CN109504691A

CN109504691A - 3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN109504691A
Application number: CN201811366200.3A
Authority: CN
Inventors: 赵方杰; 黄科; 高帆
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: CN109504691B

Abstract

本发明属于生物技术和生物医药领域，具体涉及3‑氨基‑4‑羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用。本发明中描述的3‑氨基‑4‑羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2的全长768bp，序列如SEQ ID NO.1所示，EnhoA2编码的蛋白ENhoA2含255个氨基酸，序列如SEQ ID NO.4所示，EnhoA2及其同源基因可用于构建制备乙酰胂胺的基因工程生物或直接用于乙酰胂胺的酶法制备，EnhoA2基因及其编码产物的发现在生物技术和生物医药领域具有重要的理论和应用价值。

Description

3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药领域，具体涉及3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用。

背景技术

乙酰胂胺(CAS号：97-44-9)，别名阿西太松、乙酰胺胂、醋氨胂，分子式为C₈H₁₀AsNO₅，英文简写N-AHPAA，是一种抗阿米巴病药及抗滴虫病药，其复方制剂名为滴维净，临床上它通常被用作耐甲硝唑滴虫病治疗的首选药物。目前，该药物的生产制备是通过化学合成法来完成的，其中最简单、直接的合成步骤如下：以3-氨基-4-羟基苯胂酸(英文简写3-AHPAA)为原料，将其加入5％的氢氧化钠溶液中，搅拌使原料全溶，调节反应液pH＝8.0，并加热至30-35℃，之后在剧烈搅拌下加入乙酐进行反应，待沉淀开始析出后，继续搅拌1h，于55-60℃下向反应液中加入盐酸，析出的结晶经过滤和水洗等步骤后即为粗品乙酰胂胺。通过上述描述，我们可以发现化学合成法的操作步骤相对比较繁琐，且对反应条件及反应设备都有一定的要求，这些都是造成化学合成法实施成本较高的重要原因，另外我们也不能忽略化学合成过程中可能造成的废渣污染问题。酶学合成法是近些年极力提倡的绿色合成技术的重要组成部分，它不仅在工艺生产上不会对环境产生危害，同时它的运行成本及对反应条件的要求通常低于化学合成法，然而，到目前为止，尚未见有任何关于乙酰胂胺酶学合成的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供可用于酶法制备乙酰胂胺的3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2。

本发明的另一目的是提供乙酰基转移酶基因EnhoA2编码的乙酰基转移酶EnhoA2。

本发明的又一目的是提供该基因、蛋白的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

乙酰基转移酶基因EnhoA2，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

本发明中乙酰基转移酶基因EnhoA2克隆自一株能够在好氧条件下转化洛克沙胂的菌株Enterobacter sp.CZ-1。菌株CZ-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018789，保藏日期2018年11月12日。通过前期对代谢产物进行分析鉴定，我们发现菌株CZ-1中存在着一条主要的洛克沙胂生物转化途径，即进入该菌体的洛克沙胂首先会被还原转化为3-氨基-4-羟基苯胂酸，之后又将迅速地转化为乙酰胂胺，因而我们推测在菌株CZ-1体内应该存在着可以将3-氨基-4-羟基苯胂酸直接转化为乙酰胂胺的酶类。

克隆3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶采用的方法是常规的异源表达法。从菌株CZ-1的基因组中检索到33个乙酰基转移酶编码基因，将它们分别通过PCR反应扩增出来，扩增产物分别连接到表达载体pET29a(+)上，获得的重组质粒再分别转入大肠杆菌【BL21(DE3)】感受态细胞中，通过比较获得的阳性克隆子对3-氨基-4-羟基苯胂酸的乙酰化能力，我们从上述33个候选基因中鉴定到一个3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶编码基因ENhoA2，接着我们通过生物化学手段对这个基因的编码产物ENhoA2的酶学特性进行了详细的研究。

乙酰基转移酶基因EnhoA2所编码的乙酰基转移酶ENhoA2，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

用于扩增所述的3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2的引物，如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

含有本发明所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选将所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2连入表达载体pET29a(+)。

含有本发明所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2的基因工程菌，所述的基因工程菌的出发菌株优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2在构建生产乙酰胂胺的转基因生物中的应用。

本发明所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2在乙酰胂胺工业生产中的应用。

含有本发明所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2的基因工程菌在乙酰胂胺工业生产中的应用。

本发明所述的乙酰基转移酶ENhoA2在乙酰胂胺工业生产中的应用。

有益效果

本发明采用常规的异源表达法从菌株Enterobacter sp.CZ-1中克隆到一个3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2，EnhoA2基因全长768bp，编码255个氨基酸。该基因可用于构建制备乙酰胂胺的基因工程生物或直接用于乙酰胂胺的酶法制备，EnhoA2及其编码产物的发现在生物技术和生物医药领域具有重要的理论和应用价值。

附图说明

图1.菌株CZ-1转化洛克沙胂的HPLC-ICP-MS定性色谱图，注：3-AHPAA，3-氨基-4羟基苯胂酸；N-AHPAA，乙酰胂胺。

图2.异源表达EnhoA2基因可赋予大肠杆菌更强的3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰化能力。

图3.ENhoA 2的SDS-PAGE电泳图。

图4.ENhoA 2的pH值耐受范围。

具体实施方式

实施例一：洛克沙胂转化菌株CZ-1的分离与鉴定

(1)洛克沙胂转化菌株CZ-1的分离

用于分离洛克沙胂转化菌的土壤采自中国湖南省郴州市的一处中度砷污染水稻田，该土壤样品的砷含量为86mg kg^-1。分离的步骤如下：取2g土壤加入100ml的ST10^-1液体培养基中，30℃、200rpm的摇床中震荡3h以彻底混匀土壤，取出适量土悬液进行连续稀释，将10^-3-10^-6的稀释液分别涂布于含100μM洛克沙胂的ST10^-1固体平板上，30℃培养箱培养5天后，从这些平板上挑取不同形态的单菌落分别接种于含100μM洛克沙胂的ST10^-1液体培养基中，30℃、200rpm的摇床中培养3天，之后分别验证各培养基中洛克沙胂的转化效果。ST10^-1培养基的配方(l^-1)：0.5g蛋白胨，0.05g酵母粉，0.5％(m/v)D-葡萄糖。

转化效果的定性验证方法：从培养基中取出的样品需过0.22μM的水相滤膜过滤，过膜液置于4℃冰箱保存待测。定性分析采用的仪器为高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICP-MS，安捷伦)，液相分离采用PRP X110s阴离子交换柱(汉密尔顿)，该柱柱长为150mm，内径为4.6mm，粒度为7μm，流动相的组成：(A)5％(v/v)甲醇；(B)60mM碳酸氢铵，5％(v/v)甲醇，pH＝8.75，采用上述流动相进行梯度洗脱，洗脱程序如下：0-2min，流动相B，0％→40％；2-5min，流动相B，40％；8-17min，流动相B，40％→100％；17-18min，流动相B，100％→0％；18-22min，流动相B，0％，进样量为30μl，流速2ml min^-1。

从平板上挑取的菌株中，分离到一株洛克沙胂转化菌株，命名为CZ-1，该菌株可以在3天内转化培养基中大部分的洛克沙胂，转化的主产物为3-氨基4-羟基-苯胂酸和乙酰胂胺(见图1)。

(2)洛克沙胂转化菌株CZ-1的鉴定及生物学特性

利用透射电镜(H-7650，Hitachi)观察菌株CZ-1的细胞形态，另外利用API 20E试剂条(bioMérieux)测定了菌株的典型生理生化指标。

菌株CZ-1属革兰氏阴性菌，好氧，其细胞呈杆状且带一条极性鞭毛，其在ST10^-1固体平板上的菌落呈白色，边缘整齐，湿润光滑但不透明，其他由API 20E试剂条测定的生理生化指标见表1。

表1.API 20E试剂条测定的菌株CZ-1的生理生化特征

赖氨酸脱羧酶	-	鸟氨酸脱羧酶	+
				脲酶	-	柠檬酸利用	+
色氨酸脱氨酶	-	丙酮产生	+
				明胶酶	-	葡萄糖发酵	+
硫化氢产生	-	甘露醇氧化	+
				吲哚产生	-	肌醇氧化	+
鼠李糖氧化	-	山梨醇氧化	+
				麦芽糖氧化	-	蔗糖氧化	+
β-半乳糖苷酶	+	杏苷氧化	+
				精氨酸二氢酶	+	***糖氧化	+

注:-,阴性；+,阳性。

16S rRNA基因序列***发育分析：用于16S rRNA基因序列扩增的PCR引物为：27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')，扩增产物送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行核苷酸序列测定，测序结果经在线比对分析，与NCBI数据库中的模式菌株16S rRNA基因序列进行相似性比较，结果表明：菌株CZ-1与肠杆菌属的同源性最高，与菌株Enterobacter sp.X72^T的同源性达99％。结合上述生理生化特征，菌株CZ-1被鉴定为一株肠杆菌(Enterobacter sp.)。目前该菌株已被送交位于中国湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，保藏编号为CCTCC M 2018789，保藏日期2018年11月12日。

实施例二：3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA的鉴定

(1)细菌基因组总DNA的提取

菌株CZ-1(CCTCC M 2018789)在ST10^-1培养基中大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的CZ-1基因组总DNA，将其溶于无菌ddH₂O中，置于-20℃冰箱保存，具体的总DNA提取方法可参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

(2)菌株基因组完成图测序

提取的菌株总DNA送往上海美吉生物医药科技有限公司进行基因组完成图测序。通过后续对基因组进行注释分析，我们共发现了33个假定的乙酰基转移酶编码基因(见表2)。

表2.Enterobacter sp.CZ-1基因组中33个假定的乙酰基转移酶。

(3)乙酰基转移酶基因的克隆及异源表达

通过PCR反应扩增33个已去除终止密码子的乙酰基转移酶基因，所用的引物序列参见表3，扩增产物经相应的限制性内切酶酶切后与采用相同限制性内切酶酶切的pET29a载体片段进行连接，获得的重组质粒再分别转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，对获得的克隆子的3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰化能力分别进行检验。检验方法如下：挑取含有重组质粒的克隆子，将其接入20ml含有50μg ml^-1卡那霉素(Km)的LB培养基(酵母膏，5g l^-1；蛋白胨，10g l^-1；氯化钠，10g l^-1)中，37℃、200rpm摇床中培养过夜，过夜培养物以OD₆₀₀＝0.01稀释至新鲜的100ml含有100μM 3-氨基-4-羟基苯胂酸、50μg ml^-1卡那霉素(Km)和0.3mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培养基中，放入37℃、200rpm的摇床培养24h，之后分别从中取出2ml培养物，12000rpm离心2min，再过0.22μm的水相滤膜后置于4℃冰箱保存，后续可直接用于砷形态的定性及定量分析，分析方法可参见实施例一。

在33个假定的乙酰基转移酶基因中，EnhoA2的表达可赋予大肠杆菌BL21(DE3)更强的3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰化能力，相对于对照菌株【E.coli BL21(pet29a)】，菌株E.coli BL21(pet29a-EnhoA2)可转化3-氨基-4-羟基苯胂酸生成更多的乙酰胂胺(图2)，以上结果表明：EnhoA2是一个3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶编码基因。

表3.扩增乙酰基转移酶所用的引物序列

实施例三：EnhoA2的纯化及酶学特性研究

(1)EnhoA2的体外纯化

菌株E.coli BL21(pet29a-EnhoA1)和E.coli BL21(pet29a-EnhoA2)在100ml含有50μg ml^-1Km的LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6时，分别向两培养基中加入0.3mM IPTG，将它们置于16℃、200rpm的摇床中培养过夜，培养物于12000rpm下离心5min，用20ml预冷的缓冲液A(20mM Na₃PO₄·12H₂O，500mM NaCl，pH＝7.4)洗涤菌体两次，接着用25ml相同的缓冲液重悬菌体，重悬液使用超声破碎仪(XO-650D；南京先欧)冰上破碎15分钟，12000rpm离心40min用于收集上清，之后再过0.45μm水相滤膜，使用镍离子亲和层析柱对过膜的上清液进行纯化即得乙酰基转移酶ENhoA 2(见图3)。

(2)EnhoA2的酶学特性研究

无特殊说明的情况下，所有酶学反应都在缓冲液A中进行，反应体系中的组分包括：ENhoA2，乙酰辅酶A(0.25mM)以及底物3-氨基-4-羟基苯胂酸，反应的温度为30℃。1单位的酶活定义为在30℃下每分钟产生1μM乙酰胂胺所需的酶量。我们首先对酶的pH值耐受范围进行了测定，结果显示：ENhoA2具有很广的pH值耐受范围，在pH＝4.5-10.5的范围内均有乙酰化活性的检出，在pH＝5.5-9.5时表现出的酶活性较高(图4)；接着又对这个酶的米氏动力学反应及稳定性分别进行了鉴定，测得了ENhoA2的K_m为1.78mM，Kcat为19.83min^-1；ENhoA2比较稳定，易于保存，在4℃冰箱中放置一个月后，它的活性仅下降了大约5％。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> 肠杆菌CZ-1(Enterobacter sp. CZ-1)

<400> 1

atgcagagca ataatttcaa catctctact tatttcaaac gcataaacta caccggaccg 60

gtggctgctg atacggccac gttgcatgca cttatgcgcc atcagctatt ttcagttccc 120

tttgaaaatc tggacgtgca ggcgggcaaa attgtctcgc tggcaccaga cgatattgcc 180

gataaggtgt taacccaggg acgcggcggt tactgctatg aggtgaacgg gctttttgcc 240

atggcgcttg aggcgatagg tattccttac cgtttcgtgg cggcacgccc gatgttctac 300

cctgcgcgac ggccgaaaac ccatatggcg ctcatcgctg aggtggagag ccgtcagtgg 360

ctttgcgatc tcggattcgg tagctacggc atccgtgcac cgatggcgct ggacacgctt 420

gatgtcgata tcatgcagga tttcgacacg tttcggctta gccgtagcgc tgagggcgaa 480

tatctgcttc aggcaaaagt ggagggagaa tgggcccgtc aatacggctt tgatctcacg 540

cctcaggaat ggattgattt cgttccggcc aactacctta actccacgca tccggatgcc 600

atctttgttc agaagctggt tgtggtgcag catcgcccgg atggacgtga gattttactg 660

ggcgatatgc tgaagacgat cactacggat ggggttgaaa tacagcaact ggcggaggga 720

gaaatctccc gtatgctgaa agaccgtttt gcgctgacga cggcgtaa 768

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 肠杆菌CZ-1(Enterobacter sp. CZ-1)

<400> 2

Met Gln Ser Asn Asn Phe Asn Ile Ser Thr Tyr Phe Lys Arg Ile Asn

1 5 10 15

Tyr Thr Gly Pro Val Ala Ala Asp Thr Ala Thr Leu His Ala Leu Met

20 25 30

Arg His Gln Leu Phe Ser Val Pro Phe Glu Asn Leu Asp Val Gln Ala

35 40 45

Gly Lys Ile Val Ser Leu Ala Pro Asp Asp Ile Ala Asp Lys Val Leu

50 55 60

Thr Gln Gly Arg Gly Gly Tyr Cys Tyr Glu Val Asn Gly Leu Phe Ala

65 70 75 80

Met Ala Leu Glu Ala Ile Gly Ile Pro Tyr Arg Phe Val Ala Ala Arg

85 90 95

Pro Met Phe Tyr Pro Ala Arg Arg Pro Lys Thr His Met Ala Leu Ile

100 105 110

Ala Glu Val Glu Ser Arg Gln Trp Leu Cys Asp Leu Gly Phe Gly Ser

115 120 125

Tyr Gly Ile Arg Ala Pro Met Ala Leu Asp Thr Leu Asp Val Asp Ile

130 135 140

Met Gln Asp Phe Asp Thr Phe Arg Leu Ser Arg Ser Ala Glu Gly Glu

145 150 155 160

Tyr Leu Leu Gln Ala Lys Val Glu Gly Glu Trp Ala Arg Gln Tyr Gly

165 170 175

Phe Asp Leu Thr Pro Gln Glu Trp Ile Asp Phe Val Pro Ala Asn Tyr

180 185 190

Leu Asn Ser Thr His Pro Asp Ala Ile Phe Val Gln Lys Leu Val Val

195 200 205

Val Gln His Arg Pro Asp Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Asp Met Leu

210 215 220

Lys Thr Ile Thr Thr Asp Gly Val Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Gly

225 230 235 240

Glu Ile Ser Arg Met Leu Lys Asp Arg Phe Ala Leu Thr Thr Ala

245 250 255

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggggtacca tgcagagcaa taatttcaac atctctact 39

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagc gccgtcgtca gcgcaaaac 29

Claims

1.3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2所编码的乙酰基转移酶ENhoA2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.用于扩增权利要求1所述的3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2的引物，其特征在于如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.含有权利要求1所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2的重组表达载体。

5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于将权利要求1所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2连入表达载体pET29a(+)。

6.含有权利要求1所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌的出发菌株优选大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2在构建生产乙酰胂胺的转基因生物中的应用。

8.权利要求1所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2在乙酰胂胺工业生产中的应用。

9.含有权利要求1所述的乙酰基转移酶基因EnhoA2的基因工程菌在乙酰胂胺工业生产中的应用。

10.权利要求2所述的乙酰基转移酶ENhoA2在乙酰胂胺工业生产中的应用。