CN108178787A - pORF131重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

pORF131重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108178787A
CN108178787A CN201711461888.9A CN201711461888A CN108178787A CN 108178787 A CN108178787 A CN 108178787A CN 201711461888 A CN201711461888 A CN 201711461888A CN 108178787 A CN108178787 A CN 108178787A
Authority
CN
China
Prior art keywords
porf131
recombinant proteins
thr
pro
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711461888.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108178787B (zh
Inventor
刘振兴
曹俊明
马艳平
梁志凌
马江耀
柯浩
郝乐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201711461888.9A priority Critical patent/CN108178787B/zh
Publication of CN108178787A publication Critical patent/CN108178787A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108178787B publication Critical patent/CN108178787B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了pORF131重组蛋白及其制备方法和应用，pORF131重组蛋白依次由SEQ ID NO.7—SEQ ID NO.10所示氨基酸序列通过连接子连接而成，所述连接子为4－7个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。经ELISA显示，本发明所述pORF131重组蛋白可以作为包被抗原，能很好地用以检测CyHV‑3 ORF131完整编码序列构建的DNA疫苗免疫锦鲤后产生的血清特异性抗体，以及诊断锦鲤是否感染鲤疱疹病毒3型。

Description

pORF131重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗原抗体领域，具体是涉及pORF131重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)又称锦鲤疱疹病毒(KoiHerpesvirus，KHV)，属于疱疹病毒目(Herpesvirales)，异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)，鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)，是一种双链线性DNA病毒，具有囊膜结构。该病毒严重威胁鲤(Cyprinus carpio)及其观赏品种：锦鲤，致死率高达80％-100％。鲤疱疹病毒3型基因组约295kb，编码156个不同的ORF(Aoki等，2007)。囊膜蛋白位于病毒最外层，在病毒与宿主细胞的识别、互作以及入侵过程中发挥着重要作用，也是建立检测方法和防治手段的重要靶分子(Yi等，2014；Fuchs等，2014)。CyHV-3 ORF131属毒囊膜蛋白编码基因，该基因包含2个内含子结构(刘振兴，2015)，其完整编码序列(complete CDS)全长1287bp，编码蛋白包含428个氨基酸。
CyHV-3 ORF131有待于进一步开发其相关相应。
发明内容
本发明的目的之一是提供新的pORF131重组蛋白，其可以用于检测CyHV-3 ORF131完整编码序列构建的DNA疫苗免疫锦鲤后产生的血清特异性抗体。
实现上述目的的技术方案如下。
pORF131重组蛋白，其依次由SEQ ID NO.7—SEQ ID NO.10所示氨基酸序列通过连接子连接而成，所述连接子为4－7个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。
所述连接子组成为GGGGS。
一种编码上述pORF131重组蛋白的表达基因，其序列，包括a：其核苷酸序列如SEQID NO.6所示；b：与a的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列；C:对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
上述pORF131重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
上述编码所述pORF131重组蛋白的表达基因通过HindIII/XhoI双酶切***pET32a(+)载体，构建重组质粒pET32a-modORF131；
再转入DH5α，PCR筛选阳性转化菌株，阳性菌株测序鉴定后提取质粒，分别转入BL21(DE3)表达菌株；
挑取转化pET32a-modORF131的BL21(DE3)表达菌株，接种于Amp抗性的LB培养基中培养过夜，再接种于LB新鲜培养基中，再加入IPTG诱导表达、纯化，即得。
编码所述pORF131重组蛋白的表达基因的序列如SEQ ID NO.6。
本发明的另一目的是提供一种检测锦鲤血清中针对CyHV-3pORF131的特异性抗体的试剂盒。
具体技术方案如下：
检测锦鲤的血清特异性抗体的试剂盒，包括有所述pORF131重组蛋白。
在其中一个实施例中，所述试剂盒为ELISA试剂盒，包括有用所述pORF131重组蛋白包被的酶标板。
在其中一个实施例中，还包括有鼠抗锦鲤IgM的多克隆抗体。
本发明经过发明人截取了CyHV-3pORF131全部蛋白序列中的抗原表位优势区段进行了原核表达，经ELISA显示，截短表达的蛋白(SEQ ID NO.5)可以作为包被抗原，能很好地用以检测CyHV-3 ORF131完整编码序列构建的DNA疫苗免疫锦鲤后产生的血清特异性抗体，以及诊断锦鲤是否感染鲤疱疹病毒3型。
附图说明
图1为pORF131的重组表达，其中，M:蛋白分子量标准，1：pet32a(+)未诱导，2：pet32a(+)诱导，3：pet32a(+)-compORF131未诱导，4：pet32a(+)-compORF131诱导，5：pet32a(+)-modORF131未诱导，6：pet32a(+)-modORF131诱导。
图2为重组表达pORF131的Western blot鉴定，其中M:蛋白分子量标准，1：pet32a(+)-modORF131诱导。
图3为锦鲤血清IgM纯化，M:蛋白Marker，1：未纯化锦鲤血清，2：洗涤穿流液，3：洗脱液。
具体实施方式
以下所述实施例，仅为本发明的优选方案，在实际操作中，可根据需要选择不同的分离条件。
一、材料与方法
1.CyHV-3 ORF131的序列分析与优化、合成
CyHV-3 ORF131基因编码病毒囊膜蛋白，对ORF131基因及蛋白序列(GenBankNo.KP004905、AJK93611)进行分析，预测抗原表位优势区段。最终，根据发明人的经验，经过多次评估，确定表达抗原表位优势区段的编码序列(SEQ ID NO.5)后，送金唯智公司进行密码子优化与序列合成。
2.pET32a-compORF131、pET32a-modORF131重组质粒的构建与表达
表1ORF131扩增引物序列(5’-3’)
Table 1Sequence of ORF131gene amplification
采用Trizol试剂从CyHV-3HZ419株感染CCB细胞的培养物中提取RNA，以提取的RNA作为模板，参照1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara)说明书反转录第一链cDNA。以上述第一链cDNA为模板，采用Prime Star Max高保真酶，以引物131Hind3CF/131XholR(表1)扩增ORF131完整编码序列。反应程序采用：94℃5min预变性；94℃30s,59℃30s，72℃90s，35个循环；72℃5min总延伸，4℃保存。以金唯智合成的编码抗原表位优势区段的ORF131(SEQ ID NO.6)为模板，以引物131Hind3MF/131XholMR(表1)扩增优化的ORF131。
将上述ORF131完整编码序列扩增产物以及优化片段的扩增产物(SEQ ID NO.6)通过HindIII/XhoI双酶切分别***pET32a(+)载体，构建的重组质粒分别命名为pET32a-compORF131、pET32a-modORF131，转入DH5α，PCR筛选阳性转化菌株，阳性菌株测序鉴定后提取质粒，分别转入BL21(DE3)表达菌株。挑取转入重组质粒的BL21(DE3)表达菌株，接种于Amp抗性的LB培养基中培养过夜，再按1:100比例接种于100mL LB新鲜培养基中，37℃，220rpm/min培养至菌液OD值达到0.4-0.5，加入0.8mM IPTG于28℃、诱导表达。参照NovagenPET表达***手册进行蛋白表达与可溶性分析。选取最佳表达条件下的蛋白表达产物，采用Novagen His Bind蛋白纯化试剂盒进行纯化，纯化蛋白经BCA试剂盒定量后-80℃保存，得到pORF131(pET32a-modORF131)表达蛋白(SEQ ID NO.5)。
3.重组pORF131的Western-blot分析
纯化蛋白SDS-PAGE电泳后，经100mA，1.5h转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭液37℃封闭2h后PBST洗膜3次，加入1:1000稀释的HRP标记的抗His标签鼠单克隆抗体(金斯瑞生物科技有限公司)37℃孵育2h，PBST洗膜5次后用Bio-Rad生物发光试剂盒检测。
4.锦鲤血清特异性抗体检测ELISA方法的建立
4.1锦鲤血清IgM的纯化
采集锦鲤血清，与4moL/L NaCl(pH8.3)等体积混合，取1mL加入2moL/L NaCl(pH8.3)平衡后的rProteinG预装柱(北京韦氏博慧色谱科技有限公司)，室温静置15min，2moL/L NaCl(pH8.3)洗涤10个柱床，0.05moL/L Gly洗脱，收集洗脱液，1:50加入Tris-HCl(pH8.0)调节pH。纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析。纯化条带切胶后送美吉生物公司进行LC-MS/MS分析。
4.2鼠抗锦鲤IgM的多克隆抗体的制备
以上述纯化的鲤IgM为抗原免疫小鼠，免疫3次，每次间隔2周，第1次抗原加等体积的弗氏完全佐剂，后2次加等体积的弗氏不完全佐剂，免疫剂量为50μg/只，免疫途径为背部和腹部皮下多点注射。采血前3天加强免疫，用不加佐剂抗原腹腔注射，剂量为50μg/只。摘除眼球采血，分离血清采用rProtein A(北京韦氏博慧色谱科技有限公司)，纯化小鼠IgG，-80℃保存。
5.ORF131 DNA疫苗的免疫
参照刘振兴(2015)的方法，将ORF131完整编码序列扩增后利用BglⅡ、HindⅢ酶切位点***pEGFP-N1载体，构建的重组质粒pEGFP-ORF131作为DNA疫苗肌肉注射免疫平均体重20g的锦鲤，免疫剂量为3μg/尾，同时设立pEGFP-N1载体免疫组作为阴性对照，免疫3周后采集血清，-80℃保存。
6.间接EILSA方法检测免疫血清抗体效价
纯化的上述pORF131(pET32a-modORF131)表达蛋白，用CBS稀释至320μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜，PBST洗涤3次；加入封闭液(1％BSA)，37℃封闭1.5h，PBST洗涤3次；加入1:300稀释的锦鲤血清(包括上述第5点经过DNA疫苗免疫的锦鲤血清，以及作为对照的pEGFP-N1载体免疫的锦鲤血清)100μL/孔，25℃孵育1.5h，PBST洗涤5次；加入100μL/孔1:3000稀释鼠抗锦鲤多克隆抗体(上述4.2所制备得到的)，37℃孵育2.5h，PBST洗涤5次；加入100μL/孔1:8000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，37℃孵育2h，PBST洗涤5次；加入100μL/孔TMB工作液，37℃孵育30min。加入50μL/孔终止液，检测OD450。
二、结果分析
1、pORF131序列分析与B细胞表位优势区段预测
CyHV-3HZ419株ORF131完整编码序列全长1287bp，编码蛋白包含428个氨基酸。该基因包含1个信号肽(Met1～Gly22)以及1个跨膜区段(Phe393～Ile415)。经过发明人的研究后，最终确定pORF131的4个B细胞表位优势区段：Cys20-Val140,Ser169-Tyr245,Thr259-Pro390,Phe414-Gln428。
稀有密码子分析显示，CyHV-3 ORF131完整编码序列中低丰度密码子(threshold＝10)有71个(E.coli Codon Usage Analyzer 2.1)，为提高蛋白表达效率，上述4个B细胞表位优势区段(SEQ ID.NO.7—10)采用Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)柔性区段(连接子)连接后(SEQ ID.NO.5)送金唯智公司,按照大肠杆菌偏好性密码子进行密码子优化与序列(SEQID.NO.6)合成。具体序列如下。
SEQ ID NO.5：
CQGDDDISVSCDDVTGSVGKEVTLTCNISLQCPDCSIKKCKFRSPTDSVICEQELLNDSCEQSNSFTCRYTTTTAMTEKFSFFVQTKCGMKQTEFTVDISDITISFETPELVEAYVNDVKV(SEQ ID.NO.7)GGGGSSGRVMIPEEEFLIQTAGLTTIPPTTRPTPPTAATLPPIITINVADPTTTRPTTTFTLPPTTPTTPSLEQLAASRAVY(SEQ ID.NO.8)
GGGGSTTPLPTTTTTPGTTTPPAPTPGLVVPLAQLREAFDPVYYSSLAPDTLPLPQPQVARIIAGPSTIRYKVTDPPPTHAPTVAMSTLPPSTTASTAPTTPTVPRSTLHWLNPAGFANQFHNCGSGSEALFKCSKGP(SEQ ID.NO.9)GGGGSFIKKRNAPVNYHPLQ(SEQ ID.NO.10)。
pORF131B细胞表位优势区段的密码子优化序列
TGCCAGGGCGACGATGATATCAGCGTGAGTTGCGACGATGTTACCGGTAGCGTGGGCAAAGAGGTGACCCTGACCTGCAACATCAGCCTGCAGTGCCCGGATTGTAGCATTAAGAAATGCAAGTTTCGTAGTCCGACCGACAGCGTTATTTGCGAGCAGGAACTGCTGAACGATAGCTGCGAGCAGAGTAACAGCTTCACCTGCCGCTATACCACCACCACCGCCATGACCGAGAAATTCAGTTTCTTTGTGCAAACCAAATGCGGCATGAAACAGACCGAGTTCACCGTGGACATCAGTGACATCACCATCAGCTTTGAAACCCCGGAACTGGTGGAGGCCTACGTGAATGACGTGAAGGTTGGCGGTGGCGGCAGTAGTGGTCGCGTTATGATCCCGGAAGAAGAGTTTCTGATCCAGACCGCCGGCTTAACCACAATTCCGCCTACCACCCGTCCGACCCCCCCTACAGCAGCAACCCTGCCGCCGATCATTACCATTAACGTGGCAGACCCGACCACCACCCGTCCGACAACCACCTTCACCCTGCCGCCTACCACCCCTACCACACCGAGCCTGGAACAGCTGGCAGCAAGCCGTGCCGTTTATGGCGGTGGCGGTAGCACCACACCGCTGCCGACCACAACCACCACACCGGGTACCACAACACCGCCGGCCCCTACACCTGGTCTGGTTGTGCCTCTGGCCCAGCTGCGTGAGGCCTTTGACCCGGTTTACTATAGCAGCCTGGCCCCGGATACCTTACCGCTGCCTCAGCCTCAGGTGGCCCGCATTATCGCAGGCCCGAGCACAATTCGCTATAAGGTTACCGATCCGCCTCCGACCCATGCACCTACCGTGGCAATGAGCACCTTACCGCCGAGTACCACCGCCAGCACAGCACCGACAACCCCGACAGTGCCGCGTAGCACCTTACACTGGCTGAATCCGGCCGGCTTTGCCAATCAGTTCCACAACTGCGGTAGCGGCAGCGAGGCCCTGTTTAAATGCAGCAAAGGCCCTGGTGGCGGCGGTAGCTTTATCAAGAAGCGCAACGCACCGGTGAATTATCACCCGCTGCAG(SEQ ID NO.6)。
2.重组蛋白的诱导表达
pet32a(+)-compORF131与pet32a(+)-modORF131表达的融合蛋白理论分子量分别为65.7kDa，57.8kDa，采用0.8mM IPTG，28℃诱导4h仅pet32a(+)-modORF131在目的条带附近可见明显表达的条带(图1)，pet32a(+)-compORF131在目的条带附近未见明显表达的条带。可溶性分析表明，蛋白以包涵体形式表达。利用Novagen His Bind蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白，经抗His标签的鼠单克隆抗体Western-blot分析，在57.8kD处杂交到明显的条带(图2)。
3.重组pORF131在ELISA方法中的应用
3.1鲤血清IgM的纯化与鼠抗鲤多克隆抗体的制备
SDS-PAGE显示在>70kDa附近出现明显条带，推测为锦鲤IgM重链(图3)，美吉公司LC-MS/MS质谱鉴定证实该蛋白为鲤血清IgM重链。以纯化的锦鲤IgM分3次免疫小鼠，加强免疫后3天，摘除眼球采血，ELISA检测表明，制备的鼠抗血清效价>1:160,000。
3.2特异性抗体检测ELISA方法的应用
以本研究制备的鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体为检测抗体，以纯化的重组pORF131为包被抗原，建立的间接EILSA方法检测锦鲤免疫血清抗体效价，结果表明5尾免疫锦鲤血清OD450为分别为0.532、0.522、0.511、0.488、0.482，pEGFP-N1载体免疫血清(阴性对照)OD450为≤0.220，P/N＞2.1。重复多次，检测结果稳定。该方法可以评价特异性抗体水平。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> pORF131重组蛋白及其制备方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaagcttg catgaatgct gtaaatgctg tgcaact 37
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgagc tggagcgggt gatagttgac 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccaagcttg ctgccagggc gacgatgat 29
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagc tgcagcgggt gataattc 28
<210> 6
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Gln Gly Asp Asp Asp Ile Ser Val Ser Cys Asp Asp Val Thr Gly
1 5 10 15
Ser Val Gly Lys Glu Val Thr Leu Thr Cys Asn Ile Ser Leu Gln Cys
20 25 30
Pro Asp Cys Ser Ile Lys Lys Cys Lys Phe Arg Ser Pro Thr Asp Ser
35 40 45
Val Ile Cys Glu Gln Glu Leu Leu Asn Asp Ser Cys Glu Gln Ser Asn
50 55 60
Ser Phe Thr Cys Arg Tyr Thr Thr Thr Thr Ala Met Thr Glu Lys Phe
65 70 75 80
Ser Phe Phe Val Gln Thr Lys Cys Gly Met Lys Gln Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Val Asp Ile Ser Asp Ile Thr Ile Ser Phe Glu Thr Pro Glu Leu Val
100 105 110
Glu Ala Tyr Val Asn Asp Val Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly
115 120 125
Arg Val Met Ile Pro Glu Glu Glu Phe Leu Ile Gln Thr Ala Gly Leu
130 135 140
Thr Thr Ile Pro Pro Thr Thr Arg Pro Thr Pro Pro Thr Ala Ala Thr
145 150 155 160
Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ile Asn Val Ala Asp Pro Thr Thr Thr Arg
165 170 175
Pro Thr Thr Thr Phe Thr Leu Pro Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Ser
180 185 190
Leu Glu Gln Leu Ala Ala Ser Arg Ala Val Tyr Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Thr Thr Pro Leu Pro Thr Thr Thr Thr Thr Pro Gly Thr Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Ala Pro Thr Pro Gly Leu Val Val Pro Leu Ala Gln Leu Arg Glu
225 230 235 240
Ala Phe Asp Pro Val Tyr Tyr Ser Ser Leu Ala Pro Asp Thr Leu Pro
245 250 255
Leu Pro Gln Pro Gln Val Ala Arg Ile Ile Ala Gly Pro Ser Thr Ile
260 265 270
Arg Tyr Lys Val Thr Asp Pro Pro Pro Thr His Ala Pro Thr Val Ala
275 280 285
Met Ser Thr Leu Pro Pro Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ala Pro Thr Thr
290 295 300
Pro Thr Val Pro Arg Ser Thr Leu His Trp Leu Asn Pro Ala Gly Phe
305 310 315 320
Ala Asn Gln Phe His Asn Cys Gly Ser Gly Ser Glu Ala Leu Phe Lys
325 330 335
Cys Ser Lys Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ile Lys Lys Arg Asn
340 345 350
Ala Pro Val Asn Tyr His Pro Leu Gln
355 360
<210> 5
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccagggcg acgatgatat cagcgtgagt tgcgacgatg ttaccggtag cgtgggcaaa 60
gaggtgaccc tgacctgcaa catcagcctg cagtgcccgg attgtagcat taagaaatgc 120
aagtttcgta gtccgaccga cagcgttatt tgcgagcagg aactgctgaa cgatagctgc 180
gagcagagta acagcttcac ctgccgctat accaccacca ccgccatgac cgagaaattc 240
agtttctttg tgcaaaccaa atgcggcatg aaacagaccg agttcaccgt ggacatcagt 300
gacatcacca tcagctttga aaccccggaa ctggtggagg cctacgtgaa tgacgtgaag 360
gttggcggtg gcggcagtag tggtcgcgtt atgatcccgg aagaagagtt tctgatccag 420
accgccggct taaccacaat tccgcctacc acccgtccga ccccccctac agcagcaacc 480
ctgccgccga tcattaccat taacgtggca gacccgacca ccacccgtcc gacaaccacc 540
ttcaccctgc cgcctaccac ccctaccaca ccgagcctgg aacagctggc agcaagccgt 600
gccgtttatg gcggtggcgg tagcaccaca ccgctgccga ccacaaccac cacaccgggt 660
accacaacac cgccggcccc tacacctggt ctggttgtgc ctctggccca gctgcgtgag 720
gcctttgacc cggtttacta tagcagcctg gccccggata ccttaccgct gcctcagcct 780
caggtggccc gcattatcgc aggcccgagc acaattcgct ataaggttac cgatccgcct 840
ccgacccatg cacctaccgt ggcaatgagc accttaccgc cgagtaccac cgccagcaca 900
gcaccgacaa ccccgacagt gccgcgtagc accttacact ggctgaatcc ggccggcttt 960
gccaatcagt tccacaactg cggtagcggc agcgaggccc tgtttaaatg cagcaaaggc 1020
cctggtggcg gcggtagctt tatcaagaag cgcaacgcac cggtgaatta tcacccgctg 1080
cag 1083
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Cys Gln Gly Asp Asp Asp Ile Ser Val Ser Cys Asp Asp Val Thr Gly
1 5 10 15
Ser Val Gly Lys Glu Val Thr Leu Thr Cys Asn Ile Ser Leu Gln Cys
20 25 30
Pro Asp Cys Ser Ile Lys Lys Cys Lys Phe Arg Ser Pro Thr Asp Ser
35 40 45
Val Ile Cys Glu Gln Glu Leu Leu Asn Asp Ser Cys Glu Gln Ser Asn
50 55 60
Ser Phe Thr Cys Arg Tyr Thr Thr Thr Thr Ala Met Thr Glu Lys Phe
65 70 75 80
Ser Phe Phe Val Gln Thr Lys Cys Gly Met Lys Gln Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Val Asp Ile Ser Asp Ile Thr Ile Ser Phe Glu Thr Pro Glu Leu Val
100 105 110
Glu Ala Tyr Val Asn Asp Val Lys Val
115 120
<210> 8
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ser Gly Arg Val Met Ile Pro Glu Glu Glu Phe Leu Ile Gln Thr Ala
1 5 10 15
Gly Leu Thr Thr Ile Pro Pro Thr Thr Arg Pro Thr Pro Pro Thr Ala
20 25 30
Ala Thr Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ile Asn Val Ala Asp Pro Thr Thr
35 40 45
Thr Arg Pro Thr Thr Thr Phe Thr Leu Pro Pro Thr Thr Pro Thr Thr
50 55 60
Pro Ser Leu Glu Gln Leu Ala Ala Ser Arg Ala Val Tyr
65 70 75
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Pro Leu Pro Thr Thr Thr Thr Thr Pro Gly Thr Thr Thr Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Thr Pro Gly Leu Val Val Pro Leu Ala Gln Leu Arg Glu
20 25 30
Ala Phe Asp Pro Val Tyr Tyr Ser Ser Leu Ala Pro Asp Thr Leu Pro
35 40 45
Leu Pro Gln Pro Gln Val Ala Arg Ile Ile Ala Gly Pro Ser Thr Ile
50 55 60
Arg Tyr Lys Val Thr Asp Pro Pro Pro Thr His Ala Pro Thr Val Ala
65 70 75 80
Met Ser Thr Leu Pro Pro Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ala Pro Thr Thr
85 90 95
Pro Thr Val Pro Arg Ser Thr Leu His Trp Leu Asn Pro Ala Gly Phe
100 105 110
Ala Asn Gln Phe His Asn Cys Gly Ser Gly Ser Glu Ala Leu Phe Lys
115 120 125
Cys Ser Lys Gly Pro
130
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Phe Ile Lys Lys Arg Asn Ala Pro Val Asn Tyr His Pro Leu Gln
1 5 10 15

Claims (9)

1.pORF131重组蛋白，其特征是，其依次由SEQ ID NO.7—SEQ ID NO.10所示氨基酸序列通过连接子连接而成，所述连接子为4－7个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征是，所述连接子组成为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
3.一种编码权利要求1所述的pORF131重组蛋白的表达基因，其特征是，其序列，包括a：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；b：与a的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列；C:对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的pORF131重组蛋白的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
权利要求3所述编码所述pORF131重组蛋白的表达基因通过HindIII/XhoI双酶切***pET32a(+)载体，构建重组质粒pET32a-modORF131；
再转入DH5α，PCR筛选阳性转化菌株，阳性菌株测序鉴定后提取质粒，分别转入BL21(DE3)表达菌株；
挑取转化pET32a-modORF131的BL21(DE3)表达菌株，接种于Amp抗性的LB培养基中培养过夜，再接种于LB新鲜培养基中，再加入IPTG诱导表达、纯化，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述编码所述pORF131重组蛋白的表达基因的序列如SEQ ID NO.6所示。
6.权利要求1-2任一项所述的pORF131重组蛋白在制备检测锦鲤的血清特异性抗体的试剂盒中的应用。
7.检测锦鲤的血清特异性抗体的试剂盒，其特征是，包括有权利要求1或2所述的pORF131重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的检测锦鲤的血清特异性抗体的试剂盒，其特征是，所述试剂盒为ELISA试剂盒，包括有用权利要求1或2所述pORF131重组蛋白包被的酶标板。
9.根据权利要求7或8所述的检测锦鲤的血清特异性抗体的试剂盒，其特征是，还包括有鼠抗锦鲤IgM的多克隆抗体。
CN201711461888.9A 2017-12-28 2017-12-28 pORF131重组蛋白及其制备方法和应用 Active CN108178787B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711461888.9A CN108178787B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 pORF131重组蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711461888.9A CN108178787B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 pORF131重组蛋白及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108178787A true CN108178787A (zh) 2018-06-19
CN108178787B CN108178787B (zh) 2019-10-18

Family

ID=62548443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711461888.9A Active CN108178787B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 pORF131重组蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108178787B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958806A (zh) * 2022-06-14 2022-08-30 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种鲤lpl1重组蛋白及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450627A (zh) * 2014-12-24 2015-03-25 广东省农业科学院动物卫生研究所 鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白orf132的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用
CN107056898A (zh) * 2017-02-13 2017-08-18 中国水产科学研究院珠江水产研究所 鲤疱疹病毒3型1301株orf136基因重组表达蛋白、抗体及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450627A (zh) * 2014-12-24 2015-03-25 广东省农业科学院动物卫生研究所 鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白orf132的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用
CN107056898A (zh) * 2017-02-13 2017-08-18 中国水产科学研究院珠江水产研究所 鲤疱疹病毒3型1301株orf136基因重组表达蛋白、抗体及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958806A (zh) * 2022-06-14 2022-08-30 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种鲤lpl1重组蛋白及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108178787B (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111499765B (zh) 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用
WO2016188449A1 (zh) 一种针对cd47的单域抗体
CN107033250B (zh) 牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用
CN113527476B (zh) 抗h5亚型禽流感病毒新纳米抗体及其应用
CN114258399A (zh) 蛋白质容器、多核苷酸、载体、表达盒、细胞、容器的生产方法、病原体识别或疾病诊断方法、容器的用途、和诊断试剂盒
CN110845608B (zh) 一种番茄环斑病毒单克隆抗体及其制备方法
CN110885370B (zh) 分泌番茄环斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其抗体和抗体制备方法
CN110845624B (zh) 一种sumo-cp融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法
CN109306008B (zh) 一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法
CN106350527B (zh) 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体
CN106188283A (zh) 甲型禽流感h7n2的纳米抗体及其应用
CN110577594A (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体a21、应用及试剂盒
CN108178787B (zh) pORF131重组蛋白及其制备方法和应用
CN113583124A (zh) 一种抗前胃泌素释放肽单克隆抗体及其制备方法
US11767356B1 (en) Canine parvovirus nanobody CPV-VHH-E3 and application thereof
CN103725697A (zh) 化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用
CN102675433A (zh) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白活性片段的重组蛋白、及其制备方法和应用
CN108017694B (zh) pORF65重组蛋白及其制备方法和应用
CN112898422B (zh) 一种烟草环斑病毒单克隆抗体及其制备方法和应用
CN108047317B (zh) pORF148重组蛋白及其制备方法和应用
CN110702913B (zh) 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物
CN110981969B (zh) 一种alv-k的elisa试剂盒及其检测方法
CN109021099B (zh) 一种特异性识别1型鸭甲肝病毒的纳米抗体
CN113956353A (zh) 抗猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白单克隆抗体、该单克隆抗体的识别区域及其应用
CN113512098A (zh) 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20180619

Assignee: Guangdong Shun'an Fengtai Aquatic Technology Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF ANIMAL HEALTH, GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2022980021757

Denomination of invention: PORF131 Recombinant Protein and Its Preparation and Application

Granted publication date: 20191018

License type: Common License

Record date: 20221111

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20180619

Assignee: Guangdong yuanpintai Ecological Technology Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF ANIMAL HEALTH, GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2023980053137

Denomination of invention: Recombinant protein pORF131 and its preparation method and application

Granted publication date: 20191018

License type: Common License

Record date: 20231221