CN105693831B - 一种布鲁氏菌s2疫苗免疫抗体的检测试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂,所述IELISA检测试剂的有效成分为布鲁氏菌S2疫苗株基因GL_0002189编码的抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白,或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌主要流行株—羊种/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗—S2疫苗。因此,能够在短时间内鉴别家畜血清中疫苗免疫与羊种/牛种布鲁氏菌自然感染抗体,解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测和畜群净化的难题。不仅可带来,社会经济效益,而且可为净化畜群中的布鲁氏菌病做出贡献。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及免疫学领域,具体地说,涉及一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂。
背景技术
布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella)引起的全世界范围内广泛流行的***共患,OIE归为乙类传染病。布鲁氏菌分七个种,牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)、犬种(B.cains)、绵羊种(B.ovis)、森林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)、海洋哺乳动物布鲁氏菌(B.meris),羊种、牛种为主要流行病原种类,其中羊种毒力最强,危害最大。布鲁氏菌病传染方式为接触患病动物、未消毒的肉制品、乳制品,也可经呼吸道、消化道及皮肤黏膜等组织器官侵入体内引起感染。
布鲁氏菌一旦进入宿主体内,细菌侵入血液和***,繁殖并被巨噬细胞吞噬。家畜感染布鲁氏菌病常见的症状有母畜流产、公畜睾丸肿大、严重者肝脏和脾脏等内脏肿大。家畜感染布鲁氏菌多以淘汰为主,为此,严重影响了畜牧业的健康发展,而且威胁到了人类的健康。
近几年来,我国布鲁氏菌病的流行较为严重,已经受到各级政府部门、科研工作者和广大人民群众的广泛关注。传统疫苗很难达到理想的保护免疫水平,并且目前的诊断方法无法辨别布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染,而近年来研究的一些鉴别诊断方法不能很好地在生产实践中鉴别S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染,因此,很难做到在免疫畜群中净化布鲁氏菌自然感染病畜。
发明内容
本发明的目的是提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂。
本发明的另一目的是提供用于鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒。
为了实现本发明目的,本发明针对市场上普遍使用的布鲁氏菌主流疫苗—S2疫苗,对S2疫苗进行全基因组测序及生物信息学分析。找出与羊/牛种布鲁氏菌相比较S2疫苗株的特有基因,基因重组表达后,筛选出具有免疫原性的抗原蛋白,建立布鲁氏菌S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA鉴别方法。
本发明首先提供GL_0002189抗原蛋白,其氨基酸序列如Seq ID No.1所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该GL_0002189抗原蛋白由S2疫苗株基因GL_0002189(Seq ID No.2)编码。
本发明还提供用于扩增S2疫苗株基因GL_0002189的特异性PCR引物。
本发明还提供所述GL_0002189抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂中的应用。
本发明中涉及的布鲁氏菌自然感染是指羊种和/或牛种布鲁氏菌自然感染。
本发明还提供一种鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的胶体金试纸条,所述试纸条上包被有GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白,或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
本发明还提供含有上述IELISA检测试剂的家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒。
本发明进一步提供一种鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的方法,提取待测家畜的血清,用上述IELISA检测试剂进行检测,比较两种抗原蛋白的阳性检出率。如果IELISA检测结果为两种抗原蛋白均为阳性,则待测家畜血清中含有S2疫苗免疫产生的抗体;如果GL_0002189抗原蛋白检测为阴性,BP26蛋白检测为阳性,则待检家畜为羊种或牛种布鲁氏菌自然感染。上述鉴别方法同样适用于感染布鲁氏菌的人血清的检测。
实验表明,本发明建立的IELISA鉴别方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌中毒力强、危害大的主要流行病原—羊种/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗—S2疫苗。因此,能够在短时间内鉴别家畜血清中疫苗免疫与自然感染抗体,解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测(假阳性)和畜群净化的难题。不仅可带来社会经济效益,而且可为净化畜群中的布鲁氏菌做出贡献。
附图说明
图1为本发明实施例1中布鲁氏菌S2疫苗株基因GL_0002189的PCR检测结果;其中,M为DNAMarker DL2000;1为S2疫苗;2为羊种菌;3为牛种菌。
图2为本发明实施例1中基因GL_0002189及BP26的PCR扩增电泳图;其中,M为DNAMarker DL2000;1为基因GL_0002189;2为基因BP26;3为空白对照。
图3为本发明实施例1中重组克隆质粒GL_0002189双酶切鉴定结果;其中,M为DNAMarker DL2000;1-3为基因GL_0002189。
图4为本发明实施例1中重组克隆质粒BP26双酶切鉴定结果;其中,M为DNA MarkerDL2000;1-3为基因BP26。
图5为本发明实施例1中重组表达质粒GL_0002189双酶切鉴定结果;其中,M1为DNAMarker DL2000;M2为DNA Marker DL15000;1-3为基因GL_0002189。
图6为本发明实施例1中重组表达质粒BP26双酶切鉴定结果;其中,M1为DNAMarker DL2000;M2为DNA Marker DL15000;1-3为基因BP26。
图7为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETGL_0002189)诱导时间优化SDS-PAGE电泳结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-9为pETGL_0002189 0h、1h、2h、3h、4h、6h诱导表达菌。
图8为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导时间优化SDS-PAGE电泳结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-9为pETBP26 0h、1h、2h、3h、4h、6h诱导表达菌。
图9为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pET GL_0002189)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电泳结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-9为IPTG终浓度为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM时BL21(pET GL_0002189)诱导表达。
图10为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电泳结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-9为IPTG终浓度为0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM时BL21(pETBP26)诱导表达。
图11为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETGL_0002189)诱导剂温度优化SDS-PAGE电泳结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-6为BL21(pETGL_0002189)25℃、30℃、37℃诱导表达。
图12为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导温度优化SDS-PAGE电泳结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-6为BL21(pETBP26)25℃、30℃、37℃诱导表达。
图13为本发明实施例1中重组菌在不同温度下生长情况。
图14为本发明实施例1中两个重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳检测结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21(pETGL_0002189)菌体裂解物上清;2为BL21(pETGL_0002189)菌体裂解物沉淀;3为BL21(pETBP26)上清;4为BL21(pETBP26)菌体裂解物沉淀。
图15为本发明实施例1中两个纯化的重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳检测结果;其中,M为蛋白质marker;1为纯化的重组蛋白GL_0002189;2为纯化的重组蛋白BP26。
图16为本发明实施例1中重组蛋白His标签Western-bloting检测结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21(pETGL_0002189);2为BL21(pETBP26)。
图17为本发明实施例1中纯化重组蛋白BL21(pETGL_0002189)与S2免疫血清反应检测结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21;2为BL21(pETGL_0002189)自然感染血清反应;3为BL21(pETGL_0002189)S2免疫血清反应。
图18为本发明实施例1中纯化蛋白BL21(pETBP26)与S2免疫血清反应检测结果;其中,M为蛋白质marker;1为BL21;2为BL21(pETBP26)自然感染血清反应;3为BL21(pETBP26)S2免疫血清反应。
图19为本发明实施例2中GL_0002189抗原IELISA敏感性和特异性分析。
图20为本发明实施例2中BP26抗原IELISA敏感性和特异性分析。
图21为本发明实施例2中GL_0002189抗原IELISA检测羊血清的ROC曲线图。
图22为本发明实施例2中BP26抗原IELISA检测羊血清的ROC曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 S2疫苗株基因GL_0002189以及布鲁氏菌BP26基因的克隆、原核表达
通过S2疫苗株全基因组测序,预测出的编码基因与已公布的布鲁氏菌基因组数据比对分析,找出与羊种和牛种布鲁氏菌相比较S2特有基因,用PCR方法从S2基因组中扩增出S2疫苗株的特有基因GL_0002189(Seq ID No.2),同时以布鲁氏菌BP26基因(Seq ID No.3)作为对照基因,克隆测序后,构建到原核表达载体pET30中,转化至E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,用western-bloting法验证GL_0002189和BP26两个重组蛋白的免疫原性。
1.1实验方法:
1.1.1引物设计
根据GL_0002189和BP26基因序列,用Oligo6.0设计引物,分别在上游引物和下游引物中***EcoR I、Xho I酶切位点,引物的合成由华大基因有限公司完成,引物序列见表1。
表1 GL_0002189和BP26基因引物序列
1.1.2基因组DNA提取
按照Axygen核酸提取试剂盒步骤操作。
1.1.3 GL_0002189基因PCR扩增
将S2疫苗株GL_0002189基因与NCBI公布的其它种布鲁氏菌进行BLAST比对分析,然后进行PCR扩增和特有性验证。PCR扩增反应条件为:预变性95℃5min;变性94℃1min,退火60℃1min,延伸72℃1.5min,35个循环;再延伸72℃10min。PCR扩增结束后,进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.1.4目的基因扩增
目的基因PCR扩增,进行凝胶琼脂糖电泳检测。具体反应条件如1.1.3描述。
1.1.5 PCR产物回收
按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书步骤操作,回收GL_0002189和Bp26基因PCR产物。
1.1.6 PCR回收产物与pMD19-T Simple载体的连接
取200μL离心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收产物、5μL SolutionⅠ,离心混匀,并在16℃过夜连接。
1.1.7重组质粒的转化
按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作步骤,将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中,涂布于含抗生素(Amp)的固体LB培养基上,37℃培养过夜。
1.1.8重组克隆菌菌液PCR鉴定
挑取阳性菌落,接种到含抗生素(Amp)的液体LB培养基里中培养过夜,培养物做PCR扩增鉴定。
1.1.9重组克隆质粒的双酶切鉴定
按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒,用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切电泳检测。
1.1.10重组克隆菌测序
经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定后的重组克隆菌,送到北京华大基因公司进行双向测序。
1.1.11目的基因与表达载体pET30a的回收
将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌接种于LB培养基中培养过夜,提取质粒,回收目的基因片段和pET30a片段。
1.1.12目的基因与表达载体pET30a的连接
取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表达载体片段、1μL T4 DNA连接酶、1μL buffer,16℃连接过夜。
1.1.13重组质粒转化于感受态细胞
按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司BL21(DE3)感受态细胞使用说明书操作步骤,将连接产物转化于BL21(DE3)感受态细胞中,涂布于含抗生素(Kan)固体LB培养基上37℃培养过夜。
1.1.14重组表达菌菌液PCR鉴定
具体步骤见1.1.8。
1.1.15重组表达质粒的双酶切鉴定
具体步骤见1.1.9。
1.1.16重组表达菌诱导表达
1.1.16.1诱导表达时间的优化
将重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)涂布于含Kan的固体LB培养基上培养过夜,挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基中,37℃培养过夜。第二天以1:100的比例接种于20mL含Kan LB培养基中,37℃150r/min诱导培养,当OD600达到0.6~1.0时1mL菌液作为0h对照,其余的培养物里加入IPTG诱导剂,至终浓度1.0mM,37℃150r/min诱导培养。分别在0h、1h、2h、3h、4h、6h每个时间点各取2mL菌液,1mL测吸光值OD600,另1mL离心收集菌体,菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min,12%SDS-PAGE电泳检测。
1.1.16.2诱导剂IPTG浓度的优化
将重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)涂布于含Kan固体LB培养基上培养过夜,挑取单菌落接种在6mL含Kan的液体培养基里,37℃培养过夜。第二天以1:100的比例接种于20mL含Kan的LB培养基中,37℃150r/min培养,当OD600达到0.6~1.0时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM。37℃150r/min继续培养4h,各取2mL菌液,1mL测吸光值OD600,另1mL离心收集菌体,菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min,12%SDS-PAGE电泳检测。
1.1.16.3诱导表达温度的优化
将重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)涂布于含Kan固体LB培养基上培养过夜,挑取单菌落接种在6mL含Kan液体培养基里,37℃培养过夜。第二天以1:100接种于20mL含Kan的LB培养基中,37℃150r/min培养,当OD600达到0.6~1.0时加入IPTG诱导剂至终浓度1.0mM,分别在25℃、30℃、37℃150r/min培养4h后各取2mL菌液,1mL测吸光值OD600,另1mL离心收集菌体,菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸变性10min,12%SDS-PAGE电泳检测。
1.1.16.4重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后,诱导表达300mL重组菌,离心收集菌体,将菌体沉淀用PBS洗3遍后,用PBS重悬浮沉淀,加入溶菌酶,常温放置1h,在-20℃反复冻融,冰浴超声破碎10min,12000×g离心10min,收集沉淀和上清,加入蛋白上样缓冲液煮沸10min,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。
1.1.17重组蛋白包涵体溶解及纯化
按最佳诱导条件诱导重组表达表达菌500mL,12000×g离心10min收集菌体,按上述方法裂解重组表达菌,离心收集裂解物沉淀,将沉淀用8M尿素溶解,12000×g离心10min,收集上清,0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组蛋白。
1.1.18重组蛋白western blotting检测
将纯化出的两个重组蛋白进行SDS-PAGE电泳,从制胶板上将蛋白质胶取出,在夹子上放置滤纸、NC膜、蛋白胶、滤纸,按顺序放好夹住,进行100V 60min转膜。取出NC膜TBST洗4min,重复3~4遍,用现配的封闭液常温微摇封闭1h。取出NC膜TBST洗4min,重复3~4遍,将NC膜在1:50稀释的S2免疫的绵羊血清和1:4000稀释的Mouse Anti-His.tag IgG中4℃孵育过夜。取出NC膜TBST洗4min,重复3~4遍,将NC膜在驴抗绵羊IgG中常温微摇孵育1h。取出NC膜TBST洗4min,重复3~4遍,再用ECL显色3min后照相。
1.2实验结果
1.2.1.GL_0002189基因PCR扩增
S2编码GL_0002189基因序列与NCBI公布的6种布鲁氏菌基因序列进行BLAST比对,比对结果见表2。发现GL_0002189基因只在猪种、犬种、鼠种中存在,而在羊种、牛种、绵羊种中不存在。
表2 GL_0002189BLAST比对结果
GL_0002189 PCR扩增后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1。结果表明:GL_0002189只在猪种布鲁氏菌核酸中扩增出约660bp条带,而在牛种和羊种布鲁氏菌核酸中GL_0002189均未扩增出条带。
1.2.2目的基因扩增
GL_0002189和BP26PCR扩增后,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图2。结果显示:GL_0002189和BP26分别出现约660bp、753bp条带,与预期的目的条带大小相符。
1.2.3重组克隆菌PCR鉴定
目的片段与pMD19-T载体连接后转入感受态细胞,在固体培养基上培养12~16h,挑取3个菌落接种到LB液体培养基,培养12~16h,再以菌液为模板PCR扩增,并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。GL_0002189和BP26基因克隆菌分别扩增出了约660bp、753bp条带,均获得了预期大小的目的条带。
1.2.4重组克隆质粒的双酶切鉴定
经菌液PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒,用限制性内切酶(EcoR I、Xho I)进行双酶切,酶切产物电泳检测,结果见图3、图4。结果均出现了两个条带,分别为GL_0002189(0.6kb、2.7kb)、BP26(0.7kb、2.7kb),表明两个目的基因序列成功***pMD19-T载体序列中。
1.2.5重组表达菌PCR鉴定
目的片段***到pET30a载体后转化感受态菌体细胞,涂布在固体培养基上培养12~16h,挑取3个单菌落摇菌培养12~16h,以菌液为模板PCR扩增,进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。GL_0002189和BP26分别扩增出约660bp、753bp的条带,与预期的目的条带大小相符。
1.2.6重组表达质粒的双酶切鉴定
经PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒(按照Axygen质粒提取试剂盒说明书操作)用限制性内切酶(EcoR I、Xho I)进行双酶切,酶切产物电泳检测,结果见图5、图6。结果均出现两个条带,分别为GL_0002189(0.6kb、5.4kb),BP26(0.7kb、5.4kb),结果表明两个目的片段成功***表达载体pET30a中。
1.2.7测序结果及分析
经PCR鉴定和双酶切鉴定呈阳性的菌液进行双向测序,为了确保测序结果的准确性,每个基因挑取3个独立的阳性菌株进行双向测序。双向测序得到的GL_0002189序列与全基因组测序得到的GL_0002189基因核苷酸序列比对同源性均为100%。双向测序得到的BP26序列在NCBI公布的序列同源性为100%。说明GL_0002189及BP26成功克隆至载体pMD19-T中,并成功构建重组表达载体。
1.2.8重组表达菌诱导条件优化
1.2.8.1重组表达菌诱导时间优化
重组表达菌BL21(pETGL_0002189)和BL21(pETBP26)培养至OD600达到0.6~1.0后,加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM,分别在0h、1h、2h、3h、4h、6h每个时间点各取2mL菌液,1mL测吸光值OD600,另1mL离心收集菌体,菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸10min,12%SDS-PAGE电泳检测,结果见图7、图8。结果表明:重组表达菌BL21(pETGL_0002189)和BL21(pETBP26)与空菌BL21(DE3)、pET30和未诱导的重组菌比较,分别在29KDa、32KDa处多出了一个条带,与预期的目的表达产物大小一致。
1.2.8.2重组表达菌IPTG诱导浓度优化
重组表达菌BL21(pETGL_0002189)和BL21(pETBP26)培养至OD600达到0.6~1.0之后,加入IPTG诱导剂至终浓度0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM继续培养4h,取2mL菌液,1mL测吸光值OD600,另1mL离心收集菌体,菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸10min,12%SDS-PAGE电泳检测,结果见图9、图10。结果表明:重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)与空菌BL21(DE3)、pET30和未诱导的重组菌相比分别在29KDa、32KDa处多出了一个条带,这与预期的目的表达产物大小一致。从图可见,IPTG终浓度0.05mM时各个重组表达菌与其他浓度的IPTG诱导相比表达量明显低,而IPTG终浓度0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM时各个重组菌表达量没有明显差异,为保证重组蛋白的高效表达,诱导剂IPTG最佳诱导浓度确定为较高的浓度1.0mM。
1.2.8.3重组表达菌诱导温度优化
重组表达菌BL21(pETGL_0002189)、BL21(pETBP26)培养至OD600 0.6~1.0时加入IPTG诱导剂至终浓度1.0mM,分别在25℃、30℃、37℃下,150r/min培养4h后各取2mL菌液,1mL测吸光值OD600,另1mL离心收集菌体,加入蛋白上样缓冲液煮沸10min,12%SDS-PAGE电泳检测,结果见图11、图12。从图可以看出2个重组蛋白在25℃诱导表达量明显比30℃、37℃诱导表达量低,从OD600和蛋白条带可见30℃、37℃诱导表达量没有明显差异。根据重组蛋白不同温度下生长情况,2个重组蛋白最佳诱导温度定为37℃,结果见图13。
1.2.9最佳诱导条件下重组蛋白表达形式的检测
确定重组蛋白最佳诱导条件后,诱导表达重组菌,离心收集菌体沉淀,裂解菌体,离心收集沉淀和上清,进行12%SDS-PAGE电泳,发现两个重组蛋白都以包涵体形式存在,结果见图14。
1.2.10重组蛋白包涵体溶解及蛋白纯化
两个基因重组表达诱导培养后,离心收集菌体,裂解,离心收集的沉淀用8M尿素溶解,再离心收集上清液,0.45μm孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化步骤过柱子纯化蛋白,得到了较纯的重组蛋白,结果见图15。
1.2.11重组蛋白Western-bloting检测
以Mouse Anti-His.tag IgG为抗体做Western-Blotting检测,两个重组菌蛋白BL21(pETGL_0002189)及BL21(pETBP26)分别在29KDa、32KDa处出现了特异性条带,证明重组蛋白融合表达了pET30表达载体上的His标签,结果见图16。
以S2免疫绵羊血清作为抗体检测,重组蛋白GL_0002189及BP26与空菌BL21(DE3)比较,分别在29KDa、32KDa处出现了特异性条带,表明重组蛋白能够与S2免疫血清中的抗体发生特异性反应,具有较好的免疫原性。而重组蛋白GL_0002189与自然感染血清不反应,重组蛋白BP26与自然感染血清反应,说明GL_0002189基因是S2特有的,而在自然感染羊种/牛种流行株中不存在,结果见图17、图18。
实施例2 IELISA鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的方法
2.1实验方法
2.1.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
按照棋盘滴定法,将实施例1中纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释,稀释梯度为1:25、1:50、1:100、1:200四个梯度,抗原初始浓度分别为GL_0002189(0.421mg/mL)、BP26(0.553mg/ml),每孔加100μl,4℃包被过夜,第二天弃掉孔内液体,用洗涤液洗三次,每次静置5min,洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μl封闭液,在37℃放置2h,用洗涤液洗三次,每次静置5min,洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。将已知阳性、阴性血清按1:50、1:100、1:200、1:400的四个梯度进行稀释,每孔加100μl稀释好的血清,37℃放置1h,用洗涤液洗三次,每次静置5min,洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μl按1:7000稀释的驴抗绵羊IgG-HRP,37℃放置30min,用洗涤液洗三次,每次静置5min,洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μl TMB显色液,37℃显色10min。显色结束后,每孔加100μl终止液终止反应,并在酶标仪上读取OD450值。根据OD450值计算每组的P/N值,P/N=实验组/对照组=OD阳性血清/OD阴性血清,P/N值最大时所对应的抗原稀释度和血清稀释度为最佳稀释度。
2.1.2二抗最佳最佳浓度的确定
按照棋盘滴定法,将纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释,稀释梯度为1:25、1:50、1:100、1:200四个梯度,抗原初始浓度分别为GL_0002189(0.421mg/mL)、BP26(0.553mg/ml),按上述操作方法进行抗原包被、洗涤、封闭和阴阳性血清的稀释,驴抗绵羊IgG-HRP按1:5000、1:7500、1:10000、1:15000四个梯度稀释,每孔加100μl,进行IELISA试验。根据OD450值计算每个二抗稀释度的P/N值,P/N值最大时所对应的二抗稀释度即为最佳二抗稀释度。
2.1.3重复性实验
对2份阳性血清和2份绵羊阴性血清进行检测,每个样品重复3次,计算每个样品标准差。
2.1.4判定点的确定
GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清,通过SPSS软件ROC分析,确认两个重组抗原IELISA判定点。
2.1.5敏感性和特异性实验
GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清,通过SPSS软件分析,确认两个重组抗原IELISA敏感性和特异性。
2.1.6田间实验
将待检的血清进行IELISA检测,比较两种抗原的阳性检出率。
2.2实验结果
2.2.1最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将纯化好的GL_0002189和Bp26抗原按四个梯度稀释,已知阳性血清和阴性血清按四个梯度稀释,进行IELISA检测,根据IELISA显色后的颜色和OD450值能看出阳性、阴性血清颜色和OD450值大小存在明显差异,结果见表3、表4。根据P/N值计算出抗原最佳包被浓度为1:100,血清最佳稀释度为1:100,结果见表5、表6。
表3 GL_0002189抗原棋盘滴定OD450值
表4 BP26抗原棋盘滴定OD450值
表.5 GL_0002189抗原对应的P/N值
表.6 BP26抗原对应的P/N值
2.2.2酶标二抗最佳稀释度的确定
根据IELISA显色终止反应的颜色及计算P/N值大小,确定酶标二抗最佳稀释度为1:7500,结果见表7、表8。
表7 GL_0002189酶标二抗最佳工作浓度的确定
表8 BP26酶标二抗最佳工作浓度的确定
2.2.3重复实验
选取2份阳性血清和阴性血清,用两种重组抗原IELISA检测,每个样品重复3次。3次重复OD450差异不明显,表明两种重组抗原建立的IELISA检测方法均具有较好的重复性,结果如表9。
表9重组抗原重复实验OD450值及SD值
2.2.4判定点的确定
GL_0002189和BP26抗原用iELISA法检测血清,OD450值结果见表10、表11。利用SPSS软件根据OD450值进行ROC分析,确定重组抗原GL_0002189iELISA判定点为0.57,重组抗原BP26iELISA判定点为0.589,判定点分析见图19、图20。重组抗原GL_0002189ROC分析曲线下面积为0.987,重组抗原BP26ROC分析曲线下面积为0.987,2个重组抗原ROC分析曲线下面积均接近1,说明2个重组抗原iELISA检测法可靠性高,结果见图21、图22。
表.10 GL_0002189判定点OD450值
表11 BP26判定点OD450值
2.2.5特异性敏感性分析
GL_0002189和BP26抗原检测20份背景清楚的布鲁氏菌自然感染血清及30份布鲁氏菌S2免疫血清,通过SPSS软件分析发现重组抗原GL_0002189 IELISA 敏感性为95%、特异性为95%,重组抗原BP26 IELISA 敏感性为90%、特异性为86.7%,具体结果见图19、图20。
2.2.6田间实验
对180份SAT及RBPT检测呈阳性的布鲁氏菌感染血清进行IELISA检测,以GL_0002189抗原检测出61个阳性,BP26检测出176个阳性,说明180份血清中有61个为S2疫苗抗体阳性绵羊。GL_0002189抗原IELISA 检测方法检出S2疫苗抗体阳性率为33.8%(61/180),而BP26抗原IELISA检测方法检出阳性率为98.8%(176/180),说明在SAT及RBPT检测呈阳性的家畜中,存在疫苗抗体干扰检测的假阳性。GL_0002189可用于布鲁氏菌S2疫苗感染与羊种/牛种布鲁氏菌自然感染的鉴别诊断,结果见表12。
表12田间实验结果
可见,本发明建立的IELISA鉴别检测方法能鉴别S2疫苗免疫与自然感染的布鲁氏菌病,且该方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.GL_0002189抗原蛋白,其特征在于,其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白的编码基因。
3.用于扩增权利要求2所述基因的特异性PCR引物。
4.权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂中的应用。
5.家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂,其特征在于,所述IELISA检测试剂的有效成分为权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白,或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
6.鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的胶体金试纸条,其特征在于,所述试纸条上包被有权利要求1所述GL_0002189抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白,或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
7.家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包含权利要求5所述的IELISA检测试剂。
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Families Citing this family (3)
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CN111796091B (zh) * | 2020-07-20 | 2023-09-08 | 天康生物制药有限公司 | 用于区分动物感染布氏杆菌或布氏杆菌菌影疫苗的试剂盒 |
CN113637056B (zh) * | 2021-07-28 | 2023-07-18 | 内蒙古农业大学 | 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1337269C (en) * | 1987-03-30 | 1995-10-10 | Leslie G. Adams | Vaccine against brucella abortus |
CN102621304A (zh) * | 2011-01-30 | 2012-08-01 | 吉林农业大学 | 鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法 |
CN104166000A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-11-26 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于鉴定布鲁氏菌自然感染或免疫接种家畜的方法 |
CN104862405A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-08-26 | 何洪彬 | 鉴别气溶胶中布鲁氏菌s2疫苗株的引物、探针以及试剂盒 |
CN105002173A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-10-28 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的试剂盒 |
CN105018489A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-04 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒 |
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1337269C (en) * | 1987-03-30 | 1995-10-10 | Leslie G. Adams | Vaccine against brucella abortus |
CN102621304A (zh) * | 2011-01-30 | 2012-08-01 | 吉林农业大学 | 鹿布氏杆菌病间接酶联免疫吸附检测法 |
CN104166000A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-11-26 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于鉴定布鲁氏菌自然感染或免疫接种家畜的方法 |
CN104862405A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-08-26 | 何洪彬 | 鉴别气溶胶中布鲁氏菌s2疫苗株的引物、探针以及试剂盒 |
CN105002173A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-10-28 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的试剂盒 |
CN105018489A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-04 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MULTISPECIES: hypothetical protein [Brucella];NCBI;《GenBank Database》;20130507;Accession No.WP-004692406 * |
NCBI.MULTISPECIES: hypothetical protein [Brucella].《GenBank Database》.2013,Accession No. WP-004692406. * |
布鲁氏菌疫苗株S2全基因组测序及牛羊布鲁氏菌比较基因组学研究;红梅 等;《中国***共患病学报》;20141130;第30卷(第11期);第1133-1136页 * |
鉴别布鲁氏菌S2疫苗株斑点杂交检测方法的建立;张岩;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20151215(第12期);D050-185 * |
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