饰的GH的多肽包含重组GH。
在另一个实施方式中，本文所描述的生长激素是生长激素(GH)-样细胞因子的超家族中的成员。在另一个实施方式中，本文所描述的生长激素是人类生长激素(hGH)。在另一个实施方式中，人类生长激素包含以下的氨基酸序列(Genbank登录号P01241)：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:5)。在另一个实施方式中，人类生长激素包含以下的氨基酸序列：MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCG F(SEQ ID NO:6)。在另一个实施方式中，人类生长激素包含以下的氨基酸序列：MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLA(SEQ ID NO:7)。在另一个实施方式中，hGH包含以下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKVQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:8)。在另一个实施方式中，hGH是其中hGH的第65位的谷氨酰胺被缬氨酸替换的替换变异体。
在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号AAA72260的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号AAK69708的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号CAA01435的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号CAA01329的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号CAA00380的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号AAA72555的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号NP_000506.2的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号NP_072053.1的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号NP_072054.1的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号NP_072055.1的基因库氨基酸保藏序列。在另一个实施方式中，本发明的生长激素包含登录号NP_072056.1的基因库氨基酸保藏序列。
在另一个实施方式中，编码本文的生长激素的核酸分子编码本领域技术人员已知的生长激素的任何氨基酸序列。在另一个实施方式中，编码本文所描述的生长激素的核酸分子编码hGH。在另一个实施方式中，编码生长激素的核酸分子包含登录号NM_000515.3的基因库核酸保藏序列。在另一个实施方式中，编码生长激素的核酸分子包含登录号NM_022559.2的基因库核酸保藏序列。在另一个实施方式中，编码生长激素的核酸分子包含登录号NM_022560.2的基因库核酸保藏序列。在另一个实施方式中，编码生长激素的核酸分子包含登录号NM_022561.2的基因库核酸保藏序列。在另一个实施方式中，编码生长激素的核酸分子包含登录号NM_022562.2的基因库核酸保藏序列。
在另一个实施方式中，包含本发明的生长激素的多肽包含连接到生长激素的羧基末端的一个CTP(hGH-CTP)并且具有如下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:9)。
在另一个实施方式中，包含本发明的生长激素的多肽包含串联地连接到生长激素的羧基末端的两个CTP(hGH-CTP-CTP)并且具有如下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:10)。
在另一个实施方式中，包含本发明的生长激素的多肽包含串联地连接到生长激素的羧基末端的两个CTP和连接到生长激素的氨基末端的一个CTP(CTP-hGH-CTP-CTP)并且具有如下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:11)。
在另一个实施方式中，包含本发明的生长激素的多肽包含串联地连接到生长激素的羧基末端的两个CTP(其中该两个CTP中的一个是截短的)和连接到生长激素的氨基末端的一个另外的CTP(tCTP-hGH-CTP-CTP)并且具有如下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:12)。
在另一个实施方式中，包含本发明的生长激素的多肽包含连接到生长激素的羧基末端的一个CTP和连接到生长激素的氨基末端的一个CTP(CTP-hGH-CTP)并且具有如下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:13)。
在另一个实施方式中，包含生长激素和一个CTP的多肽包含如下的氨基酸序列：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:14)。
在另一个实施方式中，编码具有CTP-hGH-CTP的多肽的多核苷酸分子包含以下的核酸序列：tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagttccccaccatccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgaggaagcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaacagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatccagaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgcagtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:15)。
在另一个实施方式中，编码具有CTP-hGH-CTP-CTP的多肽的多核苷酸分子包含以下的核酸序列：tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagttccccaccatccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgaggaagcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaacagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatccagaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgcagtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:16)。
在另一个实施方式中，编码具有CTP-hGH-CTP-CTP的多肽的多核苷酸分子包含以下的核酸序列：tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccgagcctgcccttccccaccatccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgagg aagcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaacagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatccagaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgcagtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:17)。
在另一个实施方式中，本发明的生长激素与已知的生长激素的序列是同源的。在另一个实施方式中，本发明的生长激素与本文所公开的生长激素序列是同源的。在一些实施方式中，根据本发明的同源性还涵盖其缺失、***或替换(包括氨基酸替换)的变异体以及其具有生物学活性的多肽片段。在一个实施方式中，替换变异体是其中hGH的第65位的谷氨酰胺被缬氨酸替换的变异体[Gellerfors et al.,J Pharm Biomed Anal 1989,7:173-83]。
在一个实施方式中，术语“人类生长激素”(hGH)是指表现出hGH活性的多肽(即，刺激生长)，如以Genbank登录号P01241列出的多肽。
在一个实施方式中，“人类生长激素”(hGH)是指表现出hGH活性的多肽(例如，刺激生长)的以Genbank登录号P01241列出的多肽。在一个实施方式中，本发明的hGH还指代同源物。在一个实施方式中，使用生物技术信息国家中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与GenBank登录号P01241所列出的hGH序列至少50％同源。在一个实施方式中，使用生物技术信息国家中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与GenBank登录号P01241所列出的hGH序列至少60％同源。在一个实施方式中，使用生物技术信息国家中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与GenBank登录号P01241所列出的hGH序列至少70％同源。在一个实施方式中，使用生物技术信息国家中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与GenBank登录号P01241所记载的hGH序列至少80％同源。在一个实施方式中，使用生物技术信息国家中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与GenBank登录号P01241所列出的hGH序列至少90％同源。在一个实施方式中，使用生物技术信息国家中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与GenBank登录号P01241所记载的hGH序列至少95％同源。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽结合脂肪细胞(adipocyte)并且刺激它们分解甘油三酯以及抑制它们摄取并累积循环脂质的能力。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽发挥主要由***-I(IGF-I)介导的间接作用(如实施例章节中所示的)。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽通过刺激肝脏和其他组织分泌IGF-I来刺激机体生长。在另一个实施方式中，IGF-I刺激软骨细胞的增殖，导致骨生长。在另一个实施方式中，IGF-I刺激骨骼肌细胞的增殖，导致肌肉生长。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽诱导对蛋白质、脂类和碳水化合物代谢的代谢作用。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽具有直接效应。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽通过诱导的IGF-I而具有间接效应。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽进一步包含前导肽。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽包括CTP截短的构建体。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽刺激组织中蛋白质合成代谢。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽刺激氨基酸摄取、增强蛋白质的合成并减少蛋白质的氧化。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽刺激脂肪代谢。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽通过刺激脂肪细胞中甘油三酯的分解和氧化来刺激脂肪的利用。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽减少体内脂肪。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽刺激碳水化合物代谢。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽将血糖维持在正常范围内。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽包含抗胰岛素活性。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽抑制胰岛素在外周组织中刺激葡萄糖摄取和在肝脏中提高葡萄糖的合成的能力。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽刺激导致高胰岛素血症的胰岛素分泌。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽用于补偿在受试者中有限产生或没有产生的生长激素。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽补偿有限产生或没有产生的生长激素释放激素(GHRH)。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽补偿生长抑素的活性增加。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽补偿有限产生或没有产生的胃饥饿素。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽用于治疗与下丘脑、垂体中或靶细胞中的病变相关的疾病。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽用于治疗与靶细胞对激素的降低的反应相关联的疾病。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽用于治疗患有严重生长迟缓的儿童。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽用于治疗病理性身材矮小的儿童。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽用于提高运动成绩。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的hGH的多肽用于治疗衰老症状。在另一个实施方式中，本发明的包含由CTP修饰的hGH的多肽用于治疗衰老的美容症状。
在另一个实施方式中，使用GH治疗GH缺乏的儿童引起生长增强，而使用GH治疗GH缺乏的成人时，引起瘦体质量(lean body mass)的增加并降低或减少体内脂肪。在另一个实施方式中，用CTP修饰形式的GH的治疗在儿童和成人中引起了这些效应的增强。在另一个实施方式中，当与每日接受相同剂量的商业化的未修饰的GH的GH-缺乏的儿童相比时，用CTP-修饰的hGH在GH-缺乏的儿童中的治疗引起了生长的增强。在另一个实施方式中，当与每日接受相同剂量的商业化的未修饰的GH的儿童相比时，使用CTP-修饰的hGH在儿童中的治疗引起了生长的增强。在另一个实施方式中，当与每日接受相同剂量的商业化的未修饰的GH的GH-缺乏的成人相比时，使用CTP-修饰的hGH在GH-缺乏的成人中的治疗引起了瘦体质量的增加和体内脂肪的减少。在另一个实施方式中，当与每日接受相同剂量的商业化的未修饰的GH的成人相比时，使用CTP-修饰的hGH在成人中的治疗引起了瘦体质量的增加和体内脂肪的减少。
在另一个实施方式中，本发明的包含由CTP修饰的hGH的多肽用于在雌性受试者中提高产奶量。在另一个实施方式中，本发明的CTP/牛GH结合物用于在乳牛中提高产奶量。在另一个实施方式中，本发明的CTP/动物GH构建体用于畜牧业技术。在另一个实施方式中，本发明的CTP/农畜GH构建体用于增强农畜的生长，例如但不局限于猪。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供包含由CTP修饰的hGH的多肽用于刺激肌肉生长、增加心脏功能、刺激骨骼生长、保持肌肉的完整性、平衡肌肉代谢、诱导肌肉积累、诱导从头肌肉积累、增强骨骼负荷、治疗与骨质疏松症有关的症状、治疗消耗性疾病、增加脂肪分解、改善体液平衡、治疗骨质疏松症、改善肺功能、提高免疫力、再生长重要器官、不断增加幸福感、恢复REM睡眠或它们的任何组合。在另一个实施方式中，本发明的方法提供包含由CTP修饰的hGH的多肽用于刺激肌肉生长、增加心脏功能、刺激骨骼生长、保持肌肉的完整性、平衡肌肉代谢、诱导肌肉积累、诱导从头肌肉积累、增强骨骼负荷、治疗与骨质疏松症有关的症状、治疗消耗性疾病、增加脂肪分解、改善体液平衡、治疗骨质疏松症、改善肺功能、提高免疫力、再生长重要器官、不断增加幸福感、恢复REM睡眠或它们的任何组合。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供用于治疗消耗性疾病、AIDS、恶病质(cachexia)或hGH缺乏症的hGH，其另外地具有在N-末端的至少一个CTP氨基酸肽和在C-末端的至少一个CTP氨基酸肽。在另一个实施方式中，本发明的方法提供用于治疗消耗性疾病、AIDS、恶病质或hGH缺乏症的多肽，其包含由CTP修饰的hGH。
在另一个实施方式中，本发明的人类生长激素多肽可以用来治疗患有与生长和体重相关的病症的受试者，病症如生长缺乏症、AIDS、消耗性疾病、衰老、HIV感染的受试者的免疫功能受损、分解代谢疾病、手术恢复、充血性心肌病、肝脏移植、肝切除后的肝再生、慢性肾功能衰竭、肾性骨营养不良、骨质疏松症、软骨发育不全/低软骨形成症、骨骼发育不良、慢性炎症或营养失调(例如克罗恩氏病)、短肠综合征、幼年慢性关节炎、囊性纤维化、***、X-连锁低磷性佝偻病、唐氏综合征(Down's syndrome)、脊柱裂、努南综合征(Noonan Syndrome)、肥胖症、肌肉力量受损和纤维肌痛。
在另一个实施方式中，本发明的人类生长激素多肽可以用来治疗患有多发性硬化症的受试者。在另一个实施方式中，本发明的人类生长激素多肽可以用来促进肥胖症受试者的减肥。在另一个实施方式中，本发明的人类生长激素多肽可以用来减少肥胖症受试者的体内脂肪。在另一个实施方式中，本发明的人类生长激素多肽可以用来增强受试者的瘦体质量。在另一个实施方式中，本发明的人类生长激素多肽可以用来治疗患有心脏衰竭、溃疡性结肠炎和烧伤的受试者。在另一个实施方式中，本发明的人类生长激素多肽可以用来建立肌肉(build muscle mass)。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供编码本文所描述的GH蛋白质的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的方法提供编码包含由CTP修饰的hGH的多肽的核酸序列，该多肽用于刺激肌肉生长、增加心脏功能、刺激骨骼生长、保持肌肉的完整性、平衡肌肉代谢、诱导肌肉积累、诱导从头肌肉积累、增强骨骼负荷、治疗与骨质疏松症有关的症状、治疗消耗性疾病、增加脂肪分解、改善体液平衡、治疗骨质疏松症、改善肺功能、提高免疫力、再生长重要器官、不断增加幸福感、恢复REM睡眠或它们的任何组合。
在一些实施方式中，根据本发明的教导利用人类生长激素(hGH)。在一些实施方式中，连接至hGH的氨基和羧基末端两者的CTP序列带来增强的效力(图2)。在一些实施方式中，连接至hGH的氨基和羧基末端两者的CTP序列带来延长的体内活性。
在一些实施方式中，本文所使用的“多肽”或“蛋白质”涵盖了天然多肽(或者降解产物、人工合成的合成多肽或重组多肽)和肽模拟物(拟肽)(通常为人工合成的合成多肽)以及类肽和半类肽(为多肽的类似物)，在一些实施方式中，类肽和半类肽为多肽的类似物具有使得多肽在身体中更加稳定或更加能够穿透进入细胞的修饰。
在一此实施方式中，修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、多肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰以及残基修饰。用于制备肽模拟物化合物的方法在本领域中众所周知，并且例如在Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin PergamonPress(1992)中有具体描述，其如同在本文进行了充分阐述一样通过引用而并入。关于本方面的进一步详细说明如下文。
在一些实施方式中，多肽中的多肽键(-CO-NH-)被替换。在一些实施方式中，多肽键被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)替换。在一些实施方式中，多肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)替换。在一些实施方式中，多肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-)替换。在一些实施方式中，多肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)替换，其中R为任何烷基，例如甲基，亚甲基氨基键(carba bonds)(-CH2-NH-)。在一些实施方式中，多肽键被羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)替换。在一些实施方式中，多肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)替换。在一些实施方式中，多肽键被烯属双键(-CH＝CH-)替换。在一些实施方式中，多肽键被反式酰胺键(retro amide bonds)(-NH-CO-)替换。在一些实施方式中，多肽键被多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)替换，其中R为自然地存在于碳原子上的“正常”侧链。在一些实施方式中，这些修饰可以在沿着多肽链的任何键上发生并且甚至同时在多个键(2～3个键)上发生。
在一些实施方式中，多肽的天然芳香族氨基酸(如Trp、Tyr和Phe)被替换为合成的非天然酸，如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(No1)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或O-甲基-Tyr。在一些实施方式中，本发明的多肽包括一种或多种修饰的氨基酸、或一种或多种非氨基酸单体(例如，脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施方式中，“氨基酸”或“氨基酸”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；通常在活体内在翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他非普通的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方式中，“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸。
在一些实施方式中，本发明的多肽被用在其中需要多肽为可溶形式的治疗中。在一些实施方式中，本发明的多肽包括一种或多种非天然的或天然的极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸和苏氨酸，丝氨酸和苏氨酸由于含有羟基的侧链而能够提高多肽的溶解性。
在一些实施方式中，以线性形式利用本发明的包含由CTP修饰的hGH的多肽，但是本领域技术人员可以理解，在环化不会严重干扰由CTP修饰的hGH的特性的情况下，也可以利用环化形式的生长激素。
在一些实施方式中，本发明的由CTP修饰的hGH是生化合成的，如通过使用标准的固相技术。在一些实施方式中，这些生化方法包括专属固相合成(exclusive solid phasesynthesis)、部分固相合成、片段缩合或经典的溶液合成。在一些实施方式中，当生长激素相对较短(约5-15kDa)和/或当不能通过重组技术产生(即，不是由核酸序列编码的)并由此涉及不同的化学品(chemistry)时，使用这些方法。
在一些实施方式中，由CTP修饰的hGH的固相合成步骤为本领域技术人员的熟知并且由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young,Solid Phase PolypeptideSyntheses(2nd Ed.,Pierce Chemical Company,1984)做了进一步的描述。在一些实施方式中，通过制备型高效液相色谱法来纯化所合成的多肽[Creighton T.(1983)Proteins,structures and molecular principles.WH Freeman and Co.N.Y.]，并且可以通过本领域技术人员所熟知的方法通过氨基酸测序来确认其组成。
在一些实施方式中，使用重组蛋白技术来生成本发明的由CTP修饰的hGH。在一些实施方式中，使用重组蛋白技术来生成相对较长的多肽(例如，长于18～25个氨基酸)。在一些实施方式中，使用重组蛋白技术来生成大量的本发明的由CTP修饰的hGH。在一些实施方式中，由Bitter et al.,(1987)Methods in Enzymol.153:516-544；Studier et al.(1990)Methods in Enzymol.185:60-89；Brisson et al.(1984)Nature 310:511-514；Takamatsu et al.(1987)EMBO J.6:307-311；Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3:1671-1680和Brogli et al.,(1984)Science 224:838-843；Gurley et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463所描述重组技术。
在另一个实施方式中，使用编码本发明的多肽的多核苷酸来合成本发明的由CTP修饰的hGH。在另一个实施方式中，将编码本发明的由CTP修饰的hGH的多核苷酸连接到(ligate into)表达载体中，该表达载体包含转录控制的顺式调控序列(例如，启动子序列)。在另一个实施方式中，顺式调控序列适合于引导本发明的生长激素的组成型表达。在另一个实施方式中，顺式调控序列适合于引导本发明的由CTP修饰的hGH的组织特异性表达。在另一个实施方式中，顺式调控序列适合于引导本发明的由CTP修饰的hGH的诱导型表达。
在另一个实施方式中，适合与本发明一起使用的组织特异性启动子包含在特定的细胞群中具有功能的序列，实例包括但不限于启动子，如肝特异性的启动子如白蛋白的启动子[Pinkert et al.,(1987)Genes Dev.1:268-277]；淋巴特异性启动子[Calame etal.,(1988)Adv.Immunol.43:235-275]；特别是T细胞受体[Winoto et al.,(1989)EMBOJ.8:729-733]和免疫球蛋白[Banerji et al.(1983)Cell 33729-740]的启动子；神经元特异性启动子，如神经丝蛋白启动子[Byrne et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477]；胰腺特异性启动子[Edlunch et al.(1985)Science230:912-916]；或乳腺特异性启动子，如乳清启动子(美国专利号US4,873,316和欧洲专利申请公开号264,166)。适合于与本发明一起使用的诱导型启动子包括例如四环素诱导型启动子(Srour,M.A.,etal.,2003.Thromb.Haemost.90:398-405)。
在一个实施方式中，短语“多核苷酸”是指以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如前述的组合)的形式分离并提供的单链或双链核酸序列。
在一个实施方式中，“互补多核苷酸序列”是指这样的序列，其是使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶逆转录信使RNA产生的。在一个实施方式中，序列可以使用DNA聚合酶在体内或体外随后进行扩增。
在一个实施方式中，“基因组核苷酸序列”是指源自(分离自)染色体的序列，因此其代表了染色体的一个连续部分。
在一个实施方式中，“复合多核苷酸序列”是指这样的序列，其至少部分地互补并且至少部分地是基因组。在一个实施方式中，复合序列可以包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列(exonal sequence)以及***在其间的一些内含子序列(intronicsequence)。在一个实施方式中，内含子序列可以是任何来源的，包括其他基因来源，并且典型地可包括保守的剪接信号序列。在一个实施方式中，内含子序列包括顺式作用的表达调控元件。
在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸是使用如实施例1中所描述的PCR技术或本领域技术人员已知的任何其他方法或步骤来制备的。在一个实施方式中，步骤包含两个不同的DNA序列的连接(参见例如，"Current Protocols in Molecular Biology",eds.Ausubel et al.,John Wiley&Sons,1992)。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸被***到表达载体中(即核酸构建体)以使重组多肽能够表达。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括另外的序列，其使得该载体适合于在原核生物中复制和整合。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括另外的序列，其使得该载体适合于在真核生物中复制和整合。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括穿梭载体，其使得该载体适合于在原核生物和真核生物中复制和整合。在另一个实施方式中，克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如，启动子和增强子)以及转录和翻译终止子(例如，多聚腺苷酸化信号)。
在一个实施方式中，可以使用各种原核细胞或真核细胞作为宿主表达***以表达本发明的由CTP修饰的hGH。在一些实施方式中，这些包括但不限于微生物，例如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；使用含有多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞***。
在另一个实施方式中，使用非细菌表达***(例如哺乳动物表达***，如CHO细胞)来表达本发明的生长激素。在一个实施方式中，用来在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸的表达载体是包含CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。在实施例1中描述了根据一个实施方式的pCI-dhfr载体的构建。
在另一个实施方式中，在本发明的细菌***中，取决于所表达的多肽的预期用途可以有利地选择若干表达载体。在一个实施方式中，需要大量的多肽。在一个实施方式中，引导表达高水平的蛋白质产物的载体可能作为与疏水性信号序列的融合体，该信号序列将所表达的产物导向至细菌的周质或培养基中，其中蛋白质产物如期望的容易地进行纯化。在一个实施方式中，以特异性切割位点工程化的特定融合蛋白有助于多肽的回收。在一个实施方式中，适合于此种操作的载体包括但不限于pET系列的大肠杆菌表达载体[Studieret al.,Methods in Enzymol.185:60-89(1990)]。
在一个实施方式中，使用了酵母表达***。在一个实施方式中，如美国专利申请号US 5,932,447中所公开的，在酵母中可以使用许多个含有组成型或诱导型启动子的载体。在另一个实施方式中，使用促进外源DNA序列整合进入到酵母染色体的载体。
在一个实施方式中，本发明的表达载体可以进一步包括另外的多核苷酸序列，其允许例如从单一的mRNA翻译的几种蛋白质，例如内部核糖体进入位点(IRES)和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列。
在另一个实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMTl、pNMT41、pNMT81(这些可以获自Invitrogen)、pCI(可以获自Promega)、pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV(这些可以获自Strategene)、pTRES(可以获自Clontech)以及它们的衍生物。
在另一个实施方式中，本发明使用了含有来自真核病毒(如逆转录病毒)的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，源自牛***状瘤病毒的载体包括pBV-lMTHA，而源自埃-巴二氏病毒(Epstein Bar virus)的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性的载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及在SV-40早期启动子、SV-40后期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或在真核细胞中显示对于表达有效的其他启动子的引导下允许表达蛋白质的任何其他载体。
在另一个实施方式中，重组病毒载体对于在活体内表达本发明的由CTP修饰的GH有用，因为它们提供了优势如横向感染和特异性靶向。在一个实施方式中，横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中所固有的，并且通过该过程单一感染的细胞产生许多子代病毒粒子，这些子代病毒粒子出芽并感染邻近细胞。在另一个实施方式中，结果是大面积迅速地被感染，其中大部分最初不是被原始病毒颗粒感染的。在一个实施方式中，产生的病毒载体无法横向扩散。在另一个实施方式中，如果所需的目的是将指定的基因只引入到局部数量的靶细胞中，那么这种特性是有用的。
在另一个实施方式中，可以使用各种方法将本发明的表达载体引入到细胞中。此类方法通常描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSprings Harbor Laboratory,New York(1989,1992)；Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)；Changet al.,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)；Vega et al.,GeneTargeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995)；Vectors:A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]中，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔以及使用重组病毒载体的感染。另外，对于正-负选择方法，参见美国专利号US 5,464,764和US 5,487,992。
在另一个实施方式中，通过病毒感染引入核酸相对于其他方法(如脂质体转染和电穿孔)提供了多种优势，因为通过病毒的传染性可以得到更高的转染效率。
在一个实施方式中，可以理解的是，还可以由采用上文描述的任何合适的给予模式给予至个体中的核酸构建体来表达本发明的由CTP修饰的GH(即体内基因治疗)。在一个实施方式中，通过合适的基因载体/方法(转染、转导、同源重组等)以及所需的表达***将核酸构建体引入到适合的细胞中，然后将修饰的细胞在培养基中扩增并返回到个体中(即离体基因治疗)。
在一个实施方式中，已经在动物模型中进行了使用生长激素的体内基因治疗。
在一个实施方式中，使用了植物表达载体。在一个实施方式中，由多个启动子驱动多肽编码序列的表达。在一些实施方式中，使用了病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson et al.,Nature 310:511-514(1984)]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu et al,EMBO J.6:307-311(1987)]。在另一个实施方式中，使用了植物启动子，如，例如，RUBISCO的小亚单元[Coruzzi et al,EMBO J.3:1671-1680(1984)；和Brogli etal,Science 224:838-843(1984)]，或热休克启动子，例如，大豆hspl7.5-E或hspl7.3-B[Gurley et al,Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一个实施方式中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔或本领域技术人员已知的其他技术来将构建体引入到植物细胞中。参见，例如，Weissbach&Weissbach[Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463(1988)]。本发明还可以使用本领域中众所周知的其他表达***，例如昆虫和哺乳动物宿主细胞***。
可以理解的是，除了含有用于转录和翻译所***的编码序列(编码多肽)所需的必要元件之外，本发明的表达构建体还可以包括工程化的序列以优化所表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产量或活性。
在一些实施方式中，可以使用多种方法来将本发明的表达载体引入到宿主细胞***中。在一些实施方式中，此类方法通常描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992)；Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)；Chang et al.,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)；Vega et al.,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Surveyof Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa et at.[Bio techniques 4(6):504-512,1986]中，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔以及使用重组病毒载体的感染。另外，对于正-负选择方法，参见美国专利号US 5,464,764和US 5,487,992。
在一个实施方式中，在有效条件下培养转化细胞，该有效条件允许表达大量的重组多肽。在另一个实施方式中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方式中，有效培养基是指在其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在另一个实施方式中，培养基典型地包括具有可同化的碳源、氮源和磷源、以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养物质(如维生素)的水溶液。在另一个实施方式中，本发明的细胞可以培养于传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定板和陪替氏平皿中。在另一个实施方式中，培养是在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行的。在另一个实施方式中，培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。
在另一个实施方式中，取决于用于生产的载体和宿主***，所得到的本发明的生长激素保留在该重组细胞中、分泌到发酵培养基中、分泌到两个细胞膜之间的空间中(例如大肠杆菌的周质空间)；或者保留在细胞或病毒膜的外表面。
在一个实施方式中，在培养预定的时间之后，进行重组多肽的回收。
在一个实施方式中，本文中使用的短语“回收重组多肽”是指收集含有该多肽的全部发酵培养基并且并不意味着需要另外的分离或纯化的步骤。
在一个实施方式中，采用各种标准的蛋白质纯化技术来纯化本发明的生长激素，例如但不限于亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、刀豆蛋白A色谱法、色谱聚焦和微分溶解。
在一个实施方式中，为了便于回收，可以将所表达的编码序列进行工程化以编码本发明的多肽并且融合可裂解部分。在一个实施方式中，可以设计融合蛋白质使得可以通过亲和色谱法容易地分离多肽；例如，通过固定在对可裂解部分特异的柱上。在一个实施方式中，将切割位点设计在该多肽与该可裂解部分之间，由此通过使用在该位点特异地切割融合蛋白质的适合的酶或药剂进行处理，可以从色谱柱上释放多肽[例如参见Booth etal.,Immunol.Lett.19:65-70(1988)；和Gardella et al,J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)]。
在一个实施方式中，本发明的多肽是以“基本上纯的(substantially pure)”形式回收的。
在一个实施方式中，短语“基本上纯的”是指纯度允许在本文所描述的应用中有效使用蛋白质。
在一个实施方式中，也可以使用体外表达***来合成本发明的多肽。在一个实施方式中，体外合成方法是本领域众所周知的并且该***的组分是可以商业购的。
在一个实施方式中，使用重组DNA技术来进行由CTP修饰的GH的生产。
在另一个实施方式中，合成并纯化了重组多肽；可以在体内或体外测定它们的治疗效力。在一个实施方式中，可以使用各种测定方法来确定本发明的由CTP修饰的重组GH的结合活性。
在一个实施方式中，本发明包含CTP-hGH-CTP-CTP多肽。在一个实施方式中，使用重组DNA技术方法来生产CTP-hGH-CTP-CTP，如实施例1所示。在一个实施方式中，本发明的CTP-hGH-CTP-CTP多肽的治疗效力是在体内测定的。在一个实施方式中，本发明的CTP-hGH-CTP-CTP多肽的治疗效力是在体外测定的。在一个实施方式中，本发明的重组hGH多肽的结合活性是使用预先用人生长激素受体转染的Nb2(催乳激素依赖性大鼠淋巴瘤细胞系(ECACC细胞库))或FCD-P1鼠细胞系来测量的。在一个实施方式中，hGH与这些受体的结合诱导细胞增殖，这在一个实施方式中通过作为hGH活性的函数的MTT细胞染色的水平来测量的。在一个实施方式中，通过测量经治疗的生长激素缺乏症的动物中随时间的体重增加来推断体内活性的。
在一个实施方式中，发明提供了一种在受试者中诱导生长或体重增加的方法，包括向该受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接至所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在受试者中诱导生长或体重增加。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中诱导生长的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接至所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在所述受试者中诱导生长。在一个实施方式中，所述人类受试者是青少年。在另一个实施方式中，所述人类受试者是儿童。在另一个实施方式中，人类受试者是GH-缺乏症儿童。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中诱导体重增加的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接至所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在所述受试者中诱导体重增加。在一个实施方式中，所述人类受试者是青少年。在另一个实施方式中，所述人类受试者是儿童。在另一个实施方式中，人类受试者是GH-缺乏症儿童。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中诱导体重减轻或减少体内脂肪的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接至所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在所述受试者中诱导体重减轻或减少体内脂肪。在一个实施方式中，所述受试者是肥胖者。在另一个实施方式中，所述受试者是超重者。在另一个实施方式中，人类受试者是成人。在另一个实施方式中，人类受试者是GH-缺乏症成人。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在受试者中减少脂肪沉积的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了一种在受试者中增加肌肉质量的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了一种在受试者中促进肌肉生长的方法。在另一个实施方式中，人类受试者是成人。在另一个实施方式中，人类受试者是GH-缺乏症成人。在另一个实施方式中，本发明提供了提高肌肉与脂肪的比率的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了一种降低身体质量指数(BMI)或克托莱指数(Quetelet index)的方法。
在另一个实施方式中，本文提供了一种在受试者中诱导生长的方法，包括向受试者给予本文所描述的由CTP修饰的生长激素。在一个实施方式中，将CTP-修饰的生长激素直接给予至受试者，而在另一个实施方式中，将编码所述CTP-修饰的生长激素的多核苷酸给予到受试者。在另一个实施方式中，本文提供了一种在受试者中诱导生长的方法，包括向受试者给予由已知赋形剂、已知载体(vehicle)和多肽构成的组合物，该多肽包含生长激素、连接至该生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***羧基末端肽。在另一个实施方式中，本文提供了一种在受试者中诱导生长的方法，包括向受试者给予由已知赋形剂、已知载体和多肽构成的组合物，该多肽由生长激素、连接至该生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***羧基末端肽构成。
在另一个实施方式中，通过体重增加来测量生长。在另一个实施方式中，通过身高增长来测量生长。在另一个实施方式中，通过体重增加来测量生长。在另一个实施方式中，通过肌肉质量增加来测量生长。在另一个实施方式中，通过体重增加来测量生长。在另一个实施方式中，通过骨骼质量增加来测量生长。在另一个实施方式中，通过体重增加来测量生长。在另一个实施方式中，通过脂肪增加来测量生长。在另一个实施方式中，通过本领域技术人员已知的任何已知量度来测量生长。在另一个实施方式中，其中测量生长的受试者是儿童。在另一个实施方式中，其中测量生长的受试者是GH-缺乏症儿童。
在另一个实施方式中，以1～90微克在0.1～5ml的溶液中的剂量来给予本发明的包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的GH的多肽是以1～50微克于0.1～5ml的溶液中的剂量来给予的。在另一个实施方式中，以1～25微克在0.1～5ml的溶液中的剂量来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，以50～90微克在0.1～5ml的溶液中的剂量来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，以10～50微克在0.1～5ml的溶液中的剂量来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。
在另一个实施方式中，以1～90微克在0.1～5ml的溶液中的剂量，每周一次，通过肌内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，以1～90微克在0.1～5ml的溶液中的剂量，每周两次，通过肌内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，以1～90微克在0.1～5ml的溶液中的剂量，每周三次，通过肌内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，以1～90微克在0.1～5ml的溶液中的剂量，每两周一次，通过肌内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，以1～90微克于0.1～5ml的溶液中的剂量，每17天一次，通过肌内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。在另一个实施方式中，以1～90微克于0.1～5ml的溶液中的剂量，每19天一次，通过肌内(IM)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射来给予包含由CTP修饰的GH的多肽。
在另一个实施方式中，分子量低于50,000道尔顿(dalton)的蛋白质药物(如本发明的由CTP修饰的GH)一般来说在体内是短命物种，具有几个小时的短循环半衰期。在另一个实施方式中，皮下给予途径一般提供了较慢的向循环的释放。在另一个实施方式中，本发明的CTP修饰的多肽延长了分子量低于50,000道尔顿的蛋白质药物(例如GH)的半衰期。在另一个实施方式中，本发明的CTP修饰的多肽使得GH能够在更长的时间段内发挥期有益效果。
在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的GH的CTP修饰多肽的免疫原性与分离的GH相等。在另一个实施方式中，包含由CTP修饰的GH的CTP修饰多肽的免疫原性可以与分离的GH相当。在另一个实施方式中，用CTP肽修饰本文所描述的GH降低了GH的免疫原性。在另一个实施方式中，包含GH的CTP修饰多肽的活性与分离的GH肽相同。在另一个实施方式中，包含GH的CTP修饰多肽比分离的GH更具活性。在另一个实施方式中，包含GH的CTP修饰多肽使得该生长激素的防降解的防护能力最大化，并同时使得生物学活性的降低最小化。
在另一个实施方式中，将本发明的由CTP修饰的GH本身(per se)提供给个体。在一个实施方式中，将本发明的由CTP修饰的GH作为药物组合物的一部分提供给个体，在该药物组合物中，由CTP修饰的GH与药学上可接受的载体混合。
在另一个实施方式中，“药物组合物”是指本文所描述的一种或多种活性成分与其他化学组分(如生理上适宜的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的用途是便于将化合物给予至有机体。
在另一个实施方式中，“活性成分”是指目的多肽序列，其提供出的生物学效应。
在一个实施方式中，本发明提供组合制剂(combined preparation)。在一个实施方式中，“组合制剂”尤其限定一种“部分试剂盒(kit of parts)”，在这个意义上，如上限定的组合搭配(combination partner)可以单独地或者通过使用与不同量的组合搭配的不同固定组合，即同时地、并行地、分别地或顺序地给药。在另一个实施方式中，部分试剂盒的各部分可以随后例如同时地给予或按时间顺序交错地给予，即在不同的时间点并且以相等或不同的时间间隔来给予部分试剂盒的任何部分。组合搭配的总量的比率可以施用在组合制剂中。组合制剂可以由本领域技术人员容易地做出改变，例如，为了应对待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，这些不同的需要可能是由特定疾病、疾病的严重程度、年龄、性别或体重带来的。
在另一个实施方式中，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会给生物体带来显著刺激且不会消除所施用的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。佐剂也包括在这些短语中。在一个实施方式中，包括于药学上可接受的载体中的成分之一可以是例如聚乙二醇(PEG)，其为一种在有机和水介质中都具有宽范围的溶解度的生物相容性聚合物(Mutter et al.(1979))。
在另一个实施方式中，“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步便于给予活性成分的惰性物质。在一个实施方式中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制药物和给予药物的技术可以在最新版本的"Remington'sPharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA中找到，通过引用将其并入本文。
在另一个实施方式中，适合的给予途径，例如包括口服、经直肠、经粘膜、经鼻、经肠或肠胃外递送，该肠胃外递送包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
在另一个实施方式中，以局部而非全身性的方式给予制剂，例如，通过将制剂直接注射到患者身体的特定区域中。
本发明构想了各种剂量范围的实施方式。在一个实施方式中，本发明的由CTP修饰的GH的剂量在0.005mg/天～100mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.005mg/天～5mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.01mg/天～50mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.1mg/天～20mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.1mg/天～10mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.01mg/天～5mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.001mg/天～0.01mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.001mg/天～0.1mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.1mg/天～5mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.5mg/天～50mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.2mg/天～15mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.8mg/天～65mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在1mg/天～50mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在5mg/天～10mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在8mg/天～15mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在10mg/天～20mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在20mg/天～40mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在60mg/天～120mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在12mg/天～40mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在40mg/天～60mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在50mg/天～l00mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在1mg/天～60mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在15mg/天～25mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在5mg/天～10mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在55mg/天～65mg/天的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在1mg/天～5mg/天的范围内。
在一个实施方式中，本发明的由CTP修饰的GH的剂量在0.005mg/周～100mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.005mg/周～5mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.01mg/周～50mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.05mg/周～7.2mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.05mg/周～7.2mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.05mg/周～7.2mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.1mg/周～20mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.1mg/周～10mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.01mg/周～5mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.001mg/周～0.01mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.001mg/周～0.1mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.1mg/周～5mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.5mg/周～50mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.2mg/周～15mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.26mg/周～10.7mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在0.8mg/周～65mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在1～50mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在5mg/周～10mg/ 周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在8mg/周～15mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在10mg/周～20mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在20mg/周～40mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在60mg/周～120mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在12mg/周～40mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在40mg/周～60mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在50～100mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在1mg/周～60mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在15mg/周～25mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在5mg/周～10mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在55mg/周～65mg/周的范围内。在另一个实施方式中，该剂量在1mg/周～5mg/周的范围内。
在另一个实施方式中，提供给受试者的GH剂量是提供给来自同一受试者群体(例如儿童、老人、男人、女人、GH缺乏者、具体国籍等)的参考受试者的标准剂量的50％。在另一个实施方式中，该剂量是提供给来自特定受试者群体的受试者的剂量的30％。在另一个实施方式中，该剂量是提供给来自特定受试者群体的受试者的剂量的45％。在另一个实施方式中，该剂量是提供给来自特定受试者群体的受试者的剂量的100％。
在另一个实施方式中，剂量为1mg/周～5mg/周。在另一个实施方式中，剂量为2mg/周。在另一个实施方式中，剂量为4mg/周。在另一个实施方式中，剂量为1.2mg/周。在另一个实施方式中，剂量为1.8mg/周。在另一个实施方式中，剂量大约为本文中所描述的剂量。
在另一个实施方式中，剂量为1-5mg/给予。在另一个实施方式中，剂量为2mg/给予。在另一个实施方式中，剂量为4mg/给予。在另一个实施方式中，剂量为1.2mg/给予。在另一个实施方式中，剂量为1.8mg/给予。在一个实施方式中，组合物每周给予一次。在另一个实施方式中，组合物每两周给予一次。在另一个实施方式中，组合物每月给予一次。在另一个实施方式中，组合物每天给予一次。
在另一个实施方式中，将由CTP修饰的GH配制为鼻内剂型。在另一个实施方式中，将由CTP修饰的GH配制为注射剂型。在另一个实施方式中，以范围为0.0001mg至0.6mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为0.001mg至0.005mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为0.005mg至0.01mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为0.01mg至0.3mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为0.2mg至0.6mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。
在另一个实施方式中，以范围为1微克至100微克的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为10微克至80微克的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为20微克至60微克的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为10微克至50微克的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为40微克至80微克的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为10微克至30微克的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为30微克至60微克的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。
在另一个实施方式中，以范围为0.2mg至2mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为2mg至6mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为4mg至10mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。在另一个实施方式中，以范围为5mg至15mg的剂量将由CTP修饰的GH给予受试者。
在另一个实施方式中，将由CTP修饰的GH注射到肌肉中(肌内注射)。在另一个实施方式中，将由CTP修饰的GH注射于皮肤以下(皮下注射)。在另一个实施方式中，将由CTP修饰的GH注射到肌肉中。在另一个实施方式中，将由CTP修饰的GH注射于皮肤以下。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括提高在使用GH治疗中的依从性，包括向需要其的受试者提供由CTP修饰的GH，由此提高在使用生长激素治疗中的依从性。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括提高需要GH治疗的患有慢性疾病的患者的依从性。在另一个实施方式中，本发明的方法通过如上文所描述的使用CTP修饰GH从而能够降低该GH的给药频率。在另一个实施方式中，术语“依从性”包含顺从性(adherence)。在另一个实施方式中，本发明的方法包括通过降低GH的给予频率而提高需要GH治疗的患者的依从性。在另一个实施方式中，GH的给予频率的降低是通过CTP修饰来实现的，该修饰使得CTP-修饰的GH更加稳定。在另一个实施方式中，GH的给予频率的降低是由于延长了该生长激素的T1/2而实现的。在另一个实施方式中，GH的给予频率的降低是由于延长了该GH的清除时间而实现的。在另一个实施方式中，生长激素的给予频率的降低是由于增加了该生长激素的AUC量度而实现的。
因此，在另一个实施方式中，本发明进一步提供了一种提高生长激素的曲线下面积(AUC)的方法，包括将一个绒毛膜***羧基末端肽连接至该生长激素的氨基末端和将两个绒毛膜***羧基末端肽连接至该生长激素的羧基末端的步骤，由此提高生长激素的曲线下面积(AUC).
因此，在另一个实施方式中，本发明进一步提供了一种降低生长激素的给药频率的方法，包括将一个绒毛膜***羧基末端肽连接至该生长激素的氨基末端和将两个绒毛膜***羧基末端肽连接至该生长激素的羧基末端的步骤，由此降低生长激素的给药频率。
因此，在另一个实施方式中，本发明提供了一种提高在需要其的受试者中使用生长激素治疗中的依从性，包括向所述受试者提供多肽，该多肽包含生长激素、连接至所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***羧基末端肽，从而提高在使用生长激素治疗中的依从性。在一个实施方式中，所述受试者是人类。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中提高***(IGF-1)的水平的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接至所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在所述受试者中提高IGF-1水平。在另一个实施方式中，在以下实施例6中提供了提高IGF-1水平的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种在人类受试者中将***(IGF-1)水平提高至所需的治疗范围的方法，包括向该受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接至该生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，从而在该受试者中将IGF-1水平提高至所需的治疗范围。在另一个实施方式中，人类受试者是成人。在另一个实施方式中，人类受试者是GH-缺乏症成人。在另一个实施方式中，人类受试者是正常成人。在另一个实施方式中，在下文实施例9中提供了将IGF-1水平提高至所需治疗水平的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在受试者中将***(IGF-1)水平维持在正常治疗范围内的方法，包括向该受试者给予治疗有效量的多肽，该多肽包含生长激素、连接至该生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)、和连接至该生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，由此在该受试者中将IGF-I水平维持在正常治疗范围内。在另一个实施方式中，在下文实施例9中提供了将IGF-1水平维持在正常治疗水平内的方法。
在一个实施方式中，在人类受试者中提高IGF-1水平可以在治疗、预防或抑制1型糖尿病、2型糖尿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS又名“卢伽雷氏病”)、严重烧伤和强直性肌营养不良症(MMD)中有效。在另一个实施方式中，在人类受试者中将IGF-1水平维持在正常治疗范围内可以在治疗、预防或抑制1型糖尿病、2型糖尿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS又名“卢伽雷氏病”)、严重烧伤和强直性肌营养不良症(MMD)中有效。
在一个实施方式中，如下文中进一步所提供的(参见实施例9)，将所需的治疗范围限定为在+/-2个标准偏差之间，通过从在正常人群中预期的平均IGF-1水平-2标准偏差，按年龄组别和性别分层。另外，为了观察在正常范围内的患者的方差的目的，试验测量的IGF-1水平处在+/-1.5个标准偏差的窄范围内(参见下文实施例9)。
在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予包含由CTP修饰的GH的多肽，每两天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每三天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每四天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每五天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每六天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每周一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每7～14天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每10～20天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每5～15天一次。在另一个实施方式中，向受试者给予由CTP修饰的GH，每15～30天一次。
在另一个实施方式中，剂量在50mg/天～500mg/天的范围内。在另一个实施方式中，剂量在50mg/天～150mg/天的范围内。在另一个实施方式中，剂量在100mg/天～200mg/天的范围内。在另一个实施方式中，剂量在150mg/天～250mg/天的范围内。在另一个实施方式中，剂量在200mg/天～300mg/天的范围内。在另一个实施方式中，剂量在250mg/天～400mg/天的范围内。在另一个实施方式中，剂量在300mg/天～500mg/天的范围内。在另一个实施方式中，剂量在350mg/天～500mg/天的范围内。
在一个实施方式中，剂量为20mg/天。在一个实施方式中，剂量为30mg/天。在一个实施方式中，剂量为40mg/天。在一个实施方式中，剂量为50mg/天。在一个实施方式中，剂量为0.01mg/天。在另一个实施方式中，剂量为0.1mg/天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/天。在另一个实施方式中，剂量为0.530mg/天。在另一个实施方式中，剂量为0.05mg/天。在另一个实施方式中，剂量为50mg/天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/天。在另一个实施方式中，剂量为20-70mg/天。在另一个实施方式中，剂量为5mg/天。
在另一个实施方式中，剂量为1mg/天～90mg/天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/2天～90mg/2天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/3天～90mg/3天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/4天～90mg/4天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/5天～90mg/5天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/6天～90mg/6天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/周～90mg/周。在另一个实施方式中，剂量为1mg/9天～90mg/9天。在另一个实施方式中，剂量为1mg/11天～90mg/11天。在另一个实施方式中，剂量为1～90mg/14天。
在另一个实施方式中，生长激素的剂量为10mg/天-50mg/天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/2天-50mg/2天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/3天-50mg/3天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/4天-50mg/4天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/5天-50mg/5天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/6天-50mg/6天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/周-50mg/周。在另一个实施方式中，剂量为10mg/9天-50mg/9天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/11天-50mg/11天。在另一个实施方式中，剂量为10mg/14天-50mg/14天。
在一个实施方式中，口服给予包含单元剂型，该单元剂型包含片剂、胶囊剂、锭剂、咀嚼片、混悬剂、乳剂等。此类单元剂型包含安全且有效量的所需的本发明的生长激素，其中的每一个在一个实施方式中为从约0.75mg/70kg或3.5mg/70kg至约280mg/70kg，或在另一个实施方式中，约0.5mg/70kg或10mg/70kg至约210mg/70kg。适合于口服给予用的单元剂型的制剂的药学上可接受的载体在本领域中众所周知。在一些实施方式中，片剂典型地包含作为惰性稀释剂的常规的药学相容的佐剂，如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂，如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂，如淀粉、藻酸和联羧甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石粉。在一个实施方式中，助流剂(glidant)(如二氧化硅)可以用来提高粉末-混合物的流动特性。在一个实施方式中，可以为了外观而添加着色剂，如FD&C染料。甜味剂和调味剂，如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷油以及水果香精，是有用于咀嚼片剂的佐剂。胶囊剂典型地包含一种或多种以上公开的固体稀释剂。在一些实施方式中，载体组分的选择取决于次要考虑，如口味、成本和储存稳定性，这对本发明的目的而言不是关键，并且可以由本领域技术人员容易地做出选择。
在一个实施方式中，口服剂型包含预定的释放曲线(release profile)。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包含延长释放的片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包含缓释片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包含立即释放的片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方式中，是根据本领域技术人员已知的药物活性成分的所需释放曲线来配制口服剂型。
在一些实施方式中，口服组合物包含液体溶液剂、乳剂、混悬剂等。在一些实施方式中，适合于此类组合物的制剂的药学上可接受的载体在本领域中是众所周知的。在一些实施方式中，液体口服组合物包含约0.001％至约0.933％所需的一种或多种化合物，或在另一个实施方式中，为约0.01％约10％。
在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的组合物包括溶液剂或乳剂，这在一些实施方式中是包含安全且有效量的本发明的化合物和可选地用于局部经鼻给予的其他化合物的水溶液剂或乳剂。在一些实施方式中，组合物包含约0.001％～约10.0％w/v的由CTP修饰的GH，更优选为约00.1％～约2.0％，其用于通过鼻内途径全身递送化合物。
在另一个实施方式中，药物组合物是通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂来给予的。在一些实施方式中，液体制剂包括溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施方式中，药物组合物是静脉内给予的，并因此配制为适合于静脉内给予的形式。在另一个实施方式中，药物组合物是动脉内给予的，并因此配制为适合于动脉内给予的形式。在另一个实施方式中，药物组合物是肌内给予的，并因此配制为适合于肌内给予的形式。
进一步地，在另一个实施方式中，药物组合物局部地施用到身体表面，并因此配制为适合于局部给予的形式。适合的局部制剂包括凝胶剂、软膏剂、霜剂、洗剂、滴剂等。对于局部给予，将本发明的化合物与另外的适合的一种或多种治疗剂组合、制备且应用为处于具有或不具有药物载体的生理学上可接受的稀释剂中的溶液剂、混悬剂或乳剂。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物是通过本领域中众所周知的工艺来制造的，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包封、包埋或冻干工艺。
在一个实施方式中，以常规方式使用一种或多种包含赋形剂和助剂的生理学上可接受的载体来配制根据本发明使用的药物组合物，这有助于将活性成分加工成可药用使用的制剂。在一个实施方式中，制剂取决于所选择的给予途径。
在一个实施方式中，将本发明的可注射剂(injectable)配制为水溶液。在一个实施方式中，将本发明的可注射剂配制在生理相容性缓冲液如汉克氏溶液、林格氏溶液、或生理盐水缓冲液中。在一些实施方式中，为了经粘膜给予，在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的。
在一个实施方式中，配制本文所描述的制剂用于肠胃外给予，例如通过大剂量注射或连续输注。在一些实施方式中，用于注射的制剂以单元剂型存在，例如安瓿剂或存在于具有可选加入的防腐剂的多剂量容器中。在一些实施方式中，组合物是处于油性或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且含有配制用试剂如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。
在一些实施方式中，组合物还包含防腐剂，如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，如依地酸钠(edetate sodium)等；缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐；张度剂，如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂，如抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，如聚合物，包括纤维素及其衍生物；和聚乙烯醇以及所需的用于调节这些含水组合物的pH的酸和碱。在一些实施方式中，组合物还包含局部麻醉剂或其他活性物质。组合物可以作为喷雾剂、合剂(mist)、滴剂等使用。
在一些实施方式中，用于肠胃外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，在一些实施方式中，活性成分的混悬剂被制备为适当的油性或水性注射混悬剂。在一些实施方式中，合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体)。在一些实施方式中，水性注射混悬剂含有增加混悬剂的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。在另一个实施方式中，悬浮液剂还含有适合的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂以允许制备高浓缩溶液。
在另一个实施方式中，活性化合物可以以囊泡递送，特别是脂质体(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat et al.,in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；一般参见同前)。
在另一个实施方式中，配制在控释***中递送的药物组合物用于静脉内输注、植入式渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其他的给予模式。在一个实施方式中，使用泵(参加Langer,supra；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)；Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989)。在另一个实施方式中，可以使用聚合材料。在又另一个实施方式中，可以接近治疗靶标(即大脑)放置控释***，因而只需要全身剂量的一小部分(参见，例如，Goodson,in Medical Applications ofControlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984)。Langer通过综述讨论了其他的控释***(Science 249:1527-1533(1990)。
在一些实施方式中，在使用前活性成分为用于与适合的载体(例如无菌、无热原水基溶液)进行组合的粉末形式。在一些实施方式中，配制组合物用于雾化给予和吸入给予。在另一个实施方式中，将组合物包含在具有随附的雾化装置的容器中。
在一个实施方式中，将本发明的制剂配制为直肠组合物，如，例如使用常规栓剂基质(如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂。
在另一个实施方式中，适合在本发明的上下文中使用的药物组合物包括其中以有效于达到预定目的的量含有活性成分的组合物。在另一个实施方式中，治疗有效量是指活性成分的量对于预防、缓解或改善疾病症状或延长被治疗的受试者的存活期有效。
在一个实施方式中，治疗有效量的确定完全处于本领域技术人员的能力范围内。
可以用作药学上可接受的载体或其组分的物质的一些实例是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽糖(malt)；明胶；滑石粉；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可(theobroma)油；多元醇，如丙二醇、丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；藻酸；乳化剂，如TweenTM牌乳化剂；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；制片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水；和磷酸盐缓冲液。与化合物配合使用的药学上可接受的载体的选择基本上由化合物的给予方式来确定的。在一个实施方式中，如果本发明的化合物是用于注射地，那么药学上可接受的载体是具有血液相容性助悬剂的无菌生理盐水，其pH已调节至约7.4。
另外，组合物进一步包含粘合剂(例如***胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、淀粉羟基乙酸钠)、各种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCL、乙酸盐、磷酸盐)、用以防止吸附于表面的添加剂如白蛋白或明胶、去垢剂(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(例如甘油、聚甘油)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基苯甲醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如卡波姆、胶态二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(例如硫柳汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)、流动助剂(例如胶体二氧化硅)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)、聚合物涂层(例如泊洛沙姆或泊洛沙)、涂层和膜形成剂(例如乙基纤维素，丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
用于糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬剂的载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于混悬剂，典型的助悬剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维素(例如AvicelTM,RC-591)、黄蓍胶和藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚氧化乙烯山梨糖醇(例如聚山梨酯80)。典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一个实施方式中，口服的液体组合物还含有一种或多种以上公开的组分，如甜味剂、调味剂和着色剂。
组合物还包括将活性材料掺入至聚合化合物(例如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等)的颗粒制剂内或上，或者掺入到脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。此类组合物将影响物理状态、溶解性、稳定性、体内的释放速率和体内清除的速率。
本发明还包括的是用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙)包衣的颗粒组合物以及偶联至靶向组织特异性受体、配体或抗原的抗体的化合物或者偶联至组织特异性受体的配体的化合物。
在另一个实施方式中，通过共价连接水溶性聚合物(例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸)来修饰化合物。在另一个实施方式中，在静脉内注射后，经修饰的化合物在血液中表现出比相应未修饰的化合物显著延长的半衰期。在一个实施方式中，修饰还增加了化合物在水溶液中的溶解度、消除了聚集、增加了化合物的物理化学稳定性并且极大地降低了化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施方式中，所需的体内生物学活性是通过以比未修饰的化合物更低的频率或以更低的剂量给予此类聚合物-化合物结合物(abduct)来实现的。
在另一个实施方式中，最初可以从体外测定来估算制剂的有效量或剂量。在一个实施方式中，可以在动物模型中配制剂量并且此类信息可以用来更加准确地确定人类中有用的剂量。
在一个实施方式中，可以通过标准的制药程序在体外、在细胞培养物或在实验动物中确定本文所描述的活性成分的毒性和治疗效力。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数值可以用来配制一系列在人类中使用的剂量。在一个实施方式中，剂量取决于所用的剂型和所利用的给予途径而变化。在一个实施方式中，可以由单独的医生鉴于患者的病情来选择确切的制剂、给予途径和剂量。[参见，例如，Fingl,etal.,(1975)"The Pharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.l]。
在一个实施方式中，取决于待治疗的病症的严重程度和响应性，给药可以是单剂量或多剂量给予，疗程持续数天至数周或直到实现了治愈生效或疾病状态的缓解。
在一个实施方式中，待给予的组合物的量当然地将取决于受治疗的受试者、痛苦的严重程度、给予方式、开处方的医师的判断等等。
在一个实施方式中，还制备了包括本发明的制剂(配制在相容性药物载体中)的组合物，并放置于适合的容器中，贴上用于治疗指定病症的标签。
在另一个实施方式中，通过全身性给予来给予由CTP修饰的GH。在另一个实施方式中，本文所描述的生长激素是通过静脉内、肌内或皮下注射来给予的。在另一个实施方式中，由CTP修饰的GH是组合有复合有机赋形剂和稳定剂(如非离子表面活性剂(即表面活性剂))、各种糖类、有机多元醇和/或人血清白蛋白的冻干(即冷却干燥)制剂。在另一个实施方式中，药物组合物包含冻干的CTP修饰的GH，其在注射用无菌水中。在另一个实施方式中，药物组合物包含如所描述的冻干的生长激素，其在注射用无菌PBS中。在另一个实施方式中，药物组合物包含如所描述的冻干的生长激素，其在注射用无菌0.9％NaCl。
在另一个实施方式中，药物组合物包含本文所述的由CTP修饰的GH以及复合载体，该复合载体如人血清白蛋白、多元醇、糖类、和阴离子表面活性稳定剂。参见，例如WO 89/10756(Hara et al.-含多元醇与对羟基苯甲酸)。在另一个实施方式中，药物组合物包含本文所描述的生长激素以及乳糖酸和乙酸/甘氨酸缓冲液。在另一个实施方式中，药物组合物包含本文所描述的由CTP修饰的GH以及增加干扰素组合物在水中的溶解度的氨基酸(如精氨酸或谷氨酸)。在另一个实施方式中，药物组合物包含冻干的本文所描述的由CTP修饰的GH以及甘氨酸或人血清白蛋白(HSA)、缓冲剂(例如醋酸)和等渗剂(如NaCl)。在另一个实施方式中，药物组合物包含冻干的本文所描述的由CTP修饰的GH以及磷酸盐缓冲液、甘氨酸和HAS。
在另一个实施方式中，当放置于具有约4至7.2的pH的缓冲溶液中时，稳定了包含本文的由CTP修饰的GH的药物组合物。在另一个实施方式中，用氨基酸作为稳定剂以及在一些情况下的盐(如果该氨基酸不包含带电侧链)，稳定了包含本文的由CTP修饰的GH的药物组合物。
在另一个实施方式中，包含本文的由CTP修饰的GH的药物组合物是包含按重量计约0.3％至5％的稳定剂的液体组合物，该稳定剂是氨基酸。
在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物提供了剂量准确度和产品安全性。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物提供了用于注射应用的生物学活性的、稳定的液体制剂。在另一个实施方式中，药物组合物包含非冻干的本文所描述的由CTP修饰的GH。
在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物提供了在液体状态下允许长时间存储的液体制剂，这方便了给予前的存储和运输。
在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的可注射的药物组合物包含固体脂质作为基质材料。在另一个实施方式中，根据Speiser的描述(Speiserand al.,Pharm.Res.8(1991)47-54)通过喷洒冷却生产脂质微粒，随后产生为用于口服给予的脂质纳米团粒(Speiser EP 0167825(1990))。在另一个实施方式中，身体能够良好的耐受所使用的脂质(例如，由存在于用于肠胃外营养的乳剂中的脂肪酸构成的甘油酯)。
在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物为脂质体的形式(J.E.Diederichs and al.,Pharm./nd.56(1994)267-275)。
在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含聚合物微粒。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的可注射的药物组合物包含聚合物微粒。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含纳米颗粒。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含脂质体。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含脂质乳剂。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含微球。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含脂质纳米颗粒。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含含有两亲性脂质的脂质纳米颗粒。在另一个实施方式中，包含本文所描述的由CTP修饰的GH的药物组合物包含含有药物、脂质基质和表面活性剂的脂质纳米颗粒。在另一个实施方式中，所述脂质基质具有至少50％w/w的单甘油酯含量。
在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其包含一个或多个含有活性成分的单元剂型。在一个实施方式中，包装例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方式中，该包装或分配器装置伴随有给予说明书。在一个实施方式中，该包装或分配器装置安置有由政府机构规范制造、使用或销售药品所规定的格式的与容器相关的注意事项，该注意事项反映了组合物的形式或人类或兽医行政管理的机构的批准。在一个实施方式中，此类注意事项是由美国食品和药物管理局批准的用于处方药物的标签或经批准的产品插页。
在一个实施方式中，可以理解的是，可以将本发明的由CTP修饰的GH与另外的活性剂一起提供给个体，从而与以各个单独的试剂的治疗相比，达到提高的治疗效果。在另一个实施方式中，采取措施(例如剂量和选择互补剂)来应对与联合治疗相关联的不利的副作用。
在研究了下面的实施例之后，对于本领域普通技术人员而言，本发明的另外的目的、优点和新颖特征都将变得显而易见，这些实施例并不意在限制。另外，上文中描绘的以及以下权利要求章节中主张的本发明的各种实施方式和方面的每一个都能够在下列实施例中找到实验性支持。
实施例
一般地，本文中使用的命名法以及本发明中采用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中对此类技术进行了充分的说明。参见，例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual",Sambrook et al.,(1989)；"CurrentProtocols in Molecular Biology",卷I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel etal.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；在美国专利号US4,666,828、US 4,683,202、US 4,801,531、US 5,192,659和US 5,272,057中描述的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",卷I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；Freshney,Wiley-Liss的"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique",N.Y.(1994),第三版；"Current Protocols in Immunology"卷I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds),"Selected Methods inCellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中有广泛描述，参见，例如，美国专利号US 3,791,932、US 3,839,153、US 3,850,752、US 3,850,578、US 3,853,987、US 3,867,517、US 3,879,262、US 3,901,654、US3,935,074、US 3,984,533、US 3,996,345、US 4,034,074、US 4,098,876、US 4,879,219、US5,011,771和US 5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait,M.J.,ed.(1984)；"Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；"AnimalCell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRLPress,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide ToMethods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual"CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入。在本文档中提供了其他一般的参考文献。
实施例1
产生hGH构建体
材料与方法
合成了四个hGH克隆(20kD蛋白质的变异体)。将来自该四个变异体的含有hGH序列的XbaI-NotI片段连接到事先使用XbaI-NotI消化的真核表达载体pCI-dhfr中。由该4个克隆(401-0、1、2、3和4)的制备DNA。还由22kD蛋白质合成了另一个部分hGH克隆(1-242bp)(0606114)。引物订购自Sigma-Genosys。用来产生本发明的由CTP多肽修饰的hGH的引物序列总结于下文表1中。
表1
构建402-0-p69-l(hGH)(SEQ ID NO:5)：hGH为野生型重组人类生长激素(无CTP)，制备它以在下述实验中用作对照。
进行了三个PCR反应。使用引物25和引物32R以及0606114(hGH1-242bp的部分克隆)的质粒DNA作为模板进行第一个反应；作为该PCR扩增的结果，形成了245bp的产物。
使用引物33和引物4R以及401-0-p57-2的质粒DNA作为模板进行第二个反应；作为该PCR扩增的结果，形成了542bp的产物。
使用引物25和引物4R以及前两个反应的产物的混合物作为模板进行最后一个反应；作为该PCR扩增的结果，形成了705bp的产物，并且将其连接至TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)中。将含有hGH-0序列的XbaI－NotI片段连接入真核表达载体pCI-dhfr中。将该载体转染入DG-44CHO细胞中。在无蛋白质的培养基中培养细胞。
构建402-l-p83-5(hGH-CTP)-SEQ ID NO:9和402-2-p72-3(hGH-CTPx2)-SEQ IDNO:10：hGH-CTP是重组人类生长激素，其被融合至1个拷贝的人绒毛膜***(CTP)的β链的C-末端肽。将hGH-CTP的CTP盒连接至C-末端(一个盒)。hGH-CTP-CTP为重组人类生长激素，其被融合至2个拷贝的人绒毛膜***(CTP)的β链的C-末端肽。将hGH-CTP-CTP的两个CTP盒连接至C-末端(两个盒)。
以与构建hGH-0相同的方式进行hGH-CTP和hGH-CTP-CTP的构建。在第二个PCR反应中使用pCI-dhfr-401-l-p20-l(hGH*-ctp)和pCI-dhfr-401-2-p21-2(hGH*-ctp x2)作为模板。
在DG-44CHO细胞中表达hGH-CTP和hGH-CTP-CTP。在无蛋白质的培养基中生长细胞。由于hGH具有22kD的MW，而每个“CTP盒”给总分子量贡献8.5kD，所以hGH-CTP的分子量为～30.5kD(见图1)。hGH-CTP-CTP的分子量为～39kD(见图1)。
构建402-3-p81-4(CTP-hGH-CTP-CTP)-SEQ ID NO:11和402-4-p82-9(CTP*hGH-CTP-CTP)-SEQ ID NO:12：CTP-HGH-CTP-CTP是重组人类生长激素，其被融合至3个拷贝的人绒毛膜***(CTP)的β链的C-末端肽。CTP-hGH-CTP-CTP3个盒被连接到N-末端(一个盒)和C-末端(两个盒)。tCTP-hGH-CTP-CTP是重组人类生长激素，其被融合至1个截短拷贝的和2个完整拷贝的人绒毛膜***(CTP)的β链的C-末端肽。将tCTP-hGH-CTP-CTP的该截短的CTP盒连接至N-末端并将两个CTP盒连接至C-末端(两个盒)。
进行三个PCR反应。使用引物25和引物35R以及p401-3-pl2-5或401-4-p22-l的质粒DNA作为模板进行第一反应；作为该PCR扩增的结果，形成了265bp或220bp的产物。使用引物34和引物37R以及TA-hGH-2-q65-l的质粒DNA作为模板进行第二反应；作为该PCR扩增的结果，形成了695bp的产物。使用引物25和37R以及前两个反应的产物的混合物作为模板进行最后一个反应，作为该PCR扩增的结果，形成了938bp或891bp的产物，并且将产物连接入TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)中。将含有hGH序列的XbaI-NotI片段连接入发明人的真核表达载体pCI-dhfr中。
在DG-44CHO细胞中表达CTP-hGH-CTP-CTP和tCTP-hGH-CTP-CTP。在无蛋白质的培养基中生长细胞。CTP-hGH-CTP-CTP的分子量为～47.5kD(见图1)且tCTP-hGH-CTP-CTP的分子量为～43.25kD(见图1)。
构建402-6-p95a-8(CTP-hGH-CTP)-SEQ ID NO:13：以与构建hGH-3相同的方式进行hGH-6的构建。在第二PCR反应中使用pCI-dhfr-402-l-p83-5(hGH-ctp)作为模板。
构建402-5-p96-4(CTP-hGH)-SEQ ID NO:14：使用引物25和引物39R以及pCI-dhfr-ctp-EPO-ctp(402-6-p95a-8)的质粒DNA作为模板进行PCR反应；作为PCR扩增的结果，形成了763bp的产物，并且连接入TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)中。将含有ctp-hGH序列的XbaI-NotI片段连接入发明人的真核表达载体pCI-dhfr中，得到402-5-p96-4克隆。
实施例2
本发明的hGH-CTP多肽的体内生物学活性测试
进行以下实验以测试与商业化的重组人类GH和hGH相比，hGH-CTP多肽的潜在的长效生物学活性。
材料与方法
雌性切除垂体的大鼠(60-100g)接受每周皮下注射21.7μg hGH-CTP多肽或每天一次5μg皮下注射对照商业化的rhGH。
在治疗之前、第一次注射的24小时后以及此后每隔一天直至第21天研究结束，对所有的动物进行称重。每个点代表了该组的平均增重率((第0天的体重-最后一天的体重)/第0天的体重)。相对于每天一次注射商业化的hGH的体重，将平均体重增加归一化。治疗安排总结于表2中。
表2
结果
结果总结于图2中。这些结果显示，与诱导100％体重增加的商业化的rhGH相比，CTP-hGH-CTP-CTP(SEQ ID NO:11)和tCTP-hGH-CTP-CTP(SEQ ID NO:12)诱导超过120％的体重增加。
结论
与以5μg剂量每天一次给予13天注射相同累积剂量的商业化的rhGH相比，3周剂量(注射日：1、7和13)21.7g的CTP-hGH-CTP-CTP(SEQ ID NO:11)和tCTP-hGH-CTP-CTP(SEQ IDNO:12)在切除垂体的大鼠中诱导的体重增加多出30％。
实施例3
CTP-修饰的GH的药代动力学研究
在Sprague-Dawley大鼠中进行单剂量的药代动力学研究。所有的动物实验都是按照动物福利法、实验动物管理和使用指南、并且在Modigene,Biotechnology General Ltd的实验动物管理和使用委员会的监督和批准下进行的。大鼠饲养于具有12-h光/暗周期的室中，一笼单只或一笼两只。可选地提供水(市政供应)和未经认证的啮齿动物食物。
为了在大鼠中比较CTP-hGH-CTP-CTP和GH的药代动力学，使用四组Sprague-Dawley大鼠(270-290g)，每组3至6只雄性大鼠。将大鼠随机分配到四个治疗组(见表3)。单次皮下注射或静脉注射GH(50μg/kg静脉注射或皮下注射)或CTP-hGH-CTP-CTP(108μg/kg静脉注射或皮下注射)向大鼠给予。除了在异氟烷麻醉下采集的给予前样品之外，在未麻醉的动物进行采血。将血样(约0.25ml)采集于EDTA-涂覆的微量容器中，以用于在表3所示出的时间点ELISA分析CTP-hGH-CTP-CTP血浆浓度。在每次采样后，将血体积替换为等体积的无菌0.9％盐水。在离心和血浆收获之前将样品在冰上贮存上达至1h。在分析之前，将血浆样品贮存在约-20℃下。
表3.大鼠药代动力学研究的实验设计
#3只大鼠每时间点。
使用对于检测人类生长激素特异的商业化的夹心ELISA试剂盒(RocheDiagnostics)来评价大鼠血浆样品。这种试剂盒通过抗体夹心ELISA形式检测血浆中的人类生长激素。首先使用这种试剂盒测量大鼠血浆中CTP-hGH-CTP-CTP的浓度。对于这些血浆样品，使用CTP-hGH-CTP-CTP标准曲线(1.2-100ng/ml)并且大鼠血浆中的CTP-hGH-CTP-CTP浓度来自该曲线的内插值。
标准的药代动力学参数，包括清除率(CL或CL/F)、分布体积(Vd或Vd/F)、半衰期(t1/2)、血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)、观察到的最大血浆浓度(Cmax)和最大观测血浆浓度的时间(Tmax)，是使用建模程序WinNonlin(Pharsight,version 3.1)通过非房室模型分析(noncompartmental analysis)由血浆白蛋白调理素(albutropin)或GH浓度/时间曲线来获得的。将血浆CTP-hGH-CTP-CTP或GH浓度数据进行统一地加权以用于该分析。对静脉注射数据使用对数-线性梯形分析并且对皮下注射数据使用线性上/对数下梯形法来计算AUC。单个地分析每个大鼠(除了皮下注射白蛋白调理素之外)或猴的血浆浓度分布，并且将药代动力学参数的平均值(S.E.M.)的均数±标准差报告于表4和图4A及图4B中。
CTP-hGH-CTP-CTP是275个氨基酸和上达至12个O-连接的糖的单链蛋白质。该结构由连接至三个拷贝的人绒毛膜***(hCG)的β链的C-末端肽(CTP)的经修饰的人类生长激素(Somatropin)构成；一个拷贝在N-末端而两个拷贝(串联的)在C末端。人类生长激素包含191个氨基酸。CTP包含28个氨基酸和4个O-连接的糖链。
实施例4
CTP-修饰的GH在SD大鼠中的药代动力学
评价了CTP-hGH-CTP-CTP的药代动力学并且与商业化的hGH(Biotropin)的药代动力学进行比较。
表4.在Sprague-Dawley大鼠中单剂量静脉注射和皮下注射给予CTP-hGH-CTP-CTP和GH(Biotropin)后的平均药代动力学参数。
数据统计分析
对血清样品进行分析以测定各样品的具体浓度水平。使用WinNonLin非房室模型分析处理浓度和时间点数据。
所测定的参数包括：AUC、MRT、tl/2、Cmax和Tmax。图4A和图4B显示在大鼠中单剂量静脉注射和皮下注射CTP-hGH-CTP-CTP或GH(n＝3～6每剂量/途径)后，与GH浓度(pg/ml)相比，CTP-hGH-CTP-CTP血浆浓度具有更加优异的药代动力学分布。
在单次皮下注射50μg/kg之后，CTP-hGH-CTP-CTP在SD大鼠中的清除率显著的低于CTP-hGH-CTP及Biotropin的清除率。相应计算的半衰期时间和AUC为：
Biotropin Tl/2 1.7h，AUC 41小时*ng/mL
CTP-hGH-CTP Tl/2 8.5h，AUC 424小时*ng/mL
CTP-hGH-CTP-CTP Tl/2 9.0h，AUC 680小时*ng/mL
结论：
从6个其他变异体中选出CTP-hGH-CTP-CTP作为最终的候选物。CTP-hGH-CTP-CTP在生物学活性和药代动力学方面表现出优异的性能。
实施例5
单剂量/重复剂量的CTP-修饰的GH的体重增加测定(WGA)
从CRL实验室获得了3-4周龄的切除垂体的(耳间法)雄性大鼠。在3周的手术后适应期内，每周两次对大鼠进行检查和称重，以排除由体重增加类似于假手术大鼠的体重增加而被视为具有不完全垂体切除的动物。从研究中排除具有不完全垂体切除的那些大鼠。在实验时，切除垂体的大鼠的平均体重为70～90克。这是用于hGH的标准USP和EP生物测定。切除垂体的大鼠(摘除了脑垂体的大鼠)失去了它们增加体重的能力。向这些大鼠中注射hGH(和CTP-hGH-CTP-CTP)导致体重增加。基于沿着预定的时间段内测量的体重增加以及所注射的hGH的量，确定了hGH(和CTP-hGH-CTP-CTP)的具体活性。3周时间内，单剂量皮下注射0.4 mg/Kg、0.8mg/Kg和4mg/Kg或者每隔4天重复剂量皮下注射0.6mg/Kg和1.8mg/Kg给予大鼠。在第一次给药之前，随机地测定所有动物的个体体重，然后在处死之前，每两天或在死亡的情况下在死亡时测定个体体重。
单剂量和重复剂量的体重增加测定
在图5中示出在切除垂体的大鼠中，在不同剂量模式的CTP-hGH-CTP-CTP之后，整个身体生长反应的比较结果。结果表面，单次注射0.4mg/Kg/天和0.8mg/Kg/天剂量的hGH-CTP相当于4个每天注射0.1mg/Kg/天的Biotropin。在2天后达到hGH-CTP的峰值。
图6进一步表明，在大鼠中单注射CTP-hGH-CTP-CTP之后的曲线下的面积与体重增加相关。因此，集体数据表明体重增加与累积AUC密切相关。
如图7所示，相隔4天给予的hGH-CTP构建体促进了与每天注射Biotropin相同的体重增加。预期hGH在人体中的半衰期比在大鼠中好5倍——指示在单次注射10天后在人体中可能的峰效应。这些结果支持人类中每周一次或两周一次给予hGH-CTP构建体CTP-hGH-CTP-CTP。
实施例6
CTP-修饰的GH的药效学/药代动力学研究
从CRL实验室获得了3-4周龄的切除垂体的(耳间法)雄性大鼠。在3周的手术后适应期内，每周两次对大鼠进行检查和称重，以排除由体重增加类似于假手术大鼠的体重增加而视为具有不完全垂体切除的动物。从研究中排除具有不完全垂体切除的那些大鼠。在实验时，切除垂体和假手术的大鼠的平均体重分别为70和150g。
用CTP-hGH-CTP-CTP、载体、人类生长激素CTP-hGH-CTP-CTP或人类生长激素(20μg/大鼠)单次皮下注射给予大鼠，以0.2ml/大鼠的注射体积皮下注射给予。GH的剂量为0.35μg/Kg和1.05μg/Kg，生长激素的剂量与相应0.6μg/Kg和1.8μg/Kg剂量的CTP-hGH-CTP-CTP中的GH的量是等摩尔的。治疗组总结于表4中。在注射后，在表5中所描述的时间点获得用于IGF-1分析的血浆样品。使用商业化的ELISA(R&D***)分析样品的IGF-1浓度。
每周给予CTP-修饰的hGH如同标准GH一样，成功地将IGF-1维持在正常范围内，并且其如同标准GH一样维持了体重。
表5.切除垂体的大鼠研究的治疗安排
对每组的平均血清浓度-时间曲线进行非房室模型药代动力学分析。CTP-hGH-CTP-CTP Cmax显著地高于Biotropin Cmax。CTP-hGH-CTP-CTP的终末半衰期比Biotropin高6倍。
表6.在切除垂体的大鼠中单次皮下注射CTP-hGH-CTP-CTP和Biotropin后的药代动力学参数估算值。
AUC0-t和AUC0-∞非常相似，表明采样时间足以表征药代动力学分布。CTP-hGH-CTP-CTP的AUC比Biotropin的AUC高10倍。另外，Cmax一般与剂量成正比，并且对于CTP-hGH-CTP-CTP，其比Biotropin的Cmax高两倍。但是，如图8所示，与Biotroin的0.5小时相比，CTP-hGH-CTP-CTP的Tmax为8小时。且终末半衰期似乎未随剂量水平而变化。CTP-hGH-CTP-CTP的Tl/2比Biotropin长6.8倍。
GH的间接效应是主要通过***-I(IGF-1)来介导的，该IGF-1为响应于生长激素由肝脏和其他组织来分泌的激素。生长激素的大多数促生长作用实际上是由于作用于其靶细胞的IGF-1带来的。因此，测量了CTP-hGH构建体、CTP-hGH-CTP-CTP对垂体切除的大鼠中IFG-1血清水平的影响。图9显示了在皮下注射CTP-hGH-CTP-CTP和商业化的hGH后垂体切除的大鼠中IFG-1血清水平的结果。
将单剂量的CTP-hGH-CTP-CTP 0.6mg/Kg或1.8mg/Kg和Biotropin0.35mg/Kg或1.05mg/Kg皮下注射到垂体切除的大鼠中，以测定PK/PD分布。使用特异性ELISA试剂盒(Roche Diagnostics)测量注射后的血清IGF-1。
与在注射Biotropin后相比，注射CTP-hGH-CTP-CTP后的IGF-1的累积血清水平显著更高。Cmax一般与剂量成正比，并且对于CTP-hGH-CTP-CTP，Cmax比Biotropin的Cmax高3-4倍。相比于Biotropin的20-24小时，CTP-hGH-CTP-CTP的Tmax为36-48小时。结论，更高的hGH水平和更长时间的存在于血清中使得IGF-1水平显著增加。
实施例7
CTP-修饰的GH的碳水化合物含量和唾液酸含量
基于Prozyme试剂盒分析O-聚糖。从蛋白质上化学地和酶学地裂解出O-聚糖，并且使用纸层析法与肽分离。通过连续酶消化(外-糖苷酶)进行O-聚糖池的测序，随后通过HPLC分析与标准比较。
糖分析与序列分析
由Ludger Ltd.进行糖分析(glycoprofiling)。两个样品(EN648和RS0708)各取一式三份并且每份通过HPLC分析三次。将EN648和RS0708的一式三份300μg样品和柠檬酸盐/氯化钠缓冲液的单个100μl样品、加上阳性对照胎球蛋白(250μg)以及100μl水阴性对照通过离心进行超滤，使用10,000Da的分子量截留膜以用水替换缓冲液，然后在O-模式条件(在60℃下6h)进行肼解。将释放的聚糖再N-乙酰化并且通过LudgerClean CEX柱体进行清理。然后使用2-氨基苯甲酰胺(2AB)标记等分试样的释放的聚糖，使用Ludger Clean S柱体进行清理并且通过LudgerSep-N2HILIC-HPLC进行分析。
单糖含量
中性单糖的分析要求将聚糖水解为它们的组成单糖组分。水解是由Ludger Ltd在完整糖蛋白样品上进行的。具体地，将50μg完整的糖蛋白进行酸水解，2-AB(2-氨基苯甲酰胺)标记并且在反相HPLC柱上进行运行。这种方法水解存在于包含N和O连接类型的糖蛋白上的所有聚糖。
唾液酸分析
分析了两个样品(EN648和RS0708)和缓冲液对照。唾液酸分析需要弱酸释放单糖，随后DMB荧光标记和在LudgerSep-Rl柱上HPLC分析。对每个分析，酸水解50μg完整的糖蛋白。
CTP-hGH-CTP-CTP的糖分析
表7.聚糖分析。结构分配和峰的百分比面积基于HPLC和酶阵列消化。
单糖分析显示CTP-hGH-CTP-CTP糖蛋白样品主要包含O-连接类型的聚糖。主要的O-聚糖峰为唾液酸化的核心1(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc)。主要的唾液酸是Neu5Ac并且有一些小峰显示存在3-4％的二-乙酰化的唾液酸N-乙酰基-9-O-乙酰神经氨酸(Neu5,9Ac2)和小于1％的N-羟乙酰神经氨酸。还有少量的Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAc。
实施例8
CTP-修饰的GH在恒河猴中的药代动力学/毒代动力学分析
为每只动物产生血清浓度与时间的关系曲线。使用WinNonlin专业版5.2.1(Pharsight Corporation,Mt View CA.)进行非房室模型分析。估算的药代动力学参数如下表8所示：
表8：在恒河猴中单次皮下注射后，由非房室模型分析的CTP-hGH-CTP-CTP药代动力学参数(平均值±SD)的估算值。
AUC0-t和AUC0-∞非常相似，表明采样的持续时间足以表征药代动力学分布。Cmax为与剂量成正比。在较高的剂量下，Tmax较晚。在低剂量组中，所有动物的Tmax都在4小时，而在高剂量组中，在8或24小时。两个剂量组的终末半衰期相似。
AUC与剂量大约成正比，与低剂量相比，较大成比例的AUC在较高剂量下产生较低的CL/F和Vz/F估算值。这不能说，在较高剂量下CL和Vz较低或在较低剂量下F较低。在各组之间具有重叠，所以值得商榷的是，这表现出CL/F和Vz/F有意义的差异。
通过该模型估算的药代动力学参数非常相似于来自非房室模型分析的那些。吸收和消除半衰期如下表9中所示：
表9：在皮下注射后，来自恒河猴中药代动力学建模的CTP-hGH-CTP-CTP的吸收和消除半衰期(平均值±SD)的估算值
这些数据表明各组之间的消除速率十分相似，其中，在较低剂量组中T1/2el稍长。但是，与在皮下给予1.8mg/kg后相比，皮下给予90mg/kg后吸收缓慢超过5倍。如在非房室模型分析的情形相同，建模显示在高剂量下Tmax较晚。
虽然补充GH对在儿童和成人中治疗GH缺乏症有效，但缺点在于较长的一段时间内每天注射限制了内科医生将期应用在某些患者人群，并且增加了给药错误的风险、照顾者的数量、治疗和非依从性的成本。尤其重要的是，在某些群体如身材矮小的儿童中(他们可能不理解不遵照规定的GH给药方案的含意)，为实现由GH治疗的最佳益处，依从性是必要的。寻找每天注射GH及随后的依从性收益的更合适替代物的问题更是重要的，因为GH-缺乏症儿童过渡到成人时，持续地需要GH治疗。每天治疗的需求主要是由于重组GH的短血浆半衰期所导致的，并由此导致开发了持续释放形式的GH(Reiter EO.Attire KM.,MashingTJ.Silverman BL.Kemp SF.Neolith RB.Ford KM.和Sanger P.A multimember study ofthe efficacy and safety of sustained release GH in the treatment of naivepediatric patients with GH deficiency.J.Clin.Endocrinol.Metab.86(2001),pp.4700-4706.)。
本文中所提供的重组人类生长激素-CTP融合蛋白质GH-CTP在大鼠中具有的药代动力学分布的持续时间比GH的要长。如分别由生长和血浆IGF-1水平的升高所证明的，这种独特的药代动力学分布允许间歇给予GH-CTP以在生长激素缺乏的大鼠中实现药效。
当皮下给予至大鼠中时，GH-CTP提供了比GH更加优异的药代动力学分布。与GH相比，GH-CTP的血浆清除率具有巨大的差异。具体地，在皮下给药后，血浆清除GH-CTP的速率比GH慢超过6倍。在皮下给予后，在大鼠中GH-CTP的终末半衰期和平均滞留时间约比GH的长6倍。另外，在皮下给药后，GH-CTP的Cl/F比GH的低10倍。
为了检验在大鼠中的药代动力学优势是否可以转换为药效益处，在等摩尔的CTP-hGH-CTP-CTP和GH剂量水平下，以比每天较不频繁的用药方案在GH-缺乏的切除垂体的大鼠中测试了GH-CTP可能刺激生长的可能性。单次皮下注射GH-CTP促进的增量体重增加与4天连接注射GH的相等。另外，与GH相比，GH-CTP的每第四天给予安排显示出增强的体重增加。
药效学上，相对于GH，GH-CTP在切除垂体的大鼠的长循环时间产生在单次皮下注射后在血浆中测量的延长的IGF-1响应。皮下给予单剂量的GH-CTP在切除垂体的大鼠中以剂量依赖性方式增加了循环的IGF-1浓度。在最高的白蛋白调理素剂量下，在单次给予后，IGF-1浓度被提高到基线以上长达75小时。因此，相比于单剂量的GH，单剂量GH-CTP的增长的循环时间产生实质的药效改善，提高了如下可能性：与标准GH治疗方案相比，GH-CTP可以以降低的用药频率提供类似的生长增强和身体脂肪的减少。
在Rhesus中90mg/kg以及在大鼠中180mg/kg单剂量的CTP修饰的hGH在两个物种中都耐受性良好。大鼠和灵长类动物之间的异速生长因子约为X2，这是基于蛋白质在这些动物中的预期清除率。与物种之间的治疗性蛋白质的半衰期增加(FDA指南)用的业界公认的外推模型一致。90mg/kg在灵长类动物中所具有的PK分布稍微好于180mg/kg CTP修饰的hGH在大鼠中。因此，异速生长外推到人类支持每周一次或每2周一次注射。
与商业化的GH重组产品相比，利用CTP-GH构建体的本发明的思概念降低了用药频率。Nutropin是批准在儿科人群中使用的GH的缓释制剂；但是与历史对照相比已经显示，与使用GH治疗的儿童(一年的生长速率10.1±2.8cm/年)相比，提供Nutropin 的儿童的1年和2年生长速率(一年生长速率8.2+1.8cm /年)显著更低(p<0.001)
(Silverman BL.Blethen SL.Reiter EO.Attie KM.Neuwirth RB.和Ford KM.Along-acting human growth hormone (Nutropin) :efficacy and safetyfollowing two years of treatment in children with growth hormonedeficiency.J.Pediatr.Endocrinol.Metab.15(2002),pp.715-722.)。皮下给予Nutropin的局部效应包括结节、红斑、注射部位疼痛、头痛和呕吐。在大鼠和猴中的临床前毒理学研究已经显示，与载体相比，皮下给予CTP-hGH-CTP-CTP未产生局部反应。考虑到医药需要较低频率给予GH的形式，在本研究中CTP-hGH-CTP-CTP在大鼠中的药理特性显示，这种产品在毒理学和患者的依从性上也是有利的。CTP-hGH-CTP-CTP在大鼠中的持久活性支持其作为如下试剂的潜在效用，该试剂只需要间断给予即可实现当前每天给药所实现的治疗益处。
实施例9
长效CTP-修饰型的人类生长激素(hGH-CTP)在生长激素缺乏症的成人中高度有效－II期临床试验
在当前正接受每天注射生长激素的患者中，每周一次或每月两次注射hGH-CTP以进行随机、开放性、II期临床试验以评价hGH-CTP的安全性、耐受性、药代动力学和药效学特性。试验在六个国家的多个站点进行。试验中的三个主要同期群(cohort)接受单周剂量的hGH-CTP，其含有生长激素缺乏症成年患者以每天注射的形式在7天疗程中接受的当量累积商业化hGH剂量的30％、45％或100％(分别称为“30％”、“45％”和“100％”同期群)。数据反映了来自39位患者的结果，每个同期群有13位，每个同期群包括2位女性。
除了该三个主要同期群之外，将生长激素缺乏症成人纳入实验性第四同期群，其在正式II期临床试验之外进行实验。在实验性第四同期群中的患者每两周一次接受单次注射hGH-CTP，其含有生长激素缺乏症成人患者以每天注射的形式在两周期间内接受的累积商业化的剂量的50％。
通过在7天的时间段内(在研究当中治疗的最后一周期间内)每天测量的***1(IGF-1)的水平处于所需的治疗范围内来界定接受每周单次注射hGH-CTP的三个主要同期群的效力。所需的治疗范围限定为在正常人群中预期的平均IGF-1水平+2个标准偏差至-2个标准偏差，按年龄组别和性别分层。另外，为了观察患者在正常范围内的方差，该试验测量的IGF-1水平处于+/-1.5个标准偏差的较窄的范围内。
结果：
表10含有在最后的治疗一周中测量的，表达为与正常人群的平均IGF-1水平的标准偏差的处于正常治疗范围内(+/-2SD)的天数的平均百分比、处于较窄的正常治疗范围内(+/-1.5SD)的天数的平均百分比、以及男性的IGF-1的平均Cmax(最高的浓度水平)。
表10：人类Ⅱ期临床试验结果
每周2mg的hGH-CTP，其含有成人患者通常会规定作为初始治疗剂量的累积每周hGH剂量的50％，具有很高的可能性被定义为在成人III期中作为男性和女性的初始剂量。
没有安全性问题和/或耐受性问题的证据，并且也没有迹象显示当高剂量或者甚至高于正常范围的水平使用hGH-CTP时在患者中诱导了过高水平的IGF-1。
虽然在本文中已经说明和描述了本发明的某些特征，但是现有本领域普通技术人可以想到许多修改、替换、改变和等效物。因此，可以理解的是，随附的权利要求意在涵盖落入本发明的真正精神的所有此类修改和改变。
序列表
<110> 普罗勒生物科技有限责任公司(Prolor Biotech Inc.)
<120> 长效生长激素及其生产方法
(LONG-ACTING GROWTH HORMONE AND METHODS OF PRODUCING SAME)
<130> P-9520-PC4
<140> PCT/US12/999999
<141> 2012-08-01
<150> 12/476,916
<151> 2009-06-02
<150> 13/195,931
<151> 2011-08-02
<150> 12/509,188
<151> 2009-07-24
<150> 12/476,916
<151> 2009-06-02
<150> 12/401,746
<151> 2009-03-11
<150> 11/700,910
<151> 2007-02-01
<150> 60/764,761
<151> 2006-02-03
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
Gln
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人类
<400> 2
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 人类
<400> 3
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala
20 25
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人类
<400> 4
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 217
<212> PRT
<213> 人类
<400> 5
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1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
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<210> 6
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<212> PRT
<213> 人类
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<212> PRT
<213> 人类
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20 25
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<211> 217
<212> PRT
<213> 人类
<400> 8
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人类
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Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
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Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
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Gln
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<213> 人类
<400> 11
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<213> 人类
<400> 12
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180 185 190
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
195 200 205
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
210 215 220
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
225 230 235 240
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
245 250 255
Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
260 265 270
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
275 280 285
<210> 13
<211> 273
<212> PRT
<213> 人类
<400> 13
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180 185 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260 265 270
Gln
<210> 14
<211> 245
<212> PRT
<213> 人类
<400> 14
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180 185 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe
245
<210> 15
<211> 853
<212> DNA
<213> 人类
<400> 15
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg 60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct 120
gcccagcccc agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac 180
catccccctg agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct 240
ggcctttgac acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag 300
cttcctgcag aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa 360
cagagaggag acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat 420
ccagagctgg ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta 480
cggcgccagc gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac 540
cctgatgggc cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta 600
cagcaagttc gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct 660
gtactgcttc agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag 720
aagcgtggag ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc 780
ctccccaagc aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgcctcagt gatgaaggtc 840
tggatgcggc cgc 853
<210> 16
<211> 937
<212> DNA
<213> 人类
<400> 16
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg 60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct 120
gcccagcccc agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac 180
catccccctg agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct 240
ggcctttgac acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag 300
cttcctgcag aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa 360
cagagaggag acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat 420
ccagagctgg ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta 480
cggcgccagc gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac 540
cctgatgggc cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta 600
cagcaagttc gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct 660
gtactgcttc agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag 720
aagcgtggag ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc 780
ctccccaagc aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgccacaga gcagctcctc 840
taaggcccct cctccatccc tgccatcccc ctcccggctg cctggcccct ctgacacccc 900
tatcctgcct cagtgatgaa ggtctggatg cggccgc 937
<210> 17
<211> 889
<212> DNA
<213> 人类
<400> 17
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg 60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccgagcct 120
gcccttcccc accatccccc tgagcaggct gttcgacaac gccatgctga gggctcacag 180
gctgcaccag ctggcctttg acacctacca ggagttcgag gaagcctaca tccccaagga 240
gcagaagtac agcttcctgc agaaccccca gacctccctg tgcttcagcg agagcatccc 300
cacccccagc aacagagagg agacccagca gaagagcaac ctggagctgc tgaggatctc 360
cctgctgctg atccagagct ggctggagcc cgtgcagttc ctgagaagcg tgttcgccaa 420
cagcctggtg tacggcgcca gcgacagcaa cgtgtacgac ctgctgaagg acctggagga 480
gggcatccag accctgatgg gccggctgga ggacggcagc cccaggaccg gccagatctt 540
caagcagacc tacagcaagt tcgacaccaa cagccacaac gacgacgccc tgctgaagaa 600
ctacgggctg ctgtactgct tcagaaagga catggacaag gtggagacct tcctgaggat 660
cgtgcagtgc agaagcgtgg agggcagctg cggcttcagc tccagcagca aggcccctcc 720
cccgagcctg ccctccccaa gcaggctgcc tgggccctcc gacacaccaa tcctgccaca 780
gagcagctcc tctaaggccc ctcctccatc cctgccatcc ccctcccggc tgcctggccc 840
ctctgacacc cctatcctgc ctcagtgatg aaggtctgga tgcggccgc 889
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的XbaI正向引物
<400> 18
ctctagagga catggccac 19
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的反向引物
<400> 19
acagggaggt ctgggggttc tgca 24
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的正向引物
<400> 20
tgcagaaccc ccagacctcc ctgtgc 26
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的反向引物
<400> 21
ccaaactcat caatgtatct ta 22
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的XbaI正向引物
<400> 22
ctctagagga catggccac 19
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的反向引物
<400> 23
cgaactcctg gtaggtgtca aaggc 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的正向引物
<400> 24
gcctttgaca cctaccagga gttcg 25
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的反向引物
<400> 25
acgcggccgc atccagacct tcatcactga ggc 33
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于HGH-CTP构建体的反向引物
<400> 26
gcggccgcgg actcatcaga agccgcagct gccc 34

Claims (17)

1.一种包含生长激素的绒毛膜***羧基末端肽(CTP)修饰的多肽在制备用于在人类成年受试者中的生长激素缺乏的药物中的应用，如通过将***(IGF-1)水平维持在正常治疗范围内所测量的，其中，所述CTP修饰的多肽包括：
(a)连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，或
(b)连接到所述生长激素的氨基末端的一个绒毛膜***羧基末端肽(CTP)和连接到所述生长激素的羧基末端的两个绒毛膜***CTP，以及连接到所述一个氨基末端CTP的氨基末端的信号肽；
其中，所述药物包含治疗有效量的CTP修饰的多肽，包括所述CTP修饰的多肽的1-5mg/周的剂量，并且其中，所述药物包含每周一次的剂量。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，至少一个CTP是糖基化的。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其中，至少一个CTP通过接头连接到所述生长激素。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述接头是肽键。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码至少一个CTP的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其中，所述生长激素是人生长激素。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其中，所述生长激素的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:5至少80％的同源。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其中，所述信号肽的氨基酸序列包含在SEQID NO:3中列出的序列。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其中，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO:11的氨基酸27-301的序列。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的应用，其中，所述多肽的氨基酸序列包含在SEQID NO:11中列出的序列。
11.根据权利要求1所述的应用，其中，所述多肽由在SEQ ID NO:16中列出的核酸序列编码。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的应用，其中，所述治疗有效量的CTP修饰的多肽包括1.2mg。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的应用，其中，所述治疗有效量的CTP修饰的多肽包括1.8mg。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的应用，其中，所述治疗有效量的CTP修饰的多肽包括2.0mg。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的应用，其中，所述治疗有效量的CTP修饰的多肽包括4mg。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的应用，其中，所述人类成年受试者是男性。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的应用，其中，所述药物用于皮下给予。
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