CN101935629A - 一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株 - Google Patents
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Abstract
一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，阪崎肠杆菌菌株现已在中国微生物菌种保藏中心已专利保藏。保藏日期为2010年04月06日，保藏编号：CGMCC No.3724。本发明点是：半乳糖醇(卫矛醇)阳性、苦可仁甙阴性、明胶酶阳性、乳糖为迟缓发酵等4种生物特性的阪崎肠杆菌种。该菌株经小鼠急性毒性试验表明，具有较强的毒力和侵袭力，菌株经中国药品生物制品检定所依据《伯杰细菌鉴定手册》第9版对其进行鉴定，确认阪崎肠杆菌。0819-041生物型菌株经中国医学科学院医学信息研究所查新“未检索到半乳糖醇(卫矛醇)阳性；②苦可仁甙阴性；③明胶酶阳性；④乳糖为迟缓发酵等4种生物特性的阪崎肠杆菌种。”为国际上首次发现该生物型阪崎肠杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及一株阪崎肠杆菌新菌株，尤其涉及一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株。
背景技术
奶粉为生活中常用的食品，特别是婴幼儿对乳粉的需求量大，乳粉质量不佳直接影响到婴幼儿身体健康，2003年1月9日，美国美赞臣公司向美国食品及药品管理局(FDA)报告要求回收在美国生产的一批罐装早产儿特殊配方乳粉，回收原因是在该批产品中检验出极微量的阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)。此后，“问题乳粉”事件迅速引起世界广泛关注，污染源阪崎肠杆菌也成为焦点目标。阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)为肠杆菌科、肠杆菌属，有周鞭毛、能运动的无芽孢G-短小杆菌。阪崎肠杆菌最初以婴儿配方乳粉作为传播媒介，导致新生儿出现脑膜炎、败血病、小肠结肠炎坏死等症状。致死率可高达80％。美国食品药品管理局(FDA)于2002年提出在婴幼儿配方乳粉中检测阪崎肠杆菌，随着对阪崎肠杆菌检测的重视，国家质量监督检验检疫总局要求企业生产的每批次婴幼儿配方乳粉出厂前都要进行自检，做到对阪崎肠杆菌检测工作日常化。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株。在阪崎肠杆菌分类上具有较大的价值。
本发明是这样来实现的，其特征是命名为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年04月06日，保藏编号：CGMCCNo.3724。
提取方法为：
(1)用预热45℃缓冲蛋白胨水500ml与100g乳粉摇匀，36℃±1℃培养18-24h；
(2)移取上述培养液10ml加于90ml肠道菌增菌肉汤中36℃±1℃培养18-22h；
(3)取肠道菌增菌肉汤培养物一环划线接种伊红美蓝、山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板各1块，36℃±1℃培养18-24h；
(4)观察菌落形态，从山梨醇麦康凯平板上挑取不发酵山梨醇的单个菌落接种4支TSA钭面、36℃±1℃培养18-24h；
(5)用钭面做触酶、氧化酶、G染色、进一步生化鉴定。
本发明的优点是：1、卫矛醇阳性，2、苦可仁甙阴性，3、明胶酶阳性，4、乳糖为迟缓发酵(72h)。
具体实施方式
本发明是这样实现的
1、材料与方法
材料
菌种来源：阪崎肠杆菌标准株ATCC29544、ATCC29004、CMCC45401由中国药品生物制品检定所提供。0819-041、0814-179、090830、091006、100309、100412菌株由本中心分离，0819-041是本发明中阪崎肠杆菌新菌株的代号，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，专利保藏日期为2010年04月06日，保藏编号：CGMCC No.3724。
培养基：缓冲蛋白胨水(BP)、肠道菌增菌肉汤(EE)、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)、伊红美蓝(EMB)、麦康凯(MacConKey)、山梨醇麦康凯(SorbitolMacConKey)，营养琼脂(NutirentAgar)为杭州天和微生物试剂有限公司生产。结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)，显色培养基(Xa-GicA)由北京陆桥公司生产。
微量生化管：杭州天和微生物试剂有限公司生产，部分为自配。所用培养基经实验室生物学质控考核，符合微生物生长需要。
统计学处理：实验数据统计处理采用SPSS11.5软件进行。
2.方法
2.1检测方法基础研究
2.1.1.两种修复培养基(BP、蒸馏水)比较研究：
(1)取2-8℃冰箱保存3个月(休眠期)阪崎肠杆菌斜面直接制备菌悬液，从10-1-10-9作连续10倍稀释，同时取10-9-10-10.1ml涂布平板各2块，36℃±1℃培养18-24h，菌落计数。
(2)取上述菌悬液从10-9-10-1分别取0.1ml加入A组：9ml含10％婴儿配方乳粉蒸馏水管中；B组：9ml含10％婴儿配方乳粉BP培养液中、置36℃±1℃18-24h培养。
(3)取上述A、B培养液9ml移入90mlEE增菌肉汤中，于36℃±1℃培养18-24h，划线接种EMB、MacConKey、SorbitolMacConKey、VRBGA、Xa-GicA琼脂平板、36℃±1℃培养18-24h观察结果并记录(试验重复3次)。
2.1.1.两种肠道增菌培养基(mLST-Vm、EE)的比较研究：
(1)取18-24h培养的阪崎肠杆菌新鲜斜面制备菌悬液。
用无菌生理盐水从10-1-10-9作连续10倍稀释，同时取10-9-10-10.1ml涂布平板各2块，36℃±1℃培养18-24h，菌落计数。
(2)取上述菌悬液从10-9-10-1分别取0.1ml加入9ml mLST-Vm肉汤与9mlEE肉汤管中、置36℃±1℃培养18-24h，观察结果并记录(试验重复3次)。
2.1.3阪崎肠杆菌在5种分离培养基上生物学特征及生长情况比较：
(1)取18-24h培养的阪崎肠杆菌新鲜斜面制备菌悬液。
(2)用无菌生理盐水从10-1-10-9作连续10倍稀释，取10-4、10-5、10-6分别取0.1ml涂布2％NutirentAgar、EMB、MacConKey、SorbitolMacConKey、VRBGA、Xa-GicA琼脂平板，于36℃±1℃培养18-24h进行比较(试验重复3次)。
2.2检测方法应用
2.2.1样品检测分离鉴定共分4个步骤：
(1)样品修复培养(前增菌)：无菌称取100g乳粉加入500ml预热45℃BP中，混匀，经36℃±1℃培养18-24h。
(2)样品肠道增菌培养：移取10ml加入90mlEE肉汤中，于36℃±1℃培养18-24h。
(3)样品分离培养：取EE增菌肉汤培养物1环，分别划线接种EMB、MacConKey、 SorbitolMacConKey琼脂平板各1块，置36℃±1℃培养18-24h。
(4)菌株生化鉴定：挑取单个可疑菌落接种TSA钭面，生化鉴定。
2.2.3 0819-041菌株急性毒性试验：
用灭菌营养肉汤制备菌悬液，培养6h，菌液浓度为104-105/ml。接种昆明小鼠体重17g-19g。每组3只，实验组腹腔注射菌悬液0.5ml，同时设对照组注射灭菌营养肉汤0.5ml。观察小白鼠中毒症状，如有死亡进行解剖观察(江西省职业病防治研究院为CNAS认可实验室)。
2.2.4 0819-041菌株感染动物组织病理学切片检测
取死亡小鼠组织以10％甲醛固定后，再经石蜡包埋，切片后用苏木素-伊红染色，镜检病理变化(江西省职业病防治研究院为CNAS认可实验室)。
2.2.5三种方法检测阪崎肠杆菌的应用比较
应用本研究方法与SN/T1632.1-2005行业标准、GB/T4789.40-2008国家标准，对2008年市场抽检的39件婴幼儿配方乳粉，2009年市场抽检的23件婴幼儿配方乳粉，2010年1月-5月市场抽检17件婴幼儿配方乳粉，同时检测进行比较，以评价本研究方法的准确性。
3.结果
3.1应用研究结果
3.1.1阪崎肠杆菌在自选的3种肠道分离培养基上生物学特性：
我们分离的阪崎肠杆菌在EMB琼脂平板上呈***粘液状，菌落较大，相邻菌落之间易于融合。在MacConKey琼脂平板上大小2-3mm，呈淡粉色。在SorbitolMacConKey琼脂平板上不发酵山梨醇，形成中等大小、圆形突起、边缘整齐的淡黄色菌落。
3.1.2阪崎肠杆菌形态与染色 革兰氏染色镜检为G-无芽孢短小杆菌，呈球杆状或成对排列，有时亦可呈短链状。
3.1.3阪崎肠杆菌生化特性 菌株触酶阳性、氧化酶阴性、动力阳性、葡萄糖代谢类型(0/F)为发酵型(F)，IMViC：靛基质-MR-VP+柠檬酸盐+，在TSA钭面上产黄色色素。进一步进行生化鉴定见表(4)：
表(6)菌株传统生化鉴定结果
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
3.1.4分离出一株多项生化特性与国内外标准菌株及国内已报道菌株不同的阪崎肠杆菌(0819-041)
0819-041菌株具有①卫矛醇阳性；②苦可仁甙阴性；③明胶酶阳性；④乳糖为迟缓发酵(72h)生化特性，与国内外标准菌株及国内已报道菌株不同。
3.1.5 0819-041菌株急性毒性试验结果
实验组小白鼠于接种后6h均出现精神蒌靡，呆卧少动，反应迟钝，腹式呼吸，拒食拒水，于接种后20h内实验组小白鼠全部死亡。解剖检查发现肠道基本无食物，肠肿胀有较多气泡、肠壁变薄有靡烂，肠系膜血管***。解剖还发现肺部均有出血现象。取一段死亡小白鼠脑膜、肠组织进行培养，均分离出同种同株阪崎肠杆菌。注射营养肉汤对照组小白鼠未见异常表现。
3.2基础研究结果
3.2.1两种修复培养基比较研究结果：
试验结果表明：分别取阪崎肠杆菌(休眠期)菌悬液0.1ml涂布普通营养琼脂平板36℃±1℃培养18-24h，未生长阪崎肠杆菌。经修复培养及EE增菌培养后，A组(1∶10蒸馏水稀释乳粉+菌)、B组(1∶10BP稀释乳粉+菌)两组均能在5种分离培养基上生长，阪崎肠杆菌经BP修复培养后比蒸馏水修复培养后高出1-2个稀释度(10倍-100倍，B组为10-8生长，A组为10-6、10-7生长)。见表(1)
表(1)
注：“-”表示未生长；“/”表示未划线接种，处在培养阶段；“++++”表示划线接种生长很好；
“—”表示划线接种未生长。
3.2.2两种肠道增菌培养基(mLST-Vm、EE)的比较研究结果：
试验结果表明；经生理盐水不同倍数稀释，对mLST-Vm、EE进行增菌效果比较，3种阪崎肠杆菌标准株在mLST-Vm(国标培养基)、EE(自选培养基)增菌培养基中同样生长很好。统计学结果表明，EE增菌效果与mLST-Vm无统计学差别，经Pearsonχ2检验，χ2均为0，P值为1。证实自选的EE肠道增菌培养基与国标mLST-Vm用于阪崎肠杆菌增菌培养灵敏度同样很高、无差异。(使用EE更便捷，灭菌后2℃-8℃冰箱保存，4周之内可以使用。而mLST-Vm/支需加入万古霉素溶液0.1ml，仅限于在24h之内使用。)见表(2)、表(3)、表(4)。
表(2)ATCC29544在mLST-Vm、EE增菌培养基中增菌效果
注：“+”表示生长，“-”表示未生长，“++++”表示划线接种生长很好，“—”表示划线接种未生长。
表(3)ATCC29004在mLST-Vm、EE增菌培养基中增菌效果
注：“+”表示生长，“-”表示未生长，“++++”表示划线接种生长很好，“—”表示划线接种未生长。
表(4)CMCC45401在mLST-Vm、EE增菌培养基中增菌效果
注：“+”表示生长，“-”表示未生长，“++++”表示划线接种生长很好，“—”表示划线接种未生长。
3.2.3阪崎肠杆菌在5种分离培养基上生物学特征及生长情况比较研究结果：
阪崎肠杆菌在2％NutirentAgar与5种肠道分离培养基上生长情况比较，SorbitolMacConKey、MacConKey、Xa-GicA培养基上菌落生长数量基本相接近，＜10％。在Xa-GicA上菌落呈蓝绿色，选择性强，但菌落生长较小。在EMB、VRBGA琼脂平板上阪崎肠杆菌都呈***粘液状，由于有融合生长情况，且菌落数量有明显差异(Pearson χ2＝24.36，P＝0.00)，据统计学结果提示SorbitolMacConKey培养基在10-4的和10-5均比其他培养基明显好。见表(3)
表(5)
3.2.4三种方法检测阪崎肠杆菌结果比较
2008年对市场抽检的39件婴幼儿配方乳粉应用本研究方法与SN/T1632.1-2005行业标准(当时还没有国标)，同时检出阳性2件，阳性率5.13％。2009年对市场抽检的23的件婴幼儿配方乳粉，检出阳性2件，阳性率8.70％。2010年1月-4月，对市场抽检的17的件婴幼儿配方乳粉，检出阳性2件，阳性率11.76％。采用本研究方法与GB/T4789.40-2008国家标准及SN/T1632.1-2005行业标准检测，三种方法无统计学差异(U值＝0.1009，P＝0.908＞0.05)。见表(7)
表(7)三种方法检测婴幼儿配方乳粉中阪崎肠杆菌结果比较
4.本研究方法与行业标准、国家标准在操作步骤及培养时间上的比较
4.1与SN/T1632.1.2.3-2005行业标准在操作步骤及培养时间上的比较
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局于2005年8月18日发布2006年2月1日实施《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法》SN/T1632-2005，内容有定量检测和定性检测，定量需100g、10g、1g各3份检测，根据每一稀释度出现的阳性经确证试验确认后，按常规MPN查 表，估计阪崎肠杆菌的MPN值。鉴于目前国内外对阪崎肠杆菌检测并无限定标准，因此我们按SN/T1632-2005标准定性检测，样品以100g为基本检测单位，在操作步骤及培养时间上比较如下：见表(8)
表(8)微生物培养分离鉴定阪崎肠杆菌操作步骤及培养时间上的比较
在实践中我们发现，阪崎肠杆菌在TSA琼脂平板25℃±1℃培养48-72h能形成明显黄色色素，但在TSA钭面上36℃±1℃培养18-24h同样能形成明显黄色色素。因此可以将可疑菌落接种TSA钭面，培养温度由25℃±1℃调为36℃±1℃，培养时间由48-72h缩短为18-24h(缩短1-2天)。见表(9)
表(9)与PCR与荧光PCR检测方法及培养时间上的比较：
4.2与GB/T4789.40-2008标准在操作步骤及培养时间上的比较：
中华人民共和国***、中国国家标准管理委员会于2009-03-01实施GB/T4789.40-2008阪崎肠杆菌检验方法，本研究方法与国标方法在操作步骤及培养时间上的比较如下：见表(10)
表(10)
Claims (2)
1.一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，其特征是命名为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年04月06日，保藏编号：CGMCC No.3724。
2.根据权利要求1所述的一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，其特征是提取方法为：
(1)用预热45℃缓冲蛋白胨水500ml与100g乳粉摇匀，36℃±1℃培养18-24h；
(2)移取上述培养液10ml加于90ml肠道菌增菌肉汤中36℃±1℃培养18-22h；
(3)取肠道菌增菌肉汤培养物一环划线接种伊红美蓝、山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板各1块，36℃±1℃培养18-24h；
(4)观察菌落形态，从山梨醇麦康凯平板上挑取不发酵山梨醇的单个菌落接种4支TSA钭面、36℃±1℃培养18-24h；
(5)用钭面做触酶、氧化酶、G染色、进一步生化鉴定。
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| CN (1) | CN101935629A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107022538A (zh) * | 2016-04-02 | 2017-08-08 | 华中农业大学 | 一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因 |
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2010
- 2010-06-23 CN CN 201010207673 patent/CN101935629A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 《中国乳品工业》 20081231 张雪梅等 阪崎肠杆菌的研究进展 42-46 1-2 第36卷, 第3期 2 * |
| 《中国乳品工业》 20110225 高建新等 阪崎肠杆菌及与肠杆菌科其他细菌差异比较 24-26 1-2 第39卷, 第2期 2 * |
| 《微生物学通报》 20091120 卢勉飞等 阪崎肠杆菌显色培养基的应用研究 1789-1793 1-2 第36卷, 第11期 2 * |
| 《现代预防医学》 20100110 高建新等 奶粉中一株阪崎肠杆菌的分离鉴定 105-106 1-2 第37卷, 第1期 2 * |
| 《食品研究与开发》 20090331 张霞等 进口乳粉中阪崎肠杆菌检测分析 136-138 1-2 第30卷, 第3期 2 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107022538A (zh) * | 2016-04-02 | 2017-08-08 | 华中农业大学 | 一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因 |
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